KR101837118B1 - 박테리아 배양 산물을 이용한 콜라겐의 추출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 박테리아 배양 산물을 사용하여 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 흔히 콜라겐 추출법으로 사용되는 산가용법을 사용하지 않고 박테리아의 배양 산물을 사용하여 콜라겐을 추출함으로써 식용, 화장품용 또는 의료용 원료로 사용할 수 있는 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것이다.

Description

박테리아 배양 산물을 이용한 콜라겐의 추출 방법{A Method for Extracting Collagen using Bacterial Fermentation}

본 발명은 박테리아 배양 산물을 사용하여 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것이다.

콜라겐(collagen)은 몸속에서 결합조직을 이루는 주요한 단백질로, 신체구성 단백질 중 25 내지 35%의 매우 많은 부분을 차지한다. 인체 부분별 콜라겐 구성비를 보면, 이의 상아질 18%, 피부표피 아래 진피의 70%, 관절 연골의 50%, 뼈의 유기물 중 80%, 뼈와 근육을 이어주는 힘줄의 80% 그리고, 눈의 각막과 결막에서 주성분을 이루고 있다.

동물에서 발견되는 콜라겐은 대부분 제1형 콜라겐으로, 300 kDa의 단량체로 이루어져 있으며, 특정부위에 공유결합을 가지고 있다. 그렇기 때문에 성숙한 조직에서 발견되는 콜라겐은 낮은 용해성을 가진다. 또한 콜라겐을 구성하는 아미노산은 글루탐산, 하이드록시프롤린, 글리신, 프롤린 및 알라닌 등이며, 그 중 콜라겐에만 특이적으로 존재하는 하이드록시프롤린의 함량이 높은 것이 특징이다.

콜라겐은 나이가 들수록 체내에서 합성하는 능력을 잃게 되는데, 18세 정도가 되면 콜라겐 생성 속도는 급속히 떨어지기 시작하여 40세에는 18세에 비해 절반 이하가 되는 것으로 알려져 있다. 또한 나이가 들게 되면 신진대사가 둔해져, 오래된 콜라겐이 분해되지 않고 계속 축적되면 콜라겐을 합성하는 재료도 부족해짐으로써 노화가 촉진된다.

이러한 이유로 인해, 식품이나 화장품, 의약 관련 분야 등에서는 콜라겐 개발과 이를 이용한 화장품, 식용 및 생체 소재 개발 등에 대해 지속적으로 연구되고 있다. 지금까지는 소나 돼지에서 얻어진 콜라겐이 주로 이용되어 왔지만, 소에서 발생되는 광우병의 발병 이후로 소나 돼지 이외의 어류나 기타 축산물에서 유래하는 콜라겐이 주목을 받아 화장품이나 건강식품, 의약품 등의 원료로서 이용이 검토되고 있다. 이는 사람으로부터 진화적으로 멀리 떨어져 있는 하등척추동물인 어류나 기타 축산물에서 사람과 공통되는 감염증이 비교적 발견되어 있지 않고, 소나 돼지의 콜라겐에 비하여 안전성이 높기 때문이다.

종래에 일반적인 콜라겐 소 돼지와 같은 축산물 외에 오징어 등의 어류나, 녹용, 닭발 등과 같은 동물의 특수 부위에 대부분 화학성 용매 특히, 산을 가하야 콜라겐을 추출하는 방법이 알려지고 있다.

한국특허등록 제10-892605호에서는 닭발을 이용한 콜라겐 함유량이 높은 조미료용 추출물 제조방법과 이를 조미료에 활용하는 기술이 제안되어 있다. 여기서는 닭발을 염소계 소독제로 표백 및 살균하고, 열수 또는 단백질 분해효소로 콜라겐을 포함하는 단백질을 추출한 다음, 여과, 분리 및 농축하여 콜라겐 함유량이 높은 조미료용 추출물을 제조하는 기술이 제안되어 있다.

한국특허공개 제2012-120571호에서는 오징어 내피 부분을 분리 선별 취합하고 알칼리 전해수에 세척하고 산성 전해수에 살균 소독하는 전처리 공정을 거친 오징어 내피를 10 내지 20%의 수분율로 건조하고 분쇄한 다음 효소를 이용하여 가수분해하여 콜라겐 펩타이드를 추출하고 농축하여 스프레이 건조하는 콜라겐 펩타이드 제조에 관해 기술하고 있으며, 한국특허공개 제2012-134935호에서는 오징어 껍질을 건조 및 분쇄한 오징어 껍질분말에 수산화나트륨 수용액을 가하여 비콜라겐 단백질을 제거하고, 중화 및 수세한 다음 물과 뉴트라제 효소를 첨가하여 가수분해하고, 다시 플라보자임 효소로 2차 가수분해하여 여과, 건조하는 콜라겐 조성물의 추출방법이 제안되어 있다.

한국특허등록 제10-1105603호에서는 동물 조직에서 산 용해, 펩신처리, 염 침전, 여과, 2차 산 용해, 2차 염 침전, 상 분리 및 농축, 산 용해 등을 거쳐서 콜라겐을 고순도로 처리하는 방법이 제안되어 있다. 여기서는 동물의 조직을 염산용액으로 연화시킨 후 펩신효소를 이용하고 인산용액에 넣어 콜라겐을 조직으로부터 분리해내고 염화나트륨으로 침전시킴으로써 효소 분리된 콜라겐을 회수하는 방법과, 이를 다시 인산용액에 용해하고 희석한 후 제균 여과한 다음 염 침전시켜서 콜라겐을 분리하고 수분을 제거한 뒤 콜라겐 침전물을 가압, 농축하고 인산용액에 재용해하고 수산화나트륨용액으로 중화하여 콜라겐 용액을 제조방법을 제안하고 있다. 그러나 이러한 콜라겐 추출방법은 산과 염기 처리 및 효소처리 등을 이용하는 전형적인 추출방법으로서 공정이 복잡하고 순도가 좋지 못하여 상업화가 어려운 문제가 있다.

또한, 한국특허공개 제2012-76901호에서는 오리 날개와 오리발로부터 화장용 원료 및 식품 원료로 사용할 수 있는 콜라겐 함유량이 높은 콜라겐 추출물을 조제하기 위한 오리 콜라겐 제조방법을 개시하면서, 상기 날개 및 발의 뼈를 제거한 후, 껍질과 함께 각각 작은 크기로 세절한 후 -20℃이하에 급냉시키는 원료 전처리 단계와, 이를 수산화나트륨을 이용하여 표백 및 과도한 지방을 제거하는 단계와, 산 및 염화나트륨을 이용하여 가용성 콜라겐 추출물을 제조하는 단계와, 추출에 사용한 염을 제거하는 탈염단계와, 이를 농축 건조하여 콜라겐 함유 건조물을 얻는 건조공정으로 구성되는 것을 특징으로 하는 오리의 콜라겐의 제조방법이 제안되어 있다. 그러나 이러한 콜라겐 추출 제조방법은 오리의 조직부위에서 산과 염기를 이용한 콜라겐을 추출방법으로서 지방제거와 건조 농축 등을 통해 콜라겐의 추출효율 개선에 주안점을 두고 있지만 기존의 전통적 방법을 벗어나지 못하고 있으며 콜라겐 함량이 비교적 낮고 그 순도 면에서도 고순도를 기대하기 어려울 뿐만 아니라 콜라겐의 추출 시 여러 가지 인체에 유해한 화학 시약을 사용할 뿐만 아니라 스케일 업을 할 때 오염이 쉽게 된다는 점에서 개선의 필요성이 있었다.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.

본 발명자들은 동물 또는 식물 조직으로부터 고순도의 콜라겐을 효과적으로 추출하기 위한 방법을 연구하였다. 그 결과 박테리아 배양 산물을 콜라겐이 함유된 조직에 처리하여 15 내지 25℃의 온도에서 콜라겐을 추출할 경우, 기존의 추출법인 산가용법보다 화학약품을 최대 1/100 정도만 사용하면서도 고수율 및 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 박테리아 배양 산물을 사용하여 콜라겐을 추출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 박테리아 배양 산물을 이용한 콜라겐의 추출 방법을 제공한다.

본 발명자들은 동물 또는 식물 조직으로부터 고순도의 콜라겐을 효과적으로 추출하기 위한 방법을 연구하였다. 그 결과 박테리아 배양 산물을 콜라겐이 함유된 조직에 처리하여 15 내지 25℃의 온도에서 콜라겐을 추출할 경우, 기존의 추출법인 산가용법보다 화학약품을 최대 1/100 정도만 사용하면서도 고수율 및 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있다는 사실을 알게 되었다.

본 명세서에서 용어 "콜라겐 또는 단백질 분해효소를 포함하는 박테리아"는 콜라겐 또는 단백질 분해에 관련 된 효소를 배양 시 분비하는 박테리아를 총칭하는 의미로 사용된다. 본 발명자들은 실험을 통하여 상기 박테리아들을 분석한 결과 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물에서 상기 콜라겐 또는 단백질 분해에 관련 된 효소를 배양 시 분비하는 것을 확인하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 콜라겐 또는 단백질 분해효소를 포함하는 박테리아는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 크렙실라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 상기 콜라겐 또는 단백질 분해효소를 포함하는 박테리아의 배양 산물을 이용하여 고순도의 콜라겐을 추출하는 방법을 각 단계별로 설명한다.

(a) 콜라겐 또는 단백질 분해효소를 포함하는 박테리아를 배양하는 단계:

먼저, 상기 콜라겐 또는 단백질 분해효소를 포함하는 박테리아를 배양액에서 배양한다. 상기 배양액은 박테리아가 콜라겐 또는 단백질 분해효소를 배양 시 충분히 분비할 수 있는 조건에서 수행하는 것이 바람직하다. 바람직한 조건은 예를 들어, 액상 배양액 150 내지 350 ㎖ 당 박테리아 3 내지 7 ㎖를 부유시켜 100 내지 200 rpm으로 회전시켜 가면서 25 내지 40℃에서 배양하는 것이 좋으나, 그 최적 온도는 박테리아의 종류에 따라 다를 수 있다.

또한 상기 배양액은 박테리아가 콜라겐 또는 단백질 분해효소를 충분히 분비할 수 있는 호적의 성분들을 포함할 수 있다. 상기 호적의 성분은 예를 들어, Peptone, NH₄H₂PO₄, NaCl, MgSO_{4 ·}7H₂O 및 CaCl_2·2H₂O를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 Peptone 0.5 내지 1.5%, NH₄H₂PO₄ 0.1 내지 0.5%, NaCl 0.2 내지 0.8%, MgSO_{4 ·}7H₂O 0.01 내지 0.05%, CaCl_{2 ·}2H₂O 0.01 내지 0.03% 및 tween 20 0.005 내지 0.02%를 포함할 수 있다.

(b) 상기 박테리아가 배양된 배양액으로부터 박테리아 배양산물을 수거하는 단계:

이어서, 배양액으로부터 콜라겐 또는 단백질 분해효소를 포함하고 있는 박테리아 배양산물을 수거한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 박테리아 배양산물의 수거는 박테리아가 배양된 배양액을 원심분리한 후 상층액으로부터 수거한다. 원심분리의 조건은 제한되지 않으나, 바람직하게는 2 내지 8℃에서 10 내지 20분간 5,000 내지 20,000 rpm의 속도로 원심분리를 수행한다. 박테리아에 의한 추가적인 오염을 막기 위해 주사기 필터를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 0.22 ㎛ 주사기 필터를 이용하며, 보다 바람직하게는 확실한 마이코플라즈마 제거를 위해 0.1 ㎛ 주사기 필터를 이용하는 것이 좋다.

(c) 콜라겐을 포함하는 동물 또는 식물 조직에 상기 박테리아 배양산물을 처리하고 15 내지 25℃의 온도에서 콜라겐을 추출하는 단계:

본원발명의 큰 특징 중 하나는 15 내지 25℃의 온도, 바람직하게는 20 내지 25℃의 온도에서 고순도 콜라겐을 추출하는 것이다. 종래의 추출 방법에서는 산성 용매를 다량으로 사용하거나, 4℃ 정도의 저온에서 추출을 수행하는 것이 일반적이었으나, 본원발명의 경우 15 내지 25℃의 높은 온도에서 콜라겐을 다량 얻을 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, pH 5 내지 8 및 15 내지 25℃의 높은 온도에서 콜라겐을 추출할 경우 4℃ 정도의 저온에서 추출하는 경우와 비교하여 약 3 내지 5배 정도, 바람직하게는 4 내지 5배 정도의 높은 수율로 고순도의 콜라겐을 추출할 수 있음을 확인하였다(도 3).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 동물 또는 식물 조직은 박테리아 배양산물 처리 전 잘게 절단한 것이다.

본 발명에서 이용 가능한 동물 또는 식물 조직은 콜라겐 성분을 포함하는 한 제한되지 않으며, 바람직하게는 동물 조직, 보다 바람직하게는 조류, 포유류 또는 어류의 조직, 가장 바람직하게는 오리의 발, 머리, 날개 등의 조직부위가 사용될 수 있다.

상기 조직은 그대로 이용하여도 무방하나, 콜라겐을 포함하는 조직과 상기 박테리아 배양산물의 접촉을 극대화하기 위해 상기 조직을 절단할 수 있으며, 바람직하게는 ㎜ 크기의 단위(약 1 내지 10 ㎜ 정도)로 세절하는 것이 좋다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 절단 조직을 증류수로 세척한 뒤, 박테리아 생성 산물에 5 내지 13%(w/v)로 넣고 24 내지 72시간 동안 20 내지 25℃의 온도에서 150 rpm으로 교반하여 박테리아 배양 산물을 통해 조직에 분해되도록 하였다. 그 후 조직에서 분해된 콜라겐이 함유된 점성을 가진 용액을 12,000 rpm, 30분, 4℃에서 원심분리하였다.

상기 추출된 콜라겐의 효과적인 수거를 위해서 본 발명은 다음의 단계들을 추가로 포함할 수 있다.

(d) 콜라겐 추출단계에서 얻어진 콜라겐 용액을 수거하여 완충액으로 투석하여 효소 반응을 정지시키는 효소 반응 정지단계:

효소 반응의 정지는 완충액, 바람직하게는 인산나트륨 완충액을 이용한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기에서 얻은 상층액을 수거한 뒤 효소 반응을 정지시키기 위하여 0.02 M의 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 투석외액으로 12 내지 48시간 동안 투석하였다.

(e) 효소반응 정지단계를 거쳐 얻어진 용액을 산에 녹인 뒤, 염을 가하여 침전시키고 증류수로 투석하는 투석단계:

상기 단계를 통하여 효소 반응이 정지되면, 이를 산에 녹인 뒤, 염을 가하여 침전시키고 증류수로 투석하는 과정을 추가적으로 거칠 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 효소 반응이 정지된 용액을 수거하고 원심분리하여 펠렛을 얻은 뒤 0.5 M의 초산에 녹인 후 1 M의 염을 첨가하여 12 내지 24 시간동안 침전시킨 후, 침전물을 회수하여 셀룰로오스 한외여과막(3500 Mw)에 충전시켜 24 내지 48 시간 이상 증류수를 투석외액으로 투석한 뒤 콜라겐을 수거하여 동결건조하여 최종적으로 고순도의 콜라겐을 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 과정으로 추출한 콜라겐은 기존의 콜라겐보다 단백질 함량이 30% 이상 낮으며, 하이드록시프롤린 함량이 5 내지 10 배 가까이 높아서 기존에 비해 매우 우수한 순도를 가지는 것으로 얻어질 수 있다. 또한, 제1형 콜라겐과 제3형 콜라겐이 대부분 차지하고 그 점도 또한 우수하므로 화장품, 식용, 의료용 생체 재료 등으로 매우 적합하다.

본 발명에 따라 추출한 고순도 콜라겐은 겔이나 용액 상태로 이용할 수 있고, 조직공학적 재료로 제작된 필름형이나 지지체로 만들어 사용될 수도 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 콜라겐 또는 단백질 분해효소를 포함하는 박테리아를 배양액에서 배양하는 단계; 상기 박테리아가 배양된 배양액으로부터 박테리아 배양산물을 수거하는 단계; 및 콜라겐을 포함하는 동물 또는 식물 조직에 상기 박테리아 배양산물을 처리하고 15 내지 25℃의 온도에서 콜라겐을 추출하는 단계를 포함하는 고수율의 콜라겐 추출 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에 따른 추출 방법을 이용하면 종래 콜라겐 추출 방법과 비교하여 4 내지 5배 이상의 고수율로 콜라겐을 얻을 수 있으며, 산성 용매의 사용을 현저히 줄일 수 있어 환경 친화적인 이점을 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 추출 방법은 15 내지 25℃의 온도에서 안정적으로 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있어 종래기술들보다 경제적인 장점을 갖는다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 콜라겐에 대한 조성을 확인한 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 분석결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 콜라겐을 추출하여 비교예로 추출한 콜라겐과 본 발명의 방법으로 추출한 콜라겐의 하이드록시프롤린의 양을 측정하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따르면서 추출 온도를 변형하여 얻어진 콜라겐의 양, 수율을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 콜라겐을 동결건조한 콜라겐 분말을 산성용액에 용해시킨 뒤, 동결건조 후 EDC/NHS 가교결합을 통해 제작한 콜라겐 시트를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

1. 박테리아 배양단계

Nutrient Broth (NB) 배양액에 박테리아를 부유시키고 37℃에서 24, 48 그리고 72 시간 동안 배양시켰다.

2. 박테리아 생성 산물 생성단계

Peptone, NH₄H₂PO₄, NaCl, MgSO_{4 ·}7H₂O, CaCl_{2 ·}2H₂O, Tween 20 2∼3 drops, pH 7.0 조건의 생성 배양액을 제조한 뒤, 액상 배양액 300 ㎖ 당 박테리아 5 ㎖를 부유시켜 150 rpm으로 회전시켜가면서 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양시켰다.

3. 박테리아 생성 산물 수거단계

생성 배양액에서 박테리아를 24시간 배양시킨 뒤, 박테리아가 부유된 배양액을 수거하여 12,000 rpm, 15분, 4℃의 조건에서 원심분리 하였다. 그 후 상층액을 0.1 내지 0.22 ㎛ 주사기 필터를 사용하여 필터한 뒤, 사용 전까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.

4. 절단 조직 준비단계

오리발을 증류수에 하루 동안 담가 핏물을 제거하고 증류수로 여러 번 세척하였다. 오리발을 1 내지 10 ㎜ 크기로 잘게 절단하여, 이 절단 조직을 원료로 사용하였다. 절단한 원료를 -20℃ 이하의 냉장고에서 급속 동결시켜 보관하였다.

5. 콜라겐을 함유한 동물 조직의 준비단계

콜라겐을 함유하는 동물의 절단 조직 준비단계에서 선별 세척하여 절단하여 절단 조직을 준비한다. 증류수로 세척하고 1 내지 10 ㎜ 정도로 세절하였다.

6. 콜라겐 추출 단계

상기 절단 조직을 차가운 증류수로 세척한 뒤, 조직을 위에서 준비한 박테리아 배양 산물에 10%(w/v)로 넣은 뒤, 48시간 동안 25℃의 온도에서 150 rpm으로 교반하면서 박테리아 배양 산물을 통해 조직에 분해되도록 하였다. 그 후 조직에서 분해된 콜라겐이 함유된 점성을 가진 용액을 12,000 rpm로 원심분리하였다.

7. 투석단계

상기에서 얻은 상층액을 수거한 뒤 안정적인 콜라겐을 추출하기 위하여 0.02 M의 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 투석외액으로 24시간 동안 투석하였다(이 반응을 거치지 않으면 콜라겐의 변성이 쉬움). 투석이 완료되면 용액을 수거한 뒤 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 상기에서 얻은 펠렛을 0.5 M의 초산에 녹인 뒤, 1 M의 염을 첨가하여 12 내지 24시간 침전시킨 뒤, 셀룰로오스 한외여과막(3500 Mw)에 충전시켜 24시간 이상 증류수를 투석외액으로 투석한 뒤 콜라겐을 수거하여 동결건조 하였다.

비교예

동일 시료에 대해 기존의 콜라겐 추출방법으로 오리발에서 뼈를 제거한 후, 껍질과 함께 각각 작은 크기로 세절한 뒤, 급냉시켜 이를 수산화나트륨을 이용하여 표백 및 과도한 지방을 제거하고, 산 및 염화나트륨을 이용하여 가용성 콜라겐 추출물을 제조하여, 염을 제거하고 이를 농축 건조하는 방법으로, 한국특허공개 제10-2012-0076901호에 명시된 실시예 1 내지 5에서 제시하고 있는 전처리 단계, 지방제거단계, 콜라겐 추출단계, 탈염 및 농축단계 등을 거쳐 콜라겐 추출물을 얻었다.

실험예 1: 콜라겐 조성 분석

상기 실시예에서 추출한 콜라겐의 조성을 알아보기 위하여 5 내지 20% 그라디언트 겔을 사용하여 SDS-PAGE 분석을 실시하여 도 1에 나타냈었다. 도 1의 S는 Sigma에서 구입한 시판용 콜라겐으로 본 발명에서 표준물질로 선택하였다. A는 비교예의 산가용 방법을 사용하여 추출한 콜라겐이고 B는 Bacillus cereus를 사용하여 추출한 콜라겐 그리고 C는 Bacillus cereus CNA1를 사용하여 추출한 콜라겐이다. 도 1에서 나타난 바와 같이 분자량 200, 140, 120 kDa의 type I 콜라겐이 대부분임을 확인하였으며, type III 콜라겐도 다량 포함되어 있음을 확인하였다. 보통 동물성 콜라겐은 제3형 콜라겐인 α1 chain 116 kDa, 제1형 콜라겐인 α2 chain 97.4 kDa, 제2형 콜라겐은 β chain 205 kDa를 나타낸다.

실험예 2: 콜라겐 및 단백질 함량 분석

상기 실시예에서 추출한 콜라겐의 콜라겐 함량을 측정하고자, 콜라겐이 분해될 때 특이적으로 분해되는 하이드록시프롤린 함량을 측정하여 콜라겐의 함량을 분석하였다. 하이드록시프롤린 함량 측정 결과 기존 방법인 비교예의 추출법 보다는 본 발명의 추출법으로 추출한 콜라겐에서 하이드록시프롤린 함량이 2배 또는 그 이상 높음을 알 수 있었다. 그 측정 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B와 C는 각각 Bacillus cereus, Bacillus cereus CNA1를 배양시켜 실시예의 방법으로 추출한 고순도 콜라겐이다.

실험예 3: 추출 온도별 콜라겐 수율 분석

상기 실시예에 따라 추출 온도를 달리하여 콜라겐을 추출하였을 때의 콜라겐의 수율을 분석하였다. 보통 콜라겐의 변성으로 인해 추출온도는 4℃에서 흔히 행해지지만 본 발명에서는 박테리아 배양 산물을 사용하여 15 내지 25℃의 높은 온도에서 안정적으로 추출하여 그 수율을 높였다. 동물 조직 1 ㎏에 박테리아 배양 산물을 가하여 20℃에서 추출할 경우 4℃에서 추출하였을 경우보다 5배 정도 높은 양의 콜라겐을 얻을 수 있었다(도 3).

실험예 4: 콜라겐 겔 시트 제작

본 발명에서 추출한 콜라겐을 MES 완충액에 10 wt%로 용해시킨 뒤, EDC/NHS를 사용하여 가교시켜 조직공학적으로 사용될 수 있는 콜라겐 겔 시트를 제작하였다(도 4).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. 하기의 단계를 포함하는 박테리아 배양 산물을 이용한 콜라겐의 추출 방법:
   (a) 콜라겐 또는 단백질 분해효소를 포함하는 박테리아인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 배양액에서 배양하는 단계;
   (b) 상기 박테리아가 배양된 배양액으로부터 박테리아 배양산물을 수거하는 단계;
   (c) 콜라겐을 포함하는 동물 또는 식물 조직을 1 ~ 10 mm 크기로 절단하여 절단 조직을 준비하는 단계; 및
   (d) 산처리를 하지 않은 상기 절단 조직에 상기 박테리아 배양산물을 처리하고 20 내지 25℃의 온도에서 콜라겐을 추출하는 단계.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 배양액은 Peptone, NH₄H₂PO₄, NaCl, MgSO_{4 ·}7H₂O 및 CaCl_2·2H₂O을 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 추출방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 박테리아 배양산물의 수거는 박테리아가 배양된 배양액을 원심분리한 후 상층액으로부터 수거하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 추출 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 상층액으로부터의 수거는 0.1 내지 0.22 ㎛ 주사기 필터로 걸러 수행하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 추출 방법.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1 항에 있어서, 상기 추출은 pH 5 내지 8 에서 추출하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 추출방법.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 추출 방법은 (e) 콜라겐 추출단계에서 얻어진 콜라겐 용액을 수거하여 완충액으로 투석하여 효소 반응을 정지시키는 효소 반응 정지단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 추출 방법.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 완충액은 인산나트륨 완충액인 것을 특징으로 하는 콜라겐의 추출 방법.
    
12. 제 10 항에 있어서, 상기 추출 방법은 (f) 효소반응 정지단계를 거쳐 얻어진 용액을 산에 녹인 뒤, 염을 가하여 침전시키고 증류수로 투석하는 투석단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 추출 방법.
    
13. 제 1 항에 있어서, 상기 동물은 조류, 포유류 또는 어류인 것을 특징으로 하는 콜라겐의 추출방법.
    

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