CN105734081A - 具有修饰的免疫球蛋白重链序列的非人类动物 - Google Patents

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Abstract

提供了非人类动物，例如哺乳动物，例如小鼠或大鼠，其包含有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白重链基因座。重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列可以操作性地连接至重链或轻链恒定区核酸序列。还描述了遗传修饰的非人类动物，其包含有包含一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段的免疫球蛋白轻链基因座，所述人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段可以操作性地连接至轻链恒定区核酸序列。还提供了获得编码能够在不存在重链的情况下结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域的核酸序列的方法。

Description

具有修饰的免疫球蛋白重链序列的非人类动物
相关申请的交叉引用
本申请是申请号为201480008721.5、申请日为2014年2月20日、发明名称为“具有修饰的免疫球蛋白重链序列的非人类动物”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2014/017427的国家阶段申请，该国际申请要求申请日分别为2013年2月20日和2013年9月18日，申请号分别为61/766,765和61/879,338的美国申请的优先权。这些专利申请特此以全文引用的方式并入。
序列表
呈文本文件(标题为“1270WO_SL.txt”，2014年2月20日创建，并且大小为87,000字节)形式的序列表以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
遗传修饰的非人类动物，例如啮齿动物，诸如小鼠和大鼠，其包含操作性地连接至恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列(即，重排的重链VDJ序列)。在一些实施方案中，动物经过遗传工程改造以具有包含操作性地连接至免疫球蛋白恒定区基因序列的重排的重链可变区(VDJ序列)核酸序列的免疫球蛋白基因座，其中VDJ序列是人类VDJ序列，并且恒定区基因序列是人类或非人类的。在一些实施方案中，含有遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物包含：(1)编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至轻链(例如，κ或λ轻链)恒定区基因序列；以及(2)编码人类或非人类轻链(例如，κ或λ轻链)可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人类动物包含有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座，其中重排的重链可变域包含经由间隔子操作性地连接至重链J基因区段(JH)序列的重链V基因区段(VH)序列，并且其中间隔子包含至少一个氨基酸残基。提供了遗传修饰的非人类动物，例如啮齿动物，诸如小鼠和大鼠，在其基因组中包含：(i)操作性地连接至恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列；以及(ii)包含一个或多个但小于野生型数目的人类轻链可变区基因区段的免疫球蛋白轻链基因座。提供了遗传修饰的非人类动物，在其基因组中包含：(i)操作性地连接至恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列；以及(ii)包含一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段的免疫球蛋白轻链基因座。在一些实施方案中，可变区基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变区基因区段编码的组氨酸残基。提供了制造本文所描述的遗传修饰的非人类动物的方法。提供了产生可以在不存在重链的情况下结合抗原，和/或可以与重排的重链可变域缔合，和/或展现pH依赖性抗原结合特征的免疫球蛋白轻链(例如，κ或λ轻链)可变区序列的方法，其适用于产生双特异性抗体。
背景技术
双特异性抗体是多功能抗体，其包含可以结合两个不同的抗原决定子的抗原结合位点并且已经成为用于治疗包括癌症的许多疾病的主要治疗用生物制品之一。虽然最近已经开发了具有双重抗原结合特性的多种双特异性抗体，但常规双特异性抗体中的免疫球蛋白轻链或重链可变域的特异性和亲和力必须在一定程度上被牺牲，这是因为在常规双特异性抗体中仅重链或轻链可变域有助于结合至每个抗原决定子，而在普通抗体中轻链与重链可变区都可以有助于结合至同一抗原决定子。另外，在达成所需水平的功效方面，治疗性抗体，例如双特异性治疗性抗体，常常需要高剂量或多次剂量的抗体，这归因于其在体内有限的再循环能力。
迄今开发的靶向两个抗原或表位的大多数抗原结合蛋白包含两个抗原结合臂：(i)包含有助于结合至第一抗原或表位的免疫球蛋白重-轻链可变域对的第一抗原结合臂；以及(ii)有助于结合至第二抗原或表位的第二重-轻链可变域对的第二抗原结合臂。这些抗原结合蛋白尽管在整个抗原结合蛋白的情形中是双特异性的，但不一定在每个抗原结合臂内都是双特异性的，这限制了呈多特异性格局的抗原结合蛋白，例如三特异性抗原结合蛋白的用途。如本文所公开，可以采用表达通用重链可变域的非人类动物作为用于制造以抗原结合蛋白的许多不同格局使用的抗原结合蛋白的一般工具。
发明内容
在本领域中需要产生免疫球蛋白轻链可变域序列，其中抗原特异性和亲和力仅仅或主要因免疫球蛋白轻链可变域多样性而产生，和/或仅仅或主要存在于免疫球蛋白轻链可变域多样性中。所述序列将非常适用于设计抗原结合蛋白，例如双特异性抗体，其中每个可变域独立地负责不同的抗原特异性结合。本文所描述的各种方面和实施方案一部分是基于包含由重排的重链可变基因序列(例如，重排的重链VDJ序列)编码的免疫球蛋白重链可变域的遗传修饰的非人类动物可以满足这种需要的惊人发现。编码重排的免疫球蛋白重链可变域(即，通用重链可变域)的非人类动物使抗体多样化机制集中于未重排(即，可多样化)的抗体轻链可变域上。非人类动物包括例如哺乳动物，并且在特定实施方案中包括啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)。
提供了遗传修饰的非人类动物，其在用所关注的抗原刺激后，产生具有仅仅或主要存在于抗体轻链可变域中的抗原结合特异性的抗体。轻链抗体可变域氨基酸和对应的核酸序列可以从由所述遗传修饰的动物产生的抗体中鉴别，并且这些序列可以用于重组抗体或其它抗原结合蛋白中以开发独立于重链可变域(并且以足够的特异性和亲和力)结合抗原决定子的轻链可变域。此外，包含重排的重链可变域(即，包含预先排列的重链可变域基因序列)的遗传修饰的动物的效用可以通过将编码重排的重链可变域的核苷酸序列放置于多种基因组环境中，例如不同免疫球蛋白基因座中来应用。重排的重链可变域基因序列可以被靶向重链基因座或轻链基因座以使得重排的重链可变域序列可以操作性地连接至人类或非人类重链或轻链恒定序列。重排的重链可变域基因序列可以放置在与人类、非人类或混合人类/非人类免疫球蛋白恒定区序列操作性地连接的任何地方。此外，包含编码重排的重链可变域的核苷酸序列的非人类动物可以与免疫球蛋白基因座的额外遗传修饰组合(例如，与包含免疫球蛋白基因座的额外遗传修饰的动物杂交繁育)。举例来说，由靶向轻链基因座的重排的重链可变域基因序列赋予的集中多样化可以与***重链基因座中的轻链可变域基因序列配对，从而产生完全利用所选的基因组环境的时序和多样化(例如，重链基因座的多样化机制)以增加所选的抗体可变基因序列(例如，抗体轻链可变基因序列)的多样性的动物。另外，通过利用具有受限(有限)的轻链可变区基因区段谱系(例如，包含与上文所描述的单个重排的重链序列组合的一个或多个但小于野生型数目的人类VL基因区段的受限数目的轻链可变基因序列)的小鼠，可以产生可以更有效地与免疫球蛋白重链可变域配对的免疫球蛋白轻链可变域。
因此，提供了遗传修饰的非人类动物(例如啮齿动物，诸如小鼠、大鼠或仓鼠)，其包含有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区(即，编码重排的重链可变域的核苷酸序列；即，重排的重链VDJ序列)的免疫球蛋白基因座。
在各种方面，由遗传修饰的非人类动物表达的仅基因组重链可变域编码核酸序列是重排的重链可变域。因此，由遗传修饰的非人类动物产生的抗体重链可变域的多样性极其受限。
在一些实施方案中，提供了遗传修饰的非人类动物，在其基因组中具有已经过遗传修饰以使得其可变区序列基本上由单个重排的人类重链可变区组成的免疫球蛋白基因座。应了解，所述遗传修饰的非人类动物中的不同细胞可能在单个重排的人类重链可变区中并不总是具有完全一致的序列(例如，归因于复制错误、体细胞高频突变或其它机制)，但无论如何，所述遗传修饰的非人类动物与具有未重排的重链可变序列的动物和/或基因组包括多个重链可变区基因区段(例如，多个V、D和/或J区段，特别是如果未重排的话)的动物相比显示抗体重链可变域的显著受限的多样性。
在各种方面，提供了遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座，其包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(即，包含编码重排的重链可变域的核苷酸序列)。在各种方面，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列和其编码的重排的重链可变域来源于人类V、D以及J基因区段。在各种方面，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列和其编码的重排的重链可变域来源于人类VH基因和人类JH区段。在各种方面，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至重链恒定区基因序列。在各种方面，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至轻链恒定区基因序列。在各种方面，遗传修饰的免疫球蛋白基因座存在于非人类动物的种系中。在各种方面，遗传修饰的非人类动物包含能够重排以形成与轻链恒定区基因序列操作性地连接的轻链基因的未重排的轻链可变基因区段的完整补体。在其它方面，遗传修饰的非人类动物包含多个但小于完整补体(即，小于野生型数目)的未重排的轻链可变基因区段。在各种方面，未重排的轻链可变基因区段操作性地连接至重链恒定区基因序列。在特定方面，非人类动物是啮齿动物，例如，小鼠、大鼠或仓鼠。在另一个方面，提供了核酸构建体，其包含如本文所描述的重排的人类免疫球蛋白重链可变区(即，包含编码重排的重链可变域的核苷酸序列；即，预先重排的重链VDJ序列)。
本文公开了具有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白基因座(即，具有包含编码重排的重链可变域的核苷酸序列的免疫球蛋白基因座)的遗传修饰的非人类动物的众多变化。每个变化具有使抗体多样化机制集中于免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列上的能力。
在各种方面，编码重排的重链可变域(即，由重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码的重链可变域)的核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类重链恒定区基因序列(例如，编码选自IgM、IgD、IgA、IgE、IgG以及其组合的免疫球蛋白同型的重链恒定区基因序列)。举例来说，提供了遗传修饰的非人类动物，其包含免疫球蛋白基因座，其中：(a)第一核苷酸序列编码重排的重链可变域(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类(或混合人类/非人类)重链恒定区基因序列；以及(b)第二核苷酸序列编码轻链可变域(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类轻链恒定区基因序列。
在另一个方面，提供了修饰的非人类动物，其中这些动物包含编码重链可变域的重排的核苷酸序列，其中重链可变域包含经由间隔子操作性地连接至重链J区段(JH)序列的重链可变(VH)序列，其中间隔子编码至少一个氨基酸残基。
在另一个方面，提供了非人类动物，其包含有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(即，包含编码重排的重链可变域的核酸序列；即，重排的重链VDJ序列)的遗传修饰的免疫球蛋白基因座，其中遗传修饰的免疫球蛋白基因座存在于非人类动物的种系中。在一些实施方案中，遗传修饰的免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一些实施方案中，遗传修饰的免疫球蛋白基因座是轻链基因座。
在另一个方面，提供了遗传修饰的非人类动物(例如啮齿动物，诸如小鼠、大鼠或仓鼠)，其具有重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的遗传修饰的免疫球蛋白基因组基因座，其中这种核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类轻链(例如，κ或λ轻链)恒定区基因序列。
在另一个方面，提供了包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物，其包含：(a)操作性地连接至轻链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列；以及(b)操作性地连接至人类或非人类重链恒定区基因序列(例如，编码选自IgM、IgD、IgA、IgE、IgG以及其组合的免疫球蛋白同型的重链恒定区基因序列)的未重排的人类或非人类轻链(例如，κ或λ轻链)可变区核苷酸序列。
在另一个方面，提供了遗传修饰的非人类动物，其具有包含以下的免疫球蛋白基因座：
(a)第一等位基因，其包含：
(i)操作性地连接至重链恒定区基因序列的编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，以及
(ii)操作性地连接至轻链恒定区基因序列的编码轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的情况下)；以及
(b)第二等位基因，其包含：
(i)操作性地连接至重链恒定区基因序列的编码轻链可变域的第三核苷酸序列(即，在第三核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的情况下)，以及
(ii)操作性地连接至轻链恒定区基因序列的编码重排的重链可变域的第四核苷酸序列(即，在第四核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)。
在各种方面，提供了具有未重排的轻链可变区基因序列或基因座的遗传修饰的非人类动物。在一些实施方案中，遗传修饰的非人类动物包含野生型数目(即，所有或实质上所有)的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(即，序列)。在其它方面，本文所描述的非人类动物包含轻链可变基因区段的有限谱系，例如，(i)一个、两个或更多个但小于野生型数目的人类VL基因区段；以及(ii)操作性地连接至非人类轻链恒定区核酸序列的一个或多个人类JL基因区段。重链核酸序列和/或轻链区段可以存在于例如转基因中或内源免疫球蛋白基因座处。
在各种方面，提供了遗传修饰的非人类动物，其中动物的所有免疫球蛋白重链可变域来源于相同的重排的可变重链基因序列，并且其中所述可变域与来源于至少一个、两个或三个或更多个VL基因区段和至少一个、两个或三个或更多个JL基因区段之一的轻链可变域同源表达。另外，提供了遗传修饰的非人类动物(例如啮齿动物，诸如小鼠和大鼠)，在其基因组中包含：(i)包含操作性地连接至人类或非人类重链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列的免疫球蛋白重链基因座；以及(ii)包含操作性地连接至人类或非人类轻链恒定区核酸序列的一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(例如，两个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段)的免疫球蛋白轻链基因座。在一些实施方案中，轻链恒定区是大鼠或小鼠恒定区，例如，大鼠或小鼠Cκ恒定区。
在另一个方面，如本文所描述的遗传修饰的非人类动物在用所关注的抗原刺激后，表达包含免疫球蛋白重链和轻链氨基酸序列的抗原结合蛋白，其中重链氨基酸序列来源于包含操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列的遗传修饰的重链基因座。在某些方面，轻链氨基酸序列来源于包含以下的遗传修饰的免疫球蛋白轻链基因座：一个或多个但小于野生型数目的人类VL基因区段，以及(ii)操作性地连接至非人类轻链恒定区核酸序列的两个或更多个人类JL基因区段。
提供了遗传修饰的非人类动物，在其基因组中包含有包含经由间隔子操作性地连接至重链J基因区段(JH)序列的重链V基因区段(VH)的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列，其中间隔子编码至少一个氨基酸(例如，2个氨基酸、3个氨基酸或4个氨基酸)和/或修饰的D基因区段。在各种实施方案中，重排的重链可变区核酸序列操作性地连接至人类或非人类重链恒定区核酸序列。在各种实施方案中，非人类动物在其基因组中进一步包含有包含操作性地连接至人类或非人类轻链恒定区核酸序列的一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段，例如两个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的遗传修饰的免疫球蛋白轻链基因座。
还提供了制造和使用本文所描述的遗传修饰的非人类动物的方法。提供了将与免疫球蛋白重链或轻链恒定区核酸序列操作性地连接的重排的人类重链可变区核酸序列放置于非人类动物的基因组中的方法。
在另一个方面，提供了获得能够独立于重链可变区氨基酸序列结合抗原的免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列的方法。
在另一个方面，提供了可通过如本文所描述的方法中的任一者获得的遗传修饰的免疫球蛋白基因座。
在各种方面，提供了由本文所描述的遗传修饰的非人类动物产生或来源于本文所描述的遗传修饰的非人类动物的抗原结合蛋白(例如，抗体)。还提供了制造抗原结合蛋白，包括多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗原结合蛋白的方法。还提供了制造效应子轻链免疫球蛋白可变域的方法。
在另一个方面，提供了来源于包含本文所描述的各种基因组修饰的非人类动物的多能细胞、诱导多能、或全能干细胞。还提供了包含含有如本文所描述的遗传修饰的细胞核的细胞，例如，通过原核注射引入细胞中的修饰。
在各种方面，提供了包含细胞的非人类动物胚胎，这种细胞的基因组包含有包含操作性地连接至恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列的免疫球蛋白重链基因座。在某些方面，非人类动物胚胎进一步包含有包含操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段的免疫球蛋白轻链基因座。
还提供了制造编码能够独立于重链可变域结合抗原或其表位的免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列的核酸序列的方法，其包括：(a)用所关注的抗原或其免疫原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列，以及(ii)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核酸序列；(b)允许非人类动物发动免疫反应；(c)从免疫的非人类动物中分离包含编码可以结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞；以及(d)从这种细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。在各种实施方案中，细胞是淋巴细胞，包括(但不限于)天然杀伤细胞、T细胞以及B细胞。在各种实施方案中，这种方法进一步包括(c)'使淋巴细胞与癌细胞，例如骨髓瘤细胞融合。
还提供了制造编码能够独立于重链可变域结合抗原或其表位的免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列的核酸序列的方法，其包括：(a)用所关注的抗原或其免疫原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列，以及(ii)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；(c)从免疫的非人类动物中分离包含编码可以结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞；以及(d)从这种细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。在各种实施方案中，细胞是淋巴细胞，包括(但不限于)天然杀伤细胞、T细胞以及B细胞。在各种实施方案中，这种方法进一步包括(c)'使淋巴细胞与癌细胞，例如骨髓瘤细胞融合。
还提供了制造编码能够独立于重链可变域结合抗原或其表位的免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列的核酸序列的方法，其包括：(a)用所关注的抗原或其免疫原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：(i)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列，以及(ii)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；(c)从免疫的非人类动物中分离包含编码可以结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞；以及(d)从这种细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。在各种实施方案中，细胞是淋巴细胞，包括(但不限于)天然杀伤细胞、T细胞以及B细胞。在各种实施方案中，这种方法进一步包括(c)'使淋巴细胞与癌细胞，例如骨髓瘤细胞融合。
还提供了制造抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列，以及(ii)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核酸序列；
(b)允许非人类动物对第一表位或其免疫原性部分发动免疫反应；
(c)从非人类动物中分离包含编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列的细胞；
(d)从(c)的细胞获得编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列；
(e)在表达构建体中采用(c)的核酸序列，融合至人类免疫球蛋白恒定区核酸序列；以及
(f)在表达特异性地结合第二抗原或其表位的人类免疫球蛋白重链的生产细胞系中表达(c)的核酸序列以形成抗原结合蛋白，其轻链由(c)的核酸编码并且独立于重链结合第一表位或其免疫原性部分，并且其重链特异性地结合第二抗原或表位。
还提供了制造抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列，以及(ii)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物对第一表位或其免疫原性部分发动免疫反应；
(c)从非人类动物中分离包含编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列的细胞；
(d)从(c)的细胞获得编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列；
(e)在表达构建体中采用(c)的核酸序列，融合至人类免疫球蛋白恒定区核酸序列；以及
(f)在表达特异性地结合第二抗原或其表位的人类免疫球蛋白重链的生产细胞系中表达(c)的核酸序列以形成抗原结合蛋白，其轻链由(c)的核酸编码并且独立于重链结合第一表位或其免疫原性部分，并且其重链特异性地结合第二抗原或表位。
还提供了制造抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：(i)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列，以及(ii)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物对第一表位或其免疫原性部分发动免疫反应；
(c)从非人类动物中分离包含编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列的细胞；
(d)从(c)的细胞获得编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列；
(e)在表达构建体中采用(c)的核酸序列，融合至人类免疫球蛋白恒定区核酸序列；以及
(f)在表达特异性地结合第二抗原或其表位的人类免疫球蛋白重链的生产细胞系中表达(c)的核酸序列以形成抗原结合蛋白，其轻链由(c)的核酸编码并且独立于重链结合第一表位或其免疫原性部分，并且其重链特异性地结合第二抗原或表位。
在各种方面，提供了非人类动物，在其种系基因组中包含有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白重链基因座。在一些实施方案中，非人类动物是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自由小鼠、大鼠以及仓鼠组成的群组。在一些实施方案中，非人类动物对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列而言是纯合的。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至非人类重链恒定区基因序列。在某些实施方案中，非人类重链恒定区基因序列编码Fc。在特定实施方案中，非人类重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人类动物是啮齿动物，并且重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类重链恒定区基因序列。在特定实施方案中，重链恒定区基因序列选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列来源于人类重链VH基因区段、人类重链D基因区段以及人类重链JH基因区段。在某些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列来源于人类种系重链VH区段、人类种系重链D区段以及人类种系重链JH区段。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码人类VH3-23/GY/JH4-4的序列。在一些实施方案中，实质上所有内源功能性VH、D以及JH基因区段从非人类动物的免疫球蛋白重链基因座缺失或促使无功能。在一些实施方案中，非人类动物包含使内源功能性VH、D以及JH基因区段缺失或促使其无功能的修饰；并且非人类动物包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列异位存在。在一些实施方案中，由重排的重链可变区核苷酸序列编码的免疫球蛋白重链可变域对非人类动物没有免疫原性。在一些实施方案中，非人类动物包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者。在一些实施方案中，非人类动物进一步包含编码未重排的人类免疫球蛋白轻链(VL)基因区段和未重排的人类免疫球蛋白轻链J基因区段的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码未重排的轻链V基因区段(VL)和未重排的轻链(JL)基因区段的核苷酸序列操作性地连接至免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在特定实施方案中，轻链恒定区基因序列选自啮齿动物和人类恒定区基因序列。在更特定的实施方案中，啮齿动物选自小鼠、大鼠以及仓鼠。在某些实施方案中，未重排的人类免疫球蛋白轻链(VL)基因区段和未重排的人类免疫球蛋白(JL)基因区段在内源啮齿动物基因座处操作性地连接至啮齿动物免疫球蛋白恒定区基因序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链基因座包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
在额外方面，提供了在非人类生殖细胞的基因组中的非人类免疫球蛋白重链基因座，其包含操作性地连接至重链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中恒定区基因序列包含非人类序列、人类序列或其组合。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至内源非人类免疫球蛋白恒定区基因序列。在某些实施方案中，内源非人类免疫球蛋白恒定区基因序列是小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。
在额外方面，提供了制造非人类动物的方法，这些方法包括：
(a)修饰非人类动物的基因组以使内源功能性免疫球蛋白重链VH、D以及JH基因区段缺失或促使其无功能；以及
(b)在基因组中放置重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在某些实施方案中，非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，将重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列放置于基因组中的内源免疫球蛋白重链基因座处。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列存在于非人类动物的种系基因组中。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列存在于基因组中的异位基因座处。在一些实施方案中，非人类动物包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。在一些实施方案中，非人类动物包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者。在一些实施方案中，非人类动物是选自由小鼠、大鼠或仓鼠组成的群组的啮齿动物。在一些实施方案中，提供了对于如本文所描述的免疫球蛋白重链基因座而言杂合的非人类动物，其中非人类动物表达主要来自免疫球蛋白重链基因座的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列。
在额外方面，提供了非人类动物，其包含有包含以下的遗传修饰的免疫球蛋白基因座：
(a)操作性地连接至轻链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列；以及
(b)操作性地连接至重链恒定区基因序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，非人类动物是哺乳动物。在特定实施方案中，哺乳动物选自由小鼠、大鼠以及仓鼠组成的群组。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是小鼠或大鼠轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是人类轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列是人类重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列编码选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的序列。在一些实施方案中，未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含人类κ轻链可变域基因序列。在一些实施方案中，未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含人类λ轻链可变域基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列来源于人类重链VH基因区段、人类重链D基因区段以及人类重链JH基因区段。在某些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列来源于人类种系重链VH区段、人类种系重链D区段以及人类种系重链JH区段。在某些实施方案中，人类VH基因区段选自由以下组成的群组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81，以及其多态变体。在某些实施方案中，人类D基因区段选自由以下组成的群组：D1-1、D1-7、D1-14、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-12、D5-5、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D6-25、D7-27，以及其多态变体。在某些实施方案中，人类JH基因区段选自由以下组成的群组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6，以及其多态变体。在一些实施方案中，其中重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码人类VH3-23/GY/JH4-4的序列(SEQIDNO:137)。在一些实施方案中，遗传修饰的免疫球蛋白基因座存在于非人类动物的种系中。在一些实施方案中，实质上所有内源功能性VH、D以及JH基因区段从非人类动物的免疫球蛋白重链基因座缺失或促使无功能。在一些实施方案中，非人类动物包含使内源功能性VH、D以及JH基因区段缺失或促使其无功能的修饰；并且非人类动物包含操作性地连接至轻链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列存在于基因组中的异位基因座处。在一些实施方案中，非人类动物包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者。在一些实施方案中，由重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码的重链可变域对非人类动物没有免疫原性。在一些实施方案中，遗传修饰的免疫球蛋白基因座包含操作性地连接至轻链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
额外方面提供了在非人类动物的种系基因组中的免疫球蛋白基因座，其包含：
(1)操作性地连接至轻链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，以及
(2)操作性地连接至重链恒定区基因序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是小鼠或大鼠轻链恒定区基因序列。
额外方面提供了制造包含修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，这些方法包括：
(a)修饰非人类动物的基因组以使下列区段缺失或促使其无功能：
(i)内源功能性免疫球蛋白重链V、D以及J基因区段，以及
(ii)内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及
(b)在基因组中放置：
(i)操作性地连接至轻链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，以及
(ii)操作性地连接至重链恒定区基因序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列编码κ轻链可变域。在一些实施方案中，未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列编码λ轻链可变域。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列是非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在某些实施方案中，非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在特定实施方案中，重链恒定区基因序列编码选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的序列。在一些实施方案中，非人类动物是选自由小鼠、大鼠或仓鼠组成的群组的啮齿动物。在一些实施方案中，修饰的免疫球蛋白基因座存在于非人类动物的种系基因组中。在一些实施方案中，非人类动物包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者。
还提供了包含修饰的免疫球蛋白重链基因座的非人类动物，这种修饰的免疫球蛋白重链基因座包含有包含经由间隔子操作性地连接至重链J区段(JH)序列的重链V区段(VH)序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中间隔子包含至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，非人类动物是啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自由小鼠、大鼠以及仓鼠组成的群组。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至非人类重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人类重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类重链恒定区基因序列。在某些实施方案中，重链恒定区基因序列编码选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的序列。在一些实施方案中，VH序列和JH序列来源于人类VH基因区段和人类JH基因区段。在某些实施方案中，其中人类VH基因区段选自由以下组成的群组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81，以及其多态变体。在特定实施方案中，人类VH基因区段是VH3-23或其多态变体。在一些实施方案中，间隔子编码来源于人类D基因区段的序列。在特定实施方案中，人类D基因区段选自由以下组成的群组：D1-1、D1-7、D1-14、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-12、D5-5、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D6-25、D7-27，以及其多态变体。在特定实施方案中，间隔子编码D4-4的序列或其多态变体。在某些实施方案中，人类JH基因区段选自由以下组成的群组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6，以及其多态变体。在某些实施方案中，人类JH区段是JH4-4或其多态变体。在一些实施方案中，重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码人类VH3-23/GY/JH4-4的序列(SEQIDNO:137)。在一些实施方案中，实质上所有内源功能性VH、D以及JH基因区段从非人类动物的免疫球蛋白重链可变基因座缺失或促使无功能。在一些实施方案中，非人类动物包含使内源功能性VH、D以及JH基因区段缺失或促使其无功能的修饰；并且非人类动物在其基因组的异位基因座处包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，由重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码的重链可变域对非人类动物没有免疫原性。在一些实施方案中，非人类动物包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者。
额外方面提供了在非人类动物的种系基因组中的免疫球蛋白重链基因座，其包含有包含经由间隔子操作性地连接至重链J基因区段(JH)的重链可变基因区段(VH)的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中间隔子编码至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至非人类重链恒定区基因序列。在某些实施方案中，非人类重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白基因座包含重排的重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
在额外方面，提供了制造包含修饰的免疫球蛋白重链基因座的非人类动物的方法，这些方法包括：
(a)修饰非人类动物的基因组以使内源功能性免疫球蛋白重链VH、D以及JH基因区段缺失或促使其无功能；以及
(b)在基因组中放置重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，这种重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列包含经由间隔子操作性地连接至重链J基因区段(JH)的重链可变基因区段(VH)，其中间隔子包含至少一个氨基酸残基。
在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链核苷酸序列操作性地连接至非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在某些实施方案中，非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，将重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列放置于基因组中的内源免疫球蛋白重链基因座处。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列存在于基因组中的异位基因座处。在一些实施方案中，修饰的重链基因座包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。在一些实施方案中，非人类动物是选自由小鼠、大鼠或仓鼠组成的群组的啮齿动物。在一些实施方案中，非人类动物包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者。在一些实施方案中，修饰的免疫球蛋白重链基因座存在于非人类动物的种系基因组中。
额外方面提供了修饰的非人类动物，在其基因组中包含：
(a)包含操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列的免疫球蛋白重链基因座；以及
(b)包含操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段的免疫球蛋白轻链基因座。
在一些实施方案中，非人类动物是哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是啮齿动物。在特定实施方案中，啮齿动物选自由小鼠、大鼠以及仓鼠组成的群组。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列是编码选自IgM、IgD、IgG、IgE、IgA以及其组合的免疫球蛋白同型的啮齿动物恒定区序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是啮齿动物κ或λ恒定区核酸序列。在一些实施方案中，重排的人类重链可变区核酸序列选自人类种系VH区段、人类种系D区段以及人类种系JH区段。在一些实施方案中，重排的人类重链可变区核酸序列在内源基因座处操作性地连接至恒定区核酸序列。在一些实施方案中，一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段在内源基因座处操作性地连接至轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人类动物包含不超过两个人类免疫球蛋白未重排VL基因区段，以及一个、两个或三个或更多个人类未重排JL基因区段。在一些实施方案中，重排的重链可变区核酸序列来源于选自由以下组成的群组的人类种系VH基因区段：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81，以及其多态变体。在某些中，重排的重链可变区核酸序列来源于人类种系VH3-23基因区段。在一些实施方案中，重排的重链可变区核酸序列编码人类VH3-23/GY/JH4-4的序列(SEQIDNO:137)。在一些实施方案中，重排的重链可变区核酸序列编码VH3-23/X1X2/J的序列，其中X1是任何氨基酸，并且X2是任何氨基酸。在某些实施方案中，X1是Gly并且X2是Tyr。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链基因座包含功能性Adam6a基因、Adam6b基因或两者。在某些实施方案中，Adam6a基因、Adam6b基因或两者是内源Adam6基因。在一些实施方案中，遗传修饰的非人类动物在基因组的异位基因座处包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者。在一些实施方案中，人类可变区VL和JL基因区段能够重排并编码人类免疫球蛋白轻链可变域。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座包含两个人类VL基因区段Vκ1-39和Vκ3-20。在某些实施方案中，这些基因区段是种系基因区段。在某些实施方案中，非人类动物包含Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4以及Jκ5基因区段。在一些实施方案中，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个人类VL基因区段和两个或更多个人类JL基因区段存在于内源轻链基因座处。在一些实施方案中，人类轻链VL或JL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。在一些实施方案中，VL基因区段中的至少一者包含添加组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代至少一个由对应的人类种系VL区段序列编码的非组氨酸密码子。在某些实施方案中，添加或取代的组氨酸密码子存在于CDR3中。在一些实施方案中，人类VL基因区段是人类Vκ1-39和Vκ3-20基因区段，并且人类Vκ1-39和Vκ3-20基因区段中的每一者包含用组氨酸密码子取代至少一个由对应的人类种系VL基因区段编码的非组氨酸密码子。在某些实施方案中，取代是人类Vκ1-39基因区段的三个非组氨酸密码子的取代，其中这种取代经过设计以表达位置106、108以及111处的组氨酸。在特定实施方案中，取代是人类Vκ1-39基因区段的四个非组氨酸密码子的取代，并且这种取代经过设计以表达位置105、106、108以及111处的组氨酸。在特定实施方案中，取代是人类Vκ3-20基因区段的三个非组氨酸密码子的取代，并且这种取代经过设计以表达位置105、106以及109处的组氨酸。在特定实施方案中，取代是人类Vκ3-20基因区段的四个非组氨酸密码子的取代，并且这种取代经过设计以表达位置105、106、107以及109处的组氨酸。在一些实施方案中，如权利要求107所述的非人类动物，其中非人类动物在用所关注的抗原刺激后，表达特异性地结合抗原的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白包含来源于人类VL和JL基因区段的氨基酸序列，并且其中抗原结合蛋白在由人类VL基因区段编码的氨基酸位置处包含至少一个组氨酸残基。在一些实施方案中，非人类动物表达对抗原起反应的抗原结合蛋白的群体，其中这个群体中的所有抗原结合蛋白包含：(a)包含来源于重排的人类可变区核酸序列的人类重链可变域的免疫球蛋白重链；以及(b)包含来源于人类VL基因区段和JL基因区段在非人类动物的基因组中的重排的免疫球蛋白轻链可变域的免疫球蛋白轻链，并且其中人类VL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系VL基因区段编码的组氨酸密码子。
额外方面提供了制造包含修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其包括：
(a)修饰非人类动物的基因组以使下列区段缺失或促使其无功能：
(i)内源功能性免疫球蛋白重链VH、D和/或JH基因区段，以及
(ii)内源功能性免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段；以及
(b)在非人类动物的修饰的基因组中放置：
(i)操作性地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列；以及
(ii)操作性地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段。
在一些实施方案中，非人类动物是啮齿动物。在某些实施方案中，啮齿动物是小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列操作性地连接至选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，将重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列以及人类免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段放置于野生型非人类动物的对应的核苷酸序列处或附近。在一些实施方案中，将重排的免疫球蛋白人类重链可变区核酸序列以及人类免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段放置于基因组中的异位基因座处。在一些实施方案中，非人类动物包含有包含内源Adam6a基因、Adam6b基因或两者的免疫球蛋白重链基因座。在一些实施方案中，非人类动物在基因组的异位基因座处包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列编码人类VH3-23/GY/JH4-4的序列(SEQIDNO:137)。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列是大鼠或小鼠Cκ恒定区核酸序列。在一些实施方案中，人类免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段能够重排并编码人类免疫球蛋白轻链可变域。在一些实施方案中，非人类动物包含有包含两个人类VL基因区段Vκ1-39和Vκ3-20的免疫球蛋白轻链基因座。在某些实施方案中，非人类动物包含Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4以及Jκ5基因区段。在一些实施方案中，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个人类VL基因区段和两个或更多个人类JL基因区段存在于内源轻链基因座处。在一些实施方案中，人类免疫球蛋白轻链VL或JL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。在一些实施方案中，VL基因区段中的至少一者包含添加组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代至少一个由对应的人类种系VL区段序列编码的非组氨酸密码子。在某些实施方案中，添加或取代的组氨酸密码子存在于CDR3中。在某些实施方案中，人类VL基因区段是人类Vκ1-39和Vκ3-20基因区段，并且人类Vκ1-39和Vκ3-20基因区段中的每一者包含用组氨酸密码子取代至少一个由对应的人类种系VL基因区段编码的非组氨酸密码子。在特定实施方案中，取代是人类Vκ1-39基因区段的三个非组氨酸密码子的取代，并且其中这种取代经过设计以表达位置106、108以及111处的组氨酸。在特定实施方案中，取代是人类Vκ1-39基因区段的四个非组氨酸密码子的取代，并且其中这种取代经过设计以表达位置105、106、108以及111处的组氨酸。在特定实施方案中，取代是人类Vκ3-20基因区段的三个非组氨酸密码子的取代，并且其中这种取代经过设计以表达位置105、106以及109处的组氨酸。在特定实施方案中，取代是人类Vκ3-20基因区段的四个非组氨酸密码子的取代，并且这种取代经过设计以表达位置105、106、107以及109处的组氨酸。
额外方面提供了获得编码能够独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域(VL)的核酸序列的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原或其免疫原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列；以及(ii)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物中分离包含编码可以结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞；以及
(d)从这种细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。
在一些实施方案中，分离步骤(c)是经由荧光活化细胞分选(FACS)或流式细胞测量术来进行。在一些实施方案中，包含编码结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞是淋巴细胞。在某些实施方案中，淋巴细胞包括天然杀伤细胞、T细胞或B细胞。在一些实施方案中，这种方法进一步包括(c)'使淋巴细胞与癌细胞融合的步骤。在某些实施方案中，癌细胞是骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，使(d)的核酸序列与编码免疫球蛋白恒定区核酸序列的核酸序列融合。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是人类κ序列或人类λ序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列是选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的人类序列。在一些实施方案中，(d)的核酸序列包含来源于动物的基因组中的未重排的VL基因区段的一个或多个组氨酸密码子取代或***。
额外方面提供了制造包含可以独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域的抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使遗传修饰的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：
(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列；以及
(ii)操作性地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物对第一表位或其免疫原性部分发动免疫反应；
(c)从非人类动物中分离包含编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列的细胞；
(d)从(c)的细胞获得编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列；
(e)在表达构建体中采用(d)的核酸序列，融合至人类免疫球蛋白恒定区核酸序列；以及
(f)在表达特异性地结合第二抗原或表位的人类免疫球蛋白重链的生产细胞系中表达(d)的核酸序列以形成抗原结合蛋白，其轻链由(d)的核酸编码并且独立于重链结合第一表位或其免疫原性部分，并且其重链特异性地结合第二抗原或表位。
在一些实施方案中，人类轻链VL或JL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。在一些实施方案中，第一表位来源于细胞表面受体。在特定实施方案中，细胞表面受体是Fc受体。在更特定的实施方案中，Fc受体是FcRn。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于可溶性抗原。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于细胞表面受体。在一些实施方案中，第一抗原是Fc受体，第二抗原是可溶性蛋白质，并且抗原结合蛋白包含来源于非人类动物的基因组中的VL基因区段的一个或多个组氨酸取代和***。
额外方面提供了获得编码能够独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域(VL)的核酸序列的方法，其包括：
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列，以及(ii)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核酸序列；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物中分离包含编码可以结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞；以及
(d)从这种细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。
在一些实施方案中，分离步骤(c)是经由荧光活化细胞分选(FACS)或流式细胞测量术来进行。在一些实施方案中，包含编码结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞是淋巴细胞。在某些实施方案中，淋巴细胞包括天然杀伤细胞、T细胞或B细胞。在一些实施方案中，这种方法进一步包括：(c)'使淋巴细胞与癌细胞融合。在某些实施方案中，癌细胞是骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，使(d)的核酸序列与编码免疫球蛋白恒定区核酸序列的核酸序列融合。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是人类κ序列或人类λ序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列是选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的人类序列。在一些实施方案中，(d)的核酸序列包含来源于动物的基因组中的未重排的VL基因区段的一个或多个组氨酸密码子取代或***。
额外方面提供了获得编码能够独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域(VL)的核酸序列的方法，其包括：
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：(i)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列，以及(ii)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物中分离包含编码可以结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞；以及
(d)从这种细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。
在一些实施方案中，分离步骤(c)是经由荧光活化细胞分选(FACS)或流式细胞测量术来进行。在一些实施方案中，包含编码结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞是淋巴细胞。在某些实施方案中，淋巴细胞包括天然杀伤细胞、T细胞或B细胞。在一些实施方案中，这种方法进一步包括：(c)'使淋巴细胞与癌细胞融合。在某些实施方案中，癌细胞是骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，使(d)的核酸序列与编码免疫球蛋白恒定区核酸序列的核酸序列融合。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是人类κ序列或人类λ序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列是选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的人类序列。在一些实施方案中，(d)的核酸序列包含来源于动物的基因组中的未重排的VL基因区段的一个或多个组氨酸密码子取代或***。
额外方面提供了制造包含可以独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域的抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使遗传修饰的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：
(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列；以及
(ii)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物对第一表位或其免疫原性部分发动免疫反应；
(c)从非人类动物中分离包含编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列的细胞；
(d)从(c)的细胞获得编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列；
(e)在表达构建体中采用(d)的核酸序列，融合至人类免疫球蛋白恒定区核酸序列；以及
(f)在表达特异性地结合第二抗原或表位的人类免疫球蛋白重链的生产细胞系中表达(d)的核酸序列以形成抗原结合蛋白，其轻链由(d)的核酸编码并且独立于重链结合第一表位或其免疫原性部分，并且其重链特异性地结合第二抗原或表位。
在一些实施方案中，人类轻链VL或JL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。在一些实施方案中，第一表位来源于细胞表面受体。在某些实施方案中，细胞表面受体是Fc受体。在特定实施方案中，Fc受体是FcRn。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于可溶性抗原。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于细胞表面受体。在一些实施方案中，第一抗原是Fc受体，第二抗原是可溶性蛋白质，并且抗原结合蛋白包含来源于非人类动物的基因组中的VL基因区段的一个或多个组氨酸取代和***。
额外方面提供了制造包含可以独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域的抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使遗传修饰的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：
(i)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列；以及
(ii)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物对第一表位或其免疫原性部分发动免疫反应；
(c)从非人类动物中分离包含编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列的细胞；
(d)从(c)的细胞获得编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列；
(e)在表达构建体中采用(d)的核酸序列，融合至人类免疫球蛋白恒定区核酸序列；以及
(f)在表达特异性地结合第二抗原或表位的人类免疫球蛋白重链的生产细胞系中表达(d)的核酸序列以形成抗原结合蛋白，其轻链由(d)的核酸编码并且独立于重链结合第一表位或其免疫原性部分，并且其重链特异性地结合第二抗原或表位。
在一些实施方案中，人类轻链VL或JL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。在一些实施方案中，第一表位来源于细胞表面受体。在某些实施方案中，细胞表面受体是Fc受体。在特定实施方案中，Fc受体是FcRn。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于可溶性抗原。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于细胞表面受体。在一些实施方案中，第一抗原是Fc受体，第二抗原是可溶性蛋白质，并且抗原结合蛋白包含来源于非人类动物的基因组中的VL基因区段的一个或多个组氨酸取代和***。
附图说明
图1图解了用于构建重排的重链可变域微小基因座(“UHC微小基因座”)的流程，这种微小基因座包含操作性地连接至人类VH3-23启动子(SEQIDNO:139)的重排的人类免疫球蛋白可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4；SEQIDNO:136)和JH4的内含子(SEQIDNO:140)。UHC微小基因座的5'和3'侧接有小鼠同源臂。在步骤1(I-CeuI/SpeI接合(Amp+Spec))中，将壮观霉素选择盒引入介于I-CeuI与SpeI位点之间的启动子上游以产生pJSh0038(UHC微小基因座)。
图2图解了用于(A)将潮霉素选择盒(EM7-HYG)靶向MAID1115BAC克隆体(2.BHR(Hyg+Kan))的5'端；以及(B)将UHC微小基因座(pJSh0038)靶向VI432BAC克隆体(3.BHR(Spec+Hyg))中的IgM基因座上游的流程。
图3图解了用于(A)将包含氯霉素盒的pDBa0049构建体靶向VI421克隆体的3'端，VI421克隆体从5'至3'包含Adam6a基因(在3'至5'方向上存在)；侧接有FRT位点的新霉素盒(在3'至5'方向上存在)；Adam6b基因(在3'至5'方向上存在)；基因间控制区1(IGCR1；关键V(D)J重组调控区)；以及壮观霉素盒(在5'至3'方向上存在)(4.BHR(Cm+Kan))；以及(B)经由限制消化和接合(5.I-CeuI/AscI接合(Hyg+Kan))将含有Adam6a和6b基因的VI444BAC克隆体的基因组基因座靶向介于I-CeuI与AscI位点之间的VI443BAC克隆体的通用重链(UHC)基因组基因座上游的流程。
图4图解了用于(A)将最终构建体(MAID6031BACDNA)靶向从1661杂合小鼠中分离的ES细胞的流程；并且示出了(B)筛选试验中所用的探针和引物的基因组位置。
图5示出了在RegeneronPharmaceuticals的ASAP数据库中含有类似于UHCCDR3序列(AKDYSNYYFDY；SEQIDNO:143)的CDR3序列的抗体的列表。
图6图解了6031细菌人工染色体(BAC)DNA和6031杂合ES细胞的基因组构造，以及筛选试验中所用的引物和探针的基因组位置。
图7示出了在筛选试验中用于确认等位基因(LOA)的损失、等位基因(GOA)的增加、或亲本等位基因(亲本)的引物和探针的列表。
图8示出了筛选试验中所用的引物和探针的序列。
图9图解了遗传修饰的F0小鼠的免疫球蛋白重链基因座的基因组结构，其含有靶向的等位基因的一个拷贝(包括Adam6a/6b基因和重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(hVH3-23(D)JH4)。(A)MAID6031het：具有选择盒的包含遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座的杂合F0小鼠；(B)MAID6032het：没有选择盒的包含遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座的杂合F0小鼠。
图10示出了从野生型或6032杂合小鼠中分离的骨髓细胞的荧光活化细胞分选(FACS)分析的结果。上图：将从野生型或F06032杂合小鼠中分离的骨髓细胞在单管上设门并且基于CD19表达(B细胞标志物)和CD3表达(T细胞标志物)进行分选。下图：将CD19+设门的B细胞基于IgMb抗体(从野生型等位基因；B6等位基因产生的抗体)或IgMa抗体(从编码重排的重链可变域(hVH3-23(D)JH4)的遗传修饰的等位基因(129等位基因)产生的抗体)的存在进行分选。
图11示出了从野生型或6032杂合小鼠中分离的脾细胞的FACS分析的结果。上图：将从野生型或F06032杂合小鼠中分离的脾细胞在单管上设门并且基于CD19表达(B细胞标志物)和CD3表达(T细胞标志物)进行分选。下图：将CD19+设门的B细胞基于IgMb抗体(从野生型等位基因；B6等位基因产生的抗体)或IgMa抗体(从编码重排的重链可变域(hVH3-23(D)JH4)的遗传修饰的等位基因(129等位基因)产生的抗体)的存在进行分选。
图12示出了从野生型或6032杂合小鼠中分离的血细胞的FACS分析的结果。上图：将从野生型或F06032杂合小鼠中分离的血细胞在单管上设门并且基于CD19表达(B细胞标志物)和CD3表达(T细胞标志物)进行分选。下图：将CD19+设门的B细胞基于IgMb抗体(从野生型等位基因；B6等位基因产生的抗体)或IgMa抗体(从编码重排的重链可变域(hVH3-23(D)JH4)的遗传修饰的等位基因(129等位基因)产生的抗体)的存在进行分选。
图13A示出了从野生型小鼠(WT)和对于重排的人类免疫球蛋白可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠(6032HO)收集的脾中CD19+B细胞、未成熟B细胞(CD19+IgDintIgMhi)和成熟B细胞(CD19+IgMloIgDhi)的总数的FACS分析的结果。上图：将从野生型或F26032纯合小鼠中分离的脾细胞在单管上设门并且基于CD19表达(B细胞标志物)和CD3表达(T细胞标志物)进行分选。下图示出了来自野生型小鼠(WT)和对于重排的重链人类免疫球蛋白可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的在CD19+上设门并且针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)进行染色的脾细胞的代表性等高线图。示出了每个设门区内细胞的百分比。
图13B示出了从野生型(WT)和对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠收集的脾中B细胞(CD19+)、成熟B细胞(CD19+IgDhiIgMlo)和未成熟B细胞(CD19+IgDintIgMhi)的总数。
图13C示出了来自野生型小鼠(WT)和对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠(6032HO)的在CD19+上设门的Igλ+和Igκ+脾细胞的代表性等高线图。
图13D示出了从野生型(WT)和对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠收集的脾中B细胞(CD19+)、Igκ+B细胞(CD19+Igκ+)和Igλ+B细胞(CD19+Igλ+)的总数。
图13E示出了野生型小鼠和对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠中的外周B细胞发育。等高线图的第一列(左边)示出了指示未成熟和成熟B细胞的在CD19+上设门的CD93+和B220+脾细胞。等高线图的第二列(中间)示出了指示T1(IgD-IgM+CD21loCD23-)、T2(IgDhiIgMhiCD21midCD23+)以及T3B细胞群体的未成熟B细胞中的IgM+和CD23+表达。等高线图的第三列(右边)示出了指示产生边缘区B细胞的较小第一群体和产生滤泡(FO)B细胞的第二群体的成熟B细胞的CD21+(CD35+)和IgM+表达。示出了每个设门区内细胞的百分比。
图14A示出了来自野生型小鼠(WT)和对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的针对B和T细胞(分别是CD19+和CD3+)进行染色的骨髓的代表性等高线图。
图14B示出了从野生型小鼠(WT)和对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的股骨中分离的骨髓中细胞的绝对数(左边)、细胞的总数(中间)以及B(CD19+)细胞的总数(右边)。
图14C示出了来自野生型小鼠(WT)和对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的在单管上设门并且针对免疫球蛋白M(IgM)和B220进行染色的骨髓的代表性等高线图。在每个等高线图上标注未成熟、成熟以及原/前B细胞。
图14D示出了从野生型小鼠(WT)和对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的股骨中分离的骨髓中成熟B(B220hiIgM+)和未成熟B(B220intIgM+)细胞的总数。
图14E示出了来自野生型小鼠(WT)和对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的在单管上设门并且针对免疫球蛋白M(IgM)和B220进行染色的骨髓的代表性等高线图。在每个等高线图上标注未成熟、成熟以及原/前B细胞。
图14F示出了从野生型小鼠(WT)和对于重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(VH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的股骨中分离的在未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞上设门并且针对Igκ和Igλ表达进行染色的骨髓的代表性等高线图。
图15示出了在足垫免疫之后第15天和第24天小鼠血清(野生型或6031HETF0和F1)中抗原特异性mIgG的水平。
图16示出了hVH3-23(D4-4_阅读框3)JH6(SEQIDNO:145)的密码子优化的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
图17示出了hVH3-23(D4-4_阅读框2)JH6(SEQIDNO:146)的密码子优化的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
图18示出了hVH3-23(D4-4_阅读框3)JH4(SEQIDNO:147)的密码子优化的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
图19示出了hVH3-23(D4-4_阅读框2)JH4(SEQIDNO:148)的密码子优化的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
图20示出了两个遗传修饰的双轻链(DLC)基因座的实例。上面的基因座(DLC-5J)含有含两个人类Vκ基因区段和五个人类Jκ基因区段的工程改造的人类DNA片段。下面的基因座(DLC-1J)含有含两个人类Vκ基因区段和一个人类Jκ基因区段的工程改造的人类DNA片段。每个基因座能够重排以形成操作性地连接至内源轻链恒定区(例如，Cκ)的人类Vκ区。示出了免疫球蛋白启动子(P，基因座上方的空箭头)、先导外显子(L，短空箭头)以及两个人类Vκ基因区段(长空箭头)，上游(5')全部侧接有含新霉素盒的Frt重组位点。用人类基因区段(Vκ和Jκ)中的每一者进行工程改造的重组信号序列由与每个基因区段并列的空椭圆形指示。在大多数实施方案中，除非另有指示，否则填充的形状和实线代表小鼠序列，并且空的形状和双线代表人类序列。这些图不按比例呈现。
图21A-21C示出了构建靶向载体用于包含两个人类Vκ区段(hVκ1-39和hVκ3-20)和一个人类Jκ区段(Jκ5)以及小鼠增强子和IgκC臂的免疫球蛋白κ基因座的工程改造的一般策略。图21D示出了将这种靶向载体引入ES细胞中并且用上述ES细胞产生杂合小鼠；而图21E示出了使用FLP酶使ES细胞中的选择盒缺失。在大多数实施方案中，除非另有指示，否则填充的形状和实线代表小鼠序列，并且空的形状和双线代表人类序列。这些图不按比例呈现。
图22A-22D示出了包含两个人类Vκ区段(hVκ1-39和hVκ3-20)和一个人类Jκ区段的工程改造的免疫球蛋白κ基因座部分的核苷酸序列(SEQIDNO:82)；这个核苷酸序列跨越工程改造的人类序列并且在5'与3'端都包含内源小鼠序列的100个碱基对。图22D的下部解释了用于描绘各种序列的不同字体。
图23A-23B示出了构建靶向载体用于包含两个人类Vκ区段(hVκ1-39和hVκ3-20)和五个人类Jκ区段以及小鼠增强子和IgκC臂的免疫球蛋白κ基因座的工程改造的一般策略。图23C示出了将这种靶向载体引入ES细胞中并且用上述ES细胞产生杂合小鼠；而图23D示出了使用FLP酶使ES细胞中的选择盒缺失。在大多数实施方案中，除非另有指示，否则填充的形状和实线代表小鼠序列，并且空的形状和双线代表人类序列。这些图不按比例呈现。
图24A-24D示出了包含两个人类Vκ区段(hVκ1-39和hVκ3-20)和五个人类Jκ区段的工程改造的免疫球蛋白κ基因座的核苷酸序列(SEQIDNO:83)；这个核苷酸序列跨越工程改造的序列和5'与3'端的内源小鼠序列的100个碱基对。图24D的下部解释了用于描绘各种序列的不同字体。
图25A在上图中示出了来自野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠的针对B和T细胞(分别是CD19+和CD3+)进行染色的骨髓的代表性等高线图。下图示出了来自野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠的在CD19+上设门并且针对ckit+和CD43+进行染色的骨髓的代表性等高线图。在下图的等高线图上标注原和前B细胞。
图25B示出了从野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠的股骨收集的骨髓中原(CD19+CD43+ckit+)和前(CD19+CD43-ckit-)B细胞的数目。
图26A示出了来自野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠的在单管上设门并且针对免疫球蛋白M(IgM)和B220进行染色的骨髓的代表性等高线图。在每个等高线图上标注未成熟、成熟以及原/前B细胞。
图26B示出了从野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠的股骨中分离的骨髓中B(CD19+)、未成熟B(B220intIgM+)和成熟B(B220hiIgM+)细胞的总数。
图27A示出了来自野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠的在单管上设门并且针对免疫球蛋白M(IgM)和B220进行染色的骨髓的代表性等高线图。在每个等高线图上标注未成熟、成熟以及原/前B细胞。
图27B示出了从野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠的股骨中分离的在未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞上设门并且针对Igκ和Igλ表达进行染色的骨髓的代表性等高线图。
图28A在上图中示出了来自野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠的在单管上设门并且针对B和T细胞(分别是CD19+和CD3+)进行染色的脾细胞的代表性等高线图。下图示出了来自野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠的在CD19+上设门并且针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)进行染色的脾细胞的代表性等高线图。在每个等高线图上标注成熟(对于WT是54，对于DLC-5J是56.9)和过渡(对于WT是23.6，对于DLC-5J是25.6)B细胞。
图28B示出了从野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠收集的脾中CD19+B细胞、过渡B细胞(CD19+IgMhiIgDlo)和成熟B细胞(CD19+IgMloIgDhi)的总数。
图29A示出了来自野生型小鼠(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠的在CD19+上设门的Igλ+和Igκ+脾细胞的代表性等高线图。
图29B示出了从野生型(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠收集的脾中B细胞(CD19+)、Igκ+B细胞(CD19+Igκ+)和Igλ+B细胞(CD19+Igλ+)的总数。
图30A示出了对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠中的外周B细胞发育。第一(最左边)等高线图示出了指示未成熟(39.6)和成熟(57.8)B细胞的在CD19上设门的CD93+和B220+脾细胞。第二(中上)等高线图示出了指示T1(33.7；IgD-IgM+CD21loCD23-)、T2(21.2；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)以及T3(29.1)B细胞群体的未成熟B细胞中的IgM+和CD23+表达。第三(中下)等高线图示出了指示产生边缘区B细胞的小群体(14.8)和产生滤泡(FO)B细胞的第二群体(70.5)的成熟B细胞的CD21+(CD35+)和IgM+表达。第四(右上)等高线图示出了指示边缘区(90.5；MZ)和边缘区前体(7.3；IgMhiIgDhiCD21hiCD23+)B细胞群体的成熟B细胞中的B220+和CD23+表达。第五(右下)等高线图示出了指示FO-I(79.0；IgDhiIgMloCD21midCD23+)和FO-II(15.1；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)B细胞群体的成熟B细胞中的IgD+和IgM+表达。示出了每个设门区内细胞的百分比。
图30B示出了野生型小鼠中的外周B细胞发育。第一(最左边)等高线图示出了指示未成熟(31.1)和成熟(64.4)B细胞的在CD19+上设门的CD93+和B220+脾细胞。第二(中上)等高线图示出了指示T1(28.5；IgD-IgM+CD21loCD23-)、T2(28.7；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)以及T3(30.7)B细胞群体的未成熟B细胞中的IgM+和CD23+表达。第三(中下)等高线图示出了指示产生边缘区B细胞的小群体(7.69)和产生滤泡(FO)B细胞的第二群体(78.5)的成熟B细胞的CD21+(CD35+)和IgM+表达。第四(右上)等高线图示出了指示边缘区(79.9；MZ)和边缘区前体(19.4；IgMhiIgDhiCD21hiCD23+)B细胞群体的成熟B细胞中的B220+和CD23+表达。第五(右下)等高线图示出了指示FO-I(83.6；IgDhiIgMloCD21midCD23+)和FO-II(13.1；IgDhiIgMhiCD21midCD23+)B细胞群体的成熟B细胞中的IgD+和IgM+表达。示出了每个设门区内细胞的百分比。
图31示出了野生型(WT)和对于两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠收集的脾中过渡、边缘区以及滤泡B细胞群体的总数。
图32示出了在对于用人类Vκ和Jκ基因区段(Hκ)(小鼠的人类轻链)置换内源Vκ和Jκ基因区段而言纯合的小鼠、野生型小鼠(WT)、对于两个人类Vκ基因区段和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠、以及对于两个人类Vκ基因区段和一个人类Jκ基因区段(DLC-1J)而言纯合的小鼠中在使用对Vκ3-20或Vκ1-39基因区段具特异性的探针的定量PCR试验中源自Vκ3-20和源自Vκ1-39的轻链的骨髓中的相对mRNA表达(y轴)。将信号针对小鼠Cκ的表达进行标准化。ND：未检出。
图33示出了在对于用人类Vκ和Jκ基因区段(Hκ)(小鼠的人类轻链)置换内源Vκ和Jκ基因区段而言纯合的小鼠、野生型小鼠(WT)、对于两个人类Vκ基因区段和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠、以及对于两个人类Vκ基因区段和一个人类Jκ基因区段(DLC-1J)而言纯合的小鼠中在使用对Vκ3-20或Vκ1-39基因区段具特异性的探针的定量PCR试验中源自Vκ3-20和源自Vκ1-39的轻链的整个脾中的相对mRNA表达(y轴)。将信号针对小鼠Cκ的表达进行标准化。ND：未检出。
图34示出了用于将四个组氨酸残基工程改造至人类Vκ1-39和Vκ3-20轻链序列的CDR3中的所选诱变引物的序列和特性(GC含量％、N、错配％、Tm)。序列表中所用的这些引物的SEQIDNO包括于下面的表中。F＝正向引物，R＝反向引物。
图35A示出了将包含各自被四个组氨酸残基和五个人类Jκ取代的两个人类Vκ轻链区段的靶向载体引入ES细胞中并且用上述ES细胞产生杂合小鼠；而图35B示出了使用FLPo酶使ES细胞中的选择盒缺失。在大多数实施方案中，除非另有指示，否则填充的形状和实线代表小鼠序列，并且空的形状和双线代表人类序列。这些图不按比例呈现。
图36示出了用于将三个组氨酸残基工程改造至人类Vκ1-39和Vκ3-20轻链序列的CDR3中的所选诱变引物的序列和特性(GC含量％、N、错配％、Tm)。序列表中所用的这些引物的SEQIDNO包括于下面的表中。F＝正向引物，R＝反向引物。
图37A示出了将包含各自被三个组氨酸残基和五个人类Jκ取代的两个人类Vκ轻链区段的靶向载体引入ES细胞中并且用上述ES细胞产生杂合小鼠；而图37B示出了使用FLPo酶使ES细胞中的选择盒缺失。在大多数实施方案中，除非另有指示，否则填充的形状和实线代表小鼠序列，并且空的形状和双线代表人类序列。这些图不按比例呈现。
图38A示出了由人类种系Vκ3-20序列(下部序列)编码的氨基酸序列与包含各自被CDR3序列(上部序列)中的3个组氨酸残基取代的两个Vκ区段(Vκ3-20和Vκ1-39)的在小鼠中表达的IgM轻κ链可变序列的例示性氨基酸翻译的比对；这个比对示出了保留引入种系序列中的所有三个组氨酸取代的在小鼠中表达的IgMκ链可变序列。
图38B示出了由人类种系Vκ1-39序列(每个比对中的下部序列)编码的氨基酸序列与包含各自被CDR3序列(每个比对中的上部序列)中的3个组氨酸残基取代的两个Vκ区段(Vκ3-20和Vκ1-39)的在小鼠中表达的IgM轻κ链可变序列的例示性氨基酸翻译的比对；上部比对示出了保留引入种系序列中的所有三个组氨酸修饰的在小鼠中表达的IgMκ链可变序列，下部比对示出了保留引入种系序列中的三个组氨酸修饰中的两者的在小鼠中表达的IgMκ链可变序列。在一些实施方案中，引入Vκ的最后位置中的组氨酸可能在V-J重排期间丢失。
图39图解了包含重链基因座(MAID6032；“UHC小鼠”)中的重排的重链可变区核酸序列并且进一步包含含有两个人类Vκ基因区段(例如，人类Vκ1-39和人类Vκ3-20基因区段)和五个人类Jκ基因区段(hJκ1-5；DLC-5J)的遗传工程改造的轻链基因座(MAID1912HO)的遗传修饰的F2小鼠的基因组结构。
图40A在上图中示出了来自遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)的在单管上设门并且针对B和T细胞(分别是CD19+和CD3+)进行染色的脾细胞的代表性等高线图。下图示出了来自遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)的在CD19+上设门并且针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)进行染色的脾细胞的代表性等高线图。在每个等高线图上标注成熟和未成熟B细胞。
图40B示出了从遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)收集的脾中CD19+B细胞、成熟B细胞(CD19+IgMloIgDhi)和未成熟B细胞(CD19+IgMhiIgDint)的总数。
图41A示出了来自遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)的在CD19+上设门的Igλ+和Igκ+脾细胞的代表性等高线图。
图41B示出了从遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)收集的脾中B细胞(CD19+)、Igκ+B细胞(CD19+Igκ+)和Igλ+B细胞(CD19+Igλ+)的总数。
图42示出了从遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)收集的脾中B细胞上的IgM表面表达的流式细胞测量分析。用针对IgM的荧光(PE-Cy7偶联的)抗体对细胞进行染色。
图43A示出了遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)中的外周B细胞发育。第一(最左边)等高线图示出了指示未成熟和成熟B细胞的在CD19+上设门的CD93+和B220+脾细胞。第二(中间)等高线图示出了指示T1(IgD-IgM+CD21loCD23-)、T2(IgDhiIgMhiCD21midCD23+)以及T3B细胞群体的未成熟B细胞中的IgM+和CD23+表达。第三(右边)等高线图示出了指示产生边缘区B细胞的第一较小群体和产生滤泡(FO)B细胞的第二较大群体的成熟B细胞的CD21+(CD35+)和IgM+表达。示出了每个设门区内细胞的百分比。
图43B示出了遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)中的外周B细胞发育。第一(左边)等高线图示出了指示产生边缘区B细胞的小群体和产生滤泡(FO)B细胞的第二群体的成熟B细胞的CD21+(CD35+)和IgM+表达。第二(中间)等高线图示出了指示边缘区(MZ)和边缘区前体(IgMhiIgDhiCD21hiCD23+)B细胞群体的成熟B细胞中的B220+和CD23+表达。第三(右边)等高线图示出了指示FO-I(IgDhiIgMintCD21intCD23+)和FO-II(IgDhiIgMintCD21intCD23+)B细胞群体的成熟B细胞中的IgD+和IgM+表达。示出了每个设门区内细胞的百分比。
图44A示出了来自遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)的针对B和T细胞(分别是CD19+和CD3+)进行染色的骨髓的代表性等高线图。
图44B示出了从遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)的股骨收集的骨髓中淋巴细胞的百分比、细胞/股骨的总数以及CD19+B细胞的数目。
图45A示出了来自遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)的在CD19+上设门并且针对ckit+和CD43+进行染色的骨髓的代表性等高线图。在等高线图上标注原和前B细胞。
图45B示出了从遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)的股骨收集的骨髓中前(CD19+CD43-ckit-)和原(CD19+CD43+ckit+)B细胞的数目。
图46A示出了来自遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)的在单管上设门并且针对免疫球蛋白M(IgM)和B220进行染色的骨髓的代表性等高线图。在每个等高线图上标注未成熟、成熟以及原/前B细胞。
图46B示出了从遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)的股骨中分离的骨髓中细胞/股骨、未成熟B(B220intIgM+)和成熟B(B220hiIgM+)细胞的总数。
图47示出了从遗传修饰的对照小鼠(VI3；1293HO1460HO)和对于重链基因座中的重排的重链可变区核酸序列以及轻链基因座中的两个人类Vκ和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(MAID1912HO6032HO；DLCxUHC)的股骨中分离的在未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞上设门并且针对Igλ和Igκ表达进行染色的骨髓的代表性等高线图。
图48示出了在足垫免疫之前、在第1轮足垫免疫之后23天、在第1轮足垫免疫之后5周、以及在第2轮足垫免疫之后小鼠血清(野生型或1912HO6031HET(纯合DLCx杂合UHC))中抗原特异性mIgG的水平。
图49图解了含有κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(即，操作性地连接至κ轻链恒定核酸序列的重排的重链VDJ序列)的遗传修饰的F1小鼠的基因组结构。
图50A在上图中示出了来自野生型小鼠(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的针对B和T细胞(分别是CD19+和CD3+)进行染色的骨髓的代表性等高线图。下图示出了来自野生型小鼠(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的在CD19+上设门并且针对ckit+和CD43+进行染色的骨髓的代表性等高线图。在下图的等高线图上标注原和前B细胞。
图50B示出了从野生型小鼠(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的股骨收集的骨髓中原(CD19+CD43+ckit+)和前(CD19+CD43-ckit-)B细胞的数目。
图51A示出了来自野生型小鼠(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的在单管上设门并且针对免疫球蛋白M(IgM)和B220进行染色的骨髓的代表性等高线图。在每个等高线图上标注未成熟、成熟以及原/前B细胞。
图51B示出了从野生型小鼠(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的股骨中分离的骨髓中B(CD19+)和原/前B(IgM-B220+)细胞的总数。
图51C示出了从野生型小鼠(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的股骨中分离的骨髓中未成熟B(B220intIgM+)和成熟B(B220hiIgM+)细胞的数目。
图52示出了从野生型小鼠(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的股骨中分离的在未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞上设门并且针对Igλ和Igκ表达进行染色的骨髓的代表性等高线图。
图53A在上图中示出了来自野生型小鼠(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的在单管上设门并且针对B和T细胞(分别是CD19+和CD3+)进行染色的脾细胞的代表性等高线图。下图示出了来自野生型小鼠(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠的在CD19+上设门的并且针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)进行染色的脾细胞的代表性等高线图。在每个等高线图上标注成熟(对于WT是56.9，对于κ上的hVH3-23/D/JH4是43)和过渡(对于WT是26.8，对于κ上的hVH3-23/D/JH4是34)B细胞。
图53B示出了从野生型小鼠(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠收集的脾中CD19+B细胞、成熟B细胞(CD19+IgMloIgDhi)和过渡B细胞(CD19+IgMhiIgDint)的总数。
图54A示出了来自野生型小鼠(WT)和κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)的在CD19+上设门的Igλ+和Igκ+脾细胞的代表性等高线图。
图54B示出了从野生型(WT)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠收集的脾中B细胞(CD19+)、Igκ+B细胞(CD19+Igκ+)和Igλ+B细胞(CD19+Igλ+)的总数。
图55示出了对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列(hVH3-23/D/JH4)而言纯合的小鼠相较于野生型小鼠的脾室中的外周B细胞发育。第一(左边)等高线图示出了指示未成熟和成熟B细胞的在CD19+上设门的CD93+和B220+脾细胞。第二(中间)等高线图示出了指示T1、T2以及T3B细胞群体的未成熟B细胞中的IgM+和CD23+表达。第三(右边)等高线图示出了指示产生边缘区B细胞的第一较小群体和产生滤泡(FO)B细胞的第二较大群体的成熟B细胞的CD21+(CD35+)和IgM+表达。示出了每个设门区内细胞的百分比。
图56图解了对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的(MAID6079HO；纯合“κ上UHC小鼠”)并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的(MAID1994HO；重上κ(“KoH”)小鼠)遗传修饰的F2小鼠的基因组结构。
图57A在上图中示出了来自(VI3)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的小鼠的针对B和T细胞(分别是CD19+和CD3+)进行染色的骨髓的代表性等高线图。下图示出了来自(VI3)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的小鼠的在CD19+上设门并且针对ckit+和CD43+进行染色的骨髓的代表性等高线图。在下图的等高线图上标注原和前B细胞。
图57B示出了从小鼠(1242HO1640HO)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的小鼠(1994HO6079HO)的股骨收集的骨髓中B细胞(CD19+)的总数以及原(CD19+CD43+ckit+)和前(CD19+CD43-ckit-)B细胞的数目。数目以每个股骨的细胞的绝对数与细胞百分比来呈现。
图58A示出了来自小鼠(1242HO1640HO)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的小鼠(1994HO6079HO)的在单管上设门并且针对免疫球蛋白M(IgM)和B220进行染色的骨髓的代表性等高线图。在每个等高线图上标注未成熟、成熟以及原/前B细胞。
图58B示出了从小鼠(1242HO1640HO)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的小鼠(1994HO6079HO)的股骨中分离的骨髓中未成熟B(B220intIgM+)和成熟B(B220hiIgM+)细胞的数目。数目以每个股骨的细胞的绝对数与细胞百分比来呈现。
图59示出了从小鼠(1242HO1640HO)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的小鼠(1994HO6079HO)的股骨中分离的在未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞上设门并且针对Igλ和Igκ表达进行染色的骨髓的代表性等高线图。
图60A示出了来自小鼠(VI3；1242HO1640HO)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的小鼠(1994HO6079HO)的在CD19+上设门并且针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)进行染色的脾细胞的代表性等高线图。在每个等高线图上标注成熟和过渡/未成熟B细胞。
图60B示出了从小鼠(1242HO1640HO)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的小鼠(1994HO6079HO)收集的脾中CD19+B细胞、成熟B细胞(CD19+IgMloIgDhi)和过渡B细胞(CD19+IgMhiIgDlo)的总数。
图61示出了从小鼠(1242HO1640HO)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的小鼠(1994HO6079HO)收集的脾中B细胞(CD19+)、Igκ+B细胞(CD19+Igκ+)和Igλ+B细胞(CD19+Igλ+)的总数。数目以淋巴细胞的绝对细胞数与细胞百分比来呈现。
图62示出了小鼠(1242HO1640HO)和对于κ轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的并且对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合的小鼠(1994HO6079HO)的脾室中的外周B细胞发育。上部等高线图示出了指示未成熟和成熟B细胞的在CD19+上设门的CD93+和B220+脾细胞。下部等高线图示出了指示T1、T2以及T3B细胞群体的未成熟B细胞中的IgM+和CD23+表达。示出了每个设门区内细胞的百分比。
具体实施方式
本发明并不限于所描述的特定方法和实验条件，因为所述方法和条件可能有变化。还应了解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不意图具限制性，因为本发明的范围是由权利要求书所界定。
除非另有规定，否则本文所用的所有术语和短语包括这些术语和短语在本领域中已经获得的含义，除非明确指示或从使用术语或短语的情形显而易见相反的情况。现在描述特定方法和材料，不过类似或等效于本文所描述的那些的任何方法和材料可以用于实施或测试本发明。所提及的所有公布特此以引用的方式并入。
如本文所用的术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含四个多肽链，由二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链包含重链可变域和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含三个域，CH1、CH2以及CH3。每个轻链包含轻链可变域和轻链恒定区(CL)。重链和轻链可变域可以进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有更保守区，称为构架区(FR)。每个重链和轻链可变域包含三个CDR和四个FR，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可以缩写为HCDR1、HCDR2以及HCDR3；轻链CDR可以缩写为LCDR1、LCDR2以及LCDR3)。术语“高亲和力”抗体指的是关于其靶表位的KD为约10-9M或更低(例如，约1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、或约1×10-12M)的抗体。在一个实施方案中，KD是通过表面等离子体共振，例如BIACORETM测量；在另一个实施方案中，KD是通过ELISA测量。
短语“双特异性抗体”包括能够选择性地结合两个或更多个表位的抗体。双特异性抗体一般包含两个非一致重链，其中每个重链特异性地结合不同表位-任一者在两个不同分子上(例如，两个不同免疫原上的不同表位)或在相同分子上(例如，相同免疫原上的不同表位)。如果双特异性抗体能够选择性地结合两个不同表位(第一表位和第二表位)，那么第一重链对第一表位的亲和力将一般比第一重链对第二表位的亲和力低至少一个至两个或三个或四个或更多个数量级，反之亦然。由双特异性抗体特异性地结合的表位可以在相同或不同标靶上(例如，在相同或不同蛋白质上)。例示性双特异性抗体包括具有对肿瘤抗原具特异性的第一重链和对细胞毒性标志物，例如Fc受体(例如，FcγRI、FcγRII、FcγRIII等)或T细胞标志物(例如，CD3、CD28等)具特异性的第二重链的那些。此外，第二重链可变域可以被具有不同的所需特异性的重链可变域取代。举例来说，具有对肿瘤抗原具特异性的第一重链和对毒素具特异性的第二重链的双特异性抗体可以配对以递送毒素(例如，皂草素、长春花生物碱等)至肿瘤细胞。其它例示性双特异性抗体包括具有对活化受体(例如，B细胞受体、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcαRI、T细胞受体等)具特异性的第一重链和对抑制受体(例如，FcγRIIB、CD5、CD22、CD72、CD300a等)具特异性的第二重链的那些。可以构建所述双特异性抗体用于与细胞活化相关的***状(例如，过敏和哮喘)。双特异性抗体可以例如通过组合识别相同免疫原的不同表位的重链而制得。举例来说，编码识别相同免疫原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以融合至编码相同或不同重链恒定区的核酸序列，并且所述序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。典型双特异性抗体具有两个重链，各自具有三个重链CDR，继之以(N端至C端)CH1域、铰链、CH2域和CH3域，以及不会赋予表位结合特异性但可以与每个重链缔合，或可以与每个重链缔合并且可以结合重链表位结合区所结合的表位中的一者或多者，或可以与每个重链缔合并且能够使一个或两个重链结合至一个或两个表位的免疫球蛋白轻链。类似地，术语“三特异性抗体”包括能够选择性地结合三个或更多个表位的抗体。
术语“细胞”包括适合于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物的那些(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、嗜甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)等)、非人类动物细胞、人类细胞，或细胞融合体，诸如杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施方案中，细胞是人类、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是真核的并且选自以下细胞：CHO(例如，CHOK1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如，HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL-60(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、塞尔托利细胞(Sertolicell)、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞，以及来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如，PER.C6TM细胞)。
短语“互补决定区”或术语“CDR”包括由生物体的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，其通常(即，在野生型动物中)似乎介于免疫球蛋白分子(例如，抗体或T细胞受体)的轻链或重链的可变区中的两个构架区之间。CDR可以由例如种系序列或重排或未重排的序列编码，并且例如由幼稚或成熟B细胞或T细胞编码。CDR可以经过体细胞突变(例如，在动物的种系中编码的序列发生变化)，人源化，和/或通过氨基酸取代、添加或缺失而修饰。在一些情况下(例如，对于CDR3)，CDR可以由两个或更多个序列(例如，种系序列)编码，这些序列是不连续的(例如，在未重排的核酸序列中)，但在B细胞核酸序列中，例如由于剪接或连接序列(例如，V-D-J重组以形成重链CDR3)的结果而是连续的。
术语“保守”当用于描述保守氨基酸取代时，包括氨基酸残基由具有具类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基取代。一般来说，保守氨基酸取代将不会实质上改变所关注的蛋白质的功能特性，例如，可变区以所需亲和力特异性地结合靶表位的能力。具有具类似化学特性的侧链的氨基酸群组的实例包括脂肪族侧链，诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸；脂肪族羟基侧链，诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链，诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族侧链，诸如苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；碱性侧链，诸如赖氨酸、精氨酸以及组氨酸；酸性侧链，诸如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链，诸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代群组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸，以及天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方案中，保守氨基酸取代可以是用丙氨酸取代蛋白质中的任何原生残基，如在例如丙氨酸扫描诱变中所用的。在一些实施方案中，所制得的保守取代在Gonnet等(1992)整个蛋白质序列数据库的详尽匹配(ExhaustiveMatchingoftheEntireProteinSequenceDatabase),Science256:1443-45中所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值，这个文献特此以引用的方式并入。在一些实施方案中，取代是适度保守的取代，其中这种取代在PAM250对数似然矩阵中具有非负值。
在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或重链中的残基位置因一个或多个保守氨基酸取代而不同。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或其功能性片段(例如，允许从例如B细胞中表达和分泌的片段)中的残基位置与本文中列出氨基酸序列的轻链不一致，但因一个或多个保守氨基酸取代而不同。
短语“表位结合蛋白”包括具有至少一个CDR并且能够选择性地识别表位，例如，能够以约1微摩尔浓度或更低的KD(例如，约1×10-6M、1×10-7M、1×10-9M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、或约1×10-12M的KD)结合表位的蛋白质。治疗性表位结合蛋白(例如，治疗性抗体)常常需要在纳摩尔浓度或皮摩尔浓度范围内的KD。
短语“功能性片段”包括可以被表达，分泌，并且以微摩尔浓度、纳摩尔浓度或皮摩尔浓度范围内的KD特异性地结合至表位的表位结合蛋白片段。特异性识别包括具有至少在微摩尔浓度范围、纳摩尔浓度范围或皮摩尔浓度范围内的KD。
关于免疫球蛋白核酸序列的术语“种系”包括可以传给子代的核酸序列。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白重链序列，包括免疫球蛋白重链恒定区序列。除非另有规定，否则重链可变域包括三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FR，以及其组合。典型重链具有以下可变域(从N端至C端)：CH1域、铰链、CH2域以及CH3域。重链的功能性片段包括能够特异性地识别表位(例如，以微摩尔浓度、纳摩尔浓度或皮摩尔浓度范围内的KD识别表位)，能够从细胞中表达并分泌，并且包含至少一个CDR的片段。重链可变域由可变区基因序列编码，可变区基因序列一般包含来源于存在于种系中的VH、DH以及JH区段的谱系的VH、DH以及JH区段。各种生物体的V、D以及J重链区段的序列、位置以及命名可以在IMGT数据库www.imgt.org中找到。
术语“一致性”当结合序列使用时，包括如通过本领域中已知的可以用于测量核苷酸和/或氨基酸序列一致性的许多不同算法所测定的一致性。在本文所描述的一些实施方案中，使用ClustalW1.83版(慢)比对，采用10.0的开放空位罚分、0.1的延伸空位罚分，并且使用Gonnet相似矩阵(MACVECTORTM10.0.2,MacVectorInc.,2008)来测定一致性。关于序列一致性所比较的序列的长度将取决于特定序列，但在轻链恒定域的情况下，这个长度应含有足够长度的序列以折叠成能够自缔合以形成规范的轻链恒定域，例如，能够形成包含β股的两个β折叠并且能够与人类或小鼠的至少一个CH1域相互作用的轻链恒定域。在CH1域的情况下，序列的长度应含有足够长度的序列以折叠成能够形成包含β股的两个β折叠并且能够与小鼠或人类的至少一个轻链恒定域相互作用的CH1域。
短语“免疫球蛋白分子”包括两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链。重链可以是相同的或不同的，并且轻链可以是相同的或不同的。
短语“轻链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白轻链序列，并且除非另有规定，否则包括人类κ和λ轻链和VpreB，以及替代轻链。除非另有规定，否则轻链可变域通常包括三个轻链CDR和四个构架(FR)区。一般来说，全长轻链从氨基端至羧基端包括：包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变域，和轻链恒定区。轻链可变域由轻链可变区基因序列编码，轻链可变区基因序列一般包含来源于存在于种系中的V和J区段的谱系的VL和JL区段。各种生物体的V和J轻链区段的序列、位置以及命名可以在IMGT数据库www.imgt.org中找到。轻链包括例如不会选择性地结合由出现其的表位结合蛋白选择性地结合的第一或第二表位的那些。轻链还包括结合并识别，或帮助重链结合并识别由出现其的表位结合蛋白选择性地结合的一个或多个表位。共同或通用轻链包括来源于人类Vκ1-39Jκ5基因或人类Vκ3-20Jκ1基因的那些，并且包括上述的体细胞突变(例如，亲和力成熟)型式。双轻链(DLC)包括来源于包含不超过两个人类Vκ区段，例如人类Vκ1-39基因区段和人类Vκ3-20基因区段的轻链基因座的那些，并且包括上述的体细胞突变(例如，亲和力成熟)型式。
短语“体细胞高频突变”包括提及来自已经经历类别转换的B细胞的核酸序列，其中类别转换的B细胞中的免疫球蛋白可变区的核酸序列(例如，编码重链可变域或包括重链CDR或FR序列的核苷酸序列)与类别转换之前B细胞中的核酸序列不一致，诸如在尚未经历类别转换的B细胞与已经经历类别转换的B细胞之间的CDR或构架核酸序列有差异。“体细胞突变”包括提及与没有亲和力成熟的B细胞中的对应的免疫球蛋白可变区序列(即，种系细胞的基因组中的序列)不一致的来自亲和力成熟的B细胞的核酸序列。短语“体细胞突变”还包括提及在B细胞暴露于所关注的表位之后来自B细胞的免疫球蛋白可变区核酸序列，其中这个核酸序列不同于在B细胞暴露于所关注的表位之前对应的核酸序列。短语“体细胞突变”指的是来自已经在具有人类免疫球蛋白可变区核酸序列的动物(例如，小鼠)中对免疫原激发起反应而产生，并且通过固有地在这样的动物中操作的选择过程而得到的抗体的序列。
关于核酸序列的术语“未重排”包括存在于动物***的种系中的核酸序列。
短语“可变域”包括免疫球蛋白轻链或重链(必要时加以修饰)的氨基酸序列，其从N端至C端依次包含以下氨基酸区(除非另有指示)：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语“操作性地连接”指的是组分以其预期方式将功能操作性地联系起来的关系。在一种情况下，编码蛋白质的核酸序列可以操作性地连接至调控序列(例如，启动子、增强子、沉默子序列等)以保持适当的转录调控。在一种情况下，免疫球蛋白可变区(或V(D)J区段)的核酸序列可以操作性地连接至免疫球蛋白恒定区的核酸序列以允许序列之间适当重组成免疫球蛋白重链或轻链序列。
如本文所用，例如关于功能性多肽的“功能性”包括保留至少一种通常与原生蛋白质相关的生物活性的多肽。在另一种情况下，功能性免疫球蛋白基因区段可以包括能够有效重排以产生重排的免疫球蛋白基因序列的可变基因区段。
“中性pH”包括介于约7.0与约8.0之间的pH，例如，介于约7.0与约7.4之间，例如介于约7.2与约7.4之间的pH，例如生理pH。“酸性pH”包括6.0或更低的pH，例如，介于约5.0与约6.0之间的pH、介于约5.75与约6.0之间的pH，例如核内体或溶酶体室的pH。
如本文所用的术语“多态变体”包括与给定的序列相比一个或多个核苷酸或氨基酸已经被不同核苷酸或氨基酸取代的序列。人类免疫球蛋白重链可变基因区段(VH基因)的多态等位基因主要是基因区段的***/缺失和编码区内的单核苷酸差异的结果，这两者都有对免疫球蛋白分子具有功能性结果的潜力。人类免疫球蛋白VH基因的共同多态等位基因的实例在本领域中是众所周知的(参看例如US13/653,456，以其全文引用的方式并入本文中)。
术语“实质性”或“实质上所有”当用于指一定量的基因区段(例如，“实质上所有”V、D或J基因区段)时，包括功能性与非功能性基因区段，并且在各种实施方案中包括例如所有V、D或J基因区段的80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多。在各种实施方案中，“实质上所有”基因区段包括例如至少95％、96％、97％、98％或99％的功能性(即，非假基因)基因区段。
包含重排的重链可变区基因序列并且任选地包含未重排的轻链可变基因区段的有限谱系的非人类动物
虽然已经开发了具有双重抗原结合特性的多种双特异性抗体，但常规双特异性抗体中的轻链或重链可变区的特异性和亲和力必须在一定程度上被牺牲，这是因为在常规双特异性抗体中单独的重链或轻链可变域有助于结合每个独立的抗原决定子，而在普通抗体中轻链与重链可变区都可以有助于结合同一抗原决定子。
因此，产生具有独立于重链可变区结合抗原的能力的轻链可变区可以适用于制造用于抗原结合分子(例如，包含与VL融合的重链恒定区(例如，选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合)的双特异性结合分子)中的轻链可变域(VL)，特别是不包含重链可变域的那些，包括具有相同或相似的重链恒定区，但VL具有不同特异性和/或亲和力的异二聚体。
一种用以产生可以独立于重链可变区结合至抗原的所述轻链可变域的方法是将选择压力施加于编码可变区或轻链(VL)域的核苷酸序列以产生具有更多样化的抗原结合谱系的轻链CDR3。如本文所公开，这可以通过产生在其基因组中含有重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的遗传修饰的非人类动物来达成。因为重链序列局限于这些动物中的共同或通用(即，相同或非常相似)的序列，所以将迫使轻链可变区核苷酸序列(即，基因)制造具有更多样化并且有效的抗原结合特性的轻链CDR3，其可以独立于重链可变区结合抗原决定子。此外，如本文所公开，种系可变区基因区段的精确置换(例如，通过同源重组介导的基因靶向)允许制造具有部分人类免疫球蛋白基因座的动物(例如，小鼠)。因为部分人类免疫球蛋白基因座通常发生重排、高频突变和体细胞突变(例如，类别转换)，所以部分人类免疫球蛋白基因座在动物中产生包含人类可变区的抗体。这些动物展现实质上类似于野生型动物的体液免疫***，并且显示正常细胞群体和正常淋巴器官结构-甚至在动物缺乏人类可变区基因区段的完整谱系的情况下。使这些动物(例如，小鼠)免疫引起稳固的体液反应，其显示多种多样的可变基因区段使用率。可以鉴别并克隆编码可变区的核苷酸序列，然后与所选的任何序列，例如适合于特定用途的任何免疫球蛋白同型融合(例如，在体外***中)，从而得到完全来源于人类序列的抗体或抗原结合蛋白。
另外，通过利用具有受限(有限)的轻链可变区基因区段谱系，例如，包含与上文所描述的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列组合的一个或多个但小于野生型数目的人类VL基因区段(例如，双轻链或“DLC”，美国专利申请公布号2013/0198880，以其全文引用的方式并入本文中)的受限轻链可变区段谱系的动物(例如，小鼠或大鼠)，可以产生可以更有效地与免疫球蛋白重链可变域配对的免疫球蛋白轻链可变域。此外，通过例如经由添加一个或多个组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代一个或多个非组氨酸密码子，将组氨酸密码子引入本文所描述的非人类动物的基因组中的有限轻链可变基因区段中，可以产生可以向抗原结合蛋白(例如，双特异性或三特异性抗体)赋予改善的pH依赖性再循环能力的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的非人类动物提供较高产率的抗体，而同时限制多样性，从而增加在包含单个重排的轻链可变区的非人类动物(例如，通用轻链(“ULC”)小鼠；参看例如美国授予专利前公布2013/0185821，以引用的方式并入本文中)中产生的轻链与重链成功配对的可能性。在一些实施方案中，轻链本身可以展现抗原结合特性。在一些实施方案中，可以诱导非人类动物产生展现存在于其轻链中的抗原特异性的抗原结合蛋白(例如，通过限制小鼠或大鼠的免疫球蛋白重链谱系；例如，通过用包含单个重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的基因座置换小鼠或大鼠重链基因座)。在一些实施方案中，在所述动物中产生的抗原结合蛋白(例如，抗体)将经由其轻链结合而对特定的第一表位(例如，效应子抗原、细胞毒性分子、Fc受体、毒素、活化或抑制受体、T细胞标志物、免疫球蛋白转运子等)具特异性。来源于这些非人类动物的所述表位特异性人类轻链可以与来源于具有有限轻链谱系的小鼠，例如ULC小鼠或大鼠的人类重链共同表达，其中重链是基于其结合第二表位(例如，不同抗原上的第二表位)的能力来选择。
在各种方面，提供了非人类动物，在其种系基因组中包含有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(即，重排的重链VDJ序列)的免疫球蛋白重链基因座。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类重链恒定区序列。在一些实施方案中，由重排的重链可变区核苷酸序列编码的免疫球蛋白重链可变域对非人类动物没有免疫原性。在一些实施方案中，非人类动物经过修饰以包含编码操作性地连接至重链恒定域的重排的重链可变域的两个拷贝、三个拷贝、四个拷贝或更多个拷贝的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。举例来说，核苷酸序列可以编码重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个拷贝。在一些实施方案中，核苷酸序列编码重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个拷贝。在一些实施方案中，基因座包含操作性地连接至重链恒定域基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
在其它方面，提供了非人类动物，其经过遗传工程改造以含有编码操作性地连接至人类或非人类轻链恒定区基因序列的重排的重链可变域的免疫球蛋白轻链基因座(即，包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的轻链基因座)。举例来说，在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(即，预先设计的VDJ区；即，共同或通用重链序列)可以通过将重排的重链序列靶向小鼠或大鼠轻链基因座(κ或λ)而操作性地连接至轻链恒定区基因序列。因此，在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的核苷酸序列存在于非人类动物的种系基因组中。在一些实施方案中，由遗传修饰的非人类动物表达的重排的重链可变域对非人类动物没有免疫原性。在一些实施方案中，非人类动物经过修饰以包含编码操作性地连接至轻链恒定域的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的两个拷贝、三个拷贝、四个拷贝或更多个拷贝的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列可以编码重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。举例来说，核苷酸序列编码重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个拷贝。在一些实施方案中，基因座包含操作性地连接至轻链恒定域基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
在各种方面，本文所描述的非人类动物的免疫球蛋白轻链基因座包含轻链可变基因区段的有限谱系，例如，一个或多个但小于野生型数目的人类VL基因区段；以及操作性地连接至非人类轻链恒定区核酸序列的一个或多个人类JL基因区段。因此，提供了遗传修饰的非人类动物，在其基因组中包含：(i)包含操作性地连接至人类或非人类重链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列的免疫球蛋白重链基因座；以及(ii)包含操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段的免疫球蛋白轻链基因座。在一些实施方案中，轻链恒定区是大鼠或小鼠恒定区，例如，大鼠或小鼠Cκ恒定区。在一些实施方案中，人类可变区基因区段能够重排并编码抗体的人类可变域，并且非人类动物不包含内源VL基因区段。在一些实施方案中，非人类动物包含五个人类Jκ基因区段，例如，Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4以及Jκ5基因区段。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座包含两个人类VL基因区段Vκ1-39和Vκ3-20。在一些实施方案中，一个或多个(例如，2个、3个、4个或5个)人类VL基因区段和两个或更多个人类JL基因区段存在于内源轻链基因座处，例如，内源κ轻链基因座处。在一些实施方案中，小鼠包含功能性λ轻链基因座。在一些实施方案中，小鼠包含非功能性λ轻链基因座。在一些实施方案中，一个或多个人类VH、一个或多个人类DH以及一个或多个人类JH基因区段操作性地连接至小鼠或大鼠重链恒定区序列。
在一些实施方案中，在其基因组中包含(i)包含操作性地连接至人类或非人类重链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列的免疫球蛋白重链基因座，以及(ii)包含操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段的免疫球蛋白轻链基因座的遗传修饰的小鼠，展示实质上与野生型小鼠或含有其免疫球蛋白基因座的其它修饰的小鼠(即，遗传修饰的对照小鼠；例如，小鼠，其中这种小鼠的体液免疫***功能如同野生型小鼠)中所观测到的数目相同的CD19+B细胞数和成熟B细胞数。在一些实施方案中，所述小鼠与遗传修饰的对照小鼠相比展示脾中未成熟B细胞数的增加。在特定实施方案中，所述小鼠与遗传修饰的对照小鼠相比展示脾中未成熟B细胞数的约2倍、约3倍、约4倍、或约5倍或更多倍增加。在一些实施方案中，所述小鼠在脾B细胞中的κ和γ轻链使用率方面也实质上类似于野生型小鼠或遗传修饰的对照小鼠。在一些实施方案中，所述小鼠与遗传修饰的对照小鼠相比展示脾B细胞上增加的表面IgM(即，每个细胞更多的IgM表面表达)。在一些实施方案中，所述小鼠与遗传修饰的对照小鼠相比展示通过脾室中B细胞发育的各种阶段的改变的外周B细胞发育，例如未成熟、T1和/或边缘区B细胞的增加。在一些实施方案中，所述小鼠展示实质上类似于遗传修饰的对照小鼠中所展示的数目的骨髓室中的CD19+B细胞数。在一些实施方案中，所述小鼠与遗传修饰的对照小鼠相比展示骨髓中较少的原B细胞。在特定实施方案中，与遗传修饰的对照小鼠相比，骨髓室中的原B细胞数减少约2倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍或更多倍。在一些实施方案中，所述小鼠与遗传修饰的对照小鼠相比展示骨髓中少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍等的未成熟和/或成熟B细胞。在一些实施方案中，所述小鼠与遗传修饰的对照小鼠相比展现骨髓室中对于λ轻链基因使用率的略微偏好(例如，2倍增加)。
在另一个方面，提供了非人类动物，其包含有包含以下的遗传修饰的免疫球蛋白基因座：(a)编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至轻链恒定区基因序列；以及(b)编码人类轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至重链恒定区基因序列。举例来说，在一些实施方案中，来自预先设计的VDJ区的重排的重链(即，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列；即，共同或通用重链序列)可以通过将重排的重链序列靶向小鼠轻链基因座(κ或λ)而操作性地连接至轻链恒定区基因序列。因此，如在其它实施方案中，这种遗传工程改造的免疫球蛋白基因座可以存在于非人类动物的种系基因组中。包含与重链恒定区基因序列操作性地连接的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的遗传修饰的非人类动物描述于美国授予专利前公布2012/0096572中，其以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至小鼠或大鼠κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至人类κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至小鼠或大鼠λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至人类λ轻链恒定区基因序列。
在一些实施方案中，包含含有重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白轻链基因座和含有未重排的人类免疫球蛋白轻链可变域序列(例如，κ轻链基因)的免疫球蛋白重链基因座的遗传修饰的小鼠呈现相对于野生型小鼠或在免疫球蛋白基因座处具有其它修饰的遗传修饰的小鼠(即，遗传修饰的对照小鼠；例如，小鼠，其中这种小鼠的体液免疫***功能如同野生型小鼠)改变的骨髓中的CD19+和前B细胞频率。在特定实施方案中，与野生型小鼠或遗传修饰的免疫球蛋白基因座对照小鼠相比，骨髓中的CD19+B细胞和前B细胞数低2倍、低3倍、低4倍或低5倍。在特定实施方案中，与野生型小鼠或遗传修饰的免疫球蛋白基因座对照小鼠相比，骨髓中的未成熟B细胞数少2倍、少3倍、少4倍或少5倍。在一些实施方案中，包含含有重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白轻链基因座和含有未重排的人类免疫球蛋白轻链可变域序列(例如，κ轻链基因)的免疫球蛋白重链基因座的遗传修饰的小鼠在骨髓细胞中不表达或基本上不表达λ轻链基因。在一些实施方案中，包含含有重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白轻链基因座和含有未重排的人类免疫球蛋白轻链可变域序列(例如，κ轻链基因)的免疫球蛋白重链基因座的遗传修饰的小鼠与野生型小鼠或遗传修饰的免疫球蛋白基因座对照小鼠相比具有水平降低的脾B细胞。在特定实施方案中，与野生型小鼠或遗传修饰的免疫球蛋白基因座对照小鼠相比，脾B细胞和成熟B细胞的水平低2倍、低3倍、低4倍或低5倍。在一些实施方案中，包含含有重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白轻链基因座和含有未重排的人类免疫球蛋白轻链可变域序列(例如，κ轻链基因)的免疫球蛋白重链基因座的遗传修饰的小鼠在脾B细胞中不表达或基本上不表达λ轻链基因。在特定实施方案中，包含含有重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白轻链基因座和含有未重排的人类免疫球蛋白轻链可变域序列(例如，κ轻链基因)的免疫球蛋白重链基因座的遗传修饰的小鼠与野生型小鼠或遗传修饰的免疫球蛋白基因座对照小鼠相比具有脾中频率增加的T1期细胞。
在一些实施方案中，非人类动物是哺乳动物。尽管本文中广泛论述了采用小鼠中的重排的人类重链可变域(即，具有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白基因座的小鼠)的实施方案，但也提供包含编码重排的人类重链可变域的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的其它非人类动物。所述非人类动物包括可以经过遗传修饰以表达如本文所公开的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的那些非人类动物中的任一者，例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如，母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如，绒、猕猴)，等等。举例来说，对于适合的可遗传修饰的ES细胞不易得到的那些非人类动物，采用其它方法来制造包含遗传修饰的非人类动物。所述方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导多能细胞)并且采用体细胞核转移(SCNT)将遗传修饰的基因组转移至适合的细胞，例如去核***，并且在适合的条件下在非人类动物中孕育修饰的细胞(例如，修饰的***)以形成胚胎。修饰非人类动物基因组(例如，猪、母牛、啮齿动物、鸡等基因组)的方法包括例如采用锌指核酸酶(ZFN)或转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)修饰基因组以包括重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，非人类动物是小哺乳动物，例如，跳鼠(Dipodoidea)或鼠(Muroidea)总科的动物。在一些实施方案中，遗传修饰的动物是啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自小鼠、大鼠以及仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物选自鼠总科。在一些实施方案中，遗传修饰的动物是来自选自以下的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩攀鼠、带尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺山鼠)以及鼹鼠科(Spalacidae)(例如，鼹形鼠、竹鼠以及鼢鼠)。在一个特定实施方案中，遗传修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、刺毛鼠以及冠鼠。在一些实施方案中，遗传修饰的小鼠来自鼠科的成员。在一些实施方案中，动物是啮齿动物。在特定实施方案中，啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施方案中，非人类动物是小鼠。
在一些实施方案中，非人类动物是啮齿动物，其为选自以下的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6N、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr以及C57BL/Ola。在另一个实施方案中，小鼠是129品系。在一些实施方案中，129品系选自由以下组成的群组：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参看例如Festing等(1999)品系129小鼠的修订命名(Revisednomenclatureforstrain129mice),哺乳动物基因组(MammalianGenome)10:836，还参看Auerbach等(2000)源自129/SvEv和源自C57BL/6的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析(EstablishmentandChimeraAnalysisof129/SvEv-andC57BL/6-DerivedMouseEmbryonicStemCellLines))。在一些实施方案中，遗传修饰的小鼠是前述129品系与前述C57BL品系(例如，C57BL/6品系)的混合体。在另一个实施方案中，小鼠是前述129品系的混合体，或前述C57BL/6品系的混合体。在一些实施方案中，混合体的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方案中，小鼠是源自129/SvEv和源自C57BL/6的品系的混合体。在一个特定实施方案中，小鼠是如Auerbach等2000BioTechniques29:1024-1032中所描述的源自129/SvEv和源自C57BL/6的品系的混合体。在另一个实施方案中，小鼠是BALB品系，例如，BALB/c品系。在另一个实施方案中，小鼠是BALB品系(例如，BALB/c品系)与另一个前述品系的混合体。
在一些实施方案中，非人类动物是大鼠。在一些实施方案中，大鼠选自威斯塔(Wistar)大鼠、LEA品系、斯普拉格-杜勒(SpragueDawley)品系、费舍尔(Fischer)品系、F344、F6、ACI以及暗刺鼠(DarkAgouti，DA)。在一些实施方案中，大鼠品系是选自由威斯塔、LEA、斯普拉格-杜勒、费舍尔、F344、F6、ACI以及暗刺鼠(DA)组成的群组的品系中的两者或更多者的混合体。
在一些实施方案中，在其种系基因组中包含有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白重链基因座的遗传修饰的小鼠产生相对于野生型小鼠基本上正常的脾成熟和未成熟B细胞群体。在一些实施方案中，这样的遗传修饰的小鼠相对于野生型在脾B细胞中的轻链λ基因序列使用率方面有略微降低。在特定实施方案中，这样的遗传修饰的小鼠相比野生型在脾B细胞中以低2倍、3倍、4倍或5倍的频率使用轻链λ基因序列。在一些实施方案中，这样的遗传修饰的小鼠相对于野生型具有T1群体脾B细胞的略微减少和边缘区脾B细胞的增加。在一些实施方案中，这样的遗传修饰的小鼠在骨髓中具有接近正常的B细胞群体。在一些实施方案中，这样的遗传修饰的小鼠以在野生型中使用λ基因序列的频率的一半或小于一半的频率使用λ基因序列。
在各种实施方案中，如本文所描述，重排的重链可变域(例如，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列)来源于人类V、D以及J基因序列或区段。在一些实施方案中，重排的重链可变域来源于人类种系V区段、人类种系D区段以及人类种系J区段。在一些实施方案中，人类VH区段对应于在人类群体中所观测到的变体。
在各种实施方案中，如本文所描述，人类V基因区段选自由以下组成的群组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81，以及其多态变体。在一些实施方案中，人类V区段是VH3-23或其多态变体。在各种实施方案中，如本文所描述，人类D基因区段选自由以下组成的群组：D1-1、D1-7、D1-14、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-12、D5-5、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D6-25、D7-27，以及其多态变体。在一些实施方案中，人类或非人类动物重链恒定区序列包含选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的序列。在特定实施方案中，恒定区序列包含CH1、铰链、CH2以及CH3。在各种实施方案中，如本文所描述，人类J基因区段选自由以下组成的群组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6，以及其多态变体。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码人类VH3-23/GY/JH4-4的序列(SEQIDNO:137)。在一些实施方案中，由重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码并且从其表达的重排的重链可变域包含人类VH3-23/X1X2/J的序列(其中X1是任何氨基酸，并且X2是任何氨基酸)。在一些实施方案中，X1是Gly并且X2是Tyr。在一些实施方案中，重排的重链可变域包含人类VH3-23/X1X2/JH4-4的序列(其中X1是任何氨基酸，并且X2是任何氨基酸)。在一些实施方案中，X2是包含苯基的氨基酸。在特定实施方案中，X2选自Tyr和Phe。
在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列包含在动物中非自体反应(非免疫原性)的人类D区段。在一些实施方案中，核苷酸序列包含能够在小鼠的成熟B细胞的重链可变序列中表达的人类D区段。在一些实施方案中，D区段是已经在包含有包含人类VH、人类D以及人类JH区段的人源化免疫球蛋白基因座的小鼠中表达的区段。
各种实施方案利用或涵盖来源于人源化小鼠的特征或序列信息。人源化小鼠在内源基因座处含有小鼠免疫球蛋白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(例如，κ轻链、Igκ)的种系可变区被对应的人类免疫球蛋白可变区的精确、大规模置换(参看例如US6,596,541和US8,502,018，其全部内容以引用的方式并入本文中)。总的来说，约6兆碱基的小鼠基因座被约1.5兆碱基的人类基因组序列置换。这种精确置换得到具有杂交免疫球蛋白基因座的小鼠，所述杂交免疫球蛋白基因座制得具有人类可变区和小鼠恒定区的重链和轻链。小鼠VH-D-JH和Vκ-Jκ区段的精确置换在杂交免疫球蛋白基因座处留下完整并且有功能的侧接小鼠序列。小鼠的体液免疫***功能如同野生型小鼠。B细胞发育在任何显著方面都不受阻并且在抗原激发后在小鼠中产生丰富多样的人类可变区。此外，人源化小鼠对免疫显示基本上正常的野生型反应，只有一个显著方面与野生型小鼠不同-对免疫起反应所产生的可变区是完全人类的。人源化小鼠是可能存在的，这是因为重链和κ轻链的免疫球蛋白基因区段在人类和小鼠中以类似方式重排。尽管基因座是不相同的，但其足够相似以使得可以通过用基本上覆盖来自人类免疫球蛋白基因座的等效序列的连续人类基因组序列的约一百万个碱基置换含有所有VH、D以及JH基因区段的连续小鼠序列的约三百万个碱基对来实现重链可变基因座的人源化。举例来说，在一些实施方案中，D区段来源于在用抗原免疫的人源化小鼠的成熟B细胞中表达的重链，其中D区段将不超过两个氨基酸贡献给重链CDR3序列。
在特定实施方案中，提供了包含编码重排的重链可变域的免疫球蛋白重链基因座(即，包含有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白重链基因座)的小鼠。这样修饰的小鼠包含用重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(即，在内源重链基因座处的通用重链序列)置换小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段，以及用至少40个人类Vκ基因区段和五个人类Jκ基因区段置换小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段。在一些实施方案中，人类Vκ基因区段选自由以下组成的群组：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41以及Vκ7-3。在一些实施方案中，人类Vκ基因区段包含Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5以及Vκ1-6。在一个实施方案中，Vκ基因区段包含Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15以及Vκ1-16。在一些实施方案中，人类Vκ基因区段包含Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29以及Vκ2-30。在一些实施方案中，人类Vκ基因区段包含Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39以及Vκ2-40。在特定实施方案中，Vκ基因区段包含从Vκ4-1至Vκ2-40跨越人类免疫球蛋白κ轻链基因座的连续人类免疫球蛋白κ基因区段，并且Jκ基因区段包含从Jκ1至Jκ5跨越人类免疫球蛋白κ轻链基因座的连续基因区段。在一些实施方案中，重排的人类重链可变域核苷酸序列操作性地连接至小鼠重链恒定区序列。包含编码重排的重链可变域的免疫球蛋白重链基因座(即，包含有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白重链基因座)的小鼠可以用于本文所描述的任何方面、实施方案、方法等中。
在各种实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类或小鼠重链恒定区基因序列(例如，编码选自IgM、IgD、IgA、IgE、IgG以及其组合的免疫球蛋白同型的重链恒定区基因序列)。举例来说，提供了遗传修饰的非人类动物，其包含免疫球蛋白基因座，其中：(a)第一核苷酸序列编码重排的重链可变域(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类重链恒定区基因序列；以及(b)第二核苷酸序列编码轻链可变域(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，人类重链恒定区基因序列选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合。在一些实施方案中，小鼠重链恒定区基因序列选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合。在一些实施方案中，用人类基因序列进一步置换某些非人类动物恒定区基因序列(例如，用人类CH1序列置换小鼠CH1序列，以及用人类CL序列置换小鼠CL序列)得到具有杂交免疫球蛋白基因座的遗传修饰的非人类动物，所述杂交免疫球蛋白基因座制得具有人类可变区和部分人类恒定区的抗体，其适合于例如制造完全人类抗体片段，例如完全人类Fab。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，大鼠重链恒定区基因序列选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合。在各种实施方案中，非人类动物的遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座包含操作性地连接至重链恒定域基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的两个拷贝、三个拷贝、四个拷贝或更多个拷贝。在特定实施方案中，基因座包含操作性地连接至重链恒定域基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
在各种实施方案中，重链恒定区核苷酸序列在CH2或CH3中包含修饰，其中这种修饰增加在酸性环境中(例如，在pH在约5.5至约6.0的范围内的核内体中)重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人类重链恒定区氨基酸序列，其包含以下位置处的修饰：根据EU编号的250(根据Kabat编号的263)(例如，E或Q)；根据EU编号的250(根据Kabat编号的263)和根据EU编号的428(根据Kabat编号的459)(例如，L或F)；根据EU编号的252(根据Kabat编号的265)(例如，L/Y/F/W或T)，根据EU编号254(根据Kabat编号的267)(例如，S或T)，以及根据EU编号的256(根据Kabat编号的269)(例如，S/R/Q/E/D或T)；或以下位置处的修饰：根据EU编号的428(根据Kabat编号的459)和/或根据EU编号的433(根据Kabat编号的464)(例如，L/R/S/P/Q或K)和/或根据EU编号的434(根据Kabat编号的465)(例如，H/F或Y)；或以下位置处的修饰：根据EU编号的250(根据Kabat编号的263)和/或根据EU编号的428(根据Kabat编号的459)；或以下位置处的修饰：根据EU编号的307(根据Kabat编号的326)或根据EU编号308(根据Kabat编号的327)(例如，308F、V308F)，以及根据EU编号的434(根据Kabat编号的465)。在一个实施方案中，修饰包含根据EU编号的428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰(根据Kabat编号的459，例如M459L，和465S(例如，N465S)修饰)；根据EU编号的428L、259I(例如，V259I)以及308F(例如，V308F)修饰(根据Kabat编号的459L、272I(例如，V272I)以及327F(例如，V327F)修饰)；根据EU编号的433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰(根据Kabat编号的464K(例如，H464K)和465(例如，465Y)修饰)；根据EU编号的252、254以及256(例如，252Y、254T以及256E)修饰(根据Kabat编号的265、267、269(例如，265Y、267T以及269E)修饰)；根据EU编号的250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)(根据Kabat编号的263Q和459L修饰，例如，T263Q和M459L)；以及根据EU编号的307和/或308修饰(例如，307F或308P)(根据Kabat编号的326和/或327修饰，例如，326F或308P)，其中这种修饰增加在酸性环境中(例如，在pH在约5.5至约6.0的范围内的核内体中)重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人类CH2氨基酸序列，其包含在根据EU编号的位置252与257的氨基酸残基之间的至少一个修饰(即，在根据Kabat编号的氨基酸位置265与270之间的至少一个修饰)，其中这种修饰增加在酸性环境中(例如，在pH在约5.5至约6.0的范围内的核内体中)人类CH2氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人类CH2氨基酸序列，其包含在位置307与311的氨基酸残基之间的至少一个修饰(即，在根据Kabat编号的氨基酸位置326与330之间的至少一个修饰)，其中这种修饰增加在酸性环境中(例如，在pH在约5.5至约6.0的范围内的核内体中)CH2氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人类CH3氨基酸序列，其中CH3氨基酸序列包含在根据EU编号的位置433与436的氨基酸残基之间的至少一个修饰(即，在根据Kabat编号的位置464与467的氨基酸残基之间的至少一个修饰)，其中这种修饰增加在酸性环境中(例如，在pH在约5.5至约6.0的范围内的核内体中)CH3氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人类重链恒定区氨基酸序列，其包含选自由以下组成的群组的突变：根据EU编号的M428L(根据Kabat编号的459)、根据EU编号的N434S(根据Kabat编号的465)以及其组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人类重链恒定区氨基酸序列，其包含选自由以下组成的群组的突变：根据EU编号的M428L(根据Kabat编号的M459L)、根据EU编号的V259I(根据Kabat编号的V272I)、根据EU编号的V308F(根据Kabat编号的V327)以及其组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人类重链恒定区氨基酸序列，其包含根据EU编号的N434A突变(根据Kabat编号的N465A突变)。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人类重链恒定区氨基酸序列，其包含选自由以下组成的群组的突变：根据EU编号的M252Y(根据Kabat编号的M265Y)、根据EU编号的S254T(根据Kabat编号的S267T)、根据EU编号的T256E(根据Kabat编号的T269E)以及其组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人类重链恒定区氨基酸序列，其包含选自由以下组成的群组的突变：根据EU编号的T250Q(根据Kabat编号的T263Q)、根据EU编号的M428L(根据Kabat编号的M459L)，或两者。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人类重链恒定区氨基酸序列，其包含选自由以下组成的群组的突变：根据EU编号的H433K(根据Kabat编号的H464K)、根据EU编号的N434Y(根据Kabat编号的N465Y)，或两者。
在一些实施方案中，遗传修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如本文所描述的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至编码选自IgG1、IgG2、IgG4以及其组合的人类IgG的第一CH3氨基酸序列的第一重链恒定区核苷酸序列；以及(2)第二等位基因，其中如本文所描述的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至编码选自IgG1、IgG2、IgG4以及其组合的人类IgG的第二CH3氨基酸序列的第二重链恒定区核苷酸序列，并且其中第二CH3氨基酸序列包含减少或消除第二CH3氨基酸序列与蛋白质A的结合的修饰(参看例如美国专利号8,586,713，其以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号的H435R)。在一个实施方案中，第二CH3氨基酸序列进一步包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU的H436F)。在另一个实施方案中，第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号的H435R)与Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU的H436F)。在一些实施方案中，第二CH3氨基酸序列来自修饰的人类IgG1并且进一步包含选自由以下组成的群组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(IMGT；根据EU的D356E、L38M、N384S、K392N、V397M以及V422I)。在一些实施方案中，第二CH3氨基酸序列来自修饰的人类IgG2并且进一步包含选自由以下组成的群组的突变：N44S、K52N以及V82I(IMGT：根据EU的N384S、K392N以及V422I)。在一些实施方案中，第二CH3氨基酸序列来自修饰的人类IgG4并且进一步包含选自由以下组成的群组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(IMGT：根据EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。在一些实施方案中，重链恒定区氨基酸序列是非人类恒定区氨基酸序列，并且重链恒定区氨基酸序列包含上文所描述的任何类型的修饰中的一者或多者。
在各种实施方案中，Fc域经过修饰以具有改变的Fc受体结合，其继而影响效应子功能。在一些实施方案中，包括Fc域的工程改造的重链恒定区(CH)是嵌合的。这样的话，嵌合CH区组合来源于超过一种免疫球蛋白同型的CH域。举例来说，嵌合CH区包含来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4分子的一部分或全部CH2域，与来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4分子的一部分或全部CH3域组合。在一些实施方案中，嵌合CH区含有嵌合铰链区。举例来说，嵌合铰链可以包含来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据EU编号的位置216至227的氨基酸残基；根据Kabat编号的位置226至240的氨基酸残基)，与来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4铰链区的“下铰链”序列(根据EU编号的位置228至236的氨基酸残基；根据Kabat编号的位置241至249的氨基酸位置)组合。在一些实施方案中，嵌合铰链区包含来源于人类IgG1或人类IgG4上铰链的氨基酸残基和来源于人类IgG2下铰链的氨基酸残基。
在一些实施方案中，Fc域可以经过工程改造以活化正常Fc效应子功能的全部、一些或不活化正常Fc效应子功能，而不影响含Fc蛋白质(例如抗体)所需的药物动力学特性。关于包含嵌合CH区并且具有改变的效应子功能的蛋白质的实例，参看2013年2月1日提交的美国临时申请号61/759,578，其以全文并入本文中。
在各种方面，非人类动物的基因组经过修饰(i)以使所有或实质上所有内源功能性免疫球蛋白VH、D、JH区段缺失或促使其无功能(例如，经由核苷酸序列(例如，外源核苷酸序列)***免疫球蛋白基因座中，或经由非功能性重排或倒置)；以及(ii)以包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中这种核苷酸序列存在于内源基因座处(即，在核苷酸序列位于野生型非人类动物中的位置处)。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列在基因组中的异位基因座处(例如，在不同于其基因组中的内源免疫球蛋白链基因座的基因座处，或在其内源基因座内，例如，在免疫球蛋白可变基因座内，其中内源基因座放置或移动至基因组中的不同位置)。在一些实施方案中，例如，约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的全部内源功能性重链V、D或J基因区段缺失或促使无功能。在一些实施方案中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源功能性重链V、D或J基因区段缺失或促使无功能。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类轻链恒定区基因序列(κ或λ)。
在一些实施方案中，遗传修饰的非人类动物包含使内源功能性VH、D以及JH重链可变基因区段和内源功能性轻链可变VL和JL基因区段缺失或促使其无功能的修饰；并且包含(i)重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，以及(ii)编码未重排的人类免疫球蛋白轻链V基因区段(VL)和未重排的人类免疫球蛋白轻链J基因区段(JL)的核苷酸序列(即，在核苷酸序列位于野生型非人类动物中的位置处)，或在异位位置处(例如，在不同于其基因组中的内源免疫球蛋白链基因座的基因座处，或在其内源基因座内，例如，在免疫球蛋白可变区基因座内，其中内源基因座放置或移动至基因组中的不同位置)。在一些实施方案中，遗传修饰的非人类动物包含使内源功能性VH、D以及JH重链可变基因区段和内源功能性轻链可变VL和JL基因区段缺失或促使其无功能的修饰；并且包含(i)重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，以及(ii)一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)，其在内源位置处(即，在核苷酸序列位于野生型非人类动物中的位置处)或在异位位置处(例如，在不同于其基因组中的内源免疫球蛋白链基因座的基因座处，或在其内源基因座内，例如，在免疫球蛋白可变区基因座内，其中内源基因座放置或移动至基因组中的不同位置)。在一些实施方案中，例如，约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的全部内源功能性重链V、D或J基因区段缺失或促使无功能。在一些实施方案中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源功能性重链V、D或J基因区段缺失或促使无功能。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类轻链恒定区基因序列(κ或λ)。
各种实施方案涵盖轻链可变域。编码轻链可变域的核酸序列可以用于制造本文所描述的遗传修饰的非人类，可以由所述动物表达，和/或可以编码存在于由所述动物产生(或来源于由所述动物多样化的序列)的抗体中的氨基酸。在一些实施方案中，轻链可变域是人类κ轻链可变域。在一些实施方案中，轻链可变域是小鼠κ轻链可变域。在一些实施方案中，轻链可变域是大鼠κ轻链可变域。在一些实施方案中，轻链可变域是人类λ轻链可变域。在一些实施方案中，轻链可变域是小鼠λ轻链可变域。在一些实施方案中，轻链可变域是大鼠λ轻链可变域。
在各种实施方案中，本文所描述的遗传修饰的非人类动物所产生的轻链可变域由一个或多个小鼠或人类免疫球蛋白κ轻链可变基因区段编码。在一些实施方案中，一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含约3兆碱基的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座。在一些实施方案中，一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的至少137个Vκ基因区段、至少五个Jκ基因区段或其组合。在一些实施方案中，一个或多个人类免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含约一半兆碱基的人类免疫球蛋白κ轻链基因座。在特定实施方案中，一个或多个人类免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含人类免疫球蛋白κ轻链基因座的近端重复(关于免疫球蛋白κ恒定区)。在一些实施方案中，一个或多个人类免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含人类免疫球蛋白κ轻链基因座的至少40个Vκ基因区段、至少五个Jκ基因区段或其组合。
在特定实施方案中，遗传修饰的非人类动物进一步包含编码未重排的人类免疫球蛋白轻链(VL)基因区段和未重排的人类免疫球蛋白轻链(JL)基因区段的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码未重排的轻链V基因区段和未重排的轻链J基因区段的核苷酸序列操作性地连接至免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在其它实施方案中，编码未重排的轻链V基因区段和未重排的轻链J基因区段的核苷酸序列操作性地连接至免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，未重排的人类免疫球蛋白轻链V(VL)基因区段和未重排的人类免疫球蛋白J(JL)基因区段在内源啮齿动物基因座处操作性地连接至啮齿动物免疫球蛋白轻链恒定区基因；例如，κ或λ轻链恒定区基因。
在各种实施方案中，未重排的人类可变区基因区段(例如，人类Vκ基因区段)能够重排并编码抗体的人类可变域。在一些实施方案中，非人类动物不包含内源VL基因区段。在一些实施方案中，由非人类动物表达的人类Vκ基因区段选自由以下组成的群组：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41以及Vκ7-3。在一些实施方案中，本文所描述的遗传修饰的非人类动物表达所有功能性人类Vκ基因。在一些实施方案中，人类Vκ基因区段包含Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5以及Vκ1-6。在一些实施方案中，Vκ基因区段包含Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15以及Vκ1-16。在一些实施方案中，人类Vκ基因区段包含Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29以及Vκ2-30。在一些实施方案中，人类Vκ基因区段包含Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39以及Vκ2-40。在各种实施方案中，非人类动物包含五个人类Jκ基因区段，例如，Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4以及Jκ5基因区段。在特定实施方案中，Vκ基因区段包含从Vκ4-1至Vκ2-40跨越人类免疫球蛋白κ轻链基因座的连续人类免疫球蛋白κ基因区段，并且Jκ基因区段包含从Jκ1至Jκ5跨越人类免疫球蛋白κ轻链基因座的连续基因区段。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座包含两个人类VL基因区段Vκ1-39和Vκ3-20。在一些实施方案中，一个或多个(例如，2个、3个、4个或5个)人类VL基因区段和两个或更多个人类JL基因区段存在于内源轻链基因座处，例如，内源κ轻链基因座处。在一些实施方案中，遗传修饰的非人类动物是包含功能性λ轻链基因座的小鼠。在其它实施方案中，小鼠包含非功能性λ轻链基因座。在一些实施方案中，一个或多个人类VH、一个或多个人类DH以及一个或多个人类JH基因区段操作性地连接至小鼠或大鼠重链恒定区序列(即，一个或多个人类VL基因区段和两个或更多个人类JL基因区段存在于内源重链基因座处)。
在一些实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的非人类动物(例如，小鼠或大鼠)表达重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(即，产生包含重排的重链可变域的抗原结合蛋白)以及一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个等由Vκ基因编码的轻链可变域，所述Vκ基因选自由以下组成的群组：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41以及Vκ7-3。
在各种实施方案中，轻链可变区基因区段(例如，人类轻链可变区基因区段)中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。在一些实施方案中，如本文所描述的轻链可变域在酸性pH下与中性pH相比展现至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍的离解半衰期(t1/2)减小。在一些实施方案中，在酸性pH下与中性pH相比t1/2减小约30倍或更多倍。在一些实施方案中，VL基因区段中的至少一者包含用组氨酸密码子取代至少一个由对应的人类种系VL区段序列编码的非组氨酸密码子。在一些实施方案中，取代是一个、两个、三个或四个密码子(例如，三个或四个密码子)的取代。在一些实施方案中，取代是在CDR3密码子中。在一些实施方案中，人类VL基因区段是人类Vκ1-39和Vκ3-20基因区段，并且人类Vκ1-39和Vκ3-20基因区段中的每一者包含用组氨酸密码子取代至少一个由对应的人类种系VL基因区段编码的非组氨酸密码子。在一些实施方案中，人类Vκ1-39和Vκ3-20基因区段中的每一者包含三个或四个组氨酸密码子的取代。在一些实施方案中，三个或四个取代是在CDR3区中。在一些实施方案中，取代是人类Vκ1-39基因区段的三个非组氨酸密码子的取代，其中这种取代经过设计以表达位置106、108以及111处的组氨酸。在一些实施方案中，取代是人类Vκ1-39基因区段的四个非组氨酸密码子的取代，并且这种取代经过设计以表达位置105、106、108以及111处的组氨酸(参看例如US2013/0247234A1和WO2013/138680，以引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，取代是人类Vκ3-20基因区段的三个非组氨酸密码子的取代，并且这种取代经过设计以表达位置105、106以及109处的组氨酸。在额外实施方案中，取代是人类Vκ3-20基因区段的四个非组氨酸密码子的取代，并且这种取代经过设计以表达位置105、106、107以及109处的组氨酸。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座包含一个或多个但小于野生型数目的人类VL基因区段和一个或多个，例如两个或更多个人类JL基因区段，其中人类VL基因区段中的每一者包含至少一个不由对应的人类种系VL基因区段编码的组氨酸密码子。在各种实施方案中，包含如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物在用所关注的抗原刺激后，表达包含来源于人类VL基因区段的氨基酸序列的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白在由至少一个引入人类VL基因区段中的组氨酸密码子编码的氨基酸位置处保留至少一个组氨酸残基。在一些实施方案中，动物表达对抗原起反应的抗原结合蛋白的群体，其中这个群体中的所有抗原结合蛋白包含(a)来源于人类VL基因区段和JL基因区段的重排的免疫球蛋白轻链可变域，其中人类VL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系VL基因区段编码的组氨酸密码子，以及(b)包含由重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码的人类重链可变域的免疫球蛋白重链。
各种实施方案涵盖轻链恒定区序列。在一些实施方案中，例如，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)操作性地连接至重链恒定区基因序列，并且编码人类轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的情况下)操作性地连接至轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)操作性地连接至轻链恒定区基因序列，并且编码人类轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的情况下)操作性地连接至重链恒定区基因序列。在各种实施方案中，操作性地连接至重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的轻链恒定区序列是人类κ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，操作性地连接至重排的重链可变域的轻链恒定区序列是小鼠κ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，操作性地连接至重排的重链可变域的轻链恒定区序列是大鼠κ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，操作性地连接至重排的重链可变域的轻链恒定区序列是人类λ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，操作性地连接至重排的重链可变域的轻链恒定区序列是小鼠λ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，操作性地连接至重排的重链可变域的轻链恒定区序列是大鼠λ轻链恒定区序列。
在各种方面，提供了非人类动物，其包含编码重排的重链可变域的遗传修饰的免疫球蛋白基因座(即，在免疫球蛋白基因座包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中重排的重链可变域包含经由间隔子操作性地连接至重链J区段(JH)序列的重链可变(VH)序列，其中间隔子包含至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至非人类重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人类重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重链恒定区包含选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至非人类轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人类轻链恒定区基因序列是小鼠或大鼠恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，间隔子是单个氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子是两个氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子是三个氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子是四个氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子是五个氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子是六个氨基酸残基。
在另一个方面，提供了遗传修饰的非人类动物和制造所述动物的方法，其中这些动物包含功能性通用轻链(“ULC”)免疫球蛋白基因座。在一些实施方案中，所述动物进一步包含重排的重链可变域基因座(即，包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的重链可变域免疫球蛋白基因座)。ULC是可以按双特异性格局使用的共同轻链，其含有一定功能，例如影响FcRn结合以改善半衰期的修饰，例如包含结合抗原的重链和结合FcRn的轻链的双特异性。举例来说，用FcRN使如本文所描述的遗传修饰的小鼠免疫，以获得仅仅通过轻链结合FcRN的抗体。由遗传修饰的非人类动物产生的这些轻链用作帮助双特异性抗体与FcRn缔合，从而有助于增加半衰期的ULC。选择抗体的其余部分(例如，第二个不同轻链，或结合不同于FcRn的抗原的重链)以执行第二种功能。如本文所描述的实施方案中所用的ULC还可以用于产生抗体可变链序列，其多样性主要是通过体细胞突变(例如，高频突变)的过程而产生，从而阐明了抗原结合能力得益于后基因组事件的抗体可变链序列。
各种方面包括遗传修饰的非人类动物，在其基因组中包含重排的人类重链可变区核酸序列，并且在其基因组中进一步包含编码克隆至恒定区核酸序列上的如本文所描述的轻链可变域的核酸，这种恒定区核酸序列选自κ恒定区、λ恒定区、重链恒定区(例如，选自由CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合组成的群组)。在一些实施方案中，轻链可变区核酸序列克隆至第一人类重链恒定区核酸序列上，并且第二轻链可变域克隆至第二人类重链恒定区核酸序列上；其中第一和第二人类重链恒定区核酸序列是相同的，第一轻链可变域特异性地结合第一抗原，并且第二轻链可变域特异性地结合第二抗原。在这些实施方案中，形成两个多肽的二聚体，其中融合至重链恒定区的轻链可变域中的每一者展现不同的抗原结合特异性。
在另一个方面，提供了遗传修饰的非人类动物(例如，小鼠)，其能够产生结合横穿血脑屏障的受体或其它部分，例如转铁蛋白受体的轻链。先前的研究已经显示，针对转铁蛋白受体的低亲和力抗体将横穿血脑屏障并且因低亲和力而释放。因此，在一些实施方案中，本文所描述的遗传修饰的动物(例如，小鼠)用于制造针对能够横穿血脑屏障的部分(例如，转铁蛋白受体)的低亲和力抗体，其中低亲和力抗体是双特异性的并且包含对所需标靶的第二结合特异性(即，抗体结合横穿部分，并且也结合与横穿部分不同的标靶)。
提供了制造和使用本文所描述的遗传修饰的非人类动物的方法。提供了将与免疫球蛋白重链或轻链恒定区核酸序列操作性地连接的重排的人类重链可变区核酸序列放置于非人类动物的基因组中的方法。在各种实施方案中，恒定区核酸序列是人类或非人类的，并且非人类动物是啮齿动物。在各种实施方案中，这些方法包括制造非人类动物，其进一步包含有包含操作性地连接至人类或非人类轻链恒定区核酸序列的一个或多个但小于野生型数目的人类轻链可变区基因区段，例如两个人类Vκ基因区段和一个或多个人类Jκ基因区段的免疫球蛋白轻链基因座。在各种方面，这些方法包括采用例如转基因技术，包括例如采用具有宿主胚胎的修饰的多能或全能供体细胞(例如，ES细胞或iPS细胞)、生殖细胞(例如，***)等，将前述序列放置于非人类动物(例如，啮齿动物)的种系中。因此，实施方案包括在非人类生殖细胞的基因组中的非人类免疫球蛋白重链基因座，其包含操作性地连接至重链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中恒定区基因序列包含非人类序列、人类序列或其组合。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至内源非人类免疫球蛋白恒定区基因序列。在一些实施方案中，内源非人类免疫球蛋白恒定区基因序列是小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。
在各种方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其中这种方法包括：(a)修饰非人类动物的基因组以使内源功能性免疫球蛋白重链V、D以及J基因区段缺失或促使其无功能；以及(b)在基因组中放置重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列。在一个所述方面，提供了制造表达来自非人类动物的种系中的重排的重链基因序列的单个免疫球蛋白重链的非人类动物的方法，这种方法包括以下步骤：对非人类动物进行遗传修饰以使得其整个抗体表达成熟B细胞群体表达来源于以下的重链：(i)单个VH基因区段；(ii)一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的氨基酸间隔子；以及(iii)单个JH基因区段。在一些方面，这种方法包括用如本文所描述的单个重排的重链基因灭活或置换内源重链免疫球蛋白可变基因座。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座的非人类动物的方法，所述方法包括：(a)修饰非人类动物的基因组以使内源功能性免疫球蛋白重链V、D以及J基因区段缺失或促使其无功能；以及(b)在基因组中放置重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，实质上所有内源功能性VH、D以及JH基因区段从非人类动物的免疫球蛋白重链基因座缺失或促使无功能(例如，经由***核苷酸序列(例如，外源核苷酸序列***免疫球蛋白基因座中)，或经由内源VH、D、JH区段的非功能性重排或倒置)。在一些实施方案中，这种方法包括将重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(即，编码重排的重链可变域的核苷酸序列)***内源位置中(即，靶向核苷酸序列位于野生型非人类动物中的位置)。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列异位存在(例如，在不同于其基因组中的内源免疫球蛋白链基因座的基因座处，或在其内源基因座内，例如，在免疫球蛋白可变基因座内，其中内源基因座放置或移动至基因组中的不同位置)。在一些实施方案中，例如，约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的全部内源功能性V、D或J基因区段缺失或促使无功能。在一些实施方案中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源功能性重链V、D或J基因区段缺失或促使无功能。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其包括：(a)修饰非人类动物的基因组以使内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段缺失或促使其无功能；以及(b)在内源免疫球蛋白轻链基因座中放置重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(即，编码重排的重链可变域的核苷酸序列)，其中这种核苷酸序列操作性地连接至轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，遗传工程改造的免疫球蛋白基因座存在于非人类动物的种系基因组中。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至小鼠或大鼠κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至小鼠或大鼠λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类λ轻链恒定区基因序列。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其包括：(a)修饰非人类动物的基因组以使下列区段缺失或促使其无功能：(i)内源功能性免疫球蛋白重链V、D以及J基因区段，以及(ii)内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及(b)在基因组中放置：(i)编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至轻链恒定区基因序列，以及(ii)编码人类免疫球蛋白轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，遗传工程改造的免疫球蛋白基因座存在于非人类动物的种系基因组中。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至小鼠或大鼠κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至人类κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至小鼠或大鼠λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列操作性地连接至人类λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，人类免疫球蛋白轻链可变域是κ轻链可变域。因此，在一些实施方案中，第二核苷酸序列是人类κ轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，人类免疫球蛋白轻链可变域是λ轻链可变域。因此，在一些实施方案中，第二核苷酸序列是人类λ轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列是非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其包括：(a)修饰非人类动物的基因组以使下列区段缺失或促使其无功能：(i)内源功能性免疫球蛋白重链V、D以及J基因区段，以及(ii)内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及(b)在基因组中放置：(i)编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至重链恒定区基因序列，以及(ii)编码人类免疫球蛋白轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是小鼠或大鼠κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是人类κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是小鼠或大鼠λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是人类λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，人类免疫球蛋白轻链可变域是κ轻链可变域。在一些实施方案中，人类免疫球蛋白轻链可变域是λ轻链可变域。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列是非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座的非人类动物的方法，其包括：(a)修饰非人类动物的基因组以使内源功能性免疫球蛋白重链V、D以及J基因区段缺失或促使其无功能；以及(b)在基因组中放置重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列包含经由间隔子操作性地连接至重链J基因区段(JH)序列的重链V基因区段(VH)序列，其中间隔子包含至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人类免疫球蛋白重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至非人类免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人类免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是小鼠或大鼠免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列存在于内源位置处(即，在核苷酸序列位于野生型非人类动物中的位置处)。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列异位存在(例如，在不同于其基因组中的内源免疫球蛋白链基因座的基因座处，或在其内源基因座内，例如，在免疫球蛋白可变基因座内，其中内源基因座放置或移动至基因组中的不同位置)。在一些实施方案中，间隔子是单个氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子是两个氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子是三个氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子是四个氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子是五个氨基酸残基。在一些实施方案中，间隔子是六个氨基酸残基。在一些实施方案中，核苷酸序列编码操作性地连接至重链恒定域基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的两个拷贝、三个拷贝、四个拷贝或更多个拷贝。在一些实施方案中，核苷酸序列编码操作性地连接至重链恒定域基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
提供了制造非人类动物的方法，其包括：(a)修饰非人类动物的基因组以使下列区段缺失或促使其无功能：(i)内源功能性免疫球蛋白重链VH、D和/或JH基因区段，以及(ii)内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及(b)放置(i)在重链基因座处的重排的重链可变区核酸序列，其中重排的重链可变区核酸序列包含经由间隔子操作性地连接至重链J基因区段(JH)序列的重链V基因区段(VH)序列，其中间隔子包含至少一个氨基酸残基；以及(ii)操作性地连接至人类或非人类轻链恒定区核酸序列的一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(例如，两个人类Vκ基因区段和至少一个人类Jκ基因区段)。在一些实施方案中，轻链可变区基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。
在一些方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其包括：
(a)修饰非人类动物的基因组以使内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段缺失或促使其无功能；以及
(b)在非人类动物的基因组中放置操作性地连接至轻链恒定区核苷酸序列的重排的人类重链可变区核苷酸序列。
在各种实施方案中，非人类动物是啮齿动物，例如，小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，轻链恒定区是大鼠或小鼠恒定区，例如，大鼠或小鼠Cκ恒定区。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其包括：
(a)修饰非人类动物的基因组以使下列区段缺失或促使其无功能：
(i)内源功能性免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，以及
(ii)内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及
(b)在非人类动物的基因组中放置：
(i)编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至轻链恒定区基因序列，以及
(ii)编码人类或非人类轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至重链恒定区基因序列。
在各种实施方案中，非人类动物是啮齿动物，例如，小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，轻链恒定区是大鼠或小鼠恒定区，例如，大鼠或小鼠Cκ恒定区。在一些实施方案中，第二核苷酸序列操作性地连接至选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，第二核苷酸序列操作性地连接至选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的人类重链恒定区基因序列。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其包括：
(a)修饰非人类动物的基因组以使下列区段缺失或促使其无功能：
(i)内源功能性免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，以及
(ii)内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及
(b)在非人类动物的基因组中放置：
(i)编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至重链恒定区基因序列；以及
(ii)编码轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至轻链恒定区基因序列。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其包括：
(a)修饰非人类动物的基因组以使下列区段缺失或促使其无功能：
(i)内源功能性免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，以及
(ii)内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及
(b)在非人类动物的基因组中放置：
(i)第一等位基因，其包含：
(1)操作性地连接至重链恒定区基因序列的编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，以及
(2)操作性地连接至轻链恒定区基因序列的编码轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的情况下)；以及
(ii)第二等位基因，其包含：
(1)操作性地连接至重链恒定区基因序列的编码轻链可变域的第三核苷酸序列(即，在第三核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的情况下)，以及
(2)操作性地连接至轻链恒定区基因序列的编码重排的重链可变域的第四核苷酸序列(即，在第四核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座的非人类动物的方法，其包括：(a)修饰非人类动物的基因组以使内源功能性免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段缺失或促使其无功能；以及(b)在基因组中放置重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列包含经由间隔子操作性地连接至重链J基因区段(JH)序列的重链V基因区段(VH)序列，其中间隔子包含至少一个氨基酸残基。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其包括：
(a)修饰非人类动物的基因组以使下列区段缺失或促使其无功能：
(i)内源功能性免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，以及
(ii)内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及
(b)在非人类动物的基因组中放置：
(i)操作性地连接至重链恒定区核苷酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列；以及
(ii)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段。
在各种实施方案中，非人类动物是啮齿动物，例如，小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，轻链恒定区是大鼠或小鼠恒定区，例如，大鼠或小鼠Cκ恒定区。在一些实施方案中，重排的人类重链可变区核酸序列操作性地连接至选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排的重链可变区核酸序列操作性地连接至选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的人类重链恒定区基因序列。
在另一个方面，提供了制造包含遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物的方法，其包括：
(a)修饰非人类动物的基因组以使下列区段缺失或促使其无功能：
(i)内源功能性免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，以及
(ii)内源功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及
(b)在非人类动物的基因组中放置：
(i)操作性地连接至轻链恒定区核苷酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列；以及
(ii)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段。
在各种实施方案中，非人类动物是啮齿动物，例如，小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方案中，轻链恒定区是大鼠或小鼠恒定区，例如，大鼠或小鼠Cκ恒定区。
在另一个方面，提供了编码重排的重链可变域的核酸序列(即，作为重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的核苷酸序列；即，预先重排的可变重链VDJ核苷酸序列)。在一些实施方案中，核酸序列来源于人类V、D以及J基因序列或区段。在一些实施方案中，核酸序列来源于人类种系V区段、人类种系D区段以及人类种系J区段。在一些实施方案中，人类VH区段对应于在人类群体中所观测到的变体。在各种实施方案中，核酸序列包含选自由以下组成的群组的人类V基因：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81，以及其多态变体。在一些实施方案中，人类V区段是VH3-23或其多态变体。在各种实施方案中，核酸序列包含选自由以下组成的群组的人类D基因区段：D1-1、D1-7、D1-14、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-12、D5-5、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D6-25、D7-27，以及其多态变体。在一些实施方案中，核酸序列包含在动物中非自体反应(非免疫原性)的人类D区段。在一些实施方案中，核酸序列包含能够在小鼠的成熟B细胞的重链可变序列中表达的人类D区段。在一些实施方案中，核酸序列进一步包含选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的人类或非人类动物重链恒定区基因序列。在特定实施方案中，核酸包含有包含CH1、铰链、CH2以及CH3的恒定区基因序列。在各种实施方案中，核酸序列包含选自由以下组成的群组的人类J基因区段：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6，以及其多态变体。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码人类VH3-23/GY/JH4-4的序列(SEQIDNO:137)。在一些实施方案中，核酸序列编码包含人类VH3-23/X1X2/J的序列(其中X1是任何氨基酸，并且X2是任何氨基酸)的重排的重链可变域。在一些实施方案中，X1是Gly并且X2是Tyr。在一些实施方案中，核酸序列编码包含人类VH3-23/X1X2/JH4-4的序列(其中X1是任何氨基酸，并且X2是任何氨基酸)的重排的重链可变域。在一些实施方案中，X2是包含苯基的氨基酸。在特定实施方案中，X2选自Tyr和Phe。在一些实施方案中，核酸序列进一步包含人类或非人类动物轻链恒定区基因序列。
在另一个方面，提供了核酸构建体，其包含如本文所描述的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(即，预先重排的重链VDJ序列)。在一些实施方案中，核酸构建体以使得重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至人类或非人类动物重链恒定区基因序列的方式设计。在一些实施方案中，核酸构建体含有操作性地连接至重链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的两个拷贝、三个拷贝、四个拷贝或更多个拷贝。在一些实施方案中，核酸构建体是靶向载体。在一些实施方案中，靶向载体包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者，以防止与Adam6a/6b基因缺失相关的生育力问题(参看例如US2012-0322108A1，以全文引用的方式并入)。在一些实施方案中，Adam6a和Adam6b基因放置于通用重链序列的转录单元的5'上游。在一些实施方案中，靶向载体包含侧接有重组位点的选择盒。在一些实施方案中，靶向载体包含一个或多个位点特异性重组位点(例如，loxP或FRT位点)。
在另一个方面，提供了获得能够独立于重链可变区氨基酸序列结合抗原的轻链可变区(VL)氨基酸序列的方法，其包括：(a)用所关注的抗原使如本文所描述的遗传修饰的非人类动物(例如，包含操作性地连接至重链或轻链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列的遗传修饰的动物)免疫，其中非人类动物对抗原发动免疫反应；以及(b)从遗传修饰的非人类动物的细胞(例如，成熟B细胞)获得特异性地结合抗原的轻链可变域的重排的轻链(VJ)核酸序列。在各种实施方案中，提供了通过所述方法产生的轻链可变区。
在一些方面，提供了获得编码能够独立于重链可变区结合抗原的免疫球蛋白轻链可变区(VL)域的核酸序列的方法，其包括：(a)用所关注的抗原或其免疫原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列，(b)允许非人类动物发动免疫反应，(c)从免疫的非人类动物中分离包含编码可以结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞，以及(d)从这种细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列是小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列是人类重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，由遗传修饰的基因座表达的重排的重链可变域是非自体反应的，即，对非人类动物没有免疫原性。在一些实施方案中，非人类动物在其基因组中进一步包含两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)。在一些实施方案中，人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，分离步骤(c)是经由荧光活化细胞分选(FACS)或流式细胞测量术来进行。在一些实施方案中，包含编码结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞包括天然杀伤细胞、T细胞或B细胞。在一些实施方案中，这种方法进一步包括(c)'使淋巴细胞与癌细胞融合的步骤。在某些实施方案中，癌细胞是骨髓瘤细胞。
因此，在各种方面，提供了获得编码能够独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域(VL)的核酸序列的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原或其免疫原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列；以及(ii)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物中分离包含编码可以结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞；以及
(d)从这种细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。
在一些实施方案中，分离步骤(c)是经由荧光活化细胞分选(FACS)或流式细胞测量术来进行。在一些实施方案中，包含编码结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞是淋巴细胞。在特定实施方案中，淋巴细胞包括天然杀伤细胞、T细胞或B细胞。在一些实施方案中，这些方法进一步包括(c)'使淋巴细胞与癌细胞融合的步骤。在特定实施方案中，癌细胞是骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，使(d)的核酸序列与编码免疫球蛋白恒定区核酸序列的核酸序列融合。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是人类κ序列或人类λ序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是小鼠κ序列或小鼠λ序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是大鼠κ序列或大鼠λ序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列是选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的人类序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列是选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的小鼠或大鼠。在一些实施方案中，(d)的核酸序列包含来源于动物的基因组中的未重排的VL基因区段的一个或多个组氨酸密码子取代或***。
在各种方面，提供了获得编码能够独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域(VL)的核酸序列的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原或其免疫原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列；以及(ii)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物中分离包含编码可以结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞；以及
(d)从这种细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。
在一些实施方案中，分离步骤(c)是经由荧光活化细胞分选(FACS)或流式细胞测量术来进行。在一些实施方案中，包含编码结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞是淋巴细胞。在特定实施方案中，淋巴细胞包括天然杀伤细胞、T细胞或B细胞。在一些实施方案中，这些方法进一步包括(c)'使淋巴细胞与癌细胞融合的步骤。在特定实施方案中，癌细胞是骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，使(d)的核酸序列与编码免疫球蛋白恒定区核酸序列的核酸序列融合。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是人类κ序列或人类λ序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是小鼠κ序列或小鼠λ序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是大鼠κ序列或大鼠λ序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列是选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的人类序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列是选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的小鼠或大鼠。在一些实施方案中，(d)的核酸序列包含来源于动物的基因组中的未重排的VL基因区段的一个或多个组氨酸密码子取代或***。
在一些方面，提供了获得编码能够独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域(VL)的核酸序列的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原或其免疫原使非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列；以及(ii)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物中分离包含编码可以结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞；以及
(d)从这种细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。
在一些实施方案中，分离步骤(c)是经由荧光活化细胞分选(FACS)或流式细胞测量术来进行。在一些实施方案中，包含编码结合抗原的轻链可变域的核酸序列的细胞是淋巴细胞。在特定实施方案中，淋巴细胞包括天然杀伤细胞、T细胞或B细胞。在一些实施方案中，这些方法进一步包括(c)'使淋巴细胞与癌细胞融合的步骤。在特定实施方案中，癌细胞是骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，使(d)的核酸序列与编码免疫球蛋白恒定区核酸序列的核酸序列融合。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是人类κ序列或人类λ序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是小鼠κ序列或小鼠λ序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列是大鼠κ序列或大鼠λ序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列是选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的人类序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列是选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合的小鼠或大鼠。在一些实施方案中，(d)的核酸序列包含来源于动物的基因组中的未重排的VL基因区段的一个或多个组氨酸密码子取代或***。
在一些方面，提供了获得编码能够独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域(VL)的核酸序列的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物收集淋巴细胞(例如，B细胞)；
(d)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；以及
e)从杂交瘤细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。
在另一个方面，提供了获得编码能够独立于重链可变区结合抗原的免疫球蛋白轻链的免疫球蛋白轻链可变域(VL)核酸序列的核酸序列的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物鉴别表达独立于重链可变区结合抗原的VL氨基酸序列的淋巴细胞(例如，B细胞)；以及
(d)从(c)的淋巴细胞克隆编码(c)的VL氨基酸序列的核酸序列。
在另一个方面，提供了获得能够独立于重链可变区结合抗原的免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至轻链恒定区基因序列；以及(ii)编码人类或非人类轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至重链恒定区基因序列；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物收集淋巴细胞(例如，B细胞)；
(d)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；以及
e)从杂交瘤细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。
在另一个方面，提供了获得编码能够独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域(VL)的核酸序列的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至轻链恒定区基因序列；以及(ii)编码人类或非人类轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至重链恒定区基因序列；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物鉴别表达独立于重链可变区结合抗原的VL氨基酸序列的淋巴细胞(例如，B细胞)；以及
(d)从(c)的淋巴细胞克隆编码(c)的VL氨基酸序列的核酸序列。
在另一个方面，提供了获得能够独立于重链可变区结合抗原的免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列；以及(ii)两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物收集淋巴细胞(例如，B细胞)；
(d)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；以及
e)从杂交瘤细胞获得编码可以结合抗原的轻链可变域(VL域)的核酸序列。
在另一个方面，提供了获得能够独立于重链可变区结合抗原的免疫球蛋白轻链的免疫球蛋白轻链可变区(VL)核酸序列的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列；以及(ii)两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物鉴别表达独立于重链可变区结合抗原的VL氨基酸序列的淋巴细胞(例如，B细胞)；以及
(d)从(c)的淋巴细胞克隆编码(c)的VL氨基酸序列的核酸序列。
在各种实施方案中，本文所描述的轻链可变域是效应子轻链可变域。在一些实施方案中，效应子轻链可变域特异性地结合FcRn以改善多特异性抗体的半衰期。举例来说，双特异性抗体包含结合抗原的重链可变域和结合FcRn的轻链可变域。在一些实施方案中，用FcRN使如本文所描述的遗传修饰的小鼠免疫，以获得仅仅通过轻链结合FcRN的抗体。由遗传修饰的非人类动物产生的这些轻链用作帮助双特异性抗体与FcRn缔合，从而有助于增加半衰期的通用或共同轻链。选择抗体的其余部分(例如，第二个不同轻链，或结合不同于FcRn的抗原的重链)以执行第二种功能。
在额外方面，提供了通过如本文所描述的任何方法可获得的遗传修饰的免疫球蛋白基因座。在各种实施方案中，还提供了通过如本文所描述的方法产生的轻链可变区和编码所述轻链可变区的核酸序列。
在一些方面，提供了在非人类动物的种系基因组中的免疫球蛋白基因座，其包含(1)操作性地连接至重链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，以及(2)操作性地连接至轻链恒定区基因序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。在一些方面，提供了在非人类动物的种系基因组中的免疫球蛋白基因座，其包含(1)操作性地连接至轻链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，以及(2)操作性地连接至重链恒定区基因序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。在一些方面，提供了在非人类动物的种系基因组中的免疫球蛋白基因座，其包含(1)操作性地连接至重链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，以及(2)编码两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)的核苷酸序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列是小鼠或大鼠轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链可变区核苷酸序列是κ轻链可变区基因序列。在一些实施方案中，轻链可变区核苷酸序列是λ轻链可变区基因序列。在一些实施方案中，轻链可变区核苷酸序列是小鼠或大鼠轻链可变区基因序列。
额外方面包括由本文所描述的遗传修饰的非人类动物制得的抗原结合蛋白(例如，抗体)。同样地，还提供了具有来源于本文所描述的遗传修饰的非人类动物或由其产生(即，从未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段表达)的轻链可变区(VL)序列的抗原结合蛋白(例如，重组抗体)。在一些实施方案中，通过如本文所描述的方法产生的抗原结合蛋白包含重链和轻链，其中重链不干扰轻链与抗原的结合，和/或重链在不存在轻链的情况下不结合抗原。在一些实施方案中，轻链可变域以在不存在重链的情况下相比存在重链的情况下高了不超过一个数量级的KD(例如，在存在重链的情况下KD为约10-10或在不存在重链的情况下KD为约10-9)结合所关注的抗原。在一些实施方案中，如本文所描述的抗原结合蛋白包括可以按低于10-6、10-7、10-8、10-9或10-10的亲和力(KD)特异性地结合所关注的抗原的免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，通过这些方法产生的免疫球蛋白轻链能够在不存在重链可变区的情况下以低于10-6、10-7、10-8、10-9或10-10的亲和力(KD)特异性地结合所关注的抗原。
在各种实施方案中，如本文所描述而产生的轻链可变域特异性地结合靶分子(“T”)。靶分子是活性或细胞外浓度需要被减弱、降低或消除的任何蛋白质、多肽或其它大分子。在许多情况下，轻链可变区所结合的靶分子是蛋白质或多肽(即，“靶蛋白”)；然而，还提供了靶分子(“T”)是轻链可变区所结合的碳水化合物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、脂多糖、或其它非蛋白质聚合物或分子的实施方案。在各种实施方案中，T可以是细胞表面表达的靶蛋白或可溶性靶蛋白。由抗原结合分子的靶结合可以在细胞外或细胞表面情形中发生。在某些实施方案中，然而，抗原结合分子结合细胞内的靶分子，例如在细胞内组分内，诸如内质网、高尔基体、核内体、溶酶体等。细胞表面表达的靶分子的实例包括细胞表面表达的受体、膜结合的配体、离子通道，以及具有附着至细胞膜或与细胞膜缔合的细胞外部分的任何其它单体或多聚体多肽组分。可以被本文所提供的多特异性抗原结合分子靶向的非限制性、例示性的细胞表面表达的靶分子包括例如细胞因子受体(例如，IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-22、IL-25、IL-33等的受体)，以及细胞表面标靶，包括其它1型跨膜受体，诸如PRLR，G蛋白偶合受体，诸如GCGR，离子通道，诸如Nav1.7、ASIC1或ASIC2，非受体表面蛋白，诸如MHC-I(例如，HLA-B*27)等。在T是细胞表面表达的靶蛋白的实施方案中，多特异性抗原结合分子的D1组分可以是例如特异性地结合T的抗体或抗体的抗原结合片段，或特异性地与细胞表面表达的靶蛋白相互作用的配体或配体的部分。举例来说，如果T是IL-4R，那么D1组分可以包含IL-4或其受体结合部分或由IL-4或其受体结合部分组成。可溶性靶分子的实例包括细胞因子、生长因子，以及其它配体和信号传导蛋白。可以被本文所提供的多特异性抗原结合分子靶向的非限制性、例示性的可溶性靶蛋白包括例如IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-22、IL-25、IL-33、SOST、DKK1等。可溶性靶分子还包括例如非人类靶分子，诸如过敏原(例如，FelD1、Betv1、CryJ1)、病原体(例如，白色念珠菌(Candidaalbicans)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)等)，以及病原性分子(例如，脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(lipotechoicacid，LTA)、蛋白质A、毒素等)。在T是可溶性靶分子的实施方案中，多特异性抗原结合分子的D1组分可以是例如特异性地结合T的抗体或抗体的抗原结合片段，或特异性地与可溶性靶分子相互作用的受体或受体的部分。举例来说，如果T是IL-4，那么D1组分可以包含IL-4R或其配体结合部分或由IL-4R或其配体结合部分组成。靶分子还包括肿瘤相关抗原。
在另一个方面，抗原结合蛋白(例如，双特异性或三特异性抗体)可以利用来源于包含具有重排的人类重链可变区核酸序列的免疫球蛋白基因座的非人类动物(即，包含预先设计的、重排的重链VDJ序列的动物)(即，具有由这种动物产生的人类轻链可变区(VL)序列)的抗原特异性轻链可变域来制备。所述抗原特异性反向嵌合(例如，人类可变/小鼠恒定)轻链可以用于得到可以同框克隆至具有适合的人类轻链恒定区序列的表达载体中的抗原特异性轻链可变区序列。来自包含具有重排的人类重链可变区核酸序列的免疫球蛋白基因座的动物(即，包含预先设计的、重排的重链VDJ序列的小鼠)的抗原特异性人类重链可变区(对相同或不同抗原上与抗原特异性轻链不同的表位具特异性)可以同框克隆至包含人类重链恒定区序列的表达载体中，并且抗原特异性人类轻链和重链可以在适合的细胞中共同表达以获得抗原结合蛋白(例如，双特异性或三特异性人类抗体)。或者，先前所选的抗原特异性重链，例如，来自包含来源于与重排的人类重链可变区核酸序列中所用的相同的可变区基因区段的轻链的抗体的重链，可以同框克隆至包含人类重链恒定区序列的表达载体中，并且抗原特异性人类轻链和重链可以在适合的细胞中共同表达以获得抗原结合蛋白(例如，双特异性或三特异性人类抗体)。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至非人类重链恒定区基因序列(例如，小鼠或大鼠，κ或λ)。在一些实施方案中，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至非人类轻链恒定区基因序列(例如，小鼠或大鼠，κ或λ)。在一些实施方案中，人类轻链可变区(VL)序列是κ基因序列。
在另一个方面，提供了制造多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原使含有如本文所描述的第一遗传修饰的免疫球蛋白基因座的第一非人类动物免疫，其中第一非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列；
(b)允许第一非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的第一非人类动物收集第一淋巴细胞(例如，B细胞)，其中第一淋巴细胞表达亲和力成熟抗体，其中亲和力成熟抗体包含融合至非人类恒定域的人类可变域；
(d)鉴别编码亲和力成熟抗体的人类轻链可变域的核酸序列；
(e)将(d)的核酸序列在第一表达构建体中与适合的人类恒定区核酸序列(例如，人类λ或κ序列)同框克隆以形成第一多肽基因；
(f)用所关注的第二抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的第二非人类动物免疫，其中第二非人类动物在其基因组中包含(i)连接至非人类重链恒定区核酸序列的未重排的人类V、D以及J基因区段；以及(ii)单个重排的人类轻链可变区序列；
(g)允许第二非人类动物发动免疫反应；
(h)从免疫的第二非人类动物收集第二淋巴细胞，其中第二淋巴细胞表达亲和力成熟抗体，其中亲和力成熟抗体包含融合至非人类恒定域的人类重链可变域；
(i)鉴别编码特异性地结合第二抗原的亲和力成熟抗体的人类重链可变域的核酸序列；
(j)将(i)的核酸序列在第二表达构建体中与适合的人类恒定区核酸序列(例如，人类IgG1恒定序列)同框克隆以形成第二多肽基因；以及
(k)将第一表达构建体和第二表达构建体引入适合于表达第一多肽基因和第二多肽基因的细胞中以形成包含第二多肽的二聚体的抗原结合蛋白，其中第二多肽的每个单体与第一多肽的单体缔合。
在各种实施方案中，第一表达构建体和第二表达构建体在独立的载体上。在各种实施方案中，第一表达构建体和第二表达构建体在相同的载体上。在各种实施方案中，第一抗原和第二抗原是不同的。在一个实施方案中，第一抗原和第二抗原是相同的。在各种实施方案中，第一抗原是细胞表面受体，并且第二抗原选自可溶性抗原和结合至细胞表面的抗原。在特定实施方案中，第一抗原是Fc受体(例如，FcRN)，第二抗原是可溶性蛋白质，并且抗原结合蛋白包含来源于非人类动物的基因组中的VL基因区段的一个或多个组氨酸取代和***。
在另一个方面，提供了制造多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原使含有如本文所描述的第一遗传修饰的免疫球蛋白基因座的第一非人类动物免疫，其中第一非人类动物在其基因组中包含(i)编码重排的重链可变域的第一核苷酸序列(即，在第一核苷酸序列是重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的情况下)，其中第一核苷酸序列操作性地连接至轻链恒定区基因序列；以及(ii)编码人类或非人类轻链可变域的第二核苷酸序列(即，在第二核苷酸序列是未重排的人类免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的情况下)，其中第二核苷酸序列操作性地连接至重链恒定区基因序列；
(b)允许第一非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的第一非人类动物收集第一淋巴细胞(例如，B细胞)，其中第一淋巴细胞表达亲和力成熟抗体，其中亲和力成熟抗体包含融合至非人类恒定域的人类可变域；
(d)鉴别编码亲和力成熟抗体的人类轻链可变域的核酸序列；
(e)将(d)的核酸序列在第一表达构建体中与适合的人类恒定区核酸序列(例如，人类λ或κ序列)同框克隆以形成第一多肽基因；
(f)用所关注的第二抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的第二非人类动物免疫，其中第二非人类动物在其基因组中包含(i)连接至非人类重链恒定区核酸序列的未重排的人类V、D以及J基因区段；以及(ii)单个重排的人类轻链可变区序列；
(g)允许第二非人类动物发动免疫反应；
(h)从免疫的第二非人类动物收集第二淋巴细胞，其中第二淋巴细胞表达亲和力成熟抗体，其中亲和力成熟抗体包含融合至非人类恒定域的人类重链可变域；
(i)鉴别编码特异性地结合第二抗原的亲和力成熟抗体的人类重链可变域的核酸序列；
(j)将(i)的核酸序列在第二表达构建体中与适合的人类恒定区核酸序列(例如，人类IgG1恒定序列)同框克隆以形成第二多肽基因；以及
(k)将第一表达构建体和第二表达构建体引入适合于表达第一多肽基因和第二多肽基因的细胞中以形成包含第二多肽的二聚体的抗原结合蛋白，其中第二多肽的每个单体与第一多肽的单体缔合。
在各种实施方案中，第一表达构建体和第二表达构建体在独立的载体上。在各种实施方案中，第一表达构建体和第二表达构建体在相同的载体上。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原是不同的。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原是相同的。在各种实施方案中，第一抗原是细胞表面受体，并且第二抗原选自可溶性抗原和结合至细胞表面的抗原。在特定实施方案中，第一抗原是Fc受体(例如，FcRN)，第二抗原是可溶性蛋白质，并且抗原结合蛋白包含来源于非人类动物的基因组中的VL基因区段的一个或多个组氨酸取代和***。
在另一个方面，提供了制造多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用所关注的抗原使含有如本文所描述的第一遗传修饰的免疫球蛋白基因座的第一非人类动物免疫，其中第一非人类动物在其基因组中包含(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列；以及(ii)两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许第一非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的第一非人类动物收集第一淋巴细胞(例如，B细胞)，其中第一淋巴细胞表达亲和力成熟抗体，其中亲和力成熟抗体包含融合至非人类恒定域的人类可变域；
(d)鉴别编码亲和力成熟抗体的人类轻链可变域的核酸序列；
(e)将(d)的核酸序列在第一表达构建体中与适合的人类恒定区核酸序列(例如，人类λ或κ序列)同框克隆以形成第一多肽基因；
(f)用所关注的第二抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的第二非人类动物免疫，其中第二非人类动物在其基因组中包含(i)连接至非人类重链恒定区核酸序列的未重排的人类V、D以及J基因区段；以及(ii)单个重排的人类轻链可变区序列，其中单个重排的人类轻链可变区序列来源于与编码步骤(c)的轻链可变域的VL基因区段相同的VL基因区段；
(g)允许第二非人类动物发动免疫反应；
(h)从免疫的第二非人类动物收集第二淋巴细胞，其中第二淋巴细胞表达亲和力成熟抗体，其中亲和力成熟抗体包含融合至非人类恒定域的人类重链可变域；
(i)鉴别编码特异性地结合第二抗原的亲和力成熟抗体的人类重链可变域的核酸序列；
(j)将(i)的核酸序列在第二表达构建体中与适合的人类恒定区核酸序列(例如，人类IgG1恒定序列)同框克隆以形成第二多肽基因；以及
(k)将第一表达构建体和第二表达构建体引入适合于表达第一多肽基因和第二多肽基因的细胞中以形成包含第二多肽的二聚体的抗原结合蛋白，其中第二多肽的每个单体与第一多肽的单体缔合。
在各种实施方案中，第一表达构建体和第二表达构建体在独立的载体上。在各种实施方案中，第一表达构建体和第二表达构建体在相同的载体上。在各种实施方案中，第一抗原和第二抗原是不同的。在各种实施方案中，第一抗原和第二抗原是相同的。在各种实施方案中，第一抗原是细胞表面受体，并且第二抗原选自可溶性抗原和结合至细胞表面的抗原。在各种实施方案中，第一抗原是Fc受体(例如，FcRN)，第二抗原是可溶性蛋白质，并且抗原结合蛋白包含来源于非人类动物的基因组中的VL基因区段的一个或多个组氨酸取代和***。
在另一个方面，提供了制造多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用第一抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列；以及(ii)一个或多个人类免疫球蛋白VL和JL基因区段；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物收集淋巴细胞(例如，B细胞)，其中淋巴细胞表达包含融合至小鼠免疫球蛋白恒定域的人类免疫球蛋白轻链可变域的亲和力成熟抗体；
(d)鉴别编码亲和力成熟抗体的人类轻链可变域的第一核酸序列；
(e)将(d)的第一核酸序列与人类轻链恒定区核酸序列同框克隆至第一表达载体中；
(f)向宿主细胞中引入：(i)包含与人类轻链恒定区核酸序列同框的第一核酸序列的第一表达载体；以及(ii)包含编码融合至人类重链恒定区的第一抗原特异性重链可变域的第二核酸序列的第二表达载体；
(g)培养宿主细胞以允许表达多特异性抗体；以及
(h)分离多特异性抗体，其中多特异性抗体包含第一抗原特异性重链和轻链可变域，其中多特异性抗体的重链可变域展现不同于轻链可变域的抗原结合特异性。
在各种实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是三特异性抗体，并且步骤(f)进一步包括引入包含编码与人类重链恒定区序列融合的第二抗原特异性重链可变域的第三核酸序列的第三表达载体。
在另一个方面，提供了制造多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括：
(a)用第一抗原使含有如本文所描述的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的重链可变域；以及(ii)一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白VL和JL基因区段；
(b)允许非人类动物发动免疫反应；
(c)从免疫的非人类动物收集淋巴细胞(例如，B细胞)，其中淋巴细胞表达包含融合至小鼠免疫球蛋白恒定域的人类免疫球蛋白轻链可变域的亲和力成熟抗体；
(d)鉴别编码亲和力成熟抗体的人类轻链可变域的第一核酸序列；
(e)将(d)的第一核酸序列与人类轻链恒定区核酸序列同框克隆至第一表达载体中；
(f)向宿主细胞中引入：(i)包含与人类轻链恒定区核酸序列同框的第一核酸序列的第一表达载体；以及(ii)包含编码融合至人类重链恒定区的第一抗原特异性重链可变域的第二核酸序列的第二表达载体；
(g)培养宿主细胞以允许表达多特异性抗体；以及
(h)分离多特异性抗体，其中多特异性抗体包含第一抗原特异性重链和轻链可变域，其中多特异性抗体的重链可变域展现不同于轻链可变域的抗原结合特异性。
在各种实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是三特异性抗体，并且步骤(f)进一步包括引入包含编码与人类重链恒定区序列融合的第二抗原特异性重链可变域的第三核酸序列的第三表达载体。
在另一个方面，提供了制造包含可以独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域的抗原结合蛋白的方法。所述方法包括
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使遗传修饰的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：
(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列；以及
(ii)操作性地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物对第一表位或其免疫原性部分发动免疫反应；
(c)从非人类动物中分离包含编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列的细胞；
(d)从(c)的细胞获得编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列；
(e)在表达构建体中采用(d)的核酸序列，融合至人类免疫球蛋白恒定区核酸序列；以及
(f)在表达特异性地结合第二抗原或表位的人类免疫球蛋白重链的生产细胞系中表达(d)的核酸序列以形成抗原结合蛋白，其轻链由(d)的核酸编码并且独立于重链结合第一表位或其免疫原性部分，并且其重链特异性地结合第二抗原或表位。
在一些实施方案中，未重排的人类轻链VL或JL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。在一些实施方案中，第一表位来源于细胞表面受体。在一些实施方案中，细胞表面受体是Fc受体。在特定实施方案中，Fc受体是FcRn。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于可溶性抗原。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于细胞表面受体。在一些实施方案中，第一抗原是Fc受体，第二抗原是可溶性蛋白质，并且抗原结合蛋白包含来源于非人类动物的基因组中的VL基因区段的一个或多个组氨酸取代和***。
在另一个方面，提供了制造包含可以独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域的抗原结合蛋白的方法。所述方法包括
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使遗传修饰的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：
(i)操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列；以及
(ii)操作性地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物对第一表位或其免疫原性部分发动免疫反应；
(c)从非人类动物中分离包含编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列的细胞；
(d)从(c)的细胞获得编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列；
(e)在表达构建体中采用(d)的核酸序列，融合至人类免疫球蛋白恒定区核酸序列；以及
(f)在表达特异性地结合第二抗原或表位的人类免疫球蛋白重链的生产细胞系中表达(d)的核酸序列以形成抗原结合蛋白，其轻链由(d)的核酸编码并且独立于重链结合第一表位或其免疫原性部分，并且其重链特异性地结合第二抗原或表位。
在一些实施方案中，未重排的人类轻链VL或JL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。在一些实施方案中，第一表位来源于细胞表面受体。在一些实施方案中，细胞表面受体是Fc受体。在特定实施方案中，Fc受体是FcRn。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于可溶性抗原。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于细胞表面受体。在一些实施方案中，第一抗原是Fc受体，第二抗原是可溶性蛋白质，并且抗原结合蛋白包含来源于非人类动物的基因组中的VL基因区段的一个或多个组氨酸取代和***。
在另一个方面，提供了制造包含可以独立于重链可变域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变域的抗原结合蛋白的方法。所述方法包括
(a)用包含第一表位或其免疫原性部分的第一抗原使遗传修饰的非人类动物免疫，其中非人类动物在其基因组中包含：
(i)操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列；以及
(ii)操作性地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；
(b)允许非人类动物对第一表位或其免疫原性部分发动免疫反应；
(c)从非人类动物中分离包含编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列的细胞；
(d)从(c)的细胞获得编码特异性地结合第一表位或其免疫原性部分的轻链可变域的核酸序列；
(e)在表达构建体中采用(d)的核酸序列，融合至人类免疫球蛋白恒定区核酸序列；以及
(f)在表达特异性地结合第二抗原或表位的人类免疫球蛋白重链的生产细胞系中表达(d)的核酸序列以形成抗原结合蛋白，其轻链由(d)的核酸编码并且独立于重链结合第一表位或其免疫原性部分，并且其重链特异性地结合第二抗原或表位。
在一些实施方案中，人类轻链VL或JL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。在一些实施方案中，第一表位来源于细胞表面受体。在一些实施方案中，细胞表面受体是Fc受体。在特定实施方案中，Fc受体是FcRn。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于可溶性抗原。在一些实施方案中，第二抗原或表位来源于细胞表面受体。在一些实施方案中，第一抗原是Fc受体，第二抗原是可溶性蛋白质，并且抗原结合蛋白包含来源于非人类动物的基因组中的VL基因区段的一个或多个组氨酸取代和***。
在另一个方面，为了容易地分离本文所描述的抗原结合蛋白，对一个重链进行修饰以删除蛋白质A结合决定子，从而得到均二聚结合蛋白与异二聚结合蛋白有差异的蛋白质A结合亲和力。解决这个问题的组合物和方法描述于2013年11月19日授予的美国专利号8,586,713中，题为“具有原生免疫球蛋白格局的易分离的双特异性抗体(ReadilyIsolatedBispecificAntibodieswithNativeImmunoglobulinFormat)”，特此以引用的方式并入。一旦选择包含异二聚重链与相同轻链的物质，就可以筛选这种双特异性抗原结合蛋白以确认保留其pH依赖性抗原结合特性。
在各种方面，提供了来源于包含本文中的各种基因组修饰的非人类动物的多能细胞、诱导多能、或全能干细胞。在一些实施方案中，多能或全能细胞来源于非人类动物。在一些实施方案中，非人类动物是啮齿动物，例如，小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物是小鼠。在特定实施方案中，多能细胞是胚胎干(ES)细胞。在一些实施方案中，多能细胞在其基因组中包含：(i)包含操作性地连接至重链恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列的免疫球蛋白重链基因座；以及(ii)包含操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段的免疫球蛋白轻链基因座。在特定实施方案中，多能、诱导多能、或全能干细胞是小鼠或大鼠胚胎干(ES)细胞。在一些实施方案中，多能、诱导多能、或全能干细胞具有XX核型或XY核型。
还提供了包含含有如本文所描述的遗传修饰的细胞核的细胞，这种遗传修饰如通过原核注射引入细胞中的修饰。在另一个方面，提供了杂交瘤或四源杂交瘤，其来源于如本文所描述的非人类动物的细胞。在一些实施方案中，非人类动物是啮齿动物，诸如小鼠、大鼠或仓鼠。
在另一个方面，提供了从如本文所描述的遗传修饰的非人类动物中分离的淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是B细胞，其中B细胞包含有包含操作性地连接至人类或非人类动物(例如，小鼠或大鼠)重链或轻链恒定区基因序列的重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白基因组基因座。在一些实施方案中，B细胞能够产生如本文所描述的重排的重链可变域操作性地连接至重链或轻链恒定域的抗体。
在另一个方面，非人类动物胚胎包含一种细胞，其基因组包含：(i)包含操作性地连接至恒定区核酸序列的重排的人类重链可变区核酸序列的免疫球蛋白重链基因座；以及(ii)包含操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链可变区基因区段的免疫球蛋白轻链基因座。
在各种实施方案中，遗传修饰的非人类动物表达来源于编码重排的重链可变域和多个轻链V区段(和多个轻链J区段)的核苷酸序列的抗体谱系(例如，IgG谱系)。在一些实施方案中，遗传修饰的基因座产生包含能够以低于10-6、10-7、10-8、10-9或10-10的亲和力(KD)特异性地结合所关注的抗原的免疫球蛋白轻链的抗体群体。在一些实施方案中，由遗传修饰的基因座表达的免疫球蛋白轻链能够在不存在重链可变区的情况下以低于10-6、10-7、10-8、10-9或10-10的亲和力(KD)特异性地结合所关注的抗原。
在各种实施方案中，本文所描述的遗传修饰不影响非人类动物的生育力(参看例如US2012-0322108A1，以其全文引用的方式并入)。在一些实施方案中，重链基因座包含内源Adam6a基因、Adam6b基因或两者，并且遗传修饰不影响内源Adam6a基因、Adam6b基因或两者的表达和/或功能。在一些实施方案中，遗传修饰的非人类动物的基因组包含异位定位的Adam6a基因、Adam6b基因或两者。在一些实施方案中，Adam6a和/或Adam6b基因放置于重排的重链可变区核酸序列的转录单元的5'上游。在一些实施方案中，Adam6a和/或Adam6b基因放置于重排的重链可变区核酸序列的转录单元的3'下游。
在一些实施方案中，遗传修饰的重链基因座不包含基因间控制区1(IGCR1)核酸序列。在一些实施方案中，遗传修饰的重链基因座包含重排的重链可变区核酸序列下游的IGCR1序列。在一些实施方案中，IGCR1核酸序列存在于重排的重链可变区核酸序列与V最近端的DH基因区段之间。
在一些方面，如早先所提到，本文所描述的非人类动物的免疫球蛋白轻链基因座包含轻链可变基因区段的有限谱系，例如，(i)一个、两个或更多个但小于野生型数目的人类VL基因区段。在一些实施方案中，非人类动物是小鼠；并且免疫球蛋白轻链可变域从两个人类Vκ基因区段之一和1个、2个、3个、4个或5个人类Jκ基因区段之一的重排而产生。在一些实施方案中，小鼠所展现的(a)骨髓中表达具有λ轻链的免疫球蛋白的B细胞与(b)骨髓中表达具有κ轻链的免疫球蛋白的B细胞的比率为约1至约15。在一些实施方案中，重排包括人类Vκ1-39基因区段。在一些实施方案中，重排包括人类Vκ3-20基因区段。在一些实施方案中，两个人类Vκ基因区段在内源免疫球蛋白Vκ基因座处，并且在一些实施方案中，两个人类Vκ基因区段置换所有或实质上所有小鼠免疫球蛋白Vκ基因区段。在一些实施方案中，两个人类Vκ基因区段在内源免疫球蛋白Vκ基因座处，并且在一些实施方案中，两个人类Vκ基因区段置换所有或实质上所有小鼠免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，两个人类Vκ基因区段操作性地连接至两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个)人类Jκ基因区段。在一些其它实施方案中，小鼠的轻链可变域通过人类Vκ1-39基因区段或人类Vκ3-20基因区段和两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)人类Jκ基因区段之一的重排而产生。在一些所述实施方案中，骨髓中表达具有λ轻链的免疫球蛋白的未成熟B细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的未成熟B细胞的比率为约1至约13。在一些其它实施方案中，小鼠的轻链可变域通过人类Vκ1-39基因区段或人类Vκ3-20基因区段和两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)人类Jκ基因区段之一的重排而产生，并且骨髓中表达具有λ轻链的免疫球蛋白的成熟B细胞与表达具有κ轻链的免疫球蛋白的未成熟B细胞的比率为约1至约7。
在特定实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的小鼠的轻链可变域通过人类Vκ1-39基因区段或人类Vκ3-20基因区段和两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)人类Jκ基因区段之一的重排而产生，并且骨髓中的原B细胞群体在约2.5×104至约1.5×105个细胞(包括首尾)的范围内，例如，约2.5×104、3.0×104、3.5×104、4.0×104、4.5×104、5.0×104、5.5×104、6.0×104、6.5×104、7.0×104、7.5×104、8.0×104、8.5×104、9.0×104、9.5×104、1.0×105、或1.5×105个细胞；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约2.88×104个细胞的原B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约6.42×104个细胞的原B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约9.16×104个细胞的原B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约1.19×105个细胞的原B细胞群体。如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)的骨髓中的例示性原B细胞特征为CD19、CD43、c-kit和/或其组合(例如，CD19+、CD43+、c-kit+)的表达。在一些实施方案中，如本文所描述的啮齿动物(例如，小鼠)表达通过人类Vκ1-39基因区段或人类Vκ3-20基因区段和两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)人类Jκ基因区段之一的重排而产生的轻链，并且骨髓中的前B细胞群体在约1×106至约2×106个细胞(包括首尾)的范围内，例如，约1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、或2.0×106个细胞；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约1.25×106个细胞的前B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约1.46×106个细胞的前B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约1.64×106个细胞的前B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约2.03×106个细胞的前B细胞群体。如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)的骨髓中的例示性前B细胞特征为CD19、CD43、c-kit和/或其组合(例如，CD19+、CD43-、c-kit-)的表达。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的小鼠表达通过人类Vκ1-39基因区段或人类Vκ3-20基因区段和两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)人类Jκ基因区段之一的重排而产生的轻链，并且骨髓中的未成熟B细胞群体在约5×105至约7×105个细胞(包括首尾)的范围内，例如，约5.0×105、5.1×105、5.2×105、5.3×105、5.4×105、5.5×105、5.6×105、5.7×105、5.8×105、5.9×105、6.0×105、6.1×105、6.2×105、6.3×105、6.4×105、6.5×105、6.6×105、6.7×105、6.8×105、6.9×105、或7.0×105个细胞；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约5.33×105个细胞的未成熟B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约5.80×105个细胞的未成熟B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约5.92×105个细胞的未成熟B细胞群体；在一些实施方案中，啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约6.67×105个细胞的未成熟B细胞群体。如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)的骨髓中的例示性未成熟B细胞特征为IgM、B220和/或其组合(例如，IgM+、B220int)的表达。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的小鼠表达通过人类Vκ1-39基因区段或人类Vκ3-20基因区段和两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)人类Jκ基因区段之一的重排而产生的轻链，并且骨髓中的成熟B细胞群体在约3×104至约1.5×105个细胞(包括首尾)的范围内，例如，约3.0×104、3.5×104、4.0×104、4.5×104、5.0×104、5.5×104、6.0×104、6.5×104、7.0×104、7.5×104、8.0×104、8.5×104、9.0×104、9.5×104、1.0×105、或1.5×105个细胞；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约3.11×104个细胞的成熟B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约1.09×105个细胞的成熟B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约1.16×105个细胞的成熟B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约1.44×105个细胞的成熟B细胞群体。如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)的骨髓中的例示性成熟B细胞特征为IgM、B220和/或其组合(例如，IgM+、B220hi)的表达。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)表达通过人类Vκ1-39基因区段或人类Vκ3-20基因区段和两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)人类Jκ基因区段之一的重排而产生的轻链，并且骨髓中的总B细胞群体在约1×106至约3×106个细胞(包括首尾)的范围内，例如，约1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2.0×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、或2.0×106个细胞；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约1.59×106个细胞的总B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约1.75×106个细胞的总B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约2.13×106个细胞的总B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在骨髓中包含约2.55×106个细胞的总B细胞群体。如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)的骨髓中的例示性总B细胞特征为CD19、CD20和/或其组合(例如，CD19+)的表达。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)包含有包含两个未重排的人类免疫球蛋白Vκ基因区段和两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)未重排的人类Jκ基因区段的免疫球蛋白κ轻链基因座，其中啮齿动物(例如，小鼠)包含外周脾B细胞群体，其包含与包含免疫球蛋白κ轻链V和J基因区段的野生型补体的啮齿动物(例如，小鼠)大致相同的过渡(例如，T1、T2以及T3)B细胞群体。如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)的脾中的例示性过渡B细胞群体(例如，T1、T2以及T3)特征为IgM、CD23、CD93、B220和/或其组合的表达。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中所包含的T1B细胞群体(例如，CD93+、B220+、IgMhi、CD23-)在约2×106至约7×106个细胞(包括首尾)的范围内，例如，约2.0×106、2.5×106、3.0×106、3.5×106、4.0×106、4.5×106、5.0×106、5.5×106、6.0×106、6.5×106、或7.0×106个细胞；在一些实施方案中，如本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约2.16×106个细胞的T1B细胞群体；在一些实施方案中，如本文所描述的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约3.63×106个细胞的T1B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约3.91×106的T1B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约6.83×106个细胞的T1B细胞群体。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中所包含的T2B细胞群体(例如，CD93+、B220+、IgMhi、CD23+)在约1×106至约7×106个细胞(包括首尾)的范围内，例如，约1.0×106、1.5×106、2.0×106、2.5×106、3.0×106、3.5×106、4.0×106、4.5×106、5.0×106、5.5×106、6.0×106、6.5×106、或7.0×106个细胞；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约1.30×106个细胞的T2B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约2.46×106个细胞的T2B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约3.24×106的T2B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约6.52×106个细胞的T2B细胞群体。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中的T3B细胞群体(例如，CD93+、B220+、IgMlo、CD23+)在约1×106至约4×106个细胞(包括首尾)的范围内，例如，约1.0×106、1.5×106、2.0×106、2.5×106、3.0×106、3.5×106、或4.0×106个细胞；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约1.08×106个细胞的T3B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约1.35×106个细胞的T3B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约3.37×106的T3B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约3.63×106个细胞的T1B细胞群体。
边缘区B细胞是非循环的成熟B细胞，其在解剖学上隔离至脾的边缘区(MZ)中。在啮齿动物中，MZB细胞固着并驻留于边缘窦与红髓之间的脾的外白髓中。这个区域含有巨噬细胞、树突状细胞以及MZB细胞的多个亚型；其在出生后的啮齿动物中到2至3周为止并且在人类中到1至2年为止完全形成。在这个区域内的MZB细胞通常表达高水平的sIgM、CD21、CD1、CD9与低水平至可忽略水平的sIgD、CD23、CD5以及CD11b，这有助于将其与滤泡(FO)B细胞和B1B细胞从表型上区分开来。类似于B1B细胞，MZB细胞可以按T细胞非依赖性方式快速募集至早期适应性免疫反应中。MZB细胞尤其充分地定位成针对进入循环并且被捕集在脾中的全身血源性抗原的第一线防御。据信，其尤其对细菌细胞壁组分有反应并且是脂质特异性抗体的重要来源。MZB细胞还显示出比其FOB细胞配对物更低的活化阈值，对进一步促成加速的初级抗体反应的浆细胞分化有增高的倾向。
在各种实施方案中，包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(例如，VH3-23/D/JH4)的如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)相对于野生型啮齿动物(例如，野生型小鼠)具有水平增加的边缘区B细胞。在一些实施方案中，包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)中的边缘区B细胞相对于野生型啮齿动物(例如，野生型小鼠)增加了10％、20％、30％、40％、50％或更多。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)包含有包含两个未重排的人类免疫球蛋白Vκ基因区段和1个、2个、3个、4个或5个未重排的人类免疫球蛋白Jκ基因区段的免疫球蛋白κ轻链基因座，并且其中啮齿动物(例如，小鼠)包含外周脾B细胞群体，其包含与包含免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段的野生型补体的啮齿动物(例如，小鼠)大致相同的边缘区和边缘区前体B细胞群体。如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)的脾中的例示性边缘区B细胞群体特征为IgM、CD21/35、CD23、CD93、B220和/或其组合的表达。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中所包含的边缘区B细胞群体(例如，CD93-、B220+、IgMhi、CD21/35hi、CD23-)在约1×106至约3×106个细胞(包括首尾)的范围内，例如，约1.0×106、1.5×106、2.0×106、2.5×106、或3.0×106个细胞；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约1.47×106个细胞的边缘区B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约1.49×106个细胞的边缘区B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约2.26×106个细胞的边缘区B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约2.33×106个细胞的边缘区B细胞群体。
在各种实施方案中，提供了遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)，其中啮齿动物(例如，小鼠)包含有包含两个未重排的人类免疫球蛋白Vκ基因区段和1个、2个、3个、4个或5个未重排的人类免疫球蛋白Jκ基因区段的免疫球蛋白κ轻链基因座，并且其中啮齿动物(例如，小鼠)包含外周脾B细胞群体，其包含与包含免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段的野生型补体的啮齿动物(例如，小鼠)大致相同的滤泡(例如，FO-I和FO-II)B细胞群体。如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)的脾中的例示性滤泡B细胞群体(例如，FO-I和FO-II)特征为IgM、IgD、CD21/35、CD93、B220和/或其组合的表达。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中所包含的滤泡1型B细胞群体(例如，CD93-、B220+、CD21/35int、IgMlo、IgDhi)在约3×106至约1.5×107个细胞(包括首尾)的范围内，例如，约3.0×106、3.5×106、4.0×106、4.5×106、5.0×106、5.5×106、6.0×106、6.5×106、7.0×106、7.5×106、8.0×106、8.5×106、9.0×106、9.5×106、1.0×107、或1.5×107个细胞；在一些实施方案中，如本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约3.57×106个细胞的滤泡1型B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约6.31×106个细胞的滤泡1型B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约9.42×106个细胞的滤泡1型B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约1.14×107个细胞的滤泡1型B细胞群体。
在各种实施方案中，如本文所描述的遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中所包含的滤泡2型B细胞群体(例如，CD93-、B220+、CD21/35int、IgMint、IgDhi)在约1×106至约2×106个细胞(包括首尾)的范围内，例如，1.0×106、1.25×106、1.5×106、1.75×106、或2.0×106个细胞；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约1.14×106个细胞的滤泡2型B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约1.45×106个细胞的滤泡2型B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约1.80×106的滤泡2型B细胞群体；在一些实施方案中，本文所描述的修饰的啮齿动物(例如，小鼠)在脾中包含约2.06×106个细胞的滤泡2型B细胞群体。
本文所描述的遗传修饰的非人类动物将选择压力施加于编码轻链可变区或域(例如，轻链CDR3)的基因或多核苷酸的能力可以应用于多种可变轻链基因序列。换句话说，本文所公开的重排的重链可变域基因序列可以与轻链基因座的一个或多个遗传修饰和/或编码轻链可变域的核苷酸序列至重链基因座中的***配对。这可以通过例如使本文所描述的非人类动物(局限于共同或通用重链可变域)与在一个或多个轻链编码基因座内包含遗传修饰的非人类动物交配(即，具有单个修饰的动物的杂交育种或互交)来实现。包含具有重排的重链可变域与一个或多个轻链修饰的免疫球蛋白基因座的遗传修饰的非人类动物还可以通过同时或依序(例如，通过在胚胎干细胞中依序重组)进行多个基因座的靶向基因置换来产生。除非特别标注，否则在轻链基因座处修饰的类型和方法都不限制本文所描述的实施方案。确切地说，由本文所描述的实施方案所促进的选择压力可以施加于能够被表达并且起到轻链抗原结合序列的功能的实际上任何多核苷酸序列，从而驱动更适当的抗体可变区的发展。
举例来说，如本文所描述，包含具有重排的重链可变域基因序列的免疫球蛋白基因座的遗传修饰的非人类动物可以进一步包含(例如，经由杂交育种或多基因靶向策略)如WO2011/072204、WO2011/163311、WO2011/163314、WO2012/018764、WO2012/141798、U.S.2013/0185821、WO2013/022782、WO2013/096142、WO2013/116609中所描述的一个或多个修饰；这些公布以全文引用的方式并入本文中。在特定实施方案中，在轻链基因座中包含重排的重链可变区核酸序列(即，操作性地连接至人类或非人类κ轻链恒定区基因序列的重排的重链可变域基因序列)的遗传修饰的小鼠与包含有包含人类轻链可变区基因区段(例如，***小鼠重链基因座中的40个人类Vκ基因和所有人类Jκ基因；参看例如美国授予专利前公布2012/0096572，以引用的方式并入本文中)的免疫球蛋白重链基因座的遗传修饰的小鼠杂交。在特定实施方案中，在轻链基因座中包含重排的重链可变区核酸序列(即，操作性地连接至人类或非人类κ轻链恒定区基因序列的重排的重链可变域基因序列)的遗传修饰的小鼠与包含有包含一个或多个(例如，两个)但小于野生型数目的人类轻链可变区基因区段的免疫球蛋白重链基因座的遗传修饰的小鼠杂交。所得小鼠能够产生具有来源于基因组轻链可变序列的可变重链的κ+B细胞，由此促进结合至特异性标靶的κVJ序列的鉴别，κVJ序列然后可以重新编排返回至轻链并且与多种重链配对以产生双特异性或三特异性抗体。
实施例
提出下列实施例以向本领域的一般技术人员提供如何制造和使用本文所描述的非人类动物的完整公开和描述，并且不意图限制本发明者视为其发明的范围，也不意图代表以下实验是所进行的所有或唯一的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确度，但一些实验误差和偏差应考虑在内。除非另有指示，否则份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1.候选通用重链序列的克隆和表达分析
先前的研究已经显示，hVH3-23是热稳定的人类可变重链基因区段并且也是人类谱系中最常用的可变区段之一。因此，选择密码子优化的人类VH3-23、D4-4(阅读框2或3)以及JH4(或JH6)基因区段用于设计重排的重链可变序列(下文中的“通用重链”或“UHC”)。
简单地说，从头合成(通过IDT)以下四个候选重排的VDJ序列并且克隆至CMV表达载体(例如，pRG1301或pRG1368)中：(1)hVH3-23(D4-4_RF2)JH4(SEQIDNO:148)；(2)hVH3-23(D4-4_RF2)JH6(SEQIDNO:146)；(3)hVH3-23(D4-4_RF3)JH4(SEQIDNO:147)；(4)hVH3-23(D4-4_RF3)JH6(SEQIDNO:145)。所有这些构建体都以合成的UHC基因在用XhoI/SapI消化之后可以接合至pRG1301(hIgG1)或pRG1368(mIgG1)载体中的方式设计。对于表达分析，将pIDTSMART中的四个UHC基因(1-4)亚克隆至pRG1301(hIgG1)或pRG1368(mIgG1)的XhoI/SapI位点中，并且将每个表达构建体独立地转移至CHO细胞中。转染后，以足够的水平表达所有四个候选VDJ序列，并且表达的肽能够与不同κ和λ轻链配对。
为了避免可能导致遗传修饰的小鼠中的B细胞耗竭的潜在自体反应抗体，针对含有类似于hVH3-23(D4-4)JH4的氨基酸序列的抗体来搜索从人源化小鼠所产生的抗体生成的RegeneronPharmaceuticals的ASAP抗体数据库(图5)。更具体地说，用于鉴别非自体反应抗体的准则包括DYSNY(SEQIDNO:144)的氨基酸序列或类似于DYSNY(SEQIDNO:144)的序列。然而，CHO细胞中的表达研究揭露了含有DYSNY(SEQIDNO:144)的UHC序列不会在哺乳动物细胞中充分表达。因此，替代地选择缺乏D但具有序列YSNY的另一个序列(即，抗体H1H2002B；AKGYYFDY(SEQIDNO:143)；其中AK是来自3-23；GY是来自D或N添加或N和P添加；并且YFDY是JH4)并且测试其在CHO细胞中的表达。在CHO细胞中以足够的水平表达修饰的UHC序列。这些结果表明，在由重链V基因区段编码的序列与由重链J基因区段编码的序列之间需要一些氨基酸残基(即，间隔子)用于在哺乳动物细胞中适当表达重排的VDJ序列。
另外，将来源于重排的VDJ序列(VH3-23/GY/JH4；HIH2002B)的肽AKGYYFDY在CHO细胞中的表达水平与来源于VH3-23/D4-4(阅读框2)/JH4(SEQIDNO:148)的肽关于五个人类κ链、三个人类λ链以及其它重排的VDJ序列(即，VH3-20和VH1-39)的表达进行比较。所选重排的VDJ序列(VH3-23/GY/JH4)显示与对照的那些表达水平相当的表达水平。
基于这些数据，选择VH3-23/GY/JH4(SEQIDNO:137；HIH2002B)作为重排的重链可变域序列用于形成遗传修饰的小鼠。用于产生含有编码重排的重链可变域的遗传修饰的免疫球蛋白基因座的小鼠(即，包含有包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区的免疫球蛋白基因座的小鼠)的详细靶向策略图解于图1-9中并且如下文所描述。
实施例2.构建含有重排的VDJ序列的免疫球蛋白重链基因座
通过在细菌细胞(BHR)中使用细菌人工染色体(BAC)DNA进行一系列同源重组反应来构建含有重排的人类VDJ序列的免疫球蛋白重链基因座。使用遗传工程改造技术(参看例如美国专利号6,586,251和Valenzuela,D.M.等(2003),与高解析度表达分析相结合的小鼠基因组的高通量工程改造(High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis),NatureBiotechnology21(6):652-659，以其全文引用的方式并入本文中)产生用于形成表达重排的重链可变域的遗传工程改造的小鼠的几种靶向构建体。
简单地说，设计靶向载体以将重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列(即，hVH3-23(D)JH4；SEQIDNO:136)引入所有或实质上所有内源功能性免疫球蛋白重链V、D、J基因区段已经缺失的遗传修饰的小鼠中。另外，靶向载体包括有包含Adam6a和Adam6b基因的基因组区以防止与小鼠中包含Adam6a/6b基因的基因组区缺失相关的生育力问题(参看例如US2012-0322108A1，以全文引用的方式并入本文中)。
最初，构建用于修饰包含操作性地连接至2239-bpVH3-23启动子(SEQIDNO:139)的先导序列(其引导重链通过内质网)、重排的重链可变区核苷酸序列(VH3-23(D)JH4；SEQIDNO:136)以及hJH4的内含子(SEQIDNO:140)的小鼠BAC克隆体的BHR供体。另外，基因组基因座的5'和3'侧接有小鼠IgH同源框用于与MAID1115BAC克隆体同源重组(图1)。
另外，已经进行下列五个修饰以形成含有重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列的靶向构建体。
第一，将壮观霉素选择盒引入VH3-23启动子上游(介于I-CeuI与SpeI位点之间)以产生pJSh0038(UHC微小基因座；SEQIDNO:142)(图1，1.I-CeuI/SpeI接合(Amp+Spec))。UHC微小基因座含有：(1)具有用于接合的I-CeuI/AscI位点的壮观霉素(Spec)盒；(2)2239-bphVH3-23启动子(SEQIDNO:139)；(3)重排的hVH3-23(D)JH4核苷酸序列(SEQIDNO:136)；(4)hJH4内含子(SEQIDNO:140)；以及(5)用于BHR的小鼠同源框(MAID1115)。
第二，将潮霉素选择盒(EM7-HYG)靶向MAID1115BAC克隆体的基因组区的5'端，MAID1115BAC克隆体在IgM基因组区的上游含有loxP侧接的新霉素盒(Pgk-Neo)。缺失loxP位点的潮霉素盒的***位于MAID1115克隆体的5'端。经由潮霉素/卡那霉素选择来选择含有遗传修饰的BAC克隆体(VI432)的细菌细胞(图2，2.BHR(Hyg+Kan))。
第三，将在步骤1中构建的UHC微小基因座靶向VI432BAC克隆体的IgM基因座上游。UHC微小基因座的引入用新的壮观霉素盒(VI443)置换loxP侧接(floxed)的新霉素选择盒。经由壮观霉素和潮霉素选择来选择含有遗传修饰的BAC克隆体(VI443)的细菌细胞(图2；3.BHR(Spec+Hyg))。
第四，用含有氯霉素(Cm)盒；氯霉素基因上游的AscI限制位点；以及5'和3'同源臂的pDBa0049构建体靶向VI421BAC克隆体，其从5'至3'包含(1)Adam6a基因(在3'至5'方向上存在)；(2)侧接有FRT位点的新霉素盒(在3'至5'方向上存在)；(3)Adam6b基因(在3'至5'方向上存在)；(4)基因间控制区1(IGCR1；即，关键V(D)J重组调控区)；以及(5)壮观霉素盒(在5'至3'方向上存在)。pDBa0049构建体的靶向从VI421克隆体中去除IGCR1和壮观霉素盒；并且将新的AscI限制位点和氯霉素盒引入Adam6b基因的下游。经由氯霉素和卡那霉素选择来选择含有成功靶向的克隆体(VI444)的细菌细胞(图3；4.BHR(Cm+Kan))。
第五，经由限制消化和接合将含有Adam6a和/或6b基因的VI444BAC克隆体的基因组区引入VI443BAC克隆体中介于I-CeuI与AscI位点之间的通用重链基因组基因座上游(图3)。这种修饰将Adam6a和/或6b基因引入克隆体中并且用新霉素盒置换壮观霉素盒，从而得到最终靶向构建体(MAID6031；VI445)。基于潮霉素和卡那霉素选择来选择含有最终靶向构建体(MAID6031；VI445)的细菌细胞(BHR)(图3，5.I-CeuI/AscI接合(Hyg+Kan))。
用于形成含有重排的人类重链可变域序列的基因组基因座的最终靶向构建体(MAID6031)从5'至3'含有(1)含有在内源Ig重链基因座上游的约20000bp小鼠基因组序列的5'同源臂；(2)Adam6a基因；(3)5'FRT位点；(4)新霉素盒；(5)3'FRT位点；(6)Adam6b基因；(7)2239bphVH3-23启动子(SEQIDNO:139)；(8)重排的人类免疫球蛋白重链核苷酸序列(hVH3-23(D)JH4；SEQIDNO:136)；(9)hJH4内含子(SEQIDNO:140)；以及(10)含有在小鼠JH基因区段下游的约7400bp小鼠基因组序列的3'同源臂。
使最终靶向构建体MAID6031BACDNA线性化并且电穿孔至从1661杂合小鼠中分离的ES细胞中(图4)，1661杂合小鼠含有野生型Ig重链VDJ基因组基因座和所有VH、D、JH基因已经缺失的突变VDJ基因组基因座。使用图6-8中所陈列的引物和探针来筛选成功靶向的小鼠ES细胞。使用技术将成功靶向的小鼠ES细胞引入宿主小鼠胚胎中以产生遗传修饰的杂合F0小鼠。为了产生没有选择盒(即，FRT-Ub-Neo-FRT)的小鼠(MAID6032het)，成功靶向的ES细胞在引入宿主胚胎中之前用表达Flp重组酶的质粒电穿孔。或者，将具有选择盒的MAID6031杂合雄性小鼠与表达Flp重组酶的雌性小鼠配种以去除这个盒。将带有修饰的杂合小鼠相互配种以产生能够仅从遗传修饰的基因座制得免疫球蛋白重链的纯合体(MAID6032HO)。
实施例3.表征表达重排的重链可变域的遗传修饰的小鼠
将所有小鼠在RegeneronPharmaceuticals处在特定的无病原体条件下圈养并配种。将三只野生型(WT)同窝出生的对照小鼠(16周龄，雄性，n＝2；背景：75％C57/BL6和25％129)和两只至四只MAID6032HETF0小鼠(图9；9周龄，雄性，n＝2；背景：50％C57/BL6和50％129)处死，并且从动物收集血液、脾以及骨髓。另外，将四只野生型(WT)同窝出生的对照小鼠(10周龄；2只雄性和2只雌性)和四只MAID6032纯合(“HO”)F2小鼠(10周龄；3只雄性；1只雌性)处死，并且从动物收集血液、脾以及骨髓。将血液收集至具有EDTA(目录号365973)的BD微容量管(microtainertube)中。通过用完全RPMI培养基(补充有胎牛血清、丙酮酸钠、Hepes、2-巯基乙醇、非必需氨基酸以及庆大霉素的RPMI培养基)冲洗从股骨收集骨髓。用ACK裂解缓冲液使来自外周血、脾以及骨髓制剂的红血球裂解并且用完全RPMI培养基洗涤。
流式细胞测量术
为了检查本文所描述的遗传修饰的杂合F0小鼠(MAID6032HET)产生来源于遗传修饰的等位基因(即，来自含有重排的VH3-23/D/JH4的单个拷贝的等位基因)的抗体的能力，使用从野生型或6032杂合小鼠中分离的血液、脾、骨髓细胞进行荧光活化细胞分选(FACS)分析。
简单地说，将1×106个细胞与小鼠抗CD16/CD32抗体(2.4G2，BD)在冰上一起孵育10分钟，接下来用以下抗体混合液在冰上标记30分钟：抗小鼠FITC-IgMa(DS-1，BDBiosciences)、Pacificblue-CD3(17A2，BioLegend)、APC-H7-CD19(1D3，BDBiosciences)以及PE-IgMb(AF6-78，BioLegend)。洗涤染色的细胞并且固定于2％甲醛中。在BDLSRFortessa流式细胞仪上进行数据采集并且用FlowJo分析。将从野生型或F06032杂合小鼠中分离的骨髓细胞、脾细胞以及血细胞在单管上设门并且基于CD19表达(B细胞标志物)或CD3表达(T细胞标志物)进行分选。另外，将CD19+设门的B细胞基于IgMb抗体(从野生型等位基因(B6等位基因)产生的IgM抗体)或IgMa抗体(从包含重排的重链可变区核苷酸序列(hVH3-23(D)JH4)的遗传修饰的等位基因(129等位基因)产生的抗体)的存在进行分选。FACS分析(图11-12)表明，关于靶向的等位基因杂合(即，含有重排的重链可变序列的一个拷贝；MAID6032het)的小鼠能够产生主要来源于遗传修饰的129(IgMa)等位基因的IgM抗体。
为了检查本文所描述的遗传修饰的纯合F2小鼠(MAID6032HO)产生来源于遗传修饰的等位基因(即，来自含有重排的VH3-23/D/JH4的单个拷贝的等位基因)的抗体的能力，如上文所描述使用从野生型或6032纯合小鼠中分离的脾和骨髓细胞进行荧光活化细胞分选(FACS)分析。
只有成熟B淋巴细胞可以进入脾和***的淋巴滤泡并且由此有效地参与免疫反应。成熟的、长寿命的B淋巴细胞来源于骨髓中产生的短寿命的前体。在成熟库中选择是主动过程并且在脾中发生。脾B细胞的两个群体已经被鉴别为成熟B细胞的前体。1型(T1)过渡B细胞是来自骨髓的新近迁移者。1型(T1)过渡B细胞发展成2型(T2)过渡B细胞，其为循环的并且只在脾的初级滤泡中发现。成熟B细胞可以从T1或T2B细胞产生。Loder,F.等,J.Exp.Med.,190(1):75-89,1999。
FACS分析(图13A和13B)表明，关于靶向的等位基因纯合(即，含有重排的重链可变序列的两个拷贝：MAID6032HO)的小鼠能够产生正常脾成熟和未成熟B细胞群体，虽然λ序列相对于野生型有略微减少(图13C和13D)。同样在脾中，MAID6032HO小鼠展示T1群体B细胞的略微减少和边缘区B细胞的增加(图13E)。
在骨髓中，MAID6032HO小鼠产生接近正常的B细胞群体(图14A-14E)，其λ序列使用率是野生型的一半(图14F)。
免疫研究
将五只WT(75％C57BL6/25％129背景)和三只至四只MAID6032HET小鼠在足垫中用0.025ml含有以下的混合物免疫：2.35μg抗原X、10μgCpG寡核苷酸(ODN1826，InvivoGen，目录号tlrl-1826)以及25μg磷酸铝凝胶佐剂(Brenntag，目录号7784-30-7)。用相同剂量对小鼠加强免疫六次。在初次免疫后第15天和第24天，使用眼窝后放血将血液从麻醉的小鼠收集至BD血清分离管(BD，目录号365956)中，并且按照制造商的指南收集血清。
为了测量抗原特异性IgG抗体的水平并且为了反筛选mmh(myc-myc-his)标签，用1μg/ml在4℃下孵育过夜的抗原X涂布ELISA板(Nunc)。洗去过量抗原，随后在室温下用PBS+1％BSA阻断1小时。施加血清的连续稀释液并且在室温下将板孵育1小时，随后洗涤。在室温下将板与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗IgG(目录号1030-05，SouthernBiotech)抗体一起孵育1小时。洗涤后，用TMB底物(目录号555214，BD)使板显色。用1N硫酸停止反应，并且使用VictorX5PerkinElmer读取器在450nm下读取O.D.。用GraphPadPrism分析数据以计算高于背景两倍的血清稀释度。所有动物实验都经过IACUC和RegeneronPharmaceuticals批准。
如图15中所示，关于靶向的等位基因杂合(即，含有重排的VH3-23/D/JH4核苷酸序列的一个拷贝)的遗传修饰的F0和F1小鼠(MAID6032het)能够在初次免疫后第15天与第24天产生水平相当于由野生型小鼠产生的那些的抗原特异性IgG抗体。
实施例3.包含两个人类轻链V区段的小鼠的产生和分析
实施例3.1：构建用于产生包含两个人类轻链V区段的小鼠的靶向载体
构建含有两个人类Vκ基因区段(例如，人类Vκ1-39和人类Vκ3-20基因区段；即，双轻链(“DLC”))的两个工程改造的轻链基因座(图20)。一个工程改造的轻链基因座含有呈未重排构型(DLC-5J)的两个人类Vκ基因区段和五个人类Jκ基因区段。第二个工程改造的轻链基因座含有呈未重排构型(DLC-1J)的两个人类Vκ基因区段和一个人类Jκ基因区段。对于两个额外的工程改造的轻链基因座中的每一者，人类基因区段的3'侧接有重组信号序列以允许人类基因区段在B细胞中的体内重排。
DLC-1J小鼠的工程改造和产生.产生包含两个人类Vκ基因区段(Vκ1-39和Vκ3-20)和一个人类Jκ基因区段(Jκ5)的轻链基因座，或称为DLC-1J的工程改造步骤描绘于图21中。具体地说，通过PCR从BAC模板(Invitrogen)扩增人类Vκ1-39和Vκ3-20序列，并且连同含有重组信号序列(rss)和人类Jκ5区段的扩增序列一起，经由四向接合克隆至含有UB-潮霉素选择盒的质粒中(图21A)。如图21B和21C所描绘附接5'和3'臂。
所得靶向构建体描绘于图21C中(下图；DLC-1J)，其中重组信号序列(RSS)呈透明的椭圆形。操作性地连接至小鼠序列(即，内源免疫球蛋白κ轻链基因座的上游和下游序列)的工程改造的DLC-1J轻链基因座的修饰的BACDNA克隆体是通过使用位于含有两个人类Vκ基因区段的工程改造的轻链基因座内的序列处的引物进行PCR，接下来电穿孔至包含小鼠Igκ可变基因座(包含κ可变和连接基因区段)缺失的ES细胞中(图21D)以形成表达两个人类Vκ基因区段中的任一者的小鼠来确认。含有工程改造的DLC-1J轻链基因座的阳性ES细胞克隆体是通过使用对工程改造的DLC-1J轻链基因座具特异性的探针进行TaqmanTM筛选和核型分析来确认。用于DLC-1JES细胞的ES细胞筛选的引物和探针的序列描绘于下表8中并且包括于序列表中。
表8：用于ES细胞筛选的引物和探针
经过确认的ES细胞克隆体然后用于植入雌性小鼠以生产出包含DLC-1J轻链基因座并且表达与小鼠Cκ域融合的人类轻链可变域的一窝幼崽。用于幼崽的基因型分析的引物和探针的序列列于上表8中。包括所***的工程改造序列上游和下游的小鼠序列的100个核苷酸的贯穿工程改造的DLC-1J基因座的序列呈现于图22A-22D中并且陈列于SEQIDNO:82中。
可以用表达FLP的构建体转染带有工程改造的轻链基因座的ES细胞以去除由靶向构建体引入的FRT侧接(FRTed)的新霉素盒(见图21E)。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠配种来去除新霉素盒(例如，US6,774,279)。任选地，将新霉素盒保留于小鼠中。
DLC-5J小鼠的工程改造和产生.为了产生包含两个人类Vκ基因区段(Vκ1-39和Vκ3-20)和五个人类Jκ基因区段(Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4以及Jκ5)的轻链基因座，或称为DLC-5J，将包含全部5个人类Jκ的2000碱基对扩增的序列接合至图21B(中间)中所描绘的包含两个人类Vκ基因区段和一个人类Jκ的载体中(见图23A)。后续工程改造步骤涉及如图23B中所描绘附接3'和5'臂。
所得靶向构建体描绘于图23B中(下图；DLC-5J)，其中重组信号序列(RSS)呈透明的椭圆形。操作性地连接至小鼠序列(即，内源免疫球蛋白κ轻链基因座的上游和下游序列)的工程改造的DLC-5J轻链基因座的修饰的BACDNA克隆体是通过使用位于含有两个人类Vκ基因区段的工程改造的轻链基因座内的序列处的引物进行PCR，接下来电穿孔至包含小鼠Igκ可变基因座(包含κ可变和连接基因区段)缺失的ES细胞中(图23C)以形成表达两个人类Vκ基因区段中的任一者的小鼠来确认。含有工程改造的DLC-5J轻链基因座的阳性ES细胞克隆体是通过使用对工程改造的DLC-5J轻链基因座具特异性的探针进行TaqmanTM筛选和核型分析来确认。用于DLC-5JES细胞的ES细胞筛选的引物和探针的序列描绘于下表9中并且包括于序列表中。
表9：用于ES细胞筛选的引物和探针
经过确认的ES细胞克隆体然后用于植入雌性小鼠以生产出包含DLC-5J轻链基因座并且表达与小鼠Cκ域融合的人类轻链可变域的一窝幼崽。用于幼崽的基因型分析的引物和探针的序列列于上表9中。包括所***的工程改造序列上游和下游的小鼠序列的100个核苷酸的贯穿工程改造的DLC-5J基因座的序列呈现于图24A-24D中并且陈列于SEQIDNO:83中。
可以用表达FLP的构建体转染带有工程改造的轻链基因座的ES细胞以去除由靶向构建体引入的FRT侧接的新霉素盒(见图23D)。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠配种来去除新霉素盒(例如，US6,774,279)。任选地，将新霉素盒保留于小鼠中。
实施例3.2：表征包含两个人类V区段的小鼠
流式细胞测量术.通过脾细胞和骨髓制剂的流式细胞测量分析来验证DLC小鼠中的B细胞群体和B细胞发育。使用标准方法制得来自对于两个人类Vκ基因区段和五个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(n＝4)、对于两个人类Vκ基因区段和一个人类Jκ基因区段而言纯合的小鼠(n＝4)以及野生型小鼠(n＝4)的细胞悬浮液并且用荧光标记的抗体进行染色。
简单地说，将1×106个细胞与抗小鼠CD16/CD32(克隆体2.4G2，BDPharmigen)在冰上一起孵育10分钟，接下来用以下抗体混合液在冰上标记30分钟：APC-H7偶联的抗小鼠CD19(克隆体1D3，BDPharmigen)、PacificBlue偶联的抗小鼠CD3(克隆体17A2，BioLegend)、FITC偶联的抗小鼠Igκ(克隆体187.1，BDPharmigen)或抗小鼠CD43(克隆体1B11，BioLegend)、PE偶联的抗小鼠Igλ(克隆体RML-42，BioLegend)或抗小鼠c-kit(克隆体2B8，BioLegend)、PerCP-Cy5.5偶联的抗小鼠IgD(BioLegend)、PE-Cy7偶联的抗小鼠IgM(克隆体II/41，eBioscience)、APC偶联的抗小鼠B220(克隆体RA3-6B2，eBioscience)。在染色之后，洗涤细胞并且固定于2％甲醛中。在LSRII流式细胞仪上进行数据采集并且用FlowJo(TreeStar,Inc.)分析。设门：总B细胞(CD19+CD3-)、Igκ+B细胞(Igκ+Igλ-CD19+CD3-)、Igλ+B细胞(Igκ-Igλ+CD19+CD3-)。骨髓室的结果示于图25A-27B中。脾室的结果示于图28A-图31中。
如这个实施例中所示，DLC-5J小鼠在脾和骨髓室内展示正常B细胞群体(图25A-31)。DLC-5J小鼠在骨髓室内展示实质上与野生型同窝出生仔中所观测到的相同的未成熟、成熟以及前/原B细胞群体。事实上，DLC-5J基因座能够与内源λ轻链基因座竞争以得到实质上与野生型小鼠中所观测到的相同的κ:λ比(图27B)。而且，DLC-5J小鼠展示正常外周B细胞发育，这是因为B细胞在脾室中发展通过各种阶段(例如，未成熟、成熟、T1、T2、T3、边缘区前体、边缘区、滤泡-I、滤泡-II等)以实质上与野生型小鼠中所观测到的相同的方式发生(图30A-31)。相比之下，DLC-1J小鼠与工程改造的κ轻链相比展示较少的B细胞总数和增加的λ轻链使用率(数据未示出)。
双轻链表达.使用定量PCR试验在纯合小鼠中分析两个人类Vκ基因区段的表达。简单地说，从野生型小鼠、对于用对应的人类重链和κ轻链可变区基因座(Hκ)置换小鼠重链和κ轻链可变基因座而言纯合的小鼠、以及对于含有两个人类Vκ基因区段和五个人类Jκ基因区段(DLC-5J)或一个人类Jκ基因区段(DLC-1J)的工程改造的κ轻链基因座而言纯合的小鼠的骨髓和整个脾中纯化CD19+B细胞。将相对表达针对小鼠Cκ区(每组n＝3至5只小鼠)的表达进行标准化。结果示于图32和图33中。
在DLC-5J和DLC-1J小鼠的骨髓与脾中检测含有重排的人类Vκ3-20或人类Vκ1-39基因区段的轻链的表达(图32和图33)。在骨髓室中，在DLC小鼠的两个品系中源自人类Vκ3-20与源自人类Vκ1-39的轻链的表达与包含用对应的人类Vκ和Jκ基因区段置换小鼠Vκ和Jκ基因区段的小鼠(Hκ；图32)相比显著较高。观测到源自人类Vκ3-20的轻链表达比Hκ小鼠约高六倍(DLC-5J)至十五倍(DLC-1J)。DLC-1J小鼠在骨髓室中展示源自人类Vκ3-20的轻链的表达比DLC-5J小鼠约高两倍。观测到源自人类Vκ1-39的轻链表达比Hκ小鼠约高六倍(DLC-5J)至十三倍(DLC-1J)。DLC-1J小鼠在骨髓室中展示源自人类Vκ1-39的轻链的表达比DLC-5J小鼠约高两倍。
在脾室中，在DLC小鼠的两个品系中源自人类Vκ3-20与源自人类Vκ1-39的轻链的表达与Hκ小鼠相比显著较高(图33)。观测到源自人类Vκ3-20的轻链表达比Hκ小鼠约高四倍(DLC-5J)和八倍(DLC-1J)。DLC-1J小鼠在脾室中展示源自人类Vκ3-20的轻链的表达比DLC-5J小鼠约高两倍。观测到源自人类Vκ1-39的轻链表达比Hκ小鼠约高四倍(DLC-5J)至五倍(DLC-1J)。DLC-1J小鼠与DLC-5J小鼠相比在脾室中展示源自人类Vκ1-39的轻链的类似表达。
DLC-5J小鼠中的人类Vκ/Jκ使用率.通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)针对脾B细胞中的人类Vκ/Jκ基因区段使用率来分析对于两个未重排的人类Vκ基因区段和五个未重排的人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠。
简单地说，从纯合DLC-5J(n＝3)和野生型(n＝2)小鼠收集脾并且使用磨砂玻璃载片在10mL含有10％热灭活胎牛血清的RPMI1640(Sigma)中捕捉以形成单细胞悬浮液。用离心机(1200rpm，五分钟)使脾细胞成团，并且在5mLACK裂解缓冲液(GIBCO)中使红血球裂解三分钟。用PBS(IrvineScientific)稀释脾细胞，用0.7μm细胞过滤网过滤，并且再次离心以使细胞成团，接下来使其再悬浮于1mLPBS中。
使用AllPrepDNA/RNA微型试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书从成团的脾细胞中分离RNA。使用5'RACE(cDNA末端的快速扩增)***、采用对小鼠Cκ基因具特异性的引物根据制造商的说明书(Invitrogen)对脾细胞RNA进行RT-PCR。对小鼠Cκ基因具特异性的引物是3'mIgκCRACE1(AAGAAGCACACGACTGAGGCAC；SEQIDNO:90)和mIgκC3'-1(CTCACTGGATGGTGGGAAGATGGA；SEQIDNO:91)。对PCR产物进行凝胶纯化并且克隆至载体(TA试剂盒，Invitrogen)中，并且用位于载体内侧接克隆位点的位置处的M13正向(GTAAAACGACGGCCAG；SEQIDNO:92)和M13反向(CAGGAAACAGCTATGAC；SEQIDNO:93)引物进行测序。对来自每个脾样品的十个克隆体进行测序。将序列与来自IMGT/V-QUEST参照目录集的小鼠和人类免疫球蛋白组相比较以确定Vκ/Jκ使用率。表10陈列了来自每个脾细胞样品的RT-PCR克隆体中观测到的所选克隆体的Vκ/Jκ组合。表11陈列了来自DLC-5J纯合小鼠的所选RT-PCR克隆体的人类Vκ/人类Jκ和人类Jκ/小鼠Cκ连接点的氨基酸序列。小写字母指示在重组期间由N和/或P添加所引起的可变区或非模板添加的氨基酸序列的突变。
如这个实施例中所示，对于操作性地连接至小鼠Cκ基因的两个未重排的人类Vκ基因区段和五个未重排的人类Jκ基因区段(DLC-5J)而言纯合的小鼠能够有成效地将两个人类Vκ基因区段与多个人类Jκ基因区段重组以产生有限的免疫球蛋白轻链谱系。在表10所示的DLC-5J纯合小鼠中的重排当中，对于Vκ1-39/Jκ2(1)、Vκ1-39/Jκ3(1)、Vκ3-20/Jκ1(7)、Vκ3-20/Jκ2(4)以及Vκ3-20/Jκ3(1)观测到独特的人类Vκ/Jκ重排。此外，所述独特的重排通过在发育期间由人类Vκ和Jκ基因区段的突变和/或重组所引起的轻链的CDR3区内独特氨基酸(表11)的存在而展示连接多样性。所有重排都显示至小鼠Cκ中的功能性通读(表11)。
总之，这些数据展示，经过工程改造以呈现不超过两个人类Vκ基因区段的选择的小鼠具有在所有方面都接近野生型的B细胞数和发育，这些基因区段中的两者能够重排(例如，与一个或多个并且在一些实施方案中至多五个人类Jκ基因区段重排)并且编码免疫球蛋白轻链的人类VL域。所述小鼠产生抗体集合，其免疫球蛋白轻链具有存在于这个集合中的两个可能人类VL基因区段之一。小鼠产生对抗原激发起反应的这个抗体集合，并且抗体集合与反向嵌合(人类可变/小鼠恒定)重链的多样性相关联。
表10：在脾细胞样品中所观测到的Vκ/Jκ组合
表11：来自DLC-5J纯合小鼠的人类Vκ/人类Jκ和人类Jκ/小鼠Cκ连接点的氨基酸序列
实施例4：包含两个组氨酸取代的人类轻链的小鼠的产生和表征
实施例4.1：包含各自含有四个组氨酸取代的两个Vκ区段的小鼠的工程改造和产生
将组氨酸取代引入如上文针对Vκ1-39和Vκ3-20ULC小鼠所描述的双轻链基因座中。简单地说，使用图34中所描绘的引物，使图23A(下部)中所描绘的DLC序列经受定点诱变，首先修饰Vκ1-39序列，并且随后修饰Vκ3-20序列。所得双轻链序列含有具有引入种系序列中的位置105、106、108以及111处的组氨酸的Vκ1-39区段，具有引入种系序列中的位置105、106、107以及109处的组氨酸的Vκ3-20区段，以及全部五个Jκ区段(Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4以及Jκ5)。后续工程改造步骤涉及附接携带FRT-UB-NEO-FRT盒的5'臂，以及携带小鼠Igκ增强子和恒定区的3'臂。如图35A中所描绘(在这个图中省略重组信号序列，RSS)，将这个靶向载体电穿孔至包含小鼠Igκ可变基因座(包含κ可变和连接基因区段)缺失的ES细胞中。通过修改如上文所描述的等位基因试验，使用检测上表1、5、8以及9中所描述的区域(具体地说，1633h2、1635h2、neo、Jxn1-39/3-20、mIgKd2以及mIgKp15)的引物和探针，以及下表12中所列的两组额外的引物和探针来筛选靶向的ES细胞。这两组额外的引物和探针的序列包括于序列表中。
表12：用于ES细胞筛选的引物和探针
经过确认的ES细胞克隆体然后用于植入雌性小鼠以生产出包含在两个所存在的VL区段序列中的每一者处具有四个组氨酸修饰的DLC-5J轻链基因座并且表达与小鼠Cκ域融合的人类轻链可变域的一窝幼崽。与ES细胞筛选所用的相同的序列中的一些也用于幼崽的基因型分析。
可以用表达FLP(例如，FLPo)的构建体转染带有工程改造的轻链基因座的ES细胞以去除由靶向构建体引入的FRT侧接的新霉素盒(见图35B，在这个图中省略RSS)。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠配种来去除新霉素盒(例如，US6,774,279)。任选地，将新霉素盒保留于小鼠中。
实施例4.2：包含各自含有三个组氨酸取代的两个Vκ区段的小鼠的工程改造和产生
将三个组氨酸取代引入双轻链小鼠的每个Vκ1-39和Vκ3-20中。简单地说，使用图36中所描绘的引物，使图23A(下部)中所描绘的DLC序列经受定点诱变，首先修饰Vκ1-39序列，并且随后修饰Vκ3-20序列。所得双轻链序列含有具有引入种系序列中的位置106、108以及111处的组氨酸的Vκ1-39区段，具有引入种系序列中的位置105、106以及109处的组氨酸的Vκ3-20区段，以及全部五个Jκ区段(Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4以及Jκ5)。后续工程改造步骤涉及附接携带FRT-UB-NEO-FRT盒的5'臂，以及携带小鼠Igκ增强子和恒定区的3'臂。如图37A中所描绘(在这个图中省略RSS)，将这个靶向载体电穿孔至包含小鼠Igκ可变基因座(包含κ可变和连接基因区段)缺失的ES细胞中。通过修改如上文所描述的等位基因试验，使用检测上表1、5、8以及9中所描述的区域(具体地说，1633h2、1635h2、neo、Jxn1-39/3-20、mIgKd2以及mIgKp15)的引物和探针，以及下表13中所列的两组额外的引物和探针来筛选靶向的ES细胞。这两组额外的引物和探针的序列包括于序列表中。
表13：用于ES细胞筛选的引物和探针
经过确认的ES细胞克隆体然后用于植入雌性小鼠以生产出包含在两个所存在的VL区段序列中的每一者处具有四个组氨酸修饰的DLC-5J轻链基因座并且表达与小鼠Cκ域融合的人类轻链可变域的一窝幼崽。与ES细胞筛选所用的相同的序列中的一些也用于幼崽的基因型分析。
可以用表达FLP(例如，FLPo)的构建体转染带有工程改造的轻链基因座的ES细胞以去除由靶向构建体引入的FRT侧接的新霉素盒(见图37B，在这个图中省略RSS)。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠配种来去除新霉素盒(例如，US6,774,279)。任选地，将新霉素盒保留于小鼠中。
实施例4.3：包含人类组氨酸取代的双轻链的小鼠的配种
将带有工程改造的人类组氨酸取代的双轻链基因座的小鼠与含有内源λ轻链基因座缺失的小鼠配种以产生作为其唯一轻链表达来源于双轻链基因座的工程改造的组氨酸取代的轻链的子代。
将带有工程改造的人类组氨酸取代的双轻链基因座的小鼠与含有用人类重链可变基因座置换内源小鼠重链可变基因座的小鼠(参看US6,596,541和US8,502,018；小鼠，RegeneronPharmaceuticals,Inc.)配种。
实施例4.4：检测获自包含各自含有三个组氨酸取代的两个Vκ区段的小鼠的免疫球蛋白轻链中的组氨酸修饰
使用逆转录酶PCR(RT-PCR)和高通量筛选从脾B细胞mRNA制备Vκ扩增子。
简单地说，从包含各自含有三个组氨酸取代的两个Vκ区段(Vκ1-39和Vκ3-20)(κ基因座描绘于图35中的小鼠)和内源小鼠重链的五个杂合小鼠收集脾并且使用玻璃载片在1xPBS(Gibco)中均化。在离心机(500×g，5分钟)中使细胞成团，并且在ACK裂解缓冲液(Gibco)中使红血球裂解3分钟。用1xPBS洗涤细胞并且使用0.7μm细胞过滤网过滤。使用针对CD19的MACS磁性阳性选择(MiltenyiBiotec)使B细胞与脾细胞分离。使用RNeasyPlus试剂盒(Qiagen)从成团的B细胞中分离总RNA。使用OligotexDirectmRNA微型试剂盒(Qiagen)从总RNA中分离PolyA+mRNA。
通过5'RACE，使用SMARTerPicocDNA合成试剂盒(Clontech)从脾B细胞mRNA制备双股cDNA。用来自Invitrogen的SuperscriptII和dNTP替代Clontech逆转录酶和dNTP。使用对IgK恒定区具特异性的引物和SMARTer5'RACE引物(表14)从cDNA扩增免疫球蛋白轻链谱系。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)净化PCR产物。使用相同的5'RACE引物和对IgK恒定区具特异性的巢式3'引物(表15)完成第二轮PCR。使用SizeSelectE凝胶***(Invitrogen)纯化第二轮PCR产物。用添加454个接头和条码的引物进行第三PCR。使用AgencourtAMPureXP小珠纯化第三轮PCR产物。通过SYBR-qPCR，使用KAPA文库定量试剂盒(KAPABiosystems)定量纯化的PCR产物。根据制造商的方案，对所汇集的文库使用454GSJuniorTitaniumSeriesLib-AemPCR试剂盒(RocheDiagnostics)进行乳液PCR(emPCR)并且使用Roche454GSJunior仪器进行双向测序。
表14：第一轮PCR引物
对于生物信息学分析，基于样品条码完美匹配来分选454个序列读段并且针对质量进行修整。使用igblast(NCBI，2.2.25+版)的本地安装，基于重排的Ig序列与人类种系V和J区段数据库的比对，对序列作注解。当检测到具有相同得分的多个最佳命中时，将序列标记为不明确的并且从分析中去除。开发一组perl脚本以分析结果并且在mysql数据库中储存数据。将κ轻链的CDR3区界定于保守的C密码子与FGXG基序之间。
图38呈现了由人类种系IGKV3-20(图38A)或IGKV1-39(图38B)序列编码的氨基酸序列与获自包含组氨酸修饰的DLC-5J(包含轻链可变基因座，其包含Vκ1-39和Vκ3-20基因区段，每个区段具有如上文所描述的三个组氨酸修饰)的小鼠中产生的有成效地重组的抗体的例示性Vκ序列的氨基酸翻译的比对。序列读段显示，大多数有成效地重排的轻链保留引入其种系CDR3中的至少一个组氨酸。在一些情况下，在包含保留至少一个组氨酸残基的Vκ3-20序列的所有有成效地重排的人类轻链的大部分中，保留引入其种系CDR3中的所有三个组氨酸修饰(见图38A)。在一些情况下，在包含保留至少一个组氨酸残基的Vκ1-39序列的有成效地重排的人类轻链中，约50％的轻链保留引入其种系CDR3中的所有三个组氨酸(见图38B，上部比对)，而约50％的轻链保留引入其种系CDR3中的三个组氨酸中的两者(见图38B，下部比对)。在一些情况下，在V区段序列的最后位置处的组氨酸可能因V-J重排而丢失。
实施例5.包含单个重排的人类免疫球蛋白重链核苷酸序列和两个Vκ基因区段的小鼠的产生和分析
如上文所描述产生在重链基因座中包含重排的重链可变区核酸序列的小鼠(MAID6031；“UHC小鼠”)。简单地说，在UHC小鼠中，所有内源功能性重链可变基因区段都缺失并且***作性地连接至内源重链恒定区核酸序列的编码hVH3-23/D/JH4的单个重排的重链可变区核酸序列置换。
如上文所描述产生包含含有两个人类Vκ基因区段(例如，人类Vκ1-39和人类Vκ3-20基因区段)和一个人类Jκ区段(Jκ5；DLC-1J)或五个人类Jκ基因区段(hJκ1-5；DLC-5J)的遗传工程改造的轻链基因座的小鼠。简单地说，一个工程改造的轻链基因座含有呈未重排构型的两个人类Vκ基因区段和五个人类Jκ基因区段(Jκ1-5)并且操作性地连接至内源小鼠κ恒定区序列(MAID1911(DLC-5J)；图19E)。另一个工程改造的轻链基因座含有呈未重排构型的两个人类Vκ基因区段和一个人类Jκ(Jκ1)基因区段并且操作性地连接至内源小鼠κ恒定区序列(MAID1913(DLC-1J)；图21D)。对于两个额外的工程改造的轻链基因座中的每一者，人类基因区段的3'侧接有重组信号序列以允许人类基因区段在B细胞中的体内重排。
将上文所描述的纯合UHC小鼠(MAID6031)与纯合DLC-5J(MAID1911)小鼠配种以产生对于UHC等位基因和DLC-5J等位基因而言杂合的小鼠。类似地，将纯合UHC小鼠(MAID6031)与纯合DLC-1J(MAID1913)小鼠配种以产生对于UHC等位基因和DLC-1J等位基因而言杂合的小鼠。将从这些杂交产生的F1杂合小鼠相互配种以获得对于每个等位基因而言纯合的小鼠。免疫球蛋白重链和轻链基因座中遗传修饰的等位基因的存在是通过使用上文所描述的特异性探针和引物进行TAQMANTM筛选和核型分析来确认。
将对于UHC等位基因和DLC-5J而言杂合的小鼠相互配种以产生表达主要来自遗传修饰的基因座的免疫球蛋白“轻”链的纯合体(MAID1912HO6032HO；“DLCxUHC”)。MAID1912HO6032HO(纯合DLCxUHC)小鼠包含本文所描述的通用重链(例如，hVH3-23/hD/hJH4)***所有内源可变重链VDJ基因已经缺失的小鼠重链基因座和所有小鼠Vκ和Jκ基因已经缺失的DLC-5J(hVκ1-39hVκ3-20hJκ1-5)小鼠κ轻链基因座中。
将所有小鼠在RegeneronPharmaceuticals处在特定的无病原体条件下圈养并配种。将三只F5(MAID1293O1640HO(“VI3”)；参看美国专利号8,502,018，以引用的方式并入本文中)小鼠(14周龄，雄性；背景：26.5％C57/BL6、22.75％129以及50.75％Balb/c)和三只MAID1912HO6032HOF2小鼠(图39；7-8周龄，雌性；背景：18.75C57/BL6、18.75％129以及62.5％Balb/c)处死，并且从动物收集脾和骨髓。通过用完全RPMI培养基(补充有胎牛血清、丙酮酸钠、Hepes、2-巯基乙醇、非必需氨基酸以及庆大霉素的RPMI培养基)冲洗从股骨收集骨髓。用ACK裂解缓冲液使来自脾和骨髓制剂的红血球裂解并且用完全RPMI培养基洗涤。
流式细胞测量术
为了检查本文所描述的遗传修饰的纯合“DLCxUHC”(MAID1912HO6032HO)小鼠产生来源于遗传修饰的等位基因(例如，来自在重链基因座中含有重排的VH3-23/D/JH4的单个拷贝的等位基因和在轻链基因座中含有两个人类Vκ、五个人类Jκ基因的等位基因)的抗体的能力，如实施例3进行荧光活化细胞分选(FACS)分析。
在脾室中，MAID1912HO6032HO小鼠展示实质上与(VI3)小鼠中所观测到的数目相同的CD19+B细胞数和成熟B细胞数(图40A-40B)，其充当MAID1912HO6032HO小鼠相对于在其免疫球蛋白基因座中具有其它遗传修饰的小鼠所观测到的特异性效应的对照；而且，小鼠的体液免疫***功能如同野生型小鼠(同上)。MAID1912HO6032HO小鼠与VI3小鼠相比展示脾中未成熟B细胞数的2倍增加(图40A-40B)。MAID1912HO6032HO小鼠在κ和γ轻链使用率方面也实质上类似于VI3小鼠(图41A-41B)。MAID1912HO6032HO(DLCxUHC)小鼠与VI3小鼠相比还展示脾B细胞上增加的表面IgM(即，每个细胞更多的IgM表面表达)(图42)。
而且，MAID1912HO6032HO(DLCxUHC)小鼠展示改变的外周B细胞发育，这是因为B细胞在脾室中发展通过各种阶段(例如，未成熟、成熟、T1、T2、T3、边缘区前体、边缘区、滤泡-I、滤泡-II等)以与VI3小鼠中所观测到的不同的方式发生(图43A)。具体地说，MAID1912HO6032HO(DLCxUHC)小鼠与VI3小鼠相比展示脾室中更多的未成熟、T1以及边缘区(MZ)B细胞。MAID1912HO6032HO(DLCxUHC)小鼠中的滤泡-I和滤泡-II细胞数实质上与VI3小鼠中所观测到的相同(图43B)。
在骨髓室中，MAID1912HO6032HO(DLCxUHC)小鼠与VI3小鼠对照相比展示类似的CD19+B细胞数(图44A-44B)。然而，MAID1912HO6032HO(DLCxUHC)小鼠与VI3小鼠相比展示骨髓中约少25倍的原B细胞(图45A-45B)。MAID1912HO6032HO(DLCxUHC)小鼠与VI3小鼠相比还展示骨髓中约少2倍的未成熟B细胞和少2倍的成熟B细胞(图46A-46B)。而且，MAID1912HO6032HO(DLCxUHC)小鼠与VI3小鼠相比展示对于λ表达的偏好(2倍增加)(图47)。
免疫研究
将五只WT(75％C57BL6/25％129背景)和七只F2MAID1912HO6031HET(纯合DLCx杂合UHC)小鼠在足垫中用0.025ml含有以下的混合物免疫：2.35μg抗原X、10μgCpG寡核苷酸(ODN1826，InvivoGen，目录号tlrl-1826)以及25μg磷酸铝凝胶佐剂(Brenntag，目录号7784-30-7)。用相同剂量对小鼠加强免疫六次。在初次免疫后第0天、第15天以及第23天，使用眼窝后放血将血液从麻醉的小鼠收集至BD血清分离管(BD，目录号365956)中，并且按照制造商的指南收集血清。在第一轮免疫后约五周如上进行第二轮免疫。
为了测量抗原特异性IgG抗体的水平，如实施例3进行ELISA。如图48中所示，关于含有重排的VH3-23/D/JH4核苷酸序列的靶向的等位基因杂合并且关于含有DLC-5J的靶向的等位基因纯合的遗传修饰的小鼠能够在初次免疫后23天与5周产生水平相当于由野生型小鼠产生的那些的抗原特异性IgG抗体。MAID1912HO6031HET(纯合DLCx杂合UHC)小鼠也能够在第2轮免疫后产生水平相当于由野生型小鼠产生的那些的抗原特异性IgG抗体。
因此，这些小鼠产生包含来源于两个人类VL基因区段(Vκ1-39或Vκ3-20基因区段)和人类Jκ区段之一的重排的反向嵌合轻链(人类轻链可变域和小鼠Cκ)以及来源于单个重排的人类重链可变基因区段的反向嵌合重链(人类重链可变域和小鼠CH)的抗体。在用所关注的抗原免疫后获得反向嵌合抗体(即，由这些反向嵌合链组成的抗体)。
实施例6.包含单个重排的人类免疫球蛋白重链核苷酸序列和含有三个组氨酸取代的两个Vκ基因区段的小鼠的产生和分析
类似地，将带有包含组氨酸修饰的双轻链的工程改造的人类轻链基因座的小鼠(例如，包含具有上文所描述的组氨酸修饰的两个人类VL基因区段的小鼠)与含有用通用人类重链基因座(包含如上文所描述的单个重排的人类重链可变域的基因座)置换内源小鼠重链可变基因座的小鼠配种。因此，这些小鼠产生包含来源于两个组氨酸修饰的人类VL基因区段(Vκ1-39或Vκ3-20基因区段)和人类Jκ区段之一的重排的反向嵌合轻链(人类轻链可变域和小鼠Cκ)以及来源于单个重排的人类重链可变域的反向嵌合重链(人类重链可变域和小鼠CH)的抗体。在用所关注的抗原免疫后获得反向嵌合抗体。使用本领域中已知或上文所描述的抗体分离和筛选方法鉴别所述小鼠中产生的pH依赖性人类抗体。
鉴别表达抗体的B细胞的可变轻链和重链区核苷酸序列，并且通过可变轻链和重链区核苷酸序列分别与人类CL和CH核苷酸序列融合来制得完全人类轻链和重链。所关注的轻链，例如，结合至所关注的抗原的轻链(例如，来自使用本领域中已知的多种试验，例如BIACORETM试验还展示pH依赖性抗原特性的抗体的轻链)在适合的表达***中与来源于其它抗体的重链，例如，来源于包含来源于与所关注的轻链中的相同的VL基因区段(例如，Vκ1-39或Vκ3-20)的轻链的抗体的重链共同表达，并且测试重构的抗体保留抗原结合和pH依赖性抗原结合特性的能力。
实施例7.构建包含含有重排的重链VDJ序列的免疫球蛋白轻链基因座的小鼠
通过与上文针对靶向重链基因座所描述的那些类似的方法产生在κ轻链基因座中包含重排的重链可变区核酸序列的小鼠(MAID6079；“κ上UHC小鼠”)。简单地说，在κ上UHC小鼠中，所有内源功能性轻链κ可变Vκ和Jκ基因区段都缺失并且***作性地连接至内源轻链恒定区核酸序列的编码hVH3-23/D/JH4的单个重排的重链可变区核酸序列置换。用于形成含有重排的人类重链可变域序列的基因组基因座的最终靶向构建体从5'至3'含有(1)含有在内源Ig轻链基因座上游的约22500bp小鼠基因组序列的5'同源臂；(2)5'FRT位点；(3)新霉素盒；(4)3'FRT位点；(5)2239bphVH3-23启动子(SEQIDNO:139)；(6)重排的人类免疫球蛋白重链核苷酸序列(hVH3-23/D/JH4；SEQIDNO:136)；(7)hJH4内含子(SEQIDNO:140)；以及(8)含有在小鼠JL基因区段下游的约75000bp小鼠基因组序列的3'同源臂。将带有修饰的杂合小鼠相互配种以产生能够仅从遗传修饰的基因座制得免疫球蛋白“轻”链的纯合体(MAID6079HO)。MAID6079HO(纯合κ上UHC)小鼠包含本文所描述的通用重链(例如，hVH3-23/hD/hJH4)***所有小鼠Vκ和Jκ基因已经缺失的小鼠κ轻链基因座中。
将所有小鼠在RegeneronPharmaceuticals处在特定的无病原体条件下圈养并配种。将四只MAID6079HOF1小鼠(图49；7-12.5周龄，雄性和雌性)和四只MAID6079F1野生型同窝出生的对照小鼠(7-12.5周龄，雄性和雌性)处死，并且从动物收集脾和骨髓。通过用完全RPMI培养基(补充有胎牛血清、丙酮酸钠、Hepes、2-巯基乙醇、非必需氨基酸以及庆大霉素的RPMI培养基)冲洗从股骨收集骨髓。用ACK裂解缓冲液使来自脾和骨髓制剂的红血球裂解并且用完全RPMI培养基洗涤。
流式细胞测量术
为了检查本文所描述的遗传修饰的纯合“κ上UHC小鼠”(MAID6079HO)小鼠产生来源于遗传修饰的等位基因(例如，来自在κ轻链基因座中含有重排的VH3-23/D/JH4的单个拷贝的等位基因)的抗体的能力，如实施例3进行荧光活化细胞分选(FACS)分析。
MAID6079HO小鼠在骨髓室中展示实质上与野生型同窝出生仔中所观测到的相同的原和前B细胞(图50A-50B)。相比之下，其与野生型同窝出生仔相比在骨髓室中展示较低的未成熟和成熟B细胞数(图51A-51C)。事实上，小鼠具有少2倍的未成熟B细胞和几乎少4倍的成熟B细胞。MAID6079HO小鼠在骨髓中的未成熟和成熟B细胞中几乎只使用λ轻链序列(图52)。
在脾室中，MAID6079HO小鼠与野生型同窝出生仔相比展示较少的成熟B细胞(图53A-53B)。类似于骨髓中所观测到的情况，MAID6079HO小鼠在脾室中几乎只使用λ轻链序列(图54A-54B)。其与野生型同窝出生仔相比还展示较少的未成熟细胞、边缘区B细胞的增加以及滤泡B细胞的减少(图55)。
实施例8.包含含有重排的重链VDJ序列的免疫球蛋白轻链基因座和含有人类轻链可变域序列的免疫球蛋白重链基因座的小鼠的产生和分析
如上文所描述产生对于轻链基因座中的重排的重链可变区核酸序列而言纯合的小鼠(MAID6079HO；纯合“κ上UHC小鼠”)。将这些小鼠与对于重链基因座中的κ轻链可变区核酸序列而言纯合(MAID1994HO)的小鼠(重上κ(“KoH”)小鼠)杂交。MAID1994纯合KoH小鼠包含40个人类Vκ基因和所有人类Jκ基因，其中长IGCR和小鼠ADAM6***小鼠Ig重链恒定链基因座(即，缺失的小鼠Ig重链基因座)中。KoH先前已有描述；参看例如美国授予专利前公布2012/0096572，以引用的方式并入本文中。
将所有小鼠在RegeneronPharmaceuticals处在特定的无病原体条件下圈养并配种。将两只(MAID1242HO1640HO(“VI3”)；参看美国专利号8,502,018，以引用的方式并入本文中)小鼠(15周龄，雌性，n＝2；背景：28％C57/BL6、13％129以及59％Balb/c)、四只MAID1994HO6079HOF2小鼠(图56；13-14周龄，雄性，n＝2；背景：25％C57/BL6、25％129以及50％Balb/c)、以及MAID6079野生型同窝出生的对照小鼠处死，并且从动物收集脾和骨髓。通过用完全RPMI培养基(补充有胎牛血清、丙酮酸钠、Hepes、2-巯基乙醇、非必需氨基酸以及庆大霉素的RPMI培养基)冲洗从股骨收集骨髓。用ACK裂解缓冲液使来自脾和骨髓制剂的红血球裂解并且用完全RPMI培养基洗涤。
流式细胞测量术
为了检查本文所描述的遗传修饰的纯合“KoHxκ上UHC”(MAID1994HO6079HO)小鼠产生来源于遗传修饰的等位基因(例如，来自含有重排的VH3-23/D/JH4的单个拷贝的等位基因和在重链基因座中含有κ轻链可变区核酸序列的等位基因)的抗体的能力，如实施例3进行荧光活化细胞分选(FACS)分析。
MAID1994HO6079HO小鼠与VI3小鼠相比在骨髓室中展示较低的CD19+和前B细胞频率(图57A)。具体地说，MAID199406079HO小鼠与VI3小鼠相比在骨髓中展示约少2倍的CD19+和前B细胞数(图57B)。另外，MAID1994HO6079HO小鼠相对于VI3小鼠在骨髓室中展示约少3倍的未成熟B细胞(图58A和58B)。还发现，来自MAID1994HO6079HO小鼠的B细胞基本上缺乏骨髓中λ轻链的表达(图59)。
MAID1994HO6079HO小鼠在脾室中展示较低频率的B细胞。具体地说，MAID1994HO6079HO小鼠相对于VI3小鼠具有较少的脾B细胞数(约少2倍)和成熟B细胞数(约少3倍)(图60A-60B)。其与VI3小鼠相比再次展示λ轻链的表达缺乏(图61)。
考虑到脾中的外周B细胞发育，FACS分析指示，MAID1994HO6079HO小鼠相比VI3小鼠具有脾中频率增加的T1期细胞(图62)。
本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所描述的发明内容的特定实施方案的许多等效物。所述等效物被以上权利要求书所涵盖。
在本申请通篇所引用的所有非专利文献、专利申请以及专利的全部内容以全文引用的方式并入本文中。
虽然所描述的发明内容已经参考其特定方面和实施方案加以描述，但本领域的技术人员了解，在不脱离本发明的真正精神和范围的情况下可以作出各种改变并且可以替代等效物。另外，可以作出许多修改以使特定情形、材料、物质的组合物、过程、过程步骤适于所描述的发明内容的客观精神和范围。所有这样的修改都在附加于此的权利要求书的范围内。

Claims (27)

1.一种制造啮齿动物的方法，所述方法包括在其种系基因组中修饰所述啮齿动物以在内源免疫球蛋白重链基因座处包含重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，所述重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列操作性地连接至内源重链恒定区基因序列，其中所述重排的重链可变区核苷酸序列编码VH3-23/X1X2/JH序列，其中X1是任意氨基酸，且X2是任意氨基酸，且其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
2.如权利要求1所述的方法，其中X1是Gly且X2是Tyr。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述人类JH基因区段选自由以下组成的群组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6，以及其多态变体。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码人类VH3-23/GY/JH4-4序列(SEQIDNO:137)。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述重链恒定区基因序列选自CH1、铰链、CH2、CH3以及其组合。
6.如权利要求1所述的方法，其中实质上所有内源功能性VH、D以及JH基因区段从所述非人类动物的所述免疫球蛋白重链基因座缺失或促使其无功能。
7.如权利要求1所述的方法，进一步包括修饰所述啮齿动物以使内源功能性VH、D以及JH基因区段缺失或促使其无功能。
8.如权利要求1所述的方法，其中由所述重排的重链可变区核苷酸序列编码的免疫球蛋白重链可变域对所述啮齿动物没有免疫原性。
9.如权利要求1所述的方法，进一步包括修饰所述啮齿动物以包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者。
10.如权利要求4所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠。
11.如权利要求10所述的方法，其中修饰所述小鼠以包含Adam6a基因、Adam6b基因或两者。
12.如权利要求10所述的方法，其中进一步修饰所述小鼠以包含编码未重排的人类免疫球蛋白轻链V基因区段(VL)和未重排的人类免疫球蛋白轻链J基因区段(JL)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列操作性地连接至免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。
13.如权利要求1所述的方法，进一步包括修饰所述啮齿动物以包含编码未重排的人类免疫球蛋白轻链V基因区段(VL)和未重排的人类免疫球蛋白轻链J基因区段(JL)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列操作性地连接至免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述轻链恒定区基因序列选自啮齿动物和人类恒定区基因序列。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述啮齿动物选自小鼠、大鼠以及仓鼠。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述未重排的人类免疫球蛋白轻链(VL)基因区段和所述未重排的人类免疫球蛋白(JL)基因区段在内源啮齿动物基因座处操作性地连接至啮齿动物免疫球蛋白恒定区基因序列。
17.一种制造啮齿动物的方法，所述方法包括：
(a)修饰啮齿动物的基因组以使内源免疫球蛋白重链基因座的实质上所有内源功能性免疫球蛋白重链VH、D以及JH基因区段缺失或促使其无功能，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠；以及
(b)在所述基因组中的内源免疫球蛋白重链基因座处放置重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中所述重排的重链可变区核苷酸序列编码操作性地连接至内源重链恒定区基因序列的VH3-23/X1X2/JH序列，其中X1是任意氨基酸，且X2是任意氨基酸。
18.一种制造啮齿动物的方法，所述方法包括在其基因组中修饰所述啮齿动物以包含：
(i)在内源免疫球蛋白重链基因座处，重排的人类免疫球蛋白重链可变区核酸序列操作性地连接至内源重链恒定区核酸序列，其中所述重排的重链可变区核酸序列编码VH3-23/X1X2/JH序列，其中X1是任意氨基酸，且X2是任意氨基酸，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠；且
(ii)包含操作性地连接至轻链恒定区核酸序列的一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段的免疫球蛋白轻链基因座。
19.如权利要求18所述的方法，其中X1是Gly且X2是Tyr。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述人类JH基因区段选自由以下组成的群组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6，以及其多态变体。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述重排的人类免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列编码人类VH3-23/GY/JH4-4序列(SEQIDNO:137)。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述一个或多个但小于野生型数目的人类免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段在内源基因座处操作性地连接至轻链恒定区核酸序列。
23.如权利要求18所述的方法，其中所述免疫球蛋白轻链基因座包含两个人类VL基因区段Vκ1-39和Vκ3-20。
24.如权利要求18所述的方法，其中所述人类轻链VL或JL基因区段中的至少一者编码一个或多个不由对应的人类种系轻链可变基因区段编码的组氨酸密码子。
25.如权利要求18所述的方法，其中所述VL基因区段中的至少一者包含添加组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代至少一个由对应的人类种系VL区段序列编码的非组氨酸密码子。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述添加或取代的组氨酸密码子存在于CDR3中。
27.如权利要求18所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠。
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