JP2014531452A - 動物、レパートリーおよび方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、天然には見られない新規合成抗体鎖レパートリーの開発を可能にするための抗体遺伝子セグメントレパートリーをセクター化する概念に関する。本発明はまた、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座中の他の遺伝子セグメントおよび調節エレメントと比較して、遺伝子セグメントクラスターの新しい配置を提供することにより、セクター化が遺伝子セグメント発現をも変化させ、それによって、新しい合成抗体鎖配列レパートリーを提供することができるという本発明者らの認識にも関する。本発明はまた、遺伝子セグメント逆転にも関する。

Description

抗体遺伝子レパートリーセクター化および遺伝子セグメント逆転
本発明は、天然には見られない新規合成抗体鎖レパートリーの開発を可能にするために抗体遺伝子セグメントレパートリーをセクター化(sectoring)する概念に関する。セクター化は、個々のナイーブな、および免疫化された脊椎動物のB細胞コンパートメント中の抗体配列の生成のために利用可能な抗体遺伝子セグメントレパートリーを人工的に偏らせる(biasing)ことにより、非ヒト脊椎動物(マウスおよびラットなど)の限りあるB細胞コンパートメントを活用する。複数のこれらの脊椎動物は一緒になって、天然において、および抗体遺伝子座が操作された先行技術のトランスジェニック脊椎動物においては見られない組合せの合成抗体遺伝子セグメントレパートリーへのアクセスを提供する免疫化スケジュールおよび研究プログラムにおける集団として有用である。
本発明はまた、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座中の他の遺伝子セグメントおよび調節エレメントと比較して、遺伝子セグメントクラスターの新しい配置を提供することにより、セクター化が遺伝子セグメント発現をも変化させ、それによって、新しい合成抗体鎖配列レパートリーを提供することができるという本発明者らの認識にも関する。
この目的のために、本発明は、非ヒト脊椎動物における、新規な、合成的に拡張された抗体レパートリーならびに免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列レパートリーを提供する。本発明はまた、前記レパートリーおよび新規合成(非天然)レパートリーを一緒に提供する非ヒト脊椎動物(マウスまたはラットなど)の集団から、抗体を選択する方法も提供する。本発明はまた、カッパ鎖発現の実質的に非存在下でヒトラムダ可変領域発現に偏った特定の非ヒト脊椎動物も提供する。そのような脊椎動物は、本発明による新規軽鎖配列レパートリーを提供するためにカッパおよびラムダV遺伝子レパートリーをセクター化するのに有用である。
本発明はまた、脊椎動物遺伝子セグメントの逆転、ならびに、逆転した遺伝子断片が機能的であり、新しい合成の抗体鎖および可変領域レパートリーに寄与し得るトランスジェニック抗体鎖遺伝子座を構築するための前記脊椎動物遺伝子セグメントの使用にも関する。
技術水準は、ヒト可変(V)、多様性(D)および/または連結(J)セグメント、ならびに場合によってはヒト定常領域を含む、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト脊椎動物(例えば、マウスおよびラット)および細胞を提供する。あるいは、宿主脊椎動物の内因性定常領域(例えば、マウスまたはラット定常領域)がトランスジェニック遺伝子座中に提供される。そのようなトランスジェニック脊椎動物を構築する方法ならびに抗原免疫化後に抗体およびその核酸を作製するためのこれらのものの使用は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第7501552号(Medarex);米国特許第5939598号および米国特許第6130364号(Abgenix); WO02/066630、WO2011163311およびWO2011163314 (Regeneron); WO2011004192およびWO2011158009 (Kymab Limited); WO2009076464、WO2009143472、EP1414858、WO2009013620A2、WO2010070263A1およびWO2010109165A2 (Harbour Antibodies); EP1399559 (Crescendo Biologics)ならびにWO2010039900 (Ablexis)(これらの開示は、限定されるものではないが、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を担持する非ヒト動物を作製し、内因性遺伝子座発現を不活化する方法の指針を当業者に提供する目的で本明細書に明示的に組込まれる)を参照されたい。
米国特許第7501552号 米国特許第5939598号 米国特許第6130364号 WO02/066630 WO2011163311 WO2011163314 WO2011004192 WO2011158009 WO2009076464 WO2009143472 EP1414858 WO2009013620A2 WO2010070263A1 WO2010109165A2 EP1399559 WO2010039900 米国特許第6673986号 米国特許第6586251号 米国特許第5859301号
Nature. 1993 Jun 3;363(6428):446〜8頁; Naturally occurring antibodies devoid of light chains; Hamers-Casterman C、Atarhouch T、Muyldermans S、Robinson G、Hamers C、Songa EB、Bendahman N、Hamers R Nikaidoら、Nature 292: 845-848 (1981) www.genome.ucsc.edu http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&group=IGL G. JohnsonおよびT. T.Wu, 2002; World Wide Web (www) kabatdatabase.com Kabat, E. A.、Wu, T. T.、Perry, H.、Gottesman, K.、およびFoeller, C. (1991) 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第5版、NIH Publication No. 91-3242、Bethesda、MD A. C. R. Martin、2002; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs/simkab.html M.-P. Lefranc、2002; World Wide Web (www) imgt.cines.fr I. M. Tomlinson、2002; World Wide Web (www) mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase A. C. R. Martin、2002; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs A Ho's Amazing Atlas of Antibody Anatomy; A. Honegger, 2001; World Wide Web (www) unizh.ch/~antibody Web Antibody Modeling; N. WhiteleggおよびA. R. Rees, 2001; World Wide Web (www) antibody.bath.ac.uk M. R. Clark、2001; World Wide Web (www) path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html The Antibody Resource Page、2000; World Wide Web (www) antibodyresource.com J. Saldanha、2000; World Wide Web (www) people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s 「Antibody Engineering Methods and Protocols」、Benny K C Lo(編)、Methods in Molecular Biology(商標)、Human Press World Wide Web (www) blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-engineering-methods-and-protocols.pdf Harlow, E. & Lane, D. 1998、第5版、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview, NY PasqualiniおよびArap、Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257〜259頁 Sambrook, JおよびRussell, D. (2001、第3版) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) Lefranc, M.-P.、Exp. Clin. Immunogenet.、18、161〜174頁(2001) Eur J Immunol. 1994 Apr; 24(4):827〜36頁、「A directory of human germ-line V kappa segments reveals a strong bias in their usage」、J Coxら http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&group=IGK
トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を担持するナイーブな、および免疫化された非ヒト脊椎動物において新規で潜在的に拡張されたレパートリーおよび抗体の多様性を提供するために、先行技術の上にトランスジェニック非ヒト脊椎動物を改良することが望ましい。
本発明者らは、抗体を生成する非ヒト脊椎動物の集団のメンバーにわたってレパートリーを分割することにより、抗体遺伝子セグメントレパートリーをセクター化する方法を考案することにより、これに対処した。この概念を考案する際に、本発明者らは、より高い遺伝子セグメント配列多様性(例えば、ヒト抗体遺伝子セグメントおよびヒト抗体可変領域多様性)にアクセスする能力を、個々の脊椎動物のB細胞コンパートメントを限定的な遺伝子セグメントサブレパートリーに偏らせることにより可能にし、脊椎動物の集団全体が、新規遺伝子セグメント(および得られる抗体配列)レパートリーにアクセスし、先行技術のトランスジェニック脊椎動物コレクションによっては生成されない、拡張された範囲の抗体多様性を潜在的に活用することができることに気付いた。
本発明に従うセクター化によって遺伝子セグメントレパートリーを再分配することにより、天然または先行技術のトランスジェニック動物には見出されない免疫グロブリン遺伝子座中の遺伝子セグメントの新しい配置を提供することができる。例えば、実質的に完全なヒト機能的VH遺伝子レパートリーをセクター化する場合、天然ヒト重鎖遺伝子座中では通常、遠位であるVH遺伝子セグメントのための新しい位置を提供することができる(この例では、遺伝子座のDJC領域からさらに遠いVH遺伝子セグメントは、より近いVH遺伝子セグメント、すなわち、近位のVH遺伝子セグメントよりも遠位である)。これを、例えば、DおよびJH遺伝子(例えば、実質的に完全なヒトDおよびJHレパートリー)のすぐ上流に遠位VH遺伝子セグメントクラスター(例えば、5〜10個の遠位ヒト生殖系列VH遺伝子セグメント)を置くことにより行うことができる。これは、天然のヒト重鎖遺伝子座中の遠位VH遺伝子クラスターとDJ領域との間にあるVH遺伝子セグメントを効率的に省略する。そうすることにおいて、遠位VH遺伝子セグメントが近位調節エレメントの影響に今やはるかに近い合成配置が作製される。これに関して、天然遺伝子座中の近位V遺伝子セグメントは遠位V遺伝子セグメントよりも頻繁に組換えられることが多いことが観察されている。かくして、遠位遺伝子セグメントをより近位に移動させることにより、天然には見られないこれらの遺伝子セグメントの使用を変化させる可能性が提供される。これは、本発明における新規合成レパートリーの提供を支援する。さらに、これにより、当業者であれば、他の遺伝子セグメントの有用性をより完全に活用することができるように、脊椎動物中の免疫反応を支配する傾向がある遺伝子セグメントを省略することができる。省略された遺伝子セグメントは、例えば、免疫化されたマウスまたは他の非ヒト脊椎動物中の免疫抗体レパートリーを支配する比較的低親和性の抗体をもたらすことができる。省略は、抗体薬剤候補リードの選択のために用いられるレパートリーから、これらの望ましくない抗体を除去する。さらに、またはあるいは、特異的エピトープに結合する優勢な抗体の省略は、標的抗原上の新規な望ましいエピトープ、例えば、新規中和エピトープに結合する抗体の作製および選択を可能にすることが望ましい。
この目的のために、本発明は、以下を提供する。
第1の構成において
第1の態様において:合成抗体重鎖配列レパートリーを提供する方法であって、内因性重鎖発現が実質的に不活性である2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割された重鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する工程を含み、ゲノム中のレパートリー遺伝子セグメントが、重鎖定常領域(例えば、Cミューおよび/またはCガンマ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のVH遺伝子セグメント、1つまたは複数のD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJH遺伝子セグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムがVH、DおよびJH遺伝子セグメントから誘導された抗体重鎖配列の異なるレパートリーを発現することができ;
遺伝子セグメントレパートリーが、
(a)VH遺伝子レパートリー(例えば、ヒトVH遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトVH遺伝子レパートリー);
(b)D遺伝子レパートリー(例えば、ヒトD遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトD遺伝子レパートリー);
(c)JH遺伝子レパートリー(例えば、ヒトJH遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトJH遺伝子レパートリー)
からなる群から選択され;
場合により、遺伝子座中のDおよびJHセグメントがヒトDおよびJHセグメントである、方法。
第2の態様において:合成抗体カッパ鎖配列レパートリーを提供する方法であって、内因性カッパ鎖(およびまた場合により内因性ラムダ鎖)発現が実質的に不活性である2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたカッパ鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する工程を含み、ゲノム中のレパートリー遺伝子セグメントが軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のVκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムがVκおよびJκ遺伝子セグメントから誘導された抗体カッパ鎖配列の異なるレパートリーを発現することができ;
遺伝子セグメントレパートリーが、
(a)Vκ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトVκ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー);
(c)Jκ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトJκ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトJκ遺伝子レパートリー)
からなる群から選択され;
場合により、遺伝子座中のJκセグメントがヒトJκセグメントである、方法。
第3の態様において:合成抗体ラムダ鎖配列レパートリーを提供する方法であって、内因性ラムダ鎖(およびまた場合により内因性カッパ鎖)発現が実質的に不活性である2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたラムダ鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する工程を含み、ゲノム中のレパートリー遺伝子セグメントが軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のVλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムがVλおよびJλ遺伝子セグメントから誘導された抗体ラムダ鎖配列の異なるレパートリーを発現することができ;
遺伝子セグメントレパートリーが、
(a)Vλ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトVλ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー);
(c)Jλ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトJλ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトJλ遺伝子レパートリー)
からなる群から選択され;
場合により、遺伝子座中のJλセグメントがヒトJλセグメントである、方法。
第4の態様において:合成抗体軽鎖配列レパートリーを提供する方法であって、
ゲノム中のVκ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ、例えば、ヒトCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが実質的にラムダ軽鎖発現の非存在下でVκおよびJκ遺伝子セグメントから誘導された抗体カッパ軽鎖配列のレパートリーを発現することができる、内因性ラムダ鎖(およびまた場合により、内因性カッパ鎖)発現が実質的に不活性である第1群の非ヒト脊椎動物のゲノム中のVκ遺伝子レパートリー;ならびに
ゲノム中のVλ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ、例えば、ヒトCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが実質的にカッパ軽鎖発現の非存在下でヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントから誘導された抗体ラムダ軽鎖配列のレパートリーを発現することができる、内因性カッパ鎖(およびまた場合により、内因性ラムダ鎖)発現が実質的に不活性である第2群の非ヒト脊椎動物のゲノム中のVλ遺伝子レパートリー;
を提供する工程を含み、
場合により、Vκ遺伝子レパートリーがヒトVκ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー)であり、Vλ遺伝子レパートリーがヒトVλ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー)であり、遺伝子座中のJκセグメントがヒトJκセグメントであり、遺伝子座中のJλセグメントがヒトJλセグメントであり;
場合により、第1群および第2群のゲノムが実質的に完全なヒトの機能的VH遺伝子レパートリーを含む、方法。
第5の態様において、内因性重鎖発現が実質的に不活性であり、ゲノム中のVH遺伝子が、重鎖定常領域(例えば、Cミューおよび/もしくはCガンマ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のヒトJH遺伝子セグメントと、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメントとを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座の一部として提供される、2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたVH遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVH遺伝子レパートリー)を提供する工程を含み、ゲノムがヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントから誘導された抗体重鎖配列の異なるレパートリーを発現することができる、合成抗体重鎖配列レパートリーを提供する方法。場合により、VH遺伝子レパートリーは、ヒトVH遺伝子レパートリーである。
第6の態様において:内因性重鎖発現が実質的に不活性であり、ゲノム中のJH遺伝子が、重鎖定常領域(例えば、Cミューおよび/もしくはCガンマ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメントと、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメントとを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座の一部として提供される、2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたJH遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトJH遺伝子レパートリー)を提供することを含み、前記ゲノムがヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントから誘導された抗体重鎖配列の異なるレパートリーを発現することができる、合成抗体重鎖配列レパートリーを提供する方法。場合により、JH遺伝子レパートリーは、ヒトJH遺伝子レパートリーである。
第7の態様において:内因性重鎖発現が実質的に不活性であり、ゲノム中のD遺伝子が、重鎖定常領域(例えば、Cミューおよび/もしくはCガンマ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメントと、1つまたは複数のヒトJH遺伝子セグメントとを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座の一部として提供される、2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたD遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトJH遺伝子レパートリー)を提供することを含み、前記ゲノムがヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントから誘導された抗体重鎖配列の異なるレパートリーを発現することができる、合成抗体重鎖配列レパートリーを提供する方法。場合により、D遺伝子レパートリーは、ヒトD遺伝子レパートリーである。
第2の構成において
内因性カッパ鎖(およびまた場合によっては内因性ラムダ鎖)発現が実質的に不活性であり、ゲノム中のVκ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/もしくはCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のヒトJκ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムがヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントから誘導される抗体カッパ軽鎖配列の異なるレパートリーを発現することができる、2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたVκ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー)を提供することを含む、合成抗体カッパ軽鎖配列レパートリーを提供する方法。場合により、Vκ遺伝子レパートリーは、ヒトVκ遺伝子レパートリーである。
内因性カッパ鎖(およびまた場合によっては内因性ラムダ鎖)発現が実質的に不活性であり、ゲノム中のJκ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/もしくはCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のヒトVκ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムがヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントから誘導される抗体カッパ軽鎖配列の異なるレパートリーを発現することができる、2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたJκ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトJκ遺伝子レパートリー)を提供することを含む、合成抗体カッパ軽鎖配列レパートリーを提供する方法。場合により、Jκ遺伝子レパートリーは、ヒトJκ遺伝子レパートリーである。
第3の構成において
内因性ラムダ鎖(およびまた場合によっては内因性カッパ鎖)発現が実質的に不活性であり、ゲノム中のVλ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/もしくはCλ、例えば、ヒトCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のヒトJλ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムがヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントから誘導される抗体ラムダ軽鎖配列の異なるレパートリーを発現することができる、2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたVλ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー)を提供することを含む、合成抗体ラムダ軽鎖配列レパートリーを提供する方法。場合により、Vλ遺伝子レパートリーは、ヒトVλ遺伝子レパートリーである。
内因性ラムダ鎖(およびまた場合によっては内因性カッパ鎖)発現が実質的に不活性であり、ゲノム中のJλ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/もしくはCλ、例えば、ヒトCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のヒトVλ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムがヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントから誘導される抗体ラムダ軽鎖配列の異なるレパートリーを発現することができる、2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたJλ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトJλ遺伝子レパートリー)を提供する工程を含む、合成抗体ラムダ軽鎖配列レパートリーを提供する方法。場合により、Jλ遺伝子レパートリーは、ヒトJλ遺伝子レパートリーである。
第4の構成において
合成抗体軽鎖配列レパートリーを提供する方法であって、
内因性ラムダ鎖(およびまた場合によっては内因性カッパ鎖)発現が実質的に不活性であり、ゲノム中のVκ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ、例えば、ヒトCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のヒトJκ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供される第1群の非ヒト脊椎動物のゲノムであり、カッパ軽鎖発現の実質的に非存在下でヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントから誘導された抗体カッパ軽鎖配列のレパートリーを発現することができるゲノム中のVκ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー);ならびに
内因性カッパ鎖(およびまた場合によっては内因性ラムダ鎖)発現が実質的に不活性であり、ゲノム中のVλ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ、例えば、ヒトCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のヒトJλ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供される第2群の非ヒト脊椎動物のゲノムであり、カッパ軽鎖発現の実質的に非存在下でヒトVλおよびJλ遺伝子セグメントから誘導された抗体ラムダ軽鎖配列のレパートリーを発現することができるゲノム中のVλ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー)
を提供することを含み、
場合によって、第1群および第2群のゲノムが実質的に完全なヒトの機能的VH遺伝子レパートリーを含み;
場合によって、VκおよびVλ遺伝子レパートリーがヒトVκおよびVλ遺伝子レパートリーである、方法。
第5の構成において
合成抗体重鎖配列レパートリーを提供する方法であって、
(a)異なるヒトVH遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団を提供する工程であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割される、工程
を含み、
(b)前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第1のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
(c)前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第2のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
(d)第1のVH遺伝子サブレパートリーが第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって第1の脊椎動物が、第2の脊椎動物により生成される重鎖配列レパートリーとは異なる重鎖配列レパートリーを生成することができる、方法。
第6の構成において
合成抗体軽鎖配列レパートリーを提供する方法であって、
(a)異なるヒトVL遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団を提供する工程であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割される、工程
を含み、
(b)前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第1のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
(c)前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第2のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
(d)第1のVL遺伝子サブレパートリーが第2のVL遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって第1の脊椎動物が、第2の脊椎動物により生成される軽鎖配列レパートリーとは異なる軽鎖配列レパートリーを生成することができる、方法。
第7の構成において
所定の抗原に結合する抗体を選択する方法であって、
(a)前記抗原に結合する抗体のレパートリー(第1のレパートリー)を提供する工程であって、前記抗体が、ヒト重鎖および軽鎖可変領域を含み、前記レパートリーが、
i.軽鎖可変領域がヒトVλ遺伝子セグメントとヒトJL遺伝子セグメントとの再配置により生成される抗体のサブレパートリー(ラムダサブレパートリー);ならびに
ii.軽鎖可変領域がヒトVκ遺伝子セグメントとヒトJL遺伝子セグメントとの再配置により生成される抗体のサブレパートリー(カッパサブレパートリー)
を含む、工程;
(b)所望の抗体特性(例えば、前記抗原に対する結合親和性)によるラムダサブレパートリーから1つまたは複数の抗体を選択する工程;
(c)望ましい抗体特性によるカッパサブレパートリーから1つまたは複数の抗体を選択する工程であって、
選択されたラムダおよびカッパ抗体のレパートリー(第2のレパートリー)が生成され、第2のレパートリーの抗体が前記抗原に結合するヒト可変領域を含む、工程;ならびに
(d)前記望ましい抗体特性に基づいて、前記第2のレパートリーから1つまたは複数の抗体を選択する工程
を含み、
工程(a)(i)において、ラムダサブレパートリーが前記抗原を用いる1つまたは複数の非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)(ラムダ脊椎動物)の免疫化により生成され、ラムダ脊椎動物が、カッパ型抗体(軽鎖可変領域がVκ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)よりも多くのヒトラムダ型抗体(軽鎖可変領域がヒトVλ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)を発現し;
工程(a)(ii)において、カッパサブレパートリーが前記抗原を用いる1つまたは複数の非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)(カッパ脊椎動物)の免疫化により生成され、カッパ脊椎動物が、ラムダ型抗体(軽鎖可変領域がVλ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)よりも多くのヒトカッパ型抗体(軽鎖可変領域がヒトVκ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)を発現する、方法。
第8の構成において
異なるヒトVH遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割され、
(a)前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第1のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
(b)前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第2のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
(c)第1のVH遺伝子サブレパートリーが、それぞれ互いに異なる第1および第2の抗体重鎖配列レパートリーの発現のための第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって集団が抗体重鎖配列の合成レパートリーを提供する、集団。
第9の構成において
異なるヒトVL遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割され、
(a)前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第1のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
(b)前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第2のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
(c)第1のVL遺伝子サブレパートリーが、それぞれ互いに異なる第1および第2の抗体軽鎖配列レパートリーの発現のための第2のVL遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって集団が抗体軽鎖配列の合成レパートリーを提供する、集団。
第10の構成において
非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、それぞれの脊椎動物のゲノムが、
(a)それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の重鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座;ならびに
(b)それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の軽鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJL遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
を含み;
それぞれの脊椎動物において、トランスジェニック重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントがその定常領域に動作可能に連結され、トランスジェニック軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントがその定常領域に動作可能に連結され、免疫化の際に、脊椎動物が、重鎖遺伝子座の組換えにより生成された重鎖と、軽鎖遺伝子座の組換えにより生成された軽鎖とを含む抗体を生成することができ、重鎖および軽鎖がヒト可変領域を含み;
前記集団が、
(i)前記軽鎖遺伝子座が1つまたは複数のヒトVλ遺伝子セグメントを含み、再配置後に、遺伝子座がヒトVλ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖配列(ヒトラムダ軽鎖配列)を発現し、ラムダ脊椎動物がカッパ軽鎖配列よりも多くのラムダ軽鎖配列(Vκ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖の配列)を発現する第1の脊椎動物型(ラムダ脊椎動物);ならびに
(ii)前記軽鎖遺伝子座が1つまたは複数のヒトVκ遺伝子セグメントを含み、再配置後に、遺伝子座がヒトVκ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖配列(ヒトカッパ軽鎖配列)を発現し、カッパ脊椎動物がラムダ軽鎖配列よりも多くのカッパ軽鎖配列(Vλ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖の配列)を発現する第2の脊椎動物型(カッパ脊椎動物)
を含み;
前記集団の脊椎動物を同じ抗原で免疫化して、ヒト重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体のレパートリーを生成することができ、前記レパートリーが第1の型の脊椎動物により生成されたヒトラムダ抗体のサブレパートリー(ラムダサブレパートリー)と、第2の型の脊椎動物により生成されたヒトカッパ抗体のサブレパートリー(カッパサブレパートリー)とを含む、集団。
第11の構成において
非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)であって、それぞれの脊椎動物のゲノムが、
(c)それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の重鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座;ならびに
(d)それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の軽鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトVλ遺伝子セグメントレパートリーおよび1つまたは複数のヒトJλ遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
を含み;
再配置後に、軽鎖遺伝子座が、ヒトVλ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖配列(ヒトラムダ軽鎖配列)を発現し;
カッパ(および場合により、内因性ラムダ)軽鎖発現が実質的に不活化されており、脊椎動物がカッパ軽鎖配列より多くのヒトラムダ軽鎖配列(Vκ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖の配列)を発現し;
内因性重鎖発現が実質的に不活化されており;
それぞれの前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座が実質的に完全なヒトの機能的Vλ遺伝子セグメントレパートリーを含む、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)。
第12の構成において
合成抗体重鎖レパートリーを提供する方法であって、
(a)少なくとも第1および第2の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)のゲノムにわたってヒトVH遺伝子セグメントレパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVH遺伝子レパートリー)を分割する工程であって、前記レパートリーが、
ヒトの重鎖遺伝子座の遠位VH遺伝子クラスターに対応するVH遺伝子セグメントの第1のクラスター;および
ヒトの重鎖遺伝子座の近位VH遺伝子クラスターに対応するVH遺伝子セグメントの第2のクラスター
を含み、近位クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターの近くに配置され、
遠位クラスターが、1つまたは複数のD遺伝子セグメント、1つまたは複数のJH遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第1の脊椎動物の重鎖遺伝子座中に提供され;
近位クラスターが、1つまたは複数のD遺伝子セグメント、1つまたは複数のJH遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第2の脊椎動物の重鎖遺伝子座中に提供され;
近位VH遺伝子クラスターが、第1の脊椎動物の重鎖遺伝子座中の遠位クラスターとD遺伝子セグメントとの間に存在しない(場合により、さらなるVH遺伝子セグメントが第1の脊椎動物の重鎖遺伝子座中の遠位クラスターとD遺伝子セグメントとの間に存在しない)、工程、ならびに
(b)第1および第2の脊椎動物の前記重鎖遺伝子座を発現させて、合成抗体重鎖のレパートリーを提供する工程
を含む、方法。
合成抗体カッパ鎖レパートリーを提供する方法であって、
(a)少なくとも第1および第2の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)のゲノムにわたってヒトVκ遺伝子セグメントレパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー)を分割する工程であって、前記レパートリーが、
ヒトのカッパ鎖遺伝子座の遠位Vκ遺伝子クラスターに対応するVκ遺伝子セグメントの第1のクラスター;および
ヒトのカッパ鎖遺伝子座の近位Vκ遺伝子クラスターに対応するVκ遺伝子セグメントの第2のクラスター
を含み、近位クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターの近くに配置され、
遠位クラスターが、1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第1の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中に提供され;
近位クラスターが、1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第2の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中に提供され;
近位Vκ遺伝子クラスターが、第1の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJκ遺伝子セグメントとの間に存在しない(場合により、さらなるVκ遺伝子セグメントが第1の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJκ遺伝子セグメントとの間に存在しない)、工程、ならびに
(b)第1および第2の脊椎動物の前記カッパ鎖遺伝子座を発現させて、合成抗体カッパ鎖のレパートリーを提供する工程
を含む、方法。
合成抗体ラムダ鎖レパートリーを提供する方法であって、
(a)少なくとも第1および第2の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)のゲノムにわたってヒトVλ遺伝子セグメントレパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー)を分割する工程であって、前記レパートリーが、
ヒトのラムダ鎖遺伝子座の遠位Vλ遺伝子クラスターに対応するVλ遺伝子セグメントの第1のクラスター;および
ヒトのラムダ鎖遺伝子座の近位Vλ遺伝子クラスターに対応するVλ遺伝子セグメントの第2のクラスター
を含み、近位クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターの近くに配置され、
遠位クラスターが、1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第1の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中に提供され;
近位クラスターが、1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第2の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中に提供され;
近位Vλ遺伝子クラスターが、第1の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJλ遺伝子セグメントとの間に存在しない(場合により、さらなるVλ遺伝子セグメントが第1の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJλ遺伝子セグメントとの間に存在しない)、工程、ならびに
(b)第1および第2の脊椎動物の前記ラムダ鎖遺伝子座を発現させて、合成抗体ラムダ鎖のレパートリーを提供する工程
を含む、方法。
第13の構成において
ゲノムが、定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメント(および場合により、1つまたは複数のヒトDセグメント)を含むトランスジェニック抗体鎖遺伝子座を含み、遺伝子座が1つまたは複数の逆転された脊椎動物種遺伝子セグメントを含み、逆転された遺伝子セグメントが、そのようなセグメントの脊椎動物種生殖系列方向とは反対である5'-3'方向で遺伝子座中に存在し、非ヒト脊椎動物または細胞が、逆転された遺伝子セグメントから誘導された配列を含む抗体鎖配列を発現することができる、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスもしくはラット)または脊椎動物細胞(場合により、マウス細胞もしくはラット細胞)。
かくして、遺伝子セグメントは、関連する種の脊椎動物(例えば、ヒト)の生殖系列遺伝子座中の対応するCLまたはCμと反対の方向に天然に存在するが、本発明のおかげで、これらのものは遺伝子セグメントの方向がCLまたはCμと同じとなるように逆転される。
ゲノムが、定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメント(および場合により、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメント)を含むトランスジェニック抗体鎖遺伝子座を含み、遺伝子座が1つまたは複数の逆転されたヒト遺伝子セグメントを含み、逆転されたヒト遺伝子セグメントが、そのようなセグメントのヒト生殖系列方向とは反対である5'-3'方向で遺伝子座中に存在し、脊椎動物または細胞が、逆転された遺伝子セグメントの組換えから誘導された可変領域を含む抗体鎖配列を発現することができる、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスもしくはラット)または脊椎動物細胞(場合により、マウス細胞もしくはラット細胞)。
人工ヒト抗体可変領域レパートリーを提供する方法であって、非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞の抗体鎖遺伝子座中の1つまたは複数のJ遺伝子セグメント、場合により、1つまたは複数のヒトDセグメント、および定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメント(逆転された遺伝子セグメント)を挿入する工程を含み、V遺伝子セグメントがそのようなセグメントのヒト生殖系列方向と反対である5'-3'方向で遺伝子座中に存在し、非ヒト脊椎動物または細胞(またはその細胞から誘導された非ヒト脊椎動物子孫)が逆転された遺伝子セグメントの組換えから誘導された可変領域配列を含む抗体鎖配列を発現することができる、方法。
人工ヒト抗体可変領域レパートリーを提供する方法であって、上記の脊椎動物から血清またはリンパ系細胞(例えば、脾臓細胞またはB細胞)を単離する工程、および場合により、血清または細胞から、所定の抗原に特異的に結合する1つまたは複数の抗体を単離する工程を含む、方法。
6個のヒトJH遺伝子セグメント、27個のヒトD遺伝子セグメントおよび40個のVH遺伝子セグメントを含有するトランスジェニックヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関する潜在的なIgH抗体可変領域多様性の算出を示す図である。 各軽鎖遺伝子座が5個のヒトJL遺伝子セグメントおよび40個のVL遺伝子セグメントを含有する、トランスジェニックヒト免疫グロブリン軽鎖カッパおよびラムダ遺伝子座に関する潜在的なIgκおよびIgλ抗体可変領域多様性の算出を示す図である。 4x1014の合計潜在的抗体レパートリーサイズを与える、トランスジェニックヒト免疫グロブリン遺伝子座に関する潜在的なIgH、IgκおよびIgλ抗体可変領域多様性の算出を示す概略図である。 トランスジェニックマウスからの抗体選択の先行技術の方法における典型的なサンプリングサイズおよび典型的な得られるハイブリドーマ集団サイズを示す概略図である。 本発明による集団中の数匹のマウスにわたる軽鎖多様性のセクター化およびサンプリングのための得られる有益な新しい拡張されたレパートリーを示す概略図である。 本発明による集団中の数匹のマウスにわたるヒト機能的軽鎖多様性およびヒト機能的VH遺伝子セグメント多様性のセクター化ならびにサンプリングのための得られる有益な新しい拡張されたレパートリーを示す概略図である。 3つの異なるマウス系、K1、K2およびK3を構築するのに用いられた第1、第2および第3のBACに含有されるヒト遺伝子セグメントレパートリーを示す図である。K1は、ヒト遺伝子セグメントVκ1-19をJκ5に挿入した内因性Igカッパ遺伝子座を含み;K2は、ヒト遺伝子セグメントVκ2-24をJκ5に挿入した内因性Igカッパ遺伝子座を含み;およびK3は、ヒト遺伝子セグメントVκ2D-40をJκ5に挿入した内因性Igカッパ遺伝子座を含む。 最も3'側のマウスJκとマウスCκとの間の内因性マウスカッパ遺伝子座へのヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントの挿入を含むマウスからの転写物中の合計ヒトVκ遺伝子セグメント使用対マウスVκ使用を示す図である。K3/KA-K3-第1の内因性カッパ対立遺伝子は、最も3'側の内因性JκとマウスCκとの間に3つのカッパ鎖遺伝子座DNA挿入を有し、20個のヒトVκおよびJκ1〜Jκ5の挿入をもたらす;ならびに(ii)KA-第2の内因性カッパ対立遺伝子は不活化されている(内因性介在配列の挿入による)。この配置は、第1の内因性カッパ対立遺伝子に由来するカッパ軽鎖のみをコードする。 ヒトカッパ遺伝子座DNAが連続するBAC1〜3中に挿入された転写物中でのヒトVκ遺伝子セグメント使用の改善(およびかくして、内因性マウスVκ遺伝子セグメント使用の不活化の改善)を例示する図である。BAC1は、3'側の内因性JκとマウスCκとの間に6個のヒトVκおよびJκ1〜Jκ5を挿入する。BAC2は、BAC1から挿入されたヒトDNAに対して5'側にさらに8個のヒトVκ遺伝子セグメントを挿入し、3'側の内因性JκとマウスCκとの間に14個のヒトVκおよびJκ1〜Jκ5をもたらす。BAC3は、BAC2から挿入されたヒトDNAに対して5'側にさらに6個のヒトVκ遺伝子セグメントを挿入し、3'側の内因性JκとマウスCκとの間に20個のヒトVκおよびJκ1〜Jκ5をもたらす。それぞれの挿入に関して、内因性マウスVJ領域は、さらに上流(5'側)に押され、不活化が促進される。 K3/KAマウスからの転写物レベルでのヒトVκ使用の分布を示す図である。 3つの異なるマウス型(BAC1のみ(K1遺伝子型)、BAC1+2(K2遺伝子型)およびBAC1+2+3(K3遺伝子型)に由来するヒト遺伝子セグメントDNAの挿入に対応する)にわたって20個のヒトVκ遺伝子セグメントレパートリーをセクター化する効果を比較する図である。マウスからの転写物レベルでのヒトVκ使用の分布が例示される。異なるVκ使用が見られ、ヒト遺伝子レパートリーセクター化の結果として、異なるカッパ鎖レパートリー(および対応する異なるヒトカッパ可変領域レパートリー)を生成するマウスをもたらした。 3つの異なるマウス型(K1、K2およびK3)にわたってヒトJκ遺伝子セグメントレパートリーをセクター化する効果を比較する図である。マウスからの転写物レベルでのヒトJκ使用の分布が例示される。異なるJκ使用が見られ、ヒト遺伝子レパートリーセクター化の結果として、異なるカッパ鎖レパートリー(および対応する異なるヒトカッパ可変領域レパートリー)を生成するマウスをもたらした。 ヒト重鎖遺伝子座DNAが連続的BAC1〜3(S1キメラ重鎖遺伝子座(BAC1のみに由来するヒトVDJ遺伝子セグメントが挿入されている)、S2キメラ重鎖遺伝子座(BAC1およびBAC2に由来するヒトVDJ遺伝子セグメントが挿入されている)およびS3キメラ重鎖遺伝子座(BAC1、BAC2およびBAC3に由来するヒトVDJ遺伝子セグメントが挿入されている))中に挿入された転写物中でのヒトVH遺伝子セグメント使用の改善(およびかくして、内因性マウスVH遺伝子セグメント使用の不活化の改善)を例示する図である。BAC1は、3'側の内因性JH(マウスJH4)とマウスC-ミューとの間に6個のヒトVHならびに全ての機能的ヒトDHおよびJH遺伝子セグメントを挿入する。BAC2は、BAC1から挿入されたヒトDNAに対して5'側にさらに5個のヒトVH遺伝子セグメントを挿入し、3'側の内因性JH4とマウスC-ミューとの間に11個のヒトVHならびに全ての機能的ヒトDHおよびJHをもたらす。BAC3は、BAC2から挿入されたヒトDNAに対して5'側にさらに7個のヒトVH遺伝子セグメントを挿入し、3'側の内因性JH4とマウスC-ミューとの間に18個のヒトVHならびに全ての機能的ヒトDHおよびJHをもたらす。それぞれの挿入に関して、内因性マウス重鎖VDJ領域はさらに上流(5')に押され、不活化が促進される。BAC1ヒト遺伝子セグメント:VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1、ならびに全てのヒトDおよびJH遺伝子セグメントD1-1、2-2、3-9、3-10、4-11、5-12、6-13、1-14、2-15、3-16、4-17、5-18、6-19、1-20、2-21、3-22、4-23、5-24、6-25、1-26および7-27;およびJ1、J2、J3、J4、J5およびJ6。BAC2ヒト遺伝子セグメント:VH3-7、1-8、3-9、3-11および3-13。BAC3ヒト遺伝子セグメント:VH3-15、1-18、3-20、3-21、3-23、1-24および2-26。 3つの異なるマウス型(BAC1のみ(S1遺伝子型)、BAC1+2(S2遺伝子型)およびBAC1+2+3(S3遺伝子型)に由来するヒト遺伝子セグメントDNAの挿入に対応する)にわたって18個のヒトVH遺伝子セグメントレパートリーをセクター化する効果を比較する図である。マウスからの転写物レベルでのヒトVH使用の分布が例示される。異なるVH使用が見られ、ヒト遺伝子レパートリーセクター化の結果として、異なる重鎖レパートリー(および対応する異なるヒト重鎖可変領域レパートリー)を生成するマウスをもたらした。 ヒト重鎖遺伝子座DNAが、S1キメラ重鎖遺伝子座(BAC1のみに由来するヒトVDJ遺伝子セグメントが挿入されている)対S2キメラ重鎖遺伝子座(BAC1およびBAC2に由来するヒトVDJ遺伝子セグメントが挿入されている)およびV6キメラ重鎖遺伝子座((BAC1およびBAC6に由来するヒトVDJ遺伝子セグメントが挿入されている))について連続的BAC中に挿入された転写物におけるヒトVH遺伝子セグメント使用の改善(およびかくして、内因性マウスVH遺伝子セグメント使用の不活化の改善)を例示する図である。BAC1は、3'側の内因性JH(マウスJH4)とマウスC-ミューとの間に6個のヒトVHならびに全ての機能的ヒトDHおよびJH遺伝子セグメントを挿入する。BAC2は、BAC1から挿入されたヒトDNAに対して5'側にさらなる5個のヒトVH遺伝子セグメントを挿入し、3'側の内因性JH4とマウスC-ミューとの間に11個のヒトVHならびに全ての機能的ヒトDHおよびJHをもたらす。BAC6は、BAC1から挿入されたヒトDNAに対して5'側に8個のヒトVH遺伝子セグメントを付加し、3'側の内因性JH4とマウスC-ミューとの間に14個のヒトVHならびに全ての機能的ヒトDHおよびJHをもたらす。各挿入について、内因性マウス重鎖VDJ領域はさらに上流(5')に押され、不活化が促進される。BAC6ヒト遺伝子セグメント:VH3-66、3-64、4-61、4-59、1-58、3-53、5-51および3-49。 2つの異なるマウス型(BAC1+2(S2遺伝子型)およびBAC1+6(V6遺伝子型)に由来するヒト遺伝子セグメントDNAの挿入に対応する)にわたって19個のヒトVH遺伝子セグメントレパートリーをセクター化する効果を比較する図である。マウスからの転写物レベルでのヒトVH使用の分布が例示される。異なるVH使用が見られ、ヒト遺伝子レパートリーセクター化の結果として、異なる重鎖レパートリー(および対応する異なるヒト重鎖可変領域レパートリー)を生成するマウスをもたらした。 4つの異なるマウス系、K1、K2、K3およびK4を構築するために用いられた第1、第2、第3および第4のBACに含有されるヒト遺伝子セグメントレパートリーを示す図である。K4は、ヒト遺伝子セグメントVκ3D-40を3D-7に、Vκ2D-40、Vκ1D-39およびVκ1-33をJκ5に挿入した内因性Igカッパ遺伝子座を含む。 K4マウスからの転写物中の合計ヒトVκ遺伝子セグメント使用対マウスVκ使用を示す図である。 ヒトカッパ遺伝子座DNAが連続するBAC1〜4中に挿入された転写物中でのヒトVκ遺伝子セグメント使用の改善(およびかくして、内因性マウスVκ遺伝子セグメント使用の不活化の改善)を例示する図である。 4つの異なるマウス型(BAC1のみ(K1遺伝子型)、BAC1+2(K2遺伝子型)、BAC1+2+3(K3遺伝子型)およびBAC1+2+3+4(K4遺伝子型)に由来するヒト遺伝子セグメントDNAの挿入に対応する)にわたって6、13、19および29個のヒトVκ遺伝子セグメントレパートリーをセクター化する効果を比較する図である。マウスからの転写物レベルでのヒトVκ使用の分布が例示される。異なるVκ使用が見られ、ヒト遺伝子レパートリーセクター化の結果として、異なるカッパ鎖レパートリー(および対応する異なるヒトカッパ可変領域レパートリー)を生成するマウスをもたらした。記載のVκ変異体のヌクレオチド配列は当技術分野で公知であり(および特許請求の範囲における可能な包含のために参照により本明細書に組込まれる)、例えば、本明細書に記載のIMGTデータベースもしくは1000ゲノムデータベース(リリース1、バージョン3、2012年3月16日)から公知であるか、または本明細書の配列表に開示されている(変異体標識*d01について)。NB:Vκ3-20およびVκ3D-15は、BACまたはマウス中に存在しなかった。 4つの異なるマウス型(K1、K2、K3およびK4)にわたってヒトJκ遺伝子セグメントレパートリーをセクター化する効果を比較する図である。マウスからの転写物レベルでのヒトJκ使用の分布が例示される。異なるJκ使用が見られ、ヒト遺伝子レパートリーセクター化の結果として、異なるカッパ鎖レパートリー(および対応する異なるヒトカッパ可変領域レパートリー)を生成するマウスをもたらした。 いくつかの図面(例えば、図20)において、本発明の態様を例示する脊椎動物を構築するために用いられたものとして特定のヒト遺伝子セグメント変異体(対立遺伝子)が開示される(例えば、Vκ2D-40*01、命名はIMGTによる)。例えば、2012年7月11日水曜日の22:00:09 CESTのアップデート中のIMGTデータベースから誘導可能であるこれらの変異体の全部の配列(ヌクレオチドおよびアミノ酸)は、特許請求の範囲における可能な使用のために参照により本明細書に組込まれる。また、本発明の実施形態において、記載される特定の遺伝子セグメントは、図面に示される特定の変異体の1つもしくは複数または全部として提供することができる。そのような変異体の使用は、それらがヒトにおいて天然であり、かくして、ヒト医学における使用のためのIg鎖、抗体可変ドメインおよび抗体を作製するためのIg遺伝子座、細胞および脊椎動物を作製するのに有用であるため、望ましい。
本発明は、当業者に、集団内の個々の脊椎動物のB細胞コンパートメントを、アクセスしようとする全体として望ましいレパートリーの1つのセクターに由来する遺伝子セグメントサブレパートリーに専念させることを可能にする。例えば、一実施形態においては、本発明により、当業者は、集団中の個々の脊椎動物を、1つの型の軽鎖(ラムダまたはカッパ)に主に、または専ら限定し、それによって、その個々の脊椎動物内の抗体レパートリーを、(主に)ラムダまたはカッパ型抗体に偏らせることができる。かくして、個々の脊椎動物ベースでは、B細胞コンパートメントの限りある能力(アクセス可能なコンパートメントはマウスにおいては最大で約2x108個のB細胞である)は、この例においては実質的にラムダまたはカッパ型のみの抗体を生成するように人工的に制御される。ラムダおよびカッパ軽鎖VおよびJ遺伝子セグメントによりコードされる潜在的なレパートリーは、合計で2x108個よりはるかに多いため、これは重要である。しかしながら、全体として取った場合、そのような脊椎動物の集団(すなわち、ラムダに偏った脊椎動物とカッパに偏った脊椎動物との組合せ)は、天然には見られない抗体の全体的レパートリーを提供する(先行技術の脊椎動物コレクション中のB細胞コンパートメントは本発明により強制される合成的限定を有さない)。本発明の例によるこのレパートリーは、ラムダ鎖発現に偏った脊椎動物に由来するラムダ型抗体のサブレパートリーおよびにカッパ鎖発現に偏った脊椎動物に由来するカッパ型抗体の第2のサブレパートリーを含む。そのような手法は、カッパ型抗体のみを発現するマウスの提供に関する当技術分野における手法(おそらく、マウスにおいては5%の天然範囲の非常に低レベルのラムダ型抗体を有する)とは全く異なる。そのようなマウスの使用は、抗体を発現する場合、ラムダ遺伝子多様性をはるかにより完全に探索する望ましさを無視するものである。いくつかの先行技術の例においては、単一のマウスにおけるトランスジェニック重鎖、ラムダ鎖およびカッパ鎖遺伝子座が議論されているが(例えば、WO02/066630(Regeneron)を参照されたい)、再びここでは、ラムダ:カッパ鎖の比率は潜在的なラムダおよびカッパ多様性をより完全に探索するために操作されていない。そのようなマウスにおいては、潜在
的なVJ軽鎖レパートリー(抗体を発現するマウスにおいて利用可能な約2x108個より多いアクセス可能なB細胞である)の多くをサンプリングすることができないようなアクセス可能なB細胞コンパートメントのサイズにより、多様性が制限される。かくして、これらの先行技術のマウスは、ラムダおよびカッパVおよびJ遺伝子セグメントの組換えによりコードされる非常に少量の大きな潜在的多様性のみをサンプリングする方法において用いられる。例示については以下の実施例を参照されたい。
当業者には容易に明らかとなるように、本発明の任意の構成におけるIg遺伝子座中の定常領域の上流の遺伝子セグメント(例えば、VまたはJ遺伝子セグメント)の動作可能な接続により、その遺伝子セグメントを、遺伝子座の定常領域によりコードされる配列を含む免疫グロブリン鎖中で組換え、および発現させることができる。
集団の脊椎動物間で遺伝子セグメントレパートリーを分割することに関する「分割された」とは、遺伝子セグメントレパートリーが全体としては集団中に存在するが、集団の第1および第2の個々のメンバー(すなわち、個々の脊椎動物)のゲノムが、遺伝子セグメントの異なるコレクション(異なる「サブレパートリー」)、例えば、ヒトVH遺伝子セグメントの異なるコレクションを有することを意味する。サブレパートリーは、全体的レパートリーに由来する共通のヒト遺伝子セグメント(すなわち、重複サブレパートリー)を含むか、またはレパートリーに由来する共通でない遺伝子セグメント(すなわち、非重複サブレパートリー)を含んでもよい。
一例において、本発明の抗体重鎖配列レパートリーは、ヒトVH遺伝子セグメントと、DおよびJH遺伝子セグメントならびに定常領域(例えば、C-ミュー遺伝子セグメントまたはC-ガンマ遺伝子セグメント)との組換えから誘導された配列をそれぞれ含むRNA配列(例えば、mRNA)のレパートリーである。一例において、抗体重鎖配列レパートリーは、抗体重鎖をそれぞれコードするRNA配列(例えば、mRNA)のレパートリーである。一例において、抗体重鎖配列レパートリーは、抗体重鎖のレパートリー(例えば、抗体の一部として提供される)である。同様に、抗体軽鎖配列レパートリーは、ヒトVL遺伝子セグメント(例えば、VλまたはVκ)と、JL遺伝子セグメント(例えば、それぞれ、JλまたはJκ)および定常領域(例えば、C-カッパ遺伝子セグメントまたはC-ラムダ遺伝子セグメント)との組合せから誘導された配列をそれぞれ含むRNA配列(例えば、mRNA)のレパートリーであってもよい。一例においては、抗体軽鎖配列レパートリーは、抗体軽鎖をそれぞれコードするRNA配列(例えば、mRNA)のレパートリーである。一例において、抗体軽鎖配列レパートリーは、抗体軽鎖のレパートリー(例えば、抗体の一部として提供される)である。
用語「抗体」は、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む)、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多特異的抗体(例えば、二特異的抗体、ダイアボディ、および一本鎖分子)ならびに抗体断片(例えば、dAb、Fab、F(ab')2およびFv)を含む。用語「抗体」はまた、重鎖の二量体(5'-VH-(任意選択のヒンジ)-CH2-CH3-3')を含み、軽鎖を含まないH2抗体も含む(天然のH2抗体と同種;例えば、Nature. 1993 Jun 3;363(6428):446〜8頁; Naturally occurring antibodies devoid of light chains; Hamers-Casterman C、Atarhouch T、Muyldermans S、Robinson G、Hamers C、Songa EB、Bendahman N、Hamers Rを参照されたい)。かくして、本発明の実施形態においては、トランスジェニック重鎖遺伝子座から生成されるRNAは、CH1遺伝子セグメントを再び含まない重鎖をコードし、機能的抗体軽鎖を含まない。一例においては、トランスジェニック重鎖遺伝子座から生成されたRNAは、VH単一可変ドメイン(dAb;ドメイン抗体)をコードする。これらのものは、場合により定常領域を含んでもよい。
抗体の例は、2つの軽鎖と対形成した2つの重鎖を含む古典的な4鎖抗体(例えば、5'-VL-CL-3'と対形成した5'-VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3-3'の二量体)または重鎖の二量体(5'-VH-(任意選択のヒンジ)-CH2-CH3-3')を含み、軽鎖を含まないH2抗体である。かくして、本発明の実施形態においては、重鎖配列レパートリーは、CH1遺伝子セグメントを再び含まない重鎖をコードし、機能的抗体軽鎖を含まない。一例においては、重鎖配列レパートリーは、VH単一可変ドメイン(dAb;ドメイン抗体)のレパートリーをコードする。これらのものは、場合により、定常領域を含んでもよい。
本発明の任意の構成の一例において、レパートリーは、複数の異なるメンバーを含む(かくして、例えば、重鎖配列レパートリーは複数の異なる重鎖配列、例えば、その可変領域において異なる配列を含む)。本発明の任意の構成の一例において、レパートリーは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも103個、少なくとも104個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、少なくとも1011個、少なくとも1012個、少なくとも1013個、または少なくとも1014個の異なるメンバーを含むか、またはそれからなる。例えば、抗体鎖配列または抗体のレパートリーは、それぞれ少なくとも100個、少なくとも103個、少なくとも104個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、少なくとも1011個、少なくとも1012個、少なくとも1013個、または少なくとも1014個の抗体鎖配列または抗体を含むか、またはそれからなる。例えば、レパートリーは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも103個、少なくとも104個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、少なくとも1011個、少なくとも1012個、少なくとも1013個、または少なくとも1014個の異なるメンバーを含むか、またはそれからなる。例えば、遺伝子セグメント(例えば、ヒトVH遺伝子セグメントまたはVL遺伝子セグメントまたはVλ遺伝子セグメントまたはVκ遺伝子セグメント)のレパートリーは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個の遺伝子セグメントを含むか、またはそれからなる。場合により、全ての遺伝子セグメントが互いに異なる。
本発明において用いられるヒト遺伝子セグメントのレパートリーは、一例において、さらに非ヒト遺伝子セグメント、例えば、非ヒト脊椎動物遺伝子セグメントおよび/または合成遺伝子セグメントを含む。遺伝子セグメントのそのような組合せは、可能な可変領域多様性を増強することが望ましい。
本発明のいずれかの構成の一例において、集団は、複数の異なるメンバーを含む。かくして、例えば、トランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)の集団は、少なくとも2つ以上の脊椎動物が非同一ゲノムを含む複数の脊椎動物を含む。このゲノムは、例えば、ヒト遺伝子セグメント(例えば、ヒトVH遺伝子セグメント)のそのそれぞれのレパートリーにおいて異なっていてもよい。本発明の任意の構成の一例において、非ヒト脊椎動物の集団は、2体、3体、4体、5体、6体、7体、8体、9体、10体、少なくとも15体、少なくとも20体、少なくとも30体、少なくとも40体、少なくとも50体、少なくとも60v、少なくとも70体、少なくとも80体、少なくとも90体、少なくとも100体、少なくとも103体の非ヒト脊椎動物を含むか、またはそれからなる。集団が2つの脊椎動物からなる場合、脊椎動物のゲノムは異なる、例えば、ゲノムはヒト重鎖および/もしくは軽鎖遺伝子座遺伝子セグメント、例えば、VHもしくはVL遺伝子セグメントの異なるレパートリーを含む;または第1のゲノムはヒトラムダ遺伝子座遺伝子セグメント(例えば、ヒトVλおよび/もしくはJλのレパートリー)および(実質的に)非ヒトカッパ遺伝子座遺伝子セグメントを含み、第2のゲノムはヒトカッパ遺伝子座遺伝子セグメント(例えば、ヒトVκおよび/もしくはJκのレパートリー)および場合により(実質的に)非ヒトラムダ遺伝子座遺伝子セグメントを含む。
本発明の任意の構成における一実施形態においては、それぞれの脊椎動物は非ヒト哺乳動物である。本発明の任意の構成における一実施形態においては、脊椎動物はマウス、ラット、ウサギ、ラクダ科動物(例えば、ラマ、アルパカもしくはラクダ)、ニワトリまたはサメである。例えば、全ての脊椎動物は、同じ脊椎動物種のもの、例えば、全てマウスまたは全てラットである。
本発明の任意の構成において、挿入されたヒト遺伝子は、同じ個体もしくは異なる個体から誘導されたものであるか、または合成であるか、またはヒトコンセンサス配列であってもよい。
ゲノムがヒトV、JおよびD領域を含有するトランスジーンを含む非ヒト脊椎動物および脊椎動物細胞を構築するための技術は、当技術分野で周知である。例えば、WO2011004192、米国特許第7501552号、米国特許第6673986号、米国特許第6130364号、WO2009076464および米国特許第6586251号(これらの開示はその全体が参照により本明細書に組込まれる)を参照されたい。
一態様において、ヒト重鎖遺伝子セグメントが宿主調節配列(例えば、エンハンサー、プロモーターおよび/もしくはスイッチ)または他の(非ヒト、非宿主)配列の制御下に置かれるように、それらをゲノム中に挿入する。一態様において、ヒトコード領域に対する参照は、ヒトイントロンとエクソンの両方を含むか、または別の態様においては、エクソンのみを含み、イントロンを含まず、それはcDNAの形態にあってもよい。
あるいは、ES細胞における組換え工学、または他の組換えDNA技術を用いて、非ヒト脊椎動物(例えば、マウス)プロモーターまたは他の制御領域、例えば、V領域のためのプロモーターを、ヒトIg領域を含有するBAC中に挿入することができる。次いで、組換え工学工程は、ヒトDNAの一部を、マウスプロモーターまたは他の制御領域の制御下に置く。
一態様において、本発明の任意の構成の非ヒト脊椎動物(またはそれぞれの)非ヒト脊椎動物は、少なくとも1x106個の異なる機能的キメラ免疫グロブリン配列組合せの多様性を生成することができる。
場合により、本発明の任意の構成において、それぞれの定常領域は脊椎動物にとって内因性であり、場合により、内因性スイッチを含む(定常領域が重鎖定常領域である場合)。一実施形態において、定常領域は、Cガンマ(Cγ)遺伝子セグメント(例えば、ヒトCガンマ)および/またはSミュー(Sμ)スイッチを含む。スイッチ配列は当技術分野で公知であり、例えば、Nikaidoら、Nature 292: 845-848 (1981)ならびにまた、WO2011004192、米国特許第7501552号、米国特許第6673986号、米国特許第6130364号、WO2009/076464および米国特許第6586251号、例えば、米国特許第7501552号に開示された配列番号9〜24を参照されたい。場合により、定常領域は、内因性Sガンマスイッチおよび/または内因性Sミュースイッチを含む。一実施形態においては、少なくとも1つのヒトV領域、少なくとも1つのヒトJ領域、および場合により、少なくとも1つのヒトD領域、または再配置されたVDJもしくはVJ領域が、脊椎動物または細胞にとって内因性である定常領域に動作可能に接続されてゲノム中に挿入された脊椎動物または細胞ゲノム中にトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を構築することにより、1つまたは複数の内因性スイッチ領域を提供することができる。例えば、ヒトV(D)J領域または再配置されたVDJもしくはVJを、内因性定常領域と同じ染色体上にcisの向きに挿入することができる。transの向きも可能であり、その場合、ヒトV(D)J領域または再配置されたVDJもしくはVJは、ある対の染色体の一方(例えば、マウスにおいては第6染色体対またはラットにおいて第4染色体)に挿入され、内因性定常領域はその対の他の染色体上にあり、ヒトV(D)J領域または再配置されたVDJもしくはVJが内因性定常領域に動作不可能な連結にスプライスされるtransスイッチングが起こる。このように、脊椎動物は、その脊椎動物にとって内因性である定常領域(例えば、CガンマまたはCミュー)と共に、ヒトV(D)Jまたは再配置されたVDJもしくはVJにより全部または一部コードされる可変領域を含む鎖を有する抗体を発現することができる。
ヒト可変領域は、非ヒト脊椎動物定常領域の上流に好適に挿入され、後者は完全な定常領域または抗原を特異的に認識することができる有効なキメラ抗体の形成を可能にする定常領域の十分な部分をコードするのに必要とされるDNAの全部を含む。
一態様において、本発明による脊椎動物から単離されたキメラ抗体または抗体鎖は、宿主脊椎動物中に天然に存在する抗体において見られる、例えば、それらがFc受容体と相互作用する、および/または補体に結合することができる、1つまたは複数のエフェクター機能を提供するのに十分な宿主定常領域の一部を有する。
したがって、本明細書の非ヒト脊椎動物定常領域を有するキメラ抗体または抗体鎖に対する参照は、完全な定常領域に限定されないが、宿主定常領域の全部、または1つもしくは複数のエフェクター機能を提供するのに十分なその一部を有するキメラ抗体または鎖も含む。これはまた、ヒト可変領域DNAが宿主定常領域の全部または一部を含むキメラ抗体鎖を形成するように、宿主ゲノム中に挿入することができる本発明において用いられる非ヒト脊椎動物にも適用される。一態様においては、宿主非ヒト脊椎動物定常領域の全部が、ヒト可変領域DNAに動作可能に連結される。
本明細書に記載の宿主非ヒト脊椎動物定常領域は、場合により、重鎖または軽鎖にとって適切な場合、野生型遺伝子座に位置する内因性宿主野生型定常領域である。例えば、ヒト重鎖DNAは、脊椎動物がマウスである場合、好適にはマウス重鎖定常領域に隣接して、マウス第12染色体上に好適に挿入される。
脊椎動物がマウスである1つの任意選択の態様において、ヒトVDJ領域などのヒトDNAの挿入は、マウスゲノムIgH遺伝子座中のJ4エクソンとCμ遺伝子座の間の領域を標的とし、一態様においては、座標114,667,090と114,665,190の間、好適には、座標114,667,090の後の座標114,667,091に挿入される。一態様においては、ヒト軽鎖カッパVJ領域などのヒトDNAの挿入は、座標70,673,899と70,675,515の間、好適には、位置70,674,734のマウス第6染色体に、または第16染色体上のラムダマウス遺伝子座中の同等の位置を標的とする。
マウスに関する全てのヌクレオチド座標は、別途特定しない限り、マウスC57BL/6J株に関するNCBI m37に対応するもの、例えば、2007年4月のENSEMBL Release 55.37h、例えば、2007年7月のNCBI37(NCBI build 37)(例えば、UCSCバージョンmm9、www.genome.ucsc.eduおよびhttp://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.htmlを参照されたい)である。ヒトヌクレオチド座標は、別途特定しない限り、GRCh37(例えば、UCSCバージョンhg19、http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)、2009年2月のENSEMBL Release 55.に対応するもの、またはNCBI36、Ensemble release 54に対応するものである。ラットヌクレオチドは、別途特定しない限り、RGSC 3.4、2004年12月のENSEMBL release 55.34w、またはBaylor College of Medicine HGSC v3.4、2004年11月(例えば、UCSC rn4、www.genome.ucsc.eduおよびhttp://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.htmlを参照されたい)に対応するものである。
一態様においては、キメラ抗体を形成するための宿主非ヒト脊椎動物定常領域は、異なる(内因性ではない)染色体遺伝子座にあってもよい。この場合、挿入されるヒトDNA、例えば、ヒト可変VDJまたはVJ領域を、天然の重鎖または軽鎖定常領域のものとは異なる部位で非ヒトゲノム中に挿入することができる。天然の定常領域が、本発明のキメラ抗体を依然として生成することができるようにヒト可変領域と機能的な配置にあるように、それをゲノム中に挿入するか、または天然の位置に対して異なる染色体遺伝子座でゲノム内で複製させることができる。
一態様においては、ヒトDNAは、宿主定常領域と宿主VDJ領域の間の野生型遺伝子座に位置する内因性宿主野生型定常領域に挿入される。
定常領域の上流の可変領域または遺伝子セグメントの位置に対する参照は、2つの抗体部分が脊椎動物においてin vivoでキメラ抗体または抗体鎖を形成することができるような、2つの抗体部分、可変/遺伝子セグメントおよび定常領域の好適な相対位置が存在することを意味する。かくして、挿入されるヒトDNAおよび宿主定常領域は、抗体または抗体鎖生成のために互いに動作可能な接続にある。
一態様においては、挿入されるヒトDNAは、アイソタイプスイッチングを介して異なる宿主定常領域と共に発現され得る。一態様において、アイソタイプスイッチングは、transスイッチングを必要としないか、または含まない。関連する宿主定常領域と同じ染色体上へのヒト可変領域DNAの挿入は、アイソタイプスイッチングをもたらすためにtransスイッチングが必要ないことを意味する。
本発明において、場合により宿主非ヒト脊椎動物定常領域が維持され、一例においては、少なくとも1つの非ヒト脊椎動物エンハンサーまたは他の制御配列、例えば、スイッチ領域が、非ヒト脊椎動物定常領域と共に機能的な配置に維持され、宿主脊椎動物において見られるような、エンハンサーまたは他の制御配列の効果がトランスジェニック動物において全体として、または部分的に発揮される。この手法は、ヒト遺伝子座の完全な多様性をサンプリングすることを可能にする、エンハンサーなどの非ヒト脊椎動物制御配列により達成され、B細胞におけるシグナリング、例えば、スイッチ組換え部位を用いるアイソタイプスイッチングが依然として非ヒト脊椎動物配列を使用するようなものである同じ発現レベルを可能にするように設計される。
そのようなゲノムを有する非ヒト脊椎動物は、ヒト可変および非ヒト脊椎動物定常領域を有するキメラ抗体を生成するが、これらのものは、例えば、クローニング工程において容易にヒト化される。
例えば、ヒトゲノム中で天然に逆転したか、または偽遺伝子であるV(および/または他の遺伝子セグメント)を、本発明の集団により提供されるレパートリーから省略することができる。
本発明の任意の構成における「機能的」ヒト遺伝子セグメントに対する参照は、ヒトIg遺伝子座において、いくつかのVまたは他の遺伝子セグメントが非機能的偽遺伝子(例えば、Vλ3-17、Vλ3-15、Vλ3-13、Vλ3-7、Vλ3-6、Vλ2-5、Vλ3-4、Vλ3-2;IMGTデータベース:http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&group=IGLを参照されたい)であることを認識する。また、Jλ4-Cλ4およびJλ5-Cλ5は、ヒトにおいては機能的ではない。遺伝子セグメントに関して言う場合の用語「機能的」は、偽遺伝子を含まない。機能的ヒトVλ遺伝子セグメントの一例は、Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3およびVλ3-1の群である。機能的ヒトJλ遺伝子セグメントの一例は、Jλ1、Jλ2およびJλ3; またはJλ1、Jλ2およびJλ7; またはJλ2、Jλ3およびJλ7; またはJλ1、Jλ2、Jλ3およびJλ7の群である。機能的ヒトCλ遺伝子セグメントの一例は、Cλ1、Cλ2およびCλ3; またはCλ1、Cλ2およびCλ7; またはCλ2、Cλ3およびCλ7; またはCλ1、Cλ2、Cλ3およびCλ7の群である。
用語「生殖系列構成」とは、生殖系列ゲノム構成を指す。例えば、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、遺伝子セグメントの相対的順序がヒト生殖系列ゲノム中の対応する遺伝子セグメントの順序と同じである場合、生殖系列構成にある。例えば、トランスジェニック遺伝子座が、仮定的ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントA、BおよびCを含む本発明の重鎖遺伝子座である場合、これらのものは、ヒト生殖系列ゲノムの対応する遺伝子セグメントが配列5'-A-B-C-3'を含む場合、この順序(遺伝子座中で5'から3'に向かって)で提供される。一例において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のエレメント(例えば、遺伝子セグメント、エンハンサーまたは他の調節エレメント)が本発明によるトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座中で提供される場合、ヒトIg遺伝子座エレメントは、遺伝子セグメントの相対的順序がヒト生殖系列ゲノム中の対応する遺伝子セグメントの順序と同じであり、そのエレメント間にヒト配列が含まれ、これらのものがヒト生殖系列ゲノム中に対応するエレメント間のそのような配列に対応する場合、生殖系列構成にある。かくして、仮定的な例において、トランスジェニック遺伝子座は、配列5'-A-S1-B-S2-C-S3-3'(ここで、A、BおよびCは、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントであり、S1〜S3は、ヒト遺伝子間セグメント配列であり、対応する配列5'-A-S1-B-S2-C-S3-3'はヒト生殖系列ゲノム中に存在する)中にヒトエレメントを含む。例えば、本発明のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座中に、ヒト生殖系列ゲノム中のAからCまでのDNA配列に対応するDNA挿入物(またはAからCまでのDNA配列を含む挿入物)を提供することにより、これを達成することができる。ヒト生殖系列ゲノムおよび免疫グロブリン遺伝子座中の配列は、当技術分野で公知である(例えば、IMGT、Kabatおよび他の抗体資源を参照されたい)。
抗体遺伝子セグメント配列の供給源として、当業者であれば、以下の利用可能なデータベースおよび資源(そのアップデートを含む)(その内容は参照により本明細書に組込まれる)も知っている。
Kabatデータベース(G. JohnsonおよびT. T.Wu, 2002; World Wide Web (www) kabatdatabase.com)。1966年にE.A.KabatおよびT.T.Wuによって作出されたKabatデータベースは、抗体、T細胞受容体、主要組織適合複合体(MHC)クラスIおよびII分子、ならびに免疫学的対象の他のタンパク質の整列された配列を公開する。検索可能なインタフェースは、SeqhuntIIツールにより提供され、配列アラインメント、配列亜群分類、および変動性プロットの作製のための幅広いユーティリティが利用可能である。また、特に、本発明における使用のためのヒト遺伝子セグメントを参照して、参照により本明細書に組込まれる、Kabat, E. A.、Wu, T. T.、Perry, H.、Gottesman, K.、およびFoeller, C. (1991) 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第5版、NIH Publication No. 91-3242、Bethesda、MDも参照されたい。
KabatMan(A. C. R. Martin、2002; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs/simkab.html)。これは、Kabat配列データベースへのクエリーを簡単にするウェブインタフェースである。
IMGT(International ImMunoGeneTics Information System(登録商標); M.-P. Lefranc、2002; World Wide Web (www) imgt.cines.fr)。IMGTは、あらゆる脊椎動物種の抗体、T細胞受容体、およびMHC分子を専門とする統合情報システムである。それは、ヌクレオチドおよびタンパク質配列、オリゴヌクレオチドプライマー、遺伝子マップ、遺伝子多型、特異性、および二次元(2D)および三次元(3D)構造を含む標準化されたデータへの共通のポータルを提供する。IMGTは、3つの配列データベース(IMGT/LIGM-DB、IMGT/MHC-DB、IMGT/PRIMERDB)、1つのゲノムデータベース(IMGT/GENE-DB)、1つの3D構造データベース(IMGT/3D構造-DB)、および幅広いウェブ資源(「IMGT Marie-Pauleのページ」)ならびに相互作用ツールを含む。
V-BASE(I. M. Tomlinson、2002; World Wide Web (www) mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)。V-BASEは、1000を超える公開された配列から蓄積された全てのヒト抗体生殖系列可変領域配列の包括的ディレクトリである。それは、再配置された抗体V遺伝子の、その最も近い生殖系列遺伝子セグメントへの割り当てを可能にするアラインメントソフトウェアDNAPLOTのバージョン(Hans-Helmar AlthausおよびWerner Mullerにより開発された)を含む。
抗体-構造および配列(A. C. R. Martin、2002; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs)。このページは、抗体の構造および配列に関する有用な情報をまとめたものである。それは、Kabat抗体配列データへの問い合わせインタフェース、抗体、結晶構造に関する一般情報、および他の抗体関連情報へのリンクを提供する。それはまた、Protein Databank(PDB)に寄託されたあらゆる抗体構造の自動化された概要を配布している。特に興味深いのは、抗体可変領域の様々な番号付けスキームの徹底的な記載および比較である。
AAAAA(A Ho's Amazing Atlas of Antibody Anatomy; A. Honegger, 2001; World Wide Web (www) unizh.ch/~antibody)。この資源は、構造分析、モデリング、および遺伝子操作のためのツールを含む。それは、抗体およびT細胞受容体配列の包括的構造アラインメントのための統一的スキームを採用しており、抗体分析および図示のためのExcelマクロを含む。
WAM(Web Antibody Modeling; N. WhiteleggおよびA. R. Rees, 2001; World Wide Web (www) antibody.bath.ac.uk)。University of Bath、United KingdomのCentre for Protein Analysis and Designにより主催されている。確立された理論的方法の組合せを用いて抗体Fv配列の3Dモデルを構築するためのAbMパッケージ(以前はOxford Molecularにより市販されていた)に基づけば、このサイトは最新の抗体構造情報も含む。
Mike's Immunoglobulin Structure/Function Page (M. R. Clark、2001; World Wide Web (www) path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html)。これらのページは、免疫グロブリンの構造および機能に関する教育材料を提供し、多くのカラー画像、モデル、およびアニメーションにより例示されている。抗体ヒト化およびMike Clark's Therapeutic Antibody Human Homology Projectに関するさらなる情報が利用可能であり、これは臨床効果および抗免疫グロブリン応答と、治療抗体の可変領域配列とを相関させることを目的とする。
The Antibody Resource Page (The Antibody Resource Page、2000; World Wide Web (www) antibodyresource.com)。このサイトは自身で、「抗体研究および供給業者に対する完全な指針」と記載している。アミノ酸配列決定ツール、ヌクレオチド抗体配列決定ツール、およびハイブリドーマ/細胞培養データベースへのリンクが提供される。
Humanization bY Design (J. Saldanha、2000; World Wide Web (www) people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s)。この資源は、抗体ヒト化技術に関する概説を提供する。最も有用な特徴は、設計問題、フレームワーク選択、フレームワーク復帰突然変異、およびヒト化構築物の結合親和性に関する情報を含む40を超える公開されたヒト化抗体の検索可能なデータベース(配列およびテキストによる)である。
また、「Antibody Engineering Methods and Protocols」、Benny K C Lo(編)、Methods in Molecular Biology(商標)、Human Pressも参照されたい。また、World Wide Web (www) blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-engineering-methods-and-protocols.pdfも参照されたい。
B細胞を取得することができる試料としては、限定されるものではないが、血液、血清、脾臓、脾臓組織、骨髄、リンパ、リンパ節、胸腺、および虫垂が挙げられる。抗体および免疫グロブリン鎖を、以前に記載の試料のそれぞれから、ならびにまた、以下の非限定的一覧:B細胞、腹水、ハイブリドーマ、および細胞培養物の非限定的一覧から取得することができる。
「複数」はその用語の通常の意味で用いられ、「少なくとも1つ」または「1つより多い」を意味する。
「から誘導される」は、その用語の通常の意味で用いられる。類義語の例としては、「として生成される」、「から得られる」、「から受容される」、「から取得される」、「の生成物」、「の結果」、および「から改変される」が挙げられる。例えば、重鎖のヒト可変領域を、ヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントの組換えから誘導することができ、これは、例えば、任意の付随する突然変異(例えば、連結突然変異)を有する本発明によるトランスジェニック重鎖遺伝子座中でのこれらの遺伝子セグメントのin vivoでの組換えを反映する。
本発明の任意の構成における一実施形態においては、ある脊椎動物またはそれぞれの脊椎動物のゲノムは、完全に内因性の抗体の発現を防止するか、または低減させるように改変されている。これを行うための好適な技術の例は、WO2011004192、米国特許第7501552号、米国特許第6673986号、米国特許第6130364号、WO2009/076464、EP1399559、および米国特許第6586251号に見出すことができ、その開示は参照により本明細書に組込まれる。一実施形態においては、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座の非ヒト脊椎動物VDJ領域、および場合により、内因性軽鎖免疫グロブリン遺伝子座(ラムダおよび/またはカッパ遺伝子座)のVJ領域が不活化されている。例えば、非ヒト脊椎動物VDJ領域の全部または一部は、哺乳動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座における逆転により不活化され、場合により、逆転した領域は内因性Ig遺伝子座の上流または下流に移動する。例えば、非ヒト脊椎動物VJ領域の全部または一部は、哺乳動物の内因性カッパ鎖免疫グロブリン遺伝子座における逆転により不活化され、場合により、逆転した領域は内因性Ig遺伝子座の上流または下流に移動する。例えば、非ヒト脊椎動物VJ領域の全部または一部は、哺乳動物の内因性ラムダ鎖免疫グロブリン遺伝子座における逆転により不活化され、場合により、逆転した領域は内因性Ig遺伝子座の上流または下流に移動する。一実施形態においては、内因性重鎖遺伝子座は、内因性カッパおよびラムダ遺伝子座の一方または両方と同様、この方法で不活化される。
さらに、またはあるいは、ある脊椎動物またはそれぞれの脊椎動物は、成熟宿主BおよびTリンパ球の生成を防止する遺伝的背景、場合により、RAG-1欠損および/またはRAG-2欠損背景で作製されたものである。RAG-1欠損動物を作製するための技術については、米国特許第5859301号を参照されたい。
一実施形態においては、脊椎動物の免疫グロブリンは、前記ヒト遺伝子セグメントのレパートリーにおいてのみ異なる。
用語「免疫グロブリン」(Ig)は、本明細書では「抗体」と互換的に用いられる。
「単離された」抗体は、その生成環境(例えば、天然または組換え)の成分から同定、分離および/または回収されたものである。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その生成環境に由来するあらゆる他の成分との会合を含まず、例えば、抗体はFDAにより認可され得るか、または認可された標準に対して単離されている。組換えトランスフェクト細胞から生じるものなどの、その生成環境の汚染成分は、抗体に関する研究、診断的または治療的使用を典型的に妨げる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられる。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、(1)例えば、Lowry法により決定された場合に抗体が95重量%を超えるまで、いくつかの実施形態においては、99重量%を超えるまで;(2)スピニングカップシーケネーター(spinning cup sequenator)の使用によってN末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで;または(3)クマシーブルー、もしくは、好ましくは、銀染色を用いる非還元もしくは還元条件下でのSDS-PAGEで均一になるまで精製される。抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、単離された抗体は組換え細胞内のin situの抗体を含む。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドまたは抗体は少なくとも1つの精製工程によって調製される。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合領域および/または可変領域を含む。抗体断片の例としては、dAb、Fab、Fab'、F(ab')2およびFv断片; ダイアボディ; 線状抗体; 一本鎖抗体分子ならびに抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。
特定のポリペプチド、抗原、またはエピトープに「特異的に結合する」または「特異的な」抗体は、他のポリペプチド、抗原またはエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチド、抗原、またはエピトープに結合するものである。例えば、抗原またはエピトープへの結合は、抗体が100μM以下、10μM以下、1μM以下、100nM以下、例えば、10nM以下、1nM以下、500pM以下、100pM以下、または10pM以下のKDで結合する場合に特異的である。当業者によって公知である標準的な手順、例えば、ELISAにおける結合および/または表面プラズモン共鳴を用いる親和性決定(例えば、Biacore(商標)もしくはfMまでの親和性を検出することができるKinExA(商標)液相親和性測定(Sapidyne Instruments、Idaho))を用いて、結合親和性(KD)を決定することができる。
「薬学的に許容される」とは、米国連邦もしくは州政府の規制当局により認可されたか、もしくは認可され得るか、または米国薬局方もしくはヒトを含む動物における使用のための他の一般的に認識される薬局方に列挙されていることを指す。「薬学的に許容される担体、賦形剤、またはアジュバント」とは、薬剤、例えば、本明細書に記載の任意の抗体または抗体鎖と一緒に、対象に投与することができ、その薬理活性を破壊せず、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与した場合に非毒性的である担体、賦形剤、またはアジュバントを指す。
脊椎動物がマウスである場合の本発明の任意の構成の一実施形態においては、(i)定常領域はマウスまたはラットのSμスイッチおよび場合により、マウスのCμ領域を含む。例えば、定常領域は、マウスにとって内因性である定常領域により、例えば、マウスゲノムまたはマウス細胞ゲノムの内因性定常領域との動作可能な連結中にヒトV(D)J領域配列を挿入することにより提供される。
脊椎動物がラットである場合の本発明の任意の構成の一実施形態においては、(i)定常領域はマウスまたはラットのSμスイッチおよび場合により、ラットのCμ領域を含む。例えば、定常領域は、ラットにとって内因性である定常領域により、例えば、ラットゲノムまたはラット細胞ゲノムの内因性定常領域との動作可能な連結中にヒトV(D)J領域配列を挿入することにより提供される。
本発明の脊椎動物(カッパ脊椎動物を除く)の任意の構成の一実施形態においては、ゲノムは、少なくとも1つのヒトJλ領域および少なくとも1つのヒトCλ領域、場合により、Cλ6および/またはCλ7を含むヒトIgλ遺伝子座の全部または一部を含む抗体軽鎖トランスジーンを含む。場合により、トランスジーンは、複数のヒトJλ領域、場合により、Jλ1、Jλ2、Jλ6およびJλ7のうちの2つ以上、場合により、Jλ1、Jλ2、Jλ6およびJλ7の全部を含む。ヒトラムダ免疫グロブリン遺伝子座は、連続するJ-Cクラスターから構成されるユニークな遺伝子構造を含む。この特徴を利用するために、本発明は、任意選択の態様において、例えば、定常領域が非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞に対して内因性である場合、トランスジーン中の定常領域と動作不可能な連結にある1つまたは複数のそのようなヒトJ-Cクラスターを用いる。かくして、場合により、トランスジーンは、少なくとも1つのヒトJλ-Cλクラスター、場合によっては少なくともJλ7-Cλ7を含む。トランスジーンが生殖系列構成中に1つまたは複数のJ-Cクラスターを含み、有利には、ヒト遺伝子座中のクラスター間および/または隣接するJ領域とC領域の間に介在配列をも含むように、ヒトラムダ遺伝子座の全部または一部を用いることができることにより、そのようなトランスジーンの構築は容易になる。これは、VJおよび/またはJC組換えに関与し得る、ならびにAID(活性化誘導デアミナーゼ)またはAID相同体により認識され得る介在配列内に任意の調節エレメントを保存する。
内因性調節エレメントが非ヒト脊椎動物におけるCSR(クラススイッチ組換え)に関与する場合、非ヒト脊椎動物に対して内因性である定常領域をトランスジーン中に包含させることにより、これらのものを保存することができる。本発明においては、当業者であれば、脊椎動物に対して内因性であるAIDもしくはAID相同体またはその機能的突然変異体を用いることにより、これを一致させることができる。そのような設計エレメントは、SHM(体細胞超変異)および/またはCSRのための酵素スペクトルを最大化し、かくして、抗体多様性の潜在能力を最大化するのに有利である。
場合により、ラムダトランスジーンは、ヒトEλエンハンサーを含む。場合により、カッパトランスジーンは、ヒトEκエンハンサーを含む。場合により、重鎖トランスジーンは、重鎖ヒトエンハンサーを含む。
本発明の任意の構成の一実施形態においては、定常領域は、非ヒト脊椎動物に対して内因性であるか、またはそのような定常領域から誘導される。例えば、脊椎動物はマウスであり、定常領域はマウスに対して内因性である。例えば、脊椎動物はラットであり、定常領域はラットに対して内因性である。
本発明の任意の構成の一実施形態においては、重鎖トランスジーンは、複数のヒトIgH V領域、複数のヒトD領域および複数のヒトJ領域を含む。
本発明の任意の構成の一実施形態においては、脊椎動物は重鎖のさらなるトランスジーンを含み、さらなるトランスジーンは、少なくとも1つのヒトIgH V領域、少なくとも1つのヒトD領域および少なくとも1つのヒトJ領域を含む。
一態様は、抗体または前記抗体をコードするヌクレオチド配列を単離する方法であって、
(a)脊椎動物が抗体を生成するような抗原を用いて、本発明の任意の構成または態様による脊椎動物集団を免疫化するする(例えば、Harlow, E. & Lane, D. 1998、第5版、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview, NY;ならびにPasqualiniおよびArap、Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257〜259頁を参照されたい)工程;ならびに
(b)免疫化された脊椎動物から、前記抗原に特異的に結合する抗体および/または前記抗体の少なくとも重鎖および/もしくは軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を単離する工程;
を含み、場合により、続いて、前記抗体の可変領域をヒト定常領域に連結する、方法を提供する。そのような連結は、当業者には明らかであるように、従来の組換えDNAおよびRNA技術を用いるなど、当技術分野で容易に利用可能な技術により行うことができる。例えば、Sambrook, JおよびRussell, D. (2001、第3版) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)を参照されたい。
好適には、免疫原性量の抗原が送達される。本発明はまた、上記のように生成された抗体を、その抗体の一部を認識する二次検出剤を用いて検出する工程を含む、標的抗原を検出するための方法にも関する。
工程(b)における抗体の単離を、従来の抗体選択技術、例えば、当業者には容易に明らかであるように、場合により高いストリンジェンシーでの反復ラウンドを用いる、固相支持体上に固定された抗原に対する抗体のパンニング(panning)を用いて実行することができる。
さらなる任意選択の工程として、工程(b)の後、抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域のアミノ酸配列を突然変異させて、前記抗原への結合の親和性を改善する。突然変異を、当業者には容易に明らかであるような従来の技術により、例えば、変異性PCRにより作製することができる。親和性を、当業者には容易に明らかであるような従来の技術により、例えば、表面プラズモン共鳴、例えば、Biacore(商標)を用いることにより決定することができる。
さらに、またはあるいは、さらなる任意選択の工程として、工程(b)の後、抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域のアミノ酸配列を突然変異させて、抗体の1つまたは複数の生物物理的特徴、例えば、融点、溶液状態(単量体もしくは二量体)、安定性および発現(例えば、CHOもしくは大腸菌(E coli)中での)のうちの1つまたは複数を改善する。
一態様は、場合により、医学における使用のため、例えば、患者、例えば、ヒトにおける医学的状態または疾患を処置および/または防止するための、本発明の方法により生成された抗体を提供する。
一態様は、場合により、ヌクレオチド配列がベクターの一部である、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を提供する。好適なベクターは、当業者には容易に明らかであり、例えば、1つまたは複数の発現制御エレメントと共に動作可能な連結にあるヌクレオチド配列を含む従来の抗体発現ベクターである。
一態様は、本発明の抗体と、希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物を提供し、場合により、組成物はIV容器(例えば、IVバッグ)またはIVシリンジに接続された容器中に含有される。
一態様は、患者、例えば、ヒトにおける疾患または状態の処置および/または予防のための薬剤の製造における本発明の抗体の使用を提供する。
さらなる態様において、本発明は、所望の抗原に特異的な抗体を生成する方法であって、上記の非ヒト脊椎動物の集団を、所定の抗原を用いて免疫化し、キメラ抗体を回収する工程を含む、方法に関する(例えば、Harlow, E. & Lane, D. 1998、第5版、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY;ならびにPasqualiniおよびArap、Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257〜259頁を参照されたい)。好適には、免疫原性量の抗原が送達される。本発明はまた、上記のように生成された抗体を、その抗体の一部を認識する二次検出剤を用いて検出する工程を含む、標的抗原を検出するための方法にも関する。
さらなる態様において、本発明は、上記の非ヒト脊椎動物の集団を、所定の抗原を用いて免疫化する工程、キメラ抗体または抗体を発現する細胞を回収する工程、次いで、非ヒト脊椎動物定常領域をヒト定常領域で置きかえる工程を含む、完全ヒト化抗体を生成する方法に関する。これは、非ヒト脊椎動物定常領域を、適切なヒト定常領域DNA配列で置きかえるためのDNAレベルでの標準的なクローニング技術により行うことができる。例えば、Sambrook, JおよびRussell, D. (2001、第3版) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)を参照されたい。
さらなる態様において、本発明は、キメラおよび完全ヒト化形態の両方の、本発明に従って生成されたヒト化抗体および抗体鎖、ならびに医学における前記抗体の使用に関する。本発明はまた、そのような抗体と、薬学的に許容される担体または他の賦形剤とを含む医薬組成物にも関する。
キメラヒト-非ヒト抗体鎖などの、ヒト配列を含有する抗体鎖は、ヒトタンパク質コード領域の存在の理由から、本明細書ではヒト化されていると考えられる。標準的な技術を用いて、本発明のキメラ抗体鎖をコードするDNAから出発して、完全ヒト化抗体を生成することができる。
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方の作製のための方法が当技術分野で周知であり、本発明は、本発明において用いられる非ヒト脊椎動物の集団中での抗原チャレンジに応答して生成されるキメラまたは完全ヒト化抗体のポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方に関する。
さらなる態様において、本発明を用いて作製されたキメラ抗体または抗体鎖を、好適にはDNAレベルで操作して、定常領域が存在しない重鎖に由来するヒト可変領域、例えば、ドメイン抗体;または同じか、もしくは異なる種に由来する重鎖もしくは軽鎖に由来する任意の定常領域を含むヒト可変領域;または非天然定常領域を含むヒト可変領域;または任意の他の融合パートナーと一緒のヒト可変領域などの抗体のような特性または構造を有する分子を作製することができる。本発明は、本発明を用いて同定されたキメラ抗体から誘導された全てのそのようなキメラ抗体誘導体に関する。
さらなる態様において、本発明は、疑似ヒト抗体レパートリーの状況における薬剤およびワクチンの相応しい効果の分析における、本発明の非ヒト脊椎動物の集団の使用に関する。
本発明はまた、薬剤またはワクチンの同定または検証のための方法であって、ワクチンまたは薬剤を、本発明の脊椎動物の集団に送達する工程および免疫応答、安全性プロフィール、疾患に対する効果のうちの1つまたは複数をモニタリングする工程を含む、方法にも関する。
本発明はまた、本明細書に開示される抗体または抗体誘導体と、そのような抗体または好適な実験試薬、例えば、バッファー、抗体検出試薬の使用のための説明書とを含むキットにも関する。
本発明はまた、抗体、またはその一部を作製するための方法であって、
(i)本発明の集団を用いて得られた、抗体、もしくはその一部をコードする核酸;または
(ii)本発明の集団を用いて得られた抗体、もしくはその一部をコードする核酸を発現させて、抗体を生成させることができる配列情報
を提供する工程を含む、方法にも関する。
一実施形態において、本発明の第1の態様の集団のそれぞれの脊椎動物は、非ヒト脊椎動物、マウスまたはラットであり、そのゲノムは、
(a)前記トランスジェニック重鎖遺伝子座;ならびに
(b)抗体カッパ軽鎖遺伝子座トランスジーンおよび/または抗体ラムダ鎖遺伝子座トランスジーン
を含み、内因性抗体重鎖および軽鎖発現は不活化されており;場合により、前記ゲノムは前記トランスジェニック重鎖および軽鎖遺伝子座にとって同型である。
一実施形態においては、カッパおよびラムダ鎖トランスジェニック遺伝子座は、重鎖の定常領域と対形成することができる前記非ヒト脊椎動物種の定常領域を含む。
一実施形態においては、カッパ鎖トランスジェニック遺伝子座は、実質的に完全なヒト機能的VκおよびJκレパートリーを含み、ラムダ鎖トランスジーンは、実質的に完全なヒト機能的VλおよびJλレパートリーを含む。
本文を通じて、および本発明の任意の構成、態様、実施形態または例への適用に関して、非ヒト脊椎動物に関連する用語「内因性」(例えば、内因性定常領域)は、定常領域などが脊椎動物中に通常見出される型の定常領域などである(配列がそのような脊椎動物中には通常見出されない外因性定常領域、例えば、ヒト配列とは対照的である)ことを示す。例えば、内因性定常領域は、非ヒト脊椎動物の野生型ゲノムによりコードされるものであってよい。したがって、脊椎動物がマウスである例においては、内因性定常領域はマウス定常領域である。さらに行くと、内因性領域は、一例においては、脊椎動物に対して株一致される。したがって、一実施形態においては、脊椎動物細胞はマウス129ES細胞であり、内因性定常領域はマウス129定常領域である。別の実施形態においては、脊椎動物はJM8株のマウスであり、内因性定常領域はマウスJM8定常領域である。別の実施形態においては、脊椎動物はBlack6マウスであり、内因性定常領域はマウスBlack6定常領域である。
本発明の任意の構成において、重鎖トランスジェニック遺伝子座の定常領域は、非ヒト脊椎動物定常領域(例えば、マウスまたはラット定常領域)である。場合により、定常領域は、前記非ヒト脊椎動物にとって内因性である。あるいは、重鎖トランスジーンの定常領域はヒト定常領域である。例えば、定常領域はヒトであり、CH1を含まない。これは、ヒトH2抗体を生成するのに有用である(特に、脊椎動物が軽鎖を発現することができない場合)。
本発明において用いられるある脊椎動物またはそれぞれの脊椎動物の一例においては、定常領域は、Cミュー、例えば、マウスまたはラットCミューであるか、またはそれを含む。例えば、脊椎動物がマウスである場合、Cミューは内因性マウスCミューである。トランスジェニック重鎖遺伝子座は、一例においては、Cミューの5'側にSミュースイッチを、Cミューの3'側にCガンマを含み、SガンマスイッチはCミューとCガンマとの間にある。一実施形態においては、Cミュー、Cガンマおよびスイッチは、内因性マウスC領域およびスイッチである。例えば、C領域およびスイッチは、マウス129C領域およびスイッチである;またはC領域およびスイッチは、マウスBlack6 C領域およびスイッチである。別の実施形態においては、SガンマおよびC領域は、マウスSガンマおよびC領域であり、SミューはラットSミューである。
一態様において、集団のそれぞれの脊椎動物は、遺伝的背景がマウス株C57BL/6、M129、例えば、129/SV、BALB/c、およびC57BL/6、M129の任意のハイブリッド、例えば、129/SV、またはBALB/cから選択されるマウスである。一実施形態においては、これらの脊椎動物のそれぞれは、同じ遺伝的背景を有するが、集団の2つ以上の脊椎動物は本発明のようにそのヒト遺伝子セグメントレパートリーにおいて異なる。
本発明は、非ヒト脊椎動物の集団中の合成抗体重鎖配列レパートリーを提供する方法であって、
(a)異なるヒトVH遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団を提供する工程であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割される、工程、
(b)前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された、1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第1のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
(c) 前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された、1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第2のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
(d)第1のVH遺伝子サブレパートリーが第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって第1の脊椎動物が、第2の脊椎動物により生成される重鎖配列レパートリーとは異なる重鎖配列レパートリーを生成することができる、方法に関する。
かくして、集団は、第1および第2の脊椎動物の重鎖配列レパートリーを含む全重鎖レパートリーを提供する。集団中の脊椎動物を、抗原に特異的に結合する1つまたは複数の重鎖(例えば、抗体の一部として提供される)を選択および単離する方法におけるのと同じ抗原を用いて免疫化することができる。
レパートリーのVH遺伝子セグメントは、一実施形態においては、組換えVHであってよく、すなわち、ヒトVHと、DおよびJHとの組換えから誘導された可変領域配列の一部として提供してもよい(例えば、VH、DおよびJHがヒトである場合)。
一実施形態においては、集団は第3の非ヒト脊椎動物を含み、第3の脊椎動物は、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第3のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;第3のVH遺伝子サブレパートリーは第1および第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって第3の脊椎動物は第1および第2の脊椎動物により生成される重鎖配列レパートリーとは異なる重鎖配列レパートリーを生成することができる。かくして、集団は、第1、第2および第3の脊椎動物の重鎖配列レパートリーを含む全重鎖レパートリーを提供する。集団中の脊椎動物を、抗原に特異的に結合する1つまたは複数の重鎖(例えば、抗体の一部として提供される)を選択および単離する方法におけるのと同じ抗原を用いて免疫化することができる。
一実施形態においては、前記集団により提供されるVH遺伝子セグメントレパートリーは、機能的ヒトVH遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも6個の異なるヒトJH遺伝子セグメント、27個の異なるヒトDセグメントおよび少なくとも40個の異なるヒトVH遺伝子セグメントを提供する。
一実施形態においては、前記集団により提供されるVH遺伝子セグメントレパートリーは、少なくとも20、25、30、35または40個の異なるヒトVH遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、それぞれのトランスジェニック重鎖遺伝子座のJセグメントはヒトJH遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの重鎖遺伝子座はヒトJH遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む。
一実施形態においては、それぞれの重鎖遺伝子座は少なくとも2、3、4、5または6個の異なるヒトJH遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、それぞれのトランスジェニック重鎖遺伝子座のDセグメントはヒトD遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの重鎖遺伝子座はヒトD遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む。
一実施形態においては、それぞれの重鎖遺伝子座は少なくとも5、10、15、20、25、26または27個の異なるヒトD遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、前記脊椎動物の重鎖遺伝子座は同一のヒトDおよびJH遺伝子セグメントレパートリーを含むが、そのVH遺伝子レパートリーにおいて異なる。
一実施形態においては、それぞれの重鎖遺伝子座はJ1、J2、J3、J4、J5およびJ6からなる群から選択される少なくとも2個のヒトJH遺伝子セグメント、場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む。
一実施形態においては、それぞれの脊椎動物は、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46、V3-48、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなる群から選択されるヒトVH遺伝子セグメントを含み、VH遺伝子レパートリーは実質的に完全なヒト機能的VH遺伝子レパートリーを含む。
一実施形態においては、内因性抗体重鎖発現は、脊椎動物中で不活化されている。例えば、10、5、4、3、2、1または0.5%未満の重鎖が、内因性重鎖(すなわち、その可変領域が非ヒト脊椎動物のV、DおよびJ遺伝子セグメントの組換えから誘導される重鎖)により提供される。
一実施形態においては、本発明の方法は、同じ抗原(例えば、ヒト抗原)を用いて集団の脊椎動物を免疫化する工程を含む。かくして、脊椎動物は集団であり、そのようなものとして用いられる。
一実施形態においては、2つ以上または全部の前記脊椎動物の免疫化は、12、9、6、5、4、3、2もしくは1ヶ月、または3、2もしくは2週間または6、5、4、3、2もしくは1日以下の間隔を空けられる。かくして、脊椎動物は集団であり、そのようなものとして用いられる。
一実施形態においては、本発明の方法は、一般的な望ましい抗体または重鎖特性(例えば、前記抗原に対する結合親和性)に基づいて、前記免疫化された脊椎動物のそれぞれから1つもしくは複数の重鎖または抗体を選択する工程を含み、選択された抗体または重鎖は、集団により提供されるヒトVH遺伝子セグメントレパートリーから誘導された重鎖可変領域配列を含む。
一実施形態においては、選択された抗体または重鎖は、選択された抗体または重鎖のレパートリー(選択されたレパートリー)を提供し、前記方法は、望ましい抗体もしくは重鎖特性(例えば、前記抗原もしくは異なる抗原(例えば、関連する抗原;二特異的抗体を生成するのに有用である)に対する結合親和性)に基づいて;または抗体もしくは重鎖により結合したエピトープに基づいて、選択されたレパートリーから1つもしくは複数の抗体または重鎖を選択することをさらに含み;場合により、選択されたレパートリーは選択された抗体または重鎖をプールすることにより形成される。
一例においては、脊椎動物は、その重鎖遺伝子座(場合により、1つまたは複数のその軽鎖遺伝子座)を除いて、同じ遺伝的背景を共有する。
本発明の任意の構成において、一実施形態においては、脊椎動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNA(例えば、ヒト重鎖V、DおよびJ遺伝子セグメントならびに/またはヒト軽鎖VおよびJ遺伝子セグメント)を含むように遺伝的に改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞は同一であるか、または関連し(例えば、クローン的に関連する);場合により、先祖幹細胞のゲノムは、非ヒト脊椎動物配列と、ヒト配列との間の連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムは、共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物(例えば、ヒト/マウスまたはヒト/ラット)DNA連結を含む)。例えば、ゲノムは、1つまたは複数のその免疫グロブリン鎖遺伝子座(例えば、重鎖遺伝子座および/または軽鎖遺伝子座)内、またはその境界に共通の連結を含む。例えば、集団の脊椎動物は、そのゲノムがその重鎖遺伝子座および/または1つもしくは複数の軽鎖遺伝子座内に共通のヒト-マウスDNA連結を含むマウスである。これは、マウスが集団を形成することを示す。例えば、共通の先祖から全てステムバックする(stemming back)変異体脊椎動物を生成することにより、脊椎動物は全て、そのゲノム中で1つまたは複数の遺伝子セグメントレパートリーを除いて同じ遺伝的背景を共有することができる。これは、異なる遺伝子セグメントサブレパートリーから得られる発現プロフィールを除いて、集団のメンバー間に他の導入された遺伝的変動はなく、集団のメンバーの性能の一貫性を増強することを意味する。これはまた、集団を作り上げる変異体を生成するための育種を単純化する。
本発明は、非ヒト脊椎動物の集団中の合成抗体軽鎖配列レパートリーを提供する方法であって、
(a)異なるヒトVL遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団を提供する工程であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割される、工程
を含み、
(b)前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された、1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第1のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
(c)前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された、1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第2のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
(d)第1のVL遺伝子サブレパートリーが第2のVL遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって第1の脊椎動物が、第2の脊椎動物により生成される軽鎖配列レパートリーとは異なる軽鎖配列レパートリーを生成することができる、方法を提供する。
かくして、集団は、第1および第2の脊椎動物の軽鎖配列レパートリーを含む全軽鎖レパートリーを提供する。集団中の脊椎動物を、抗原に特異的に結合する1つまたは複数の軽鎖(例えば、抗体の一部として提供される)を選択および単離する方法におけるのと同じ抗原を用いて免疫化することができる。
レパートリーのVL遺伝子セグメントは、一実施形態においては、組換えVLであってよく、すなわち、ヒトVLと、JLとの組換えから誘導された可変領域配列の一部として提供してもよい(例えば、VLおよびJLがヒトである場合)。
一実施形態においては、前記集団は第3の非ヒト脊椎動物を含み、第3の脊椎動物は、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第3のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;第3のVL遺伝子サブレパートリーは第1および第2のVL遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって第3の脊椎動物は第1および第2の脊椎動物により生成される軽鎖配列レパートリーとは異なる軽鎖配列レパートリーを生成することができる。かくして、前記集団は、第1、第2および第3の脊椎動物の軽鎖配列レパートリーを含む全軽鎖レパートリーを提供する。集団中の脊椎動物を、抗原に特異的に結合する1つまたは複数の軽鎖(例えば、抗体の一部として提供される)を選択および単離する方法におけるのと同じ抗原を用いて免疫化することができる。
一実施形態においては、それぞれのトランスジェニック軽鎖遺伝子座のJセグメントは、ヒトJL遺伝子セグメントであり;場合により、それぞれの軽鎖遺伝子座は、ヒトJκまたはJλ遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む(例えば、それぞれのトランスジェニック遺伝子座は、ヒトVλ遺伝子セグメントおよびJλ遺伝子セグメント、場合により、ヒトJλ遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む;またはそれぞれのトランスジェニック遺伝子座は、ヒトVκ遺伝子セグメントおよびJκ遺伝子セグメント、場合により、ヒトJκ遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む)。
一実施形態においては、前記集団により提供されるレパートリーは、機能的ヒトVκ遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み;場合により、少なくとも5個の異なるヒトJκ遺伝子セグメントおよび少なくとも40個の異なるヒトVκ遺伝子セグメントを提供する。一例においては、それぞれの脊椎動物が、そのVκレパートリーが実施例に示されるように、30個以下、20個以下、14個以下または6個以下のヒトVκ遺伝子セグメント型からなるIgK遺伝子座を含むレパートリーが、本発明の非ヒト脊椎動物の集団により提供される。
一実施形態においては、前記集団により提供されるレパートリーは、少なくとも20、25、30、35または40個の異なるヒトVκ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、前記集団により提供されるレパートリーは、機能的ヒトVλ遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも5個の異なるJλ遺伝子セグメントおよび少なくとも40個の異なるヒトVλ遺伝子セグメントを提供する。
一実施形態においては、前記集団により提供されるレパートリーは、少なくとも20、25、30、35または40個の異なるヒトVλ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、それぞれの軽鎖遺伝子座は、少なくとも2、3、4、5または6個の異なるヒトJκまたはJλ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、前記脊椎動物の軽鎖遺伝子座は同一のヒトJL遺伝子セグメントレパートリーを含むが、そのVL遺伝子レパートリーにおいて異なる。
一実施形態においては、内因性抗体カッパおよび/またはラムダ軽鎖発現は脊椎動物中で不活化されている。
一実施形態においては、脊椎動物の前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座は、カッパ軽鎖遺伝子座である(内因性カッパ遺伝子座にある、すなわち、野生型非ヒト脊椎動物ゲノム中のカッパ遺伝子座の位置に対応する)。例えば、トランスジェニックカッパ遺伝子座は、定常領域(例えば、CH、CλまたはCκ遺伝子セグメント;場合により、内因性遺伝子セグメントである)の上流にヒトVκ遺伝子セグメントおよびJκ遺伝子セグメントを含んでもよい。例えば、トランスジェニックカッパ遺伝子座は、定常領域(例えば、CH、CλまたはCκ遺伝子セグメント;場合により、内因性遺伝子セグメントである)の上流にヒトVλ遺伝子セグメントおよびJλ遺伝子セグメントを含んでもよい。
一実施形態においては、脊椎動物の前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座は、ラムダ軽鎖遺伝子座である(内因性ラムダ遺伝子座にある、すなわち、野生型非ヒト脊椎動物ゲノム中のラムダ遺伝子座の位置に対応する)。例えば、トランスジェニックラムダ遺伝子座は、定常領域(例えば、CH、CλまたはCκ遺伝子セグメント;場合により、内因性遺伝子セグメントである)の上流にヒトVκ遺伝子セグメントおよびJκ遺伝子セグメントを含んでもよい。例えば、トランスジェニックラムダ遺伝子座は、定常領域(例えば、CH、CλまたはCκ遺伝子セグメント;場合により、内因性遺伝子セグメントである)の上流にヒトVλ遺伝子セグメントおよびJλ遺伝子セグメントを含んでもよい。
一実施形態においては、本発明の方法は、同じ抗原(例えば、ヒト抗原)を用いて集団の脊椎動物を免疫化する工程を含む。かくして、脊椎動物は集団であり、そのようなものとして用いられる。
一実施形態においては、2つ以上または全部の前記脊椎動物の免疫化は、12、9、6、5、4、3、2もしくは1ヶ月、または3、2もしくは2週間または6、5、4、3、2もしくは1日以下の間隔を空けられる。かくして、脊椎動物は集団であり、そのようなものとして用いられる。
一実施形態においては、本発明の方法は、一般的な望ましい抗体または軽鎖特性(例えば、前記抗原に対する結合親和性)に基づいて、前記免疫化された脊椎動物のそれぞれから1つもしくは複数の軽鎖または抗体を選択する工程を含み、選択された抗体または軽鎖は、集団により提供されるヒトVL遺伝子セグメントから誘導された軽鎖可変領域配列を含む。
一実施形態においては、選択された抗体または軽鎖は、選択された抗体または軽鎖のレパートリー(選択されたレパートリー)を提供し、前記方法は、望ましい抗体もしくは軽鎖特性(例えば、前記抗原もしくは異なる抗原(例えば、関連する抗原;二特異的抗体を生成するのに有用である)に対する結合親和性)に基づいて;または抗体もしくは軽鎖により結合したエピトープに基づいて、選択されたレパートリーから1つもしくは複数の抗体または軽鎖を選択することをさらに含み;場合により、選択されたレパートリーは選択された抗体または軽鎖をプールすることにより形成される。
本明細書で記載されるプールすることとは、さらなる使用のため(例えば、望ましい抗体または抗体鎖特性に基づく組合せまたはコレクションのメンバーのさらなる選択のため)の組合せまたはコレクションを提供することを指す。一例においては、メンバーは物理的にプールされる(すなわち、単一または比較的少数の容器、例えば、2、3、4、5もしくは6個の容器中で混合される)。
一実施形態においては、脊椎動物は、前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座(および場合により、1つまたは複数のその重鎖遺伝子座)を除いて、同じ遺伝的背景を共有する。
一実施形態においては、脊椎動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞が同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムが、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物(例えば、ヒト/マウスまたはヒト/ラット)DNA連結を含む)。
本発明は、所定の抗原(例えば、ヒト抗原)に結合する抗体を選択する方法であって、
(a)前記抗原に結合する抗体のレパートリー(第1のレパートリー)を提供する工程であって、前記抗体が、ヒト重鎖および軽鎖可変領域を含み、前記レパートリーが、
i.軽鎖可変領域がヒトVλ遺伝子セグメントとヒトJL遺伝子セグメントとの再配置により生成される抗体のサブレパートリー(ラムダサブレパートリー);ならびに
ii.軽鎖可変領域がヒトVκ遺伝子セグメントとヒトJL遺伝子セグメントとの再配置により生成される抗体のサブレパートリー(カッパサブレパートリー)
を含む、工程;
(b)所望の抗体特性(例えば、前記抗原に対する結合親和性)によるラムダサブレパートリーから1つまたは複数の抗体を選択する工程;
(c)前記望ましい抗体特性によるカッパサブレパートリーから1つまたは複数の抗体を選択する工程であって、
選択されたラムダおよびカッパ抗体のレパートリー(第2のレパートリー)が生成され、第2のレパートリーの抗体が前記抗原に結合するヒト可変領域を含む、工程;ならびに
(d)望ましい抗体特性(例えば、前記抗原に対する結合親和性)に基づいて、前記第2のレパートリーから1つまたは複数の抗体を選択する工程
を含み、
工程(a)(i)において、ラムダサブレパートリーが前記抗原を用いる1つまたは複数の非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)(ラムダ脊椎動物)の免疫化により生成され、ラムダ脊椎動物が、カッパ型抗体(軽鎖可変領域がVκ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)よりも多くのヒトラムダ型抗体(軽鎖可変領域がヒトVλ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)を発現し;
工程(a)(ii)において、カッパサブレパートリーが前記抗原を用いる1つまたは複数の非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)(カッパ脊椎動物)の免疫化により生成され、カッパ脊椎動物が、ラムダ型抗体(軽鎖可変領域がVλ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)よりも多くのヒトカッパ型抗体(軽鎖可変領域がヒトVκ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)を発現する、方法を提供する。
それぞれのサブレパートリーは少なくとも2個の抗体を含み、例えば、それぞれのサブレパートリーは、少なくとも10、15、20、50、100、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、もしくは1014個の抗体を含むか、またはそれらからなる。
望ましい抗体特性の例は、所定の抗原またはエピトープへの結合の親和性(例えば、表面プラズモン共鳴により決定される)、所定の抗原またはエピトープへの結合に関する既知の抗体との競合、抗体のエピトープ特異性(例えば、X線結晶学により決定される)、既知の抗体が抗原に特異的に結合する場合の抗原結合に関する既知の抗体との競合(例えば、表面プラズモン共鳴、例えば、Biacore(商標)により決定される)、ELISAまたは別の免疫アッセイにおける性能、望ましい生物物理学的特性(例えば、融点、pI、溶液状態、凝集度、保存プロフィールなど)である。
ラムダ型抗体は、任意の定常領域、例えば、Cλ、CκまたはCH(場合により、Cは内因性である)を含んでもよい。カッパ型抗体は、任意の定常領域、例えば、Cλ、CκまたはCH(場合により、Cは内因性である)を含んでもよい。
本発明における使用のための免疫化の方法は、当業者には周知であり、古典的な初回-追加レジメ、RIMMSまたは任意の他のプロトコルを含んでもよい。当技術分野で公知のように、アジュバントを抗原と共に投与してもよい。
第2のレパートリーは、少なくとも2個の抗体を含み、例えば、それぞれのサブレパートリーは、少なくとも10、15、20、50、100、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、もしくは1014個の抗体を含むか、またはそれらからなる。
ヒト重鎖可変領域は、ヒトVH遺伝子セグメントと、DおよびJH遺伝子セグメントとの組換えから誘導された可変領域である(例えば、DおよびJH遺伝子セグメントもヒトである場合)。ヒト軽鎖可変領域は、ヒトVL遺伝子セグメントと、JL遺伝子セグメントとの組換えから誘導された可変領域である(例えば、JL遺伝子セグメントもヒトである場合)。
一実施形態においては、ラムダ脊椎動物は、カッパ型抗体を実質的に発現しない。例えば、10、5、4、3、2、1または0.5%未満のカッパ抗体が内因性である。
一実施形態においては、内因性カッパ抗体発現は、ラムダ脊椎動物中では実質的に不活性である。例えば、10、5、4、3、2、1または0.5%未満のカッパ抗体が内因性である。
一実施形態においては、カッパ脊椎動物は、ラムダ型抗体を実質的に発現しない。例えば、10、5、4、3、2、1または0.5%未満のラムダ抗体が内因性である。マウスにおける比較的低い内因性ラムダ発現に起因して、脊椎動物がマウスである場合、実質的に不活性のラムダ発現を達成するために、マウスにおける任意の特定の遺伝子操作を実行する必要はなくてもよい。
一実施形態においては、内因性ラムダ抗体発現は、カッパ脊椎動物中では実質的に不活性である。例えば、10、5、4、3、2、1または0.5%未満のラムダ抗体が内因性である。マウスにおける比較的低い内因性ラムダ発現に起因して、脊椎動物がマウスである場合、実質的に不活性のラムダ発現を達成するために、マウスにおける任意の特定の遺伝子操作を実行する必要はなくてもよい。
一実施形態においては、ラムダサブレパートリーの形成(例えば、最初または最後の免疫化)は、カッパサブレパートリーの形成(例えば、最初または最後の免疫化)から12、9、6、5、4、3、2もしくは1ヶ月または3、2もしくは1週間または6、5、4、3、2もしくは1日以下の間隔を空けられる。かくして、脊椎動物は集団を形成し、そのようなものとして用いられる。
一実施形態においては、第2のレパートリーは、選択されたラムダおよびカッパ抗体をプールすることにより形成される。
一実施形態においては、ラムダおよびカッパ抗体は、前記抗原への結合の親和性に基づいて選択される(より高い親和性がより低い親和性より好ましい)。
一実施形態においては、親和性は表面プラズモン共鳴により決定される。
一実施形態においては、カッパおよびラムダ脊椎動物は、その軽鎖遺伝子座(および場合により、その重鎖遺伝子座)を除いて、同じ遺伝的背景を共有する。
一実施形態においては、カッパおよびラムダ脊椎動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞が同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムは、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物(例えば、ヒト/マウスまたはヒト/ラット)DNA連結を含む)。
一実施形態においては、異なるヒトVH遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割され、
(a)前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第1のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
(b) 前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第2のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
(c)第1のVH遺伝子サブレパートリーが、それぞれ互いに異なる第1および第2の抗体重鎖配列レパートリーの発現のための第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって集団が抗体重鎖配列の合成レパートリーを提供する、集団を提供する。
一実施形態においては、集団は第3の非ヒト脊椎動物を含み、第3の脊椎動物は定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第3のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み、第3のVH遺伝子サブレパートリーは、第1および第2の抗体重鎖配列レパートリーと異なる第3の抗体重鎖配列レパートリーの発現のための第1および第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって集団が抗体重鎖配列の合成レパートリーを提供する。
一実施形態においては、脊椎動物は同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている。
一実施形態においては、前記集団により提供されるレパートリーは、機能的ヒトVH遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも6個の異なるヒトJH遺伝子セグメント、27個の異なるヒトDセグメントおよび少なくとも40個の異なるヒトVH遺伝子セグメントを提供する。
一実施形態においては、前記集団により提供されるヒトVH遺伝子セグメントレパートリーは、少なくとも20、25、30、35または40個の異なるヒトVH遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、それぞれのトランスジェニック重鎖遺伝子座のJセグメントはヒトJH遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの重鎖遺伝子座はヒトJH遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む。
一実施形態においては、それぞれの重鎖遺伝子座は少なくとも2、3、4、5または6個の異なるヒトJH遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、それぞれのトランスジェニック重鎖遺伝子座のDセグメントはヒトD遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの重鎖遺伝子座はヒトD遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む。
一実施形態においては、それぞれの重鎖遺伝子座は少なくとも5、10、15、20、25、26または27個の異なるヒトD遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、前記脊椎動物の重鎖遺伝子座は同一のヒトDおよびJH遺伝子セグメントレパートリーを含むが、そのVH遺伝子レパートリーにおいて異なる。
一実施形態においては、それぞれの重鎖遺伝子座はJ1、J2、J3、J4、J5およびJ6からなる群から選択される少なくとも2個のヒトJH遺伝子セグメント、場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む。
一実施形態においては、それぞれの重鎖遺伝子座は、D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26、D6-25およびD7-27からなる群から選択される少なくとも10個のヒトD遺伝子セグメント、場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む。
一実施形態においては、集団は、上記の第3の脊椎動物を含み、それぞれの脊椎動物は、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46、V3-48、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなる群から選択されるヒトVH遺伝子セグメントを含み、レパートリーにより提供される集団は、実質的に完全なヒト機能的VH遺伝子レパートリーを含む。
一実施形態においては、内因性抗体重鎖発現は脊椎動物中で不活化されている。
一実施形態においては、集団の前記脊椎動物の2つ以上または全部が同じ抗原で免疫化されており、2回以上の免疫化は12、9、6、5、4、3、2もしくは1ヶ月または3、2もしくは1週間または6、5、4、3、2もしくは1日以下の間隔を空けられる。
一実施形態においては、脊椎動物は、その重鎖遺伝子座(および場合により、1つまたは複数のその軽鎖遺伝子座)を除いて、同じ遺伝的背景を共有する。
一実施形態においては、脊椎動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞は同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムは、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物(例えば、ヒト/マウスまたはヒト/ラット)DNA連結を含む)。
本発明は、異なるヒトVL遺伝子セグメントを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割され、
前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第1のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第2のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
第1のVL遺伝子サブレパートリーが、それぞれ互いに異なる第1および第2の抗体軽鎖配列レパートリーの発現のための第2のVL遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって集団が抗体軽鎖配列の合成レパートリーを提供する、集団を提供する。
一実施形態においては、集団は第3の非ヒト脊椎動物を含み、第3の脊椎動物は定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第3のVL遺伝子サブレパートリー)Jセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み、第3のVH遺伝子サブレパートリーは、第1および第2の抗体軽鎖配列レパートリーと異なる第3の抗体軽鎖配列レパートリーの発現のための第1および第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって集団が抗体重鎖配列の合成レパートリーを提供する。
一実施形態においては、脊椎動物は同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている。
一実施形態においては、それぞれのトランスジェニック軽鎖遺伝子座のJセグメントはヒトJL遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの軽鎖遺伝子座はヒトJκまたはJλ遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む。
一実施形態においては、前記集団により提供されるVL遺伝子セグメントレパートリーは、機能的ヒトVκ遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも5個の異なるJκ遺伝子セグメントおよび少なくとも40個の異なるヒトVκ遺伝子セグメントを提供する。
一実施形態においては、前記集団により提供されるVL遺伝子セグメントレパートリーは、少なくとも20、25、30、35または40個の異なるヒトVκ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、前記集団により提供されるVL遺伝子セグメントレパートリーは、機能的ヒトVλ遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも5個の異なるJλ遺伝子セグメントおよび30個の異なるヒトVλ遺伝子セグメントを提供する。
一実施形態においては、前記集団により提供されるVL遺伝子セグメントレパートリーは、少なくとも20、25または30個の異なるヒトVλ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、それぞれの軽鎖遺伝子座は、少なくとも2、3、4、5または6個の異なるヒトJκまたはJλ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、前記脊椎動物の軽鎖遺伝子座は同一のヒトJL遺伝子セグメントレパートリーを含むが、そのVL遺伝子レパートリーにおいて異なる。
一実施形態においては、内因性抗体カッパおよび/またはラムダ軽鎖発現は脊椎動物中で不活化されている。
一実施形態においては、脊椎動物の前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座はカッパ軽鎖遺伝子座である。
一実施形態においては、脊椎動物の前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座はラムダ軽鎖遺伝子座である。
一実施形態においては、前記脊椎動物の軽鎖遺伝子座は同一のヒトJL遺伝子セグメントレパートリーを含むが、そのVL遺伝子レパートリーにおいて異なる。
一実施形態においては、それぞれの軽鎖遺伝子座は、少なくとも2、3、4もしくは5個のヒトJκ遺伝子セグメントまたは少なくとも2、3、4もしくは5個のヒトJλ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態においては、集団の前記脊椎動物の2つ以上または全部が同じ抗原で免疫化されており、2回以上の免疫化は12、9、6、5、4、3、2もしくは1ヶ月または3、2もしくは1週間または6、5、4、3、2もしくは1日以下の間隔を空けられる。
一実施形態においては、脊椎動物は、前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座(および場合により、1つまたは複数のその重鎖遺伝子座)を除いて、同じ遺伝的背景を共有する。
一実施形態においては、脊椎動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞は同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムは、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物(例えば、ヒト/マウスまたはヒト/ラット)DNA連結を含む)。
本発明は、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、それぞれの脊椎動物のゲノムが、
それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の重鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座;ならびに
それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の軽鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJL遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
を含み;
それぞれの脊椎動物において、トランスジェニック重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントがその定常領域に動作可能に連結され、トランスジェニック軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントがその定常領域に動作可能に連結され、免疫化の際に、脊椎動物が、重鎖遺伝子座の組換えにより生成された重鎖と、軽鎖遺伝子座の組換えにより生成された軽鎖とを含む抗体を生成することができ、重鎖および軽鎖がヒト可変領域を含み;
前記集団が、
(i)前記軽鎖遺伝子座が1つまたは複数のヒトVλ遺伝子セグメントを含み、再配置後に、遺伝子座がヒトVλ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖配列(ヒトラムダ軽鎖配列)を発現し、ラムダ脊椎動物がカッパ軽鎖配列よりも多くのラムダ軽鎖配列(Vκ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖の配列)を発現する第1の脊椎動物型(ラムダ脊椎動物);ならびに
(ii)前記軽鎖遺伝子座が1つまたは複数のヒトVκ遺伝子セグメントを含み、再配置後に、遺伝子座がヒトVκ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖配列(ヒトカッパ軽鎖配列)を発現し、カッパ脊椎動物がラムダ軽鎖配列よりも多くのカッパ軽鎖配列(Vλ遺伝子セグメントから誘導された可変領域を含む軽鎖の配列)を発現する第2の脊椎動物型(カッパ脊椎動物)
を含み;
前記集団の脊椎動物を同じ抗原で免疫化して、ヒト重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体のレパートリーを生成することができ、前記レパートリーが第1の型の脊椎動物により生成されたヒトラムダ抗体のサブレパートリー(ラムダサブレパートリー)と、第2の型の脊椎動物により生成されたヒトカッパ抗体のサブレパートリー(カッパサブレパートリー)とを含む、集団を提供する。
一実施形態においては、脊椎動物は同じ抗原、場合により、ヒト抗原で免疫化されている。
一実施形態においては、ラムダ脊椎動物の免疫化は、カッパ脊椎動物の免疫化から12、9、6、5、4、3、2、もしくは1ヶ月以下または3、2、もしくは1週間以下または1日以下の間隔を空けられる。
一実施形態においては、ラムダ脊椎動物は、カッパ型抗体を実質的に発現しない。
一実施形態においては、内因性カッパ抗体発現は、ラムダ脊椎動物中で実質的に不活性である。
一実施形態においては、カッパ脊椎動物は、ラムダ型抗体を実質的に発現しない。
一実施形態においては、内因性ラムダ抗体発現は、カッパ脊椎動物中で実質的に不活性である。
本発明は、本発明による集団を含有する動物舎または実験室を提供する。例えば、集団の脊椎動物を、同じケージ中で、または同じ動物舎、建築物もしくは実験室中のケージの同じコレクション中で飼育することができる。ケージまたは脊椎動物自体が同じ集団または実験の一部であるように、それらを標識することができる。それらは同じ所有者、例えば、同じ会社によって所有されていてもよく、または単一の個人もしくは会社の制御にあってもよい。それらを、共通の抗原または関連する抗原に対する1つまたは複数の抗体または抗体鎖を探索することを目的とする同じ研究プログラムまたは一連の関連する研究実験における使用のために割り当てることができる。かくして、脊椎動物は集団を提供し、そのようなものとして用いられる。それは、脊椎動物が同じ研究プログラムもしくは免疫化スケジュールまたは実験もしくは実験のセットに関する実験室ノートもしくは実験室ノートのセットにおける同じ研究プログラムもしくは免疫化スケジュールまたは実験もしくは実験のセットの文脈で議論される集団を示す。例えば、そのようなプログラム、スケジュールまたは実験は、同じ抗原を用いる集団の脊椎動物の免疫化に関するものであってもよい。
本発明は、本発明の方法に従って生成された抗体の選択されたレパートリー、または本発明の方法に従って生成された抗体の第2のレパートリーを提供し、選択されたレパートリーまたは第2のレパートリーの抗体は、非ヒト脊椎動物の集団から共通の抗原(例えば、ヒト抗原)への結合について選択されたものである。
一実施形態においては、レパートリーにおいて、脊椎動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞は同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムは、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物(例えば、ヒト/マウスまたはヒト/ラット)DNA連結を含む)。
一実施形態においては、レパートリーにおいて、集団は、本明細書の本発明の任意の構成、態様、実施形態、実施例または説明に従う。
本発明は、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)であって、それぞれの脊椎動物のゲノムが、
それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の重鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座;ならびに
それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の軽鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトVλ遺伝子セグメントレパートリーおよび1つまたは複数のヒトJλ遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン軽鎖遺伝子座(例えば、ラムダ遺伝子座またはカッパ遺伝子座)
を含み;
再配置後に、軽鎖遺伝子座が、ヒトVλ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖配列(ヒトラムダ軽鎖配列)を発現し;
カッパ(および場合により、内因性ラムダ)軽鎖発現が実質的に不活化されており、脊椎動物がカッパ軽鎖配列より多くのヒトラムダ軽鎖配列(Vκ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖の配列)を発現し;
内因性重鎖発現が実質的に不活化されており;
それぞれの前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座が実質的に完全なヒトの機能的Vλ遺伝子セグメントレパートリーを含む、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)を提供する。
そのような脊椎動物は、全部または実質的に全部の軽鎖がヒトラムダ軽鎖配列を含む軽鎖を発現し、脊椎動物は内因性Ig鎖またはカッパ鎖を実質的に発現しない。そのような脊椎動物は、本発明の第7および第10の構成(すなわち、別々のラムダ脊椎動物およびカッパ脊椎動物が存在する本発明の実施形態)における使用のためのラムダ脊椎動物の集団として有用である。
例えば、10、5、4、3、2、1または0.5%未満のカッパ抗体が内因性であるか、またはカッパ抗体は内因性ではない。
例えば、10、5、4、3、2、1または0.5%未満のラムダ抗体が内因性であるか、またはラムダ抗体は内因性ではない。マウスにおける比較的低い内因性ラムダ発現に起因して、脊椎動物がマウスである場合、実質的に不活性なラムダ発現を達成するために、マウスにおける任意の特定の遺伝子操作を実行する必要はなくてもよい。
例えば、10、5、4、3、2、1または0.5%未満の重鎖抗体が内因性であるか、または重鎖抗体は内因性ではない。
脊椎動物の一実施形態において、それぞれの前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座は、V3-1、V2-8、V3-9、V3-10、V2-11、V3-12、V3-16、V2-18、V3-19、V3-21、V3-22、V2-23、V3-25、V3-27、V1-36、V5-37、V5-39、V1-40、V7-43、V1-44、V5-45、V7-46、V1-74、V9-49、V1-51、V5-52、V6-57、V4-60、V8-61およびV4-69からなる群から選択される少なくとも20、25、26、27、28または29個のヒトVλ遺伝子セグメント;場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む。
脊椎動物の一実施形態において、それぞれの前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座は、実質的に完全なヒトの機能的Jλ遺伝子セグメントレパートリーを含む。
脊椎動物の一実施形態において、それぞれの前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座は、J1、J2、J3、J6およびJ7からなる群から選択される少なくとも3個または4個のヒトJλ遺伝子セグメント;場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む。
脊椎動物の一実施形態において、それぞれの前記トランスジェニック重鎖遺伝子座は、実質的に完全なヒトの機能的VH遺伝子セグメントレパートリーを含む。
脊椎動物の一実施形態において、それぞれの前記トランスジェニック重鎖遺伝子座は、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46、V3-48、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなる群から選択される少なくとも30、35、36、37、38または39個のヒトVH遺伝子セグメント;場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む。
脊椎動物の一実施形態において、それぞれの前記トランスジェニック重鎖遺伝子座は、J1、J2、J3、J4、J5、J6からなる群から選択される少なくとも4個または5個のヒトJH遺伝子セグメント;場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む。
脊椎動物の一実施形態において、それぞれの前記トランスジェニック重鎖遺伝子座は、D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26、D6-25およびD7-27からなる群から選択される少なくとも15、20、21、22、23、24、25または26個のヒトD遺伝子セグメント;場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む。
本発明は、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団を提供し、それぞれの脊椎動物は本発明に従うものであり、集団は本発明のように前記集団の2つ以上の脊椎動物間で分割されるヒトVH遺伝子セグメントレパートリーを提供する。
本発明は、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、それぞれの脊椎動物は本発明に従うものであり、前記集団が、第1、第2および第3の脊椎動物の間に分割されたヒトVH遺伝子セグメントレパートリーを提供し、
第1の脊椎動物が、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41およびV2-5からなる群に由来する5個または6個の遺伝子セグメントを含むヒトVH遺伝子レパートリーを含み;
第2の脊椎動物が、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46およびV3-48からなる群に由来する15、16、17、18、19、20または21個の遺伝子セグメントを含むヒトVH遺伝子レパートリーを含み;
第3の脊椎動物が、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなる群に由来する10、11、12または13個の遺伝子セグメントを含むヒトVH遺伝子レパートリーを含み;
脊椎動物のVH遺伝子レパートリーが互いに異なり;
前記集団が、実質的に完全なヒトの機能的VH遺伝子セグメントレパートリーと、実質的に完全なヒトの機能的Vλ遺伝子セグメントとを提供し、抗原を用いる集団の脊椎動物の免疫化後に、実質的にカッパ鎖発現および内因性重鎖発現の非存在下で実質的に完全な機能的ヒトVHおよびVλレパートリーから誘導された抗体の合成レパートリーを生成することができる、集団を提供する。
集団の一実施形態において、第1の脊椎動物は、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41およびV2-5からなるヒトVH遺伝子レパートリーを含み;
第2の脊椎動物は、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46およびV3-48からなるヒトVH遺伝子レパートリーを含み;
第3の脊椎動物は、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなるヒトVH遺伝子レパートリーを含む。
集団の一実施形態においては、脊椎動物はカッパ軽鎖を全く発現しない。
本発明は、所定の抗原に結合し、重鎖および軽鎖可変領域がそれぞれヒトVHおよびVλ遺伝子セグメントから誘導される抗体(ラムダ型抗体)を単離する方法であって、本発明に従う脊椎動物または脊椎動物の集団を抗原で免疫化する工程、および前記脊椎動物または集団からラムダ型抗体を選択する工程を含む方法を提供する。
本発明は、前記抗原に結合する上記の通り選択された抗体またはその誘導体を、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と共に含む医薬組成物を提供する。
誘導体抗体の例(本明細書の任意の態様による)は、単離された抗体と比較して1つまたは複数の突然変異を有する抗体(例えば、抗原結合親和性を改善するため、および/またはFc機能を増強もしくは不活化するため)である。そのような突然変異体は、抗原に特異的に結合する。誘導体を生成するための突然変異または適合は、例えば、Fc増強または不活化をもたらすための突然変異を含む。誘導体は、毒性ペイロードまたは受容体または標識または他の活性部分へのコンジュゲーション後の抗体であってもよい。別の例においては、キメラ抗体鎖または抗体は、対応するヒト定常領域により、1つまたは全部のそのヒト定常領域を置きかえることによって改変される。例えば、そのような細胞または脊椎動物から単離された抗体の全ての定常領域は、ヒト定常領域と置きかえられて、完全ヒト抗体(すなわち、ヒト可変および定常領域を含む)を生成する。そのような抗体は、患者による抗抗体反応を低減させるためのヒト患者への投与にとって有用である。
本発明は、合成抗体重鎖配列レパートリーを提供する方法であって、内因性重鎖発現が実質的に不活性である2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割された重鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する工程を含み、ゲノム中のレパートリー遺伝子セグメントが、重鎖定常領域(例えば、Cミューおよび/またはCガンマ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のVH遺伝子セグメント、1つまたは複数のD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJH遺伝子セグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが、VH、DおよびJH遺伝子セグメントから誘導された抗体重鎖配列の異なるレパートリーを発現することができ;
遺伝子セグメントレパートリーが、
(a)VH遺伝子レパートリー(例えば、ヒトVH遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトVH遺伝子レパートリー);
(b)D遺伝子レパートリー(例えば、ヒトD遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトD遺伝子レパートリー);
(c)JH遺伝子レパートリー(例えば、ヒトJH遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトJH遺伝子レパートリー)
からなる群から選択され;
場合により、遺伝子座中のDおよびJHセグメントがヒトDおよびJHセグメントである、方法を提供する。
本発明は、合成抗体カッパ鎖配列レパートリーを提供する方法であって、内因性カッパ鎖(およびまた場合により内因性ラムダ鎖)発現が実質的に不活性である2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたカッパ鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する工程を含み、ゲノム中のレパートリー遺伝子セグメントが、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のVκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが、VκおよびJκ遺伝子セグメントから誘導された抗体カッパ鎖配列の異なるレパートリーを発現することができ;
遺伝子セグメントレパートリーが、
(a)Vκ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトVκ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー);
(c)Jκ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトJκ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトJκ遺伝子レパートリー)
からなる群から選択され;
場合により、遺伝子座中のJκセグメントがヒトJκセグメントである、方法を提供する。
本発明は、合成抗体ラムダ鎖配列レパートリーを提供する方法であって、内因性ラムダ鎖(およびまた場合により内因性カッパ鎖)発現が実質的に不活性である2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたラムダ鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する工程を含み、ゲノム中のレパートリー遺伝子セグメントが、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のVλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが、VλおよびJλ遺伝子セグメントから誘導された抗体ラムダ鎖配列の異なるレパートリーを発現することができ;
遺伝子セグメントレパートリーが、
(a)Vλ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトVλ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー);
(c)Jλ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトJλ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトJλ遺伝子レパートリー)
からなる群から選択され;
場合により、遺伝子座中のJλセグメントがヒトJλセグメントである、方法を提供する。
本発明は、合成抗体軽鎖配列レパートリーを提供する方法であって、
内因性ラムダ鎖(およびまた場合により、内因性カッパ鎖)発現が実質的に不活性である、第1群の非ヒト脊椎動物のゲノム中のVκ遺伝子レパートリーであって、ゲノム中のVκ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ、例えば、ヒトCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが実質的にラムダ軽鎖発現の非存在下でVκおよびJκ遺伝子セグメントから誘導された抗体カッパ軽鎖配列のレパートリーを発現することができる、Vκ遺伝子レパートリー;ならびに
内因性カッパ鎖(およびまた場合により、内因性ラムダ鎖)発現が実質的に不活性である、第2群の非ヒト脊椎動物のゲノム中のVλ遺伝子レパートリーであって、ゲノム中のVλ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ、例えば、ヒトCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが実質的にカッパ軽鎖発現の非存在下でVλおよびJλ遺伝子セグメントから誘導された抗体ラムダ軽鎖配列のレパートリーを発現することができる、Vλ遺伝子レパートリー
を提供する工程を含み、
場合により、Vκ遺伝子レパートリーがヒトVκ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー)であり、Vλ遺伝子レパートリーがヒトVλ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー)であり、遺伝子座中のJκセグメントがヒトJκセグメントであり、遺伝子座中のJλセグメントがヒトJλセグメントであり;
場合により、第1群および第2群のゲノムが実質的に完全なヒトの機能的VH遺伝子レパートリーを含む、方法を提供する。
本発明は、抗体を作製するための非ヒト脊椎動物の集団であって、上記の第1群および第2群の脊椎動物を含み、場合により、集団の脊椎動物が同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている、集団を提供する。
本発明は、抗体重鎖配列、抗体軽鎖配列、抗体カッパ鎖配列、抗体ラムダ鎖配列の合成レパートリー、または本発明に従う非ヒト脊椎動物の集団から得られた抗体のレパートリー;もしくは本発明の脊椎動物から得られたレパートリーを提供する。
レパートリーの一実施形態において、脊椎動物の集団は同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている。
レパートリーの一実施形態において、脊椎動物の集団はナイーブである。
任意の構成の一実施形態においては、脊椎動物はナイーブである(すなわち、この用語が当技術分野で理解されている通り、所定の抗原で免疫化されていない;例えば、そのような脊椎動物は、R&Dのために用いられる動物舎により提供されるように比較的無菌環境中で保持されている)。別の例においては、脊椎動物は、所定の抗原、例えば、ヒトエピトープを担持する抗原で免疫化されている。別の例においては、集団はナイーブで免疫化された脊椎動物を含む。
レパートリーの一実施形態において、脊椎動物のゲノムは共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物(例えば、ヒト/マウスまたはヒト/ラット)DNA連結を含む。
レパートリーの一実施形態において、レパートリーのメンバーは共通の抗原に結合し、同じ研究プログラムにおいて作製された。
本発明は、合成抗体重鎖レパートリーを提供する方法であって、
(a)少なくとも第1および第2の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)のゲノムにわたってヒトVH遺伝子セグメントレパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVH遺伝子レパートリー)を分割する工程であって、前記レパートリーが、
ヒトの重鎖遺伝子座の遠位VH遺伝子クラスターに対応するVH遺伝子セグメントの第1のクラスター;および
ヒトの重鎖遺伝子座の近位VH遺伝子クラスターに対応するVH遺伝子セグメントの第2のクラスター
を含み、近位クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターの近くに配置され、
遠位クラスターが、1つまたは複数のD遺伝子セグメント、1つまたは複数のJH遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第1の脊椎動物の重鎖遺伝子座中に提供され;
近位クラスターが、1つまたは複数のD遺伝子セグメント、1つまたは複数のJH遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第2の脊椎動物の重鎖遺伝子座中に提供され;
近位VH遺伝子クラスターが、第1の脊椎動物の重鎖遺伝子座中の遠位クラスターとD遺伝子セグメントとの間に存在しない(場合により、さらなるVH遺伝子セグメントが第1の脊椎動物の重鎖遺伝子座中の遠位クラスターとD遺伝子セグメントとの間に存在しない)、工程、ならびに
(b)第1および第2の脊椎動物の前記重鎖遺伝子座を発現させて、合成抗体重鎖のレパートリーを提供する工程
を含む、方法を提供する。
ヒト遺伝子セグメント(例えば、VH遺伝子セグメント)のクラスターとは、ヒトゲノム(例えば、生殖系列ヒトIg遺伝子座)中の第1の遺伝子セグメントから第2の下流(3'側)の遺伝子セグメントのヒトIg遺伝子座(例えば、ヒト重鎖遺伝子座)に存在する遺伝子セグメントのコレクションを指す。遺伝子セグメント配置の例は、IMGTデータベース中に(またはKabatもしくは当業者にとって利用可能であり、本明細書に記載された他の抗体資源に対する参照により)見出される。例えば、クラスター中の遺伝子セグメントは、全てヒトVHである。例えば、クラスター中の遺伝子セグメントは、全てヒトVκ遺伝子セグメントである。例えば、クラスター中の遺伝子セグメントは、全てヒトVλ遺伝子セグメントである。例えば、クラスター中の遺伝子セグメントは、全てヒトJH遺伝子セグメントである。例えば、クラスター中の遺伝子セグメントは、全てヒトJλ遺伝子セグメントである。例えば、クラスター中の遺伝子セグメントは、全てヒトJκ遺伝子セグメントである。例えば、クラスター中の遺伝子セグメントは、全てヒトD遺伝子セグメントである。例えば、ヒト生殖系列重鎖Ig遺伝子座は、以下の遺伝子クラスター(3'から5'の方向に、すなわち、近い方から遠い方に向かって、すなわち、下流から上流の方向に): V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41を含む。本発明における使用のために、このクラスター中のV遺伝子セグメントを、この順序(ヒト生殖系列の順序)、または本明細書で示されるものとは異なる順序で提供することができる。このクラスターが本発明において「近位クラスター」であると考えられる場合、「遠位クラスター」は(3'から5'の方向に、すなわち、近い方から遠い方に向かって、すなわち、下流から上流の方向に): V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74であってよい。中央クラスター(下記参照)は(3'から5'の方向に、すなわち、近い方から遠い方に向かって、すなわち、下流から上流の方向に): V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46およびV3-48であってよい。一例においては、遺伝子セグメントクラスターは別個のものである(すなわち、共通の遺伝子セグメントを共有しない)。一例においては、2つ以上のクラスターが重複する、例えば、第1の遺伝子セグメントクラスター(近位クラスターなど)は、第2の遺伝子セグメントクラスター(中央または遠位クラスターなど)により含まれる1つまたは複数の遺伝子セグメントを含み、第1および第2のクラスターは異なる。
前記方法の一実施形態においては、第3の脊椎動物はヒトの重鎖遺伝子座の中央VH遺伝子クラスターに対応するVH遺伝子セグメントの第3のクラスターを含み、中央クラスターは前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターと近位クラスターとの間に配置され、中央クラスターは1つまたは複数のD遺伝子セグメント、1つまたは複数のJH遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第3の脊椎動物の重鎖遺伝子座中に提供され、第3の脊椎動物の重鎖遺伝子座は前記ヒトの配置に対応する配置に遠位、中央および近位クラスターを含まず(場合により、第3の脊椎動物の重鎖遺伝子座が遠位および近位クラスターを含まない)、前記方法は第3の脊椎動物の前記重鎖遺伝子座を発現させる工程をさらに含み、それによって合成抗体重鎖のレパートリーが第1、第2および第3の脊椎動物遺伝子座からの発現により提供される。
前記方法の一実施形態においては、脊椎動物は同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている。
前記方法の一実施形態においては、脊椎動物はナイーブである。
前記方法の一実施形態においては、脊椎動物は軽鎖遺伝子座の共通コレクションを有する。例えば、カッパ鎖遺伝子座対立遺伝子は、その脊椎動物において同一であり、および/またはラムダ鎖遺伝子座対立遺伝子はその脊椎動物において同一である。これにより、集団を生成するための脊椎動物変異体の構築が簡単になり、また育種が簡単になる。
一実施形態においては、前記方法は、所望の特徴(例えば、抗原の結合に対する親和性)による前記レパートリーから、1つまたは複数の抗体重鎖(例えば、抗体の一部として)を選択する工程を含む。
本発明は、合成抗体カッパ鎖レパートリーを提供する方法であって、
(a)少なくとも第1および第2の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)のゲノムにわたってヒトVκ遺伝子セグメントレパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー)を分割する工程であって、前記レパートリーが、
ヒトのカッパ鎖遺伝子座の遠位Vκ遺伝子クラスターに対応するVκ遺伝子セグメントの第1のクラスター;および
ヒトのカッパ鎖遺伝子座の近位Vκ遺伝子クラスターに対応するVκ遺伝子セグメントの第2のクラスター
を含み、近位クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターの近くに配置され、
遠位クラスターが、1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第1の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中に提供され;
近位クラスターが、1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第2の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中に提供され;
近位Vκ遺伝子クラスターが、第1の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJκ遺伝子セグメントとの間に存在しない(場合により、さらなるVκ遺伝子セグメントが第1の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJκ遺伝子セグメントとの間に存在しない)、工程、ならびに
(b)第1および第2の脊椎動物の前記カッパ鎖遺伝子座を発現させて、合成抗体カッパ鎖のレパートリーを提供する工程
を含む、方法を提供する。
前記方法の一実施形態においては、第3の脊椎動物はヒトのカッパ鎖遺伝子座の中央Vκ遺伝子クラスターに対応するVκ遺伝子セグメントの第3のクラスターを含み、中央クラスターは前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターと近位クラスターとの間に配置され、中央クラスターは1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第3の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中に提供され、第3の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座は前記ヒトの配置に対応する配置に遠位、中央および近位クラスターを含まず(場合により、第3の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座は遠位および近位クラスターを含まない)、前記方法は第3の脊椎動物の前記カッパ鎖遺伝子座を発現させる工程をさらに含み、それによって合成抗体カッパ鎖のレパートリーが第1、第2および第3の脊椎動物遺伝子座からの発現により提供される。
本発明は、合成抗体ラムダ鎖レパートリーを提供する方法であって、
(a)少なくとも第1および第2の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)のゲノムにわたってヒトVλ遺伝子セグメントレパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー)を分割する工程であって、前記レパートリーが、
ヒトのラムダ鎖遺伝子座の遠位Vλ遺伝子クラスターに対応するVλ遺伝子セグメントの第1のクラスター;および
ヒトのラムダ鎖遺伝子座の近位Vλ遺伝子クラスターに対応するVλ遺伝子セグメントの第2のクラスター
を含み、近位クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターの近くに配置され、
遠位クラスターが、1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第1の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中に提供され;
近位クラスターが、1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第2の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中に提供され;
近位Vλ遺伝子クラスターが、第1の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJλ遺伝子セグメントとの間に存在しない(場合により、さらなるVλ遺伝子セグメントが第1の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJλ遺伝子セグメントとの間に存在しない)、工程、ならびに
(b)第1および第2の脊椎動物の前記ラムダ鎖遺伝子座を発現させて、合成抗体ラムダ鎖のレパートリーを提供する工程
を含む、方法を提供する。
前記方法の一実施形態においては、第3の脊椎動物はヒトのラムダ鎖遺伝子座の中央Vλ遺伝子クラスターに対応するVλ遺伝子セグメントの第3のクラスターを含み、中央クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターと近位クラスターとの間に配置され、中央クラスターは1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第3の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中に提供され、第3の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座は前記ヒトの配置に対応する配置に遠位、中央および近位クラスターを含まず(場合により、第3の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座は遠位および近位クラスターを含まない)、前記方法は第3の脊椎動物の前記ラムダ鎖遺伝子座を発現させる工程をさらに含み、それによって合成抗体ラムダ鎖のレパートリーが第1、第2および第3の脊椎動物遺伝子座からの発現により提供される。
前記方法の一実施形態においては、脊椎動物は同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている。
前記方法の一実施形態においては、脊椎動物はナイーブである。
前記方法の一実施形態においては、脊椎動物は重鎖遺伝子座の共通のコレクションを有する。
一実施形態においては、前記方法は、所望の特性(例えば、抗原結合に対する親和性)に従って前記レパートリーから1つまたは複数の抗体カッパまたはラムダ鎖(例えば、抗体の一部として)を選択する工程を含む。
実施例で説明されるように、本発明者らは、ヒト生殖系列ゲノム中で天然には反対の5'-3'方向にあるヒト遺伝子セグメントを逆転させたレパートリーを用いてセクター化を実行した(例えば、IMGTデータベースおよびLefranc, M.-P.、Exp. Clin. Immunogenet.、18、161〜174頁(2001)に示されるような、Igカッパ遺伝子座配置を参照されたい-「D」とマークされた5'遺伝子セグメントを参照されたい)。トランスジェニック非ヒト脊椎動物におけるヒト遺伝子セグメント使用の分布は驚くべきことに、人工的に逆転された遺伝子セグメントが再配置および発現のために用いられ、その使用は予想外に相対的に高いことを証明した(図10)。これらの知見は、これらの逆転された遺伝子セグメントがヒトにおいては稀にしか用いられないが、それらはトランスジェニック脊椎動物および本発明の細胞においては用いられ、一度、それらが野生型ヒト生殖系列の向きとは反対の向きに逆転されたら、トランスジェニックIg遺伝子座発現に良好に寄与することができることを示している。
かくして、本発明は、ゲノムが、定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメント(および場合により、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメント)を含むトランスジェニック抗体鎖遺伝子座を含み、遺伝子座が1つまたは複数の逆転された脊椎動物種遺伝子セグメントを含み、逆転された遺伝子セグメントが、そのようなセグメントの脊椎動物種生殖系列方向とは反対である5'-3'方向で遺伝子座中に存在し、非ヒト脊椎動物または細胞が、逆転された遺伝子セグメントから誘導された配列を含む抗体鎖配列を発現することができる、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスもしくはラット)または脊椎動物細胞(場合により、マウス細胞もしくはラット細胞)を提供する。
一例においては、細胞はB細胞、ハイブリドーマ、ES細胞またはiPS細胞である。ES細胞およびiPS細胞を用いて、逆転した遺伝子セグメントが、本発明者らが驚くべきことに観察した通り機能的である対応する非ヒト脊椎動物(本発明の脊椎動物)を開発することができる。
一実施形態においては、逆転した遺伝子セグメントは、V遺伝子セグメントである。
一実施形態においては、脊椎動物種は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ニワトリ、魚類、鳥類、爬虫類、ラクダ科動物、ウシ、チンパンジー、非ヒト霊長類および霊長類から選択される。
一実施形態においては、脊椎動物種はヒトであり、場合により、本発明の脊椎動物はまたマウスまたはラットである。
本発明はまた、ゲノムが、定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメント(および場合により、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメント)を含むトランスジェニック抗体鎖遺伝子座を含み、遺伝子座が1つまたは複数の逆転されたヒト遺伝子セグメントを含み、逆転されたヒト遺伝子セグメントが、そのようなセグメントのヒト生殖系列方向とは反対である5'-3'方向で遺伝子座中に存在し、脊椎動物または細胞が、逆転された遺伝子セグメントの組換えから誘導された可変領域を含む抗体鎖配列を発現することができる、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスもしくはラット)または脊椎動物細胞(場合により、マウス細胞もしくはラット細胞)も提供する。
一実施形態においては、逆転された遺伝子セグメントはヒトVκ遺伝子セグメントであるか、またはそれを含む。
一実施形態においては、逆転したVκ遺伝子セグメントは、Vκ2D-40、1D-39、1D-33、2D-30、2D-29、2D-28、2D-26、3D-20、1D-17、1D-16、1D-13、1D-12、3D-11、1D-43、1D-8および3D-7のうちの1つもしくは複数または全て、およびまた場合により、3D-15を含む。
一実施形態においては、遺伝子座は、Vκ2D-40、1D-39、1D-33、2D-30、2D-29、2D-28、2D-26、3D-20、1D-17、1D-16、1D-13、1D-12、3D-11、1D-43、1D-8および3D-7のうちの1つもしくは複数または全部、およびまた場合により、3D-15を含むVκ4-1および/または5-2を含むヒトVκ遺伝子セグメントを含み、ヒトVκ遺伝子セグメントは全て、遺伝子座の定常領域と同じ方向にある。さらに、またはあるいは、例えば、遺伝子座は、Vκ3D-7、1D-8、1D-43および3D-11の1つもしくは複数または全部の3'側に、ヒトVκ2D-40、1D-39、1D-33および2D-30のうちの1つもしくは複数または全部を含む。一実施形態においては、Vκ2D-40、1D-39、1D-33および2D-30は、遺伝子座中に3'から5'に向かってこの順序で存在する。さらに、またはあるいは、一実施形態においては、Vκ3D-7、1D-8、1D-43および3D-11は、遺伝子座中に3'から5'に向かってこの順序で存在する。
一例においては、遺伝子座中の最も5'側の逆転したVκ遺伝子セグメントは、Vκ3D-20である。別の例においては、それはVκ2D-40である(例えば、野生型ヒト第2染色体中に見出される天然に逆転したヒトVκ遺伝子セグメントの配列がこの配列として提供されるが、逆向きに提供される場合、また、Vκ2D-40については、本発明の遺伝子座中の最も5'側の逆転した遺伝子セグメントが最も3'側の逆転した遺伝子セグメントである場合)。
一実施形態においては、Vκ遺伝子セグメントは、ヒトVκ2D-40を含む。
一実施形態においては、Vκ遺伝子セグメントは、ヒトVκ1D-39、例えば、ヒトVκ1D-39の次のヒトVκ2D-40を含む(例えば、5'から3'の方向に、ヒトVκ1D-39の次にヒトVκ2D-40)。
一実施形態においては、定常領域はヒトである。別の実施形態においては、定常領域はマウスまたはラット定常領域、例えば、非ヒト脊椎動物にとって内因性の定常領域である。
本発明はまた、人工ヒト抗体可変領域レパートリーを提供する方法であって、非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞の抗体鎖遺伝子座中の1つまたは複数のJ遺伝子セグメント、場合により1つまたは複数のD遺伝子セグメント、および定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメント(逆転された遺伝子セグメント)を挿入する工程を含み、V遺伝子セグメントがそのようなセグメントのヒト生殖系列方向と反対である5'-3'方向で遺伝子座中に存在し、非ヒト脊椎動物または細胞(またはその細胞から誘導された非ヒト脊椎動物子孫)が逆転された遺伝子セグメントの組換えから誘導された可変領域配列を含む抗体鎖配列を発現することができる、方法も提供する。
一実施形態においては、脊椎動物または細胞または逆転した遺伝子セグメントは、上記の通りである。
本発明はまた、人工ヒト抗体可変領域レパートリーを提供する方法であって、本発明の脊椎動物から血清またはリンパ系細胞(例えば、脾臓細胞もしくはB細胞)を単離する工程、および場合により、血清または細胞から、所定の抗原に特異的に結合する1つまたは複数の抗体を単離する工程を含む方法も提供する。
本発明はまた、上記の方法において単離された抗体、またはその断片もしくは誘導体も提供する。
本明細書に記載の特定の実施形態は、例示のために示されるものであり、本発明の限定として示されるものではなく、(文脈が別途記述しない限り)実施形態を本明細書に記載の本発明の任意の構成に適用することができることが理解される。本発明の主な特徴を、本発明の範囲から逸脱することなく様々な実施形態において用いることができる。当業者であれば、日常的なものを超えない試験を用いて、本明細書に記載の特定の手順に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができる。そのような均等物は、本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲により包含される。本明細書に記載の全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者の知識のレベルを示すものである。全ての刊行物および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組込まれたのと同程度まで、参照により本明細書に組込まれる。特許請求の範囲および/または明細書において用語「含む(comprising)」と共に用いられる場合、単語「a」または「an」は、「1つ」を意味してもよいが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」および「1つまたは1つより多い」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されない限り、または選択肢が相互に排他的でない限り、「および/または」を意味するように用いられるが、本開示は、選択肢のみならびに「および/または」を指す定義を支持する。本出願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために用いられるデバイス、方法、または試験対象間に存在する変動に関する固有の誤差の変動を含むように用いられる。
本明細書および特許請求の範囲で用いられる単語「含む(comprising)」(および任意の形態のcomprising、例えば、「含む(comprise)」および「含む(comprises)」）、「有する(having)」(および任意の形態のhaving、例えば、「有する(have)」および「有する(has)」)、「含む(including)」(および任意の形態のincluding、例えば、「含む(includes)」および「含む(include)」)または「含有する(containing)」(および任意の形態のcontaining、例えば、「含有する(contains)」および「含有する(contain)」)は、包括的であるか、または非制限的であり、追加の、記載されていない要素または方法工程を排除するものではない。
本明細書で用いられる用語「またはその組合せ」とは、その用語に先行する列挙された項目の全ての順列および組合せを指す。例えば、「A、B、C、またはその組合せ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCのうちの少なくとも1つを含むことが意図され、特定の文脈において順序が重要である場合、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、またはCABも含むことが意図される。この例を続ければ、明示的に含まれるのは、1つまたは複数の項目または用語の反復、例えば、BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどを含有する組合せである。当業者であれば、典型的に、別途文脈から明らかでない限り、任意の組合せ中の項目または用語の数に制限はないことを理解する。
別途文脈から明らかでない限り、本開示の任意の部分を、本開示の任意の他の部分と組合せて読むことができる。
本明細書に開示され、特許請求される全ての組成物、集団、脊椎動物、抗体、レパートリーおよび/または方法を、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および/または方法ならびに方法の工程もしくは方法の一連の工程に変更を加えてもよいことが当業者には明らかである。当業者にとって明らかな全てのそのような類似する置換および改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると見なされる。
本発明を、以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明する。
(実施例)
(実施例1)
軽鎖レパートリーセクター化
本発明者らは、先行技術のマウスが、所望の重鎖カッパおよびラムダ遺伝子セグメントレパートリーの全部が個々のマウスの細胞のゲノム中に一緒に提供される免疫グロブリン遺伝子座を提供することに気付いた。これを行う際に、本発明者らは、先行技術の設計が、制限されたアクセス可能なB細胞コンポーネントサイズの限界(例えば、マウスにおいては約2x108個のB細胞)およびいずれか1匹のマウスにおいて発現させ、アクセスすることができる全体的な抗体鎖多様性に関する同時的制限に対処していないことに気付いた。
これは、図1〜図4を参照することにより例示される。図1は、ヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントの完全な機能的レパートリーを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座に関する潜在的な多様性の算出を示す(この例においては、6個の異なるヒトJH、27個の異なるヒトDおよび40個の異なるヒトVH生殖系列遺伝子セグメント)。算出は、結合多様性を考慮に入れる(典型的には、J-D連結に3個のヌクレオチド付加およびD-V連結に2個のヌクレオチド付加)。遺伝子セグメントの組換えにより生成される重鎖可変領域配列の潜在的多様性の計算値は、4x1010である。
図2は、ヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントの完全な機能的レパートリーをそれぞれ含む、トランスジェニックカッパおよびラムダ軽鎖遺伝子座の潜在的多様性の算出を示す(この例においては、それぞれの軽鎖遺伝子座中に5個の異なるヒトJLおよび40個の異なるヒトVL生殖系列遺伝子セグメント)。算出は結合多様性を考慮に入れる(典型的には、V-J連結に1個のヌクレオチド付加)。遺伝子セグメントの組換えにより生成されるカッパおよびラムダ鎖可変領域配列の潜在的多様性の計算値は、1x104である。
図3は、トランスジェニック重鎖、カッパおよびラムダ軽鎖遺伝子座の潜在的多様性の算出(すなわち、潜在的重鎖/軽鎖可変領域組合せの合計の算出)を示す。算出された結果は、4x1014の潜在的多様性である。
図4は、マウスが同じマウス中にヒト重鎖、カッパおよびラムダ遺伝子レパートリーを一緒に含む存在する理論的設計の欠点を図示する。現在まで、技術水準は、1匹のマウスゲノム中に完全な機能的ヒト重鎖カッパおよびラムダ遺伝子セグメントレパートリーを全部含有するマウスの生成の成功を報告していない。それにも拘らず、当業者が4x1014個の可能な抗体可変領域レパートリーからこれを行った場合(例えば、図1〜図3に記載の完全なレパートリーを用いることによる)、アクセス可能なB細胞コンパートメントから最大で約2x108個の抗体のみをサンプリングすることができる(実際、当技術分野ではこのレベルに近いどこでもサンプリングすることさえ争われることが多い)。かくして、大量の潜在的多様性をサンプリングすることはできない。これは、ラムダ配列空間をより完全にサンプリングする損害に対するマウスにおけるカッパ抗体の偏りの問題によってさらに悪化する。また、免疫化後の免疫応答を支配し得る個々のV領域における偏りが存在し得る;この場合、より稀に用いられる遺伝子セグメントは、それらが望ましい抗体(例えば、望ましい親和性および/または望ましいエピトープ認識を有する)を提供することができるとしてもアクセスすることができない。この問題は、アクセスすることができる最大2x108個のB細胞のうち、典型的には、ほんの少量のみが、当技術分野で日常的なハイブリドーマ作製方法を用いた場合にハイブリドーマを生成することを考えた場合、さらにより明確になる(ハイブリドーマ作製は所望のモノクローナル抗体の研究および製造供給に対する機能し得るアクセスを可能にするための標準的な方法である)。典型的には、ハイブリドーマ作製技術の適用後、作製することができるハイブリドーマは約1x104個に過ぎない。かくして、貧弱な多様性サンプリングの緊急の問題は当業者には容易に明らかとなるであろう:元の潜在的なレパートリーのうち、潜在的な4x1014個の組合せの最大でも1x104個しかアクセスできない。これは、先行技術の概念に従って設計されたマウスからの新しく有用な抗体の探索を厳しく制限する極めて少量の多様性である。
本発明者らは、トランスジェニック動物中の所望のレパートリー全体をセクター化し、レパートリーが、単一のゲノム中ではなく、集団を作る複数のゲノムにわたってアクセスされるようにすることにより、この問題に対処した。軽鎖レパートリーをセクター化して、カッパ遺伝子セグメント多様性からラムダ遺伝子セグメント多様性を分離する例について、これを図5に図示する。これは、例えば、本発明による別々のラムダ脊椎動物およびカッパ脊椎動物の提供により可能である。図5の例において、全てのマウスは同じトランスジェニック重鎖遺伝子座を含む(V、DおよびJ遺伝子セグメントの完全なヒト機能的多様性である図1に例示される遺伝子座)。この例においては、完全な機能的ヒトVλ遺伝子セグメントレパートリーは、3匹のマウスにわたって分割されており、そのマウスは異なるヒトVλ遺伝子セグメントサブレパートリーを含む(この場合、サブレパートリーは重複していないが、それらがその遺伝子セグメントのコレクションにおいて同一でない限り、それらを重複させることはできる)。同様に、完全な機能的Vκ遺伝子セグメントレパートリーは、3つの異なるカッパ脊椎動物にわたってセクター化されている(図の右手側)。図の中心にある大きい円は、4x1014の潜在的な全体的多様性を表し、それぞれの小さい方の円はそれぞれのマウスのアクセス可能なB細胞コンパートメントを表す。本実施例により、潜在的な配列空間全体の6つの個々のサンプリング(サブレパートリー)が可能になることを容易に理解することができる。かくして、これらのサブレパートリーは一緒になって、レパートリーサイズ全体が図4に示される従来の設計を用いた場合に可能なものよりも有意に大きい集団多様性を提供する。さらに、サンプリングのためのレパートリーを有意に拡張することに加えて、重要なことに、ラムダマウス中のレパートリーは、同じマウス中に一緒に先行技術のカッパおよびラムダ抗体比を発現する従来のトランスジェニックマウスにおいては見られない新規合成レパートリーである。例えば、カッパ軽鎖配列の発現が不活化された場合、ラムダマウス中の全抗体はラムダ軽鎖を含み、これは天然ではマウスにおいて見られない。同様に(例えば、内因性ラムダ発現が全体的に不活化されているか、または無視できる程度である場合)、カッパマウスにおいて、カッパ型抗体は本質的に排他的に発現される。総合すると、ラムダおよびカッパマウス(ナイーブなマウス(所定の抗原で免疫化されていないか、または外来抗原に対して実質的に曝露されていない)と、免疫化されたマウスの両方における)において発現される抗体のラムダ型およびカッパ型レパートリーは、新規な、有用に拡張された、合成のものである(天然には見られない)全抗体レパートリーを提供する。
(実施例2)
ヒトVH遺伝子セグメントレパートリーおよびヒト軽鎖レパートリーセクター化
図6は、重鎖VH遺伝子セグメントレパートリーが本発明に従ってセクター化される図例を示す。本実施例において、レパートリーは以下のような3匹のマウス(マウス「A」、「B」および「C」)間に分割された完全なヒト機能的VH遺伝子レパートリーである:
A… V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46、V3-48、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74
B… V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46およびV3-48
C… V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74
本実施例においては、マウスA、BおよびCのV遺伝子レパートリーは重複するが、そのレパートリーはユニークである。代替例においては、レパートリーは重複しない、例えば、VH遺伝子レパートリーは非重複的であり、以下のものを含むか、またはそれからなる:
A’… V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41およびV2-5
B’… V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46およびV3-48
C’… V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74
別の代替例においては、VH遺伝子レパートリーは、以下のものを含むか、またはそれからなる:
S… V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-13、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24およびV2-26
T… V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46およびV3-48
V… V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74
それぞれのマウスのVH遺伝子サブレパートリーは、完全な機能的ヒトJH遺伝子レパートリーおよび完全な機能的ヒトD遺伝子レパートリーを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座中で提供される。内因性重鎖発現は不活化される。それぞれのマウスに、同じ軽鎖遺伝子座(例えば、それぞれの軽鎖遺伝子座がヒトVLおよびJL遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニックラムダ遺伝子座および1つまたは複数のトランスジェニックカッパ遺伝子座)を提供することが可能である。しかしながら、図6の例においては、ラムダおよびカッパ遺伝子レパートリーはまた、図5における例示のように本発明に従ってセクター化されている。いずれかの例において、内因性カッパ鎖発現はラムダマウスにおいては不活化される(および内因性ラムダ鎖発現はカッパマウスにおいては場合により不活化される)。
一例において、JHおよびDレパートリーは、
D&JHレパートリー1
J1、J2、J3、J4、J5およびJ6
D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26およびD7-27
からなるか、またはそれを含む。
別の例において、JHおよびDレパートリーは、
D&JHレパートリー2
J1、J2、J3、J4、J5およびJ6
D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26およびD7-27
からなるか、またはそれを含む。
別の代替例において、VH、DHおよびJH遺伝子レパートリーは、以下のようなヒト遺伝子セグメントを含むか、またはそれからなる:
V、D、Jレパートリー1
V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-13、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24およびV2-26
(場合により、これがV遺伝子セグメントの5'から3'の順序である場合)
J1、J2、J3、J4、J5およびJ6
D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26およびD7-27
V、D、Jレパートリー2
V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46およびV3-48(場合により、これがV遺伝子セグメントの5'から3'の順序である場合)
J1、J2、J3、J4、J5およびJ6
D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26およびD7-27
(場合により、これがD遺伝子セグメントの5'から3'の順序である場合)
V、D、Jレパートリー3
V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74
(場合により、これがV遺伝子セグメントの5'から3'の順序である場合)
J1、J2、J3、J4、J5およびJ6
D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26およびD7-27
(場合により、これがD遺伝子セグメントの5'から3'の順序である場合)。
一例において、その重鎖遺伝子セグメントレパートリーにおいて異なる(および場合により、同一のヒト軽鎖遺伝子セグメントレパートリーを含む)本発明による第1および第2の非ヒト脊椎動物(例えば、マウス)の集団が提供され、ここで重鎖遺伝子セグメントレパートリーは、ヒトVH遺伝子セグメントの同一のレパートリーおよび異なるヒトD遺伝子セグメントレパートリーを含み、
第1の脊椎動物のD遺伝子セグメントレパートリーは、
D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26およびD7-27
を含み、
第2の脊椎動物のD遺伝子セグメントレパートリーは、
D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26およびD7-27
を含み、場合により、脊椎動物は同一のJH遺伝子レパートリー(例えば、J1、J2、J3、J4、J5およびJ6)を含む。
本実施例の一実施形態においては、それぞれのヒトVH遺伝子セグメントレパートリーは、ヒトVH遺伝子セグメント(a)V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-13、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24およびV2-26および/または(b)V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46およびV3-48および/または(c)V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74
を含むか、またはそれらからなる。例えば、それぞれのヒトVH遺伝子セグメントレパートリーは、ヒトVH遺伝子セグメント(a)、(b)および(c)を含むか、またはそれらからなる。
図6に見られるように、それぞれのマウスは、抗体のユニークなサブレパートリーならびに抗体重鎖および軽鎖配列を提供する。この設計により、上記で説明されたカッパおよびラムダレパートリーのセクター化のため、先行技術の設計を用いた場合に存在するものよりはるかにより完全なヒトVλ多様性を探索することができる。さらに、ヒトVH遺伝子レパートリーのセクター化は、重鎖遺伝子座中の新しい遺伝子セグメント配置を提供する(遠位遺伝子セグメントをより近くに持って行き、単一の遺伝子座中に一緒にVH遺伝子セグメントの非天然の組合せを提供する)。これにより、これまで以前に可能であったものより完全にヒトVH遺伝子多様性を探索することができる。さらに、例示された設計において、ユニークなVH遺伝子レパートリーは、カッパ脊椎動物とは別々にラムダ脊椎動物の文脈でマウスにおいて別々に探索され、次いで、天然には見られない、またはこれまで以前に可能でなかった新規組合せを提供する。
図5および図6に示されるトランスジェニックマウスは、抗原による免疫化後のサンプリングのための抗体および抗体鎖レパートリーの有用な供給源を提供する。例えば、図5または図6の集団に示される全てのマウス(または両図面における全てのマウスの組合せ)を、同じヒト抗原で免疫化し、例えば、抗原への相対的に高い親和性結合について、または抗原の特定のエピトープ領域における結合について(例えば、既知のエピトープ特異性の抗抗原抗体との競合により決定した場合)、望ましい抗体を選択することができる。それによって、選択された抗体は、1つまたは複数の好ましい薬剤候補を選択することができる抗体の選択されたレパートリー(場合により、プールされた)を提供する。この選択は、第1ラウンドの選択において既に得られた情報に基づくものであってもよく、および/またはさらなるセットの実験(例えば、選択されたレパートリー内の親和性を決定するためのELISAおよび/または表面プラズモン共鳴(例えば、Biacore(商標)を用いる))を実施してレパートリーからの選択を可能にしてもよい。
(実施例3)
ヒトVκ遺伝子レパートリーの遺伝子セクター化による新規軽鎖およびヒトVκ領域レパートリーの生成
本発明者らは、機能的ヒト遺伝子セグメントレパートリー(図7に示されるように、Vκ2D-40からJκ5まで)をセクター化して、3つの異なるトランスジェニックカッパ鎖対立遺伝子(K1、K2およびK3と命名する)および対応するマウスを生成した。トランスジェニック対立遺伝子をマウスにおいて発現させ、カッパ鎖レパートリーをRNA転写物レベルで評価した。
マウスAB2.1 ES細胞(Baylor College of Medicine)のIGK遺伝子座への1st IGK BAC由来ヒトカッパ遺伝子セグメントの挿入を行って、軽鎖対立遺伝子を作出し、K1対立遺伝子と命名した。挿入されたヒト配列は、位置89312220から位置89159079のヒト第2染色体の配列に対応し、機能的カッパ遺伝子セグメントVκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4およびJκ5を含む(図7)。挿入はマウス第6染色体上の位置70674755と70674756の間で行ったが、これはマウスCκ領域の上流である。マウスVκおよびJκ遺伝子セグメントは、挿入されたヒトカッパDNAのすぐ上流(5'側)の遺伝子座中に保持された。マウスラムダ遺伝子座は、無傷のままであった。
より多くのヒト機能的Vκ遺伝子セグメントが、第2のBACに由来するヒトDNAの連続的挿入によりK1対立遺伝子中に挿入された最も5'側のVκの上流(5'側)に挿入された第2の対立遺伝子K2を構築した。BAC2に由来する挿入されたヒト配列は、位置89478399から位置89312221のヒト第2染色体の配列に対応し、機能的カッパ遺伝子セグメントVκ2-24、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11を含む(図7)。
より多くのヒト機能的Vκ遺伝子セグメントが、第3のBACに由来するヒトDNAの連続的挿入によりK2対立遺伝子中に挿入された最も5'側のVκの上流(5'側)に挿入された第3の対立遺伝子K3を構築した。挿入された配列は、位置89889512から位置89902788および位置89609410から位置89478400のヒト第2染色体の配列に対応し、機能的カッパ遺伝子セグメントVκ2D-40、Vκ1D-39、Vκ1-33、Vκ2-30、Vκ2-29、Vκ2-28およびVκ1-27を含む(図7)。
ヒト遺伝子セグメントVκ2D-40およびVκ1D-39は、天然で逆転され (天然のヒトゲノム中の場合、他の機能的遺伝子セグメント、例えば、BAC1〜3中の他のVκおよびJκとは反対の向き)、ヒトにおいては比較的稀に用いられる(IMGTデータベース中のIgカッパ遺伝子座表示およびEur J Immunol. 1994 Apr; 24(4):827〜36頁、「A directory of human germ-line V kappa segments reveals a strong bias in their usage」、J Coxらを参照されたい)。現在の戦略では、これらの遺伝子セグメント配列は、それらが他のヒト遺伝子セグメントと同じ5'-3'の向きでBAC3中に存在するように、その天然の状態から逆転された。本発明者らは、ヒトの進化の間に逆転した遺伝子セグメントの機能がトランスジェニック動物において新しい方向に変え、それによって機能を増強し、かくして、発現されたレパートリーの提供に関与し得るかどうかに興味を持った。
内因性カッパ遺伝子座中にK1、K2またはK3挿入のいずれかを担持するマウスを、標準的な手順を用いてES細胞から作製した。他の内因性カッパ遺伝子座を、マウスJκ-Cκイントロン中にneoRを含む不活化配列の挿入により、マウス中で不活化した(「KA」対立遺伝子を生成するため)。標準的な5'-RACEを実行して、K1、K2およびK3マウス中でトランスジェニックカッパ軽鎖遺伝子座に由来するRNA転写物を分析した。
K3マウスは、ヒトVκ遺伝子セグメントの高い使用を示し、ヒトVκ遺伝子セグメントを用いるのは再配置された転写物の92.8%であり、マウスVκ遺伝子セグメントを用いるのはそれらの7.2%のみである(図8)。K1およびK2と比較して、K3は改善されたヒトVκ使用を示した(K1:78%;K2:83%およびK3:93%)(図9)。
K3マウスに由来するヒトVκ使用の分布により、2つの移植され、逆転されたVκ2D-40およびVκ1D-39が驚くべきことに、再配置および発現のために用いられ、Vκ1D-39の使用が予想外に相対的に高いことが示された(図10)。これらのデータは、これらの2つのVκ遺伝子セグメントがヒトにおいては稀にしか用いられないが、一度、それらが逆転され、ヒトJκ遺伝子セグメントと同じ向きを有したら、それらは用いられ、トランスジェニックIgK遺伝子座発現に寄与することができることを示している。本発明による遺伝子セグメント逆転の驚くべき効果のさらなる例を、以下の実施例6に示す。
また、K1〜K3マウスに由来するヒトVκ使用の分布により、ヒトVκ遺伝子セグメントの異なるレパートリーの挿入が、ヒトVκの使用を変化させることも示された(図11)。いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、これがVκ間での変化する競合に起因し、その相対的使用を決定すると推量している。またこれは驚くべきことにヒトJκ使用についても観察された。例えば、本発明者らは驚くべきことに、第3のBAC挿入に関して、Jκ4使用が増加することを観察した(図12)。かくして、本発明によるヒトVκ遺伝子レパートリーセクター化は、発現されたヒトVκ遺伝子セグメントのレパートリーを変化させただけでなく、発現されたJκプロフィールをも変化させた。かくして、本発明者らは驚くべきことに、本発明者らが遺伝子レパートリーセクター化により抗体鎖の異なるレパートリーを提供する方法を発見したことに気付いた。組合せ集団としてのK1、K2およびK3のコレクションは、所望の抗原に対して選択することができる抗体鎖および抗体の新規レパートリーを生成するために有用であることに、本発明者らは気付いた。例えば、K1、K2およびK3マウスを同じヒト抗原で免疫化し、マウス中の全抗体に由来する抗抗原抗体を、親和性および/または標的エピトープ認識もしくは別の望ましい特徴に基づいて選択することができる。
セクター化のさらなる例は、以下の実施例6に開示されるように、さらにより多くのヒトIgK DNAの挿入により確立された(K4マウスを作出するため)。
まとめると、示差的使用およびかくして異なる軽鎖配列レパートリーを示すカッパ軽鎖配列の分析を、遺伝子セクター化技術により生成することができる。レパートリーは、そのヒトVおよびJ遺伝子セグメント使用において異なっていた。さらに、マウスにより共有された特定のヒト遺伝子セグメントの割合を、本発明の遺伝子セクター化技術により発現プロフィールにおいて変化させることができる。
(実施例4)
ヒトVH遺伝子レパートリーの遺伝子セクター化による新規重鎖およびヒトVH領域レパートリーの生成
本発明者らは、機能的ヒト遺伝子セグメントレパートリー(VH2-26からJH6まで、ヒトIgH遺伝子座の構造については、IMGTデータベース; http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&group=IGKを参照されたい)をセクター化して、3つの異なるトランスジェニック重鎖対立遺伝子(S1、S2およびS3と命名された)および対応するマウスを生成した。トランスジェニック対立遺伝子をそのマウス中で発現させ、重鎖レパートリーをRNA転写物レベルで評価した。
マウスAB2.1 ES細胞(Baylor College of Medicine)のIGH遺伝子座中への1st IGH BACに由来するヒト重鎖遺伝子セグメントの挿入を実施して、重鎖対立遺伝子を作出し、S1対立遺伝子と命名した。挿入されたヒト配列は、位置106494908から位置106328951のヒト第14染色体の配列に対応し、機能的重鎖遺伝子セグメントVH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1、D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5およびJH6 (5'から3'の順序に)を含む。挿入をマウス第12染色体上の位置114666435と114666436との間で行ったが、これはマウスCμ領域の上流である。マウスVH、DおよびJH遺伝子セグメントは、挿入されたヒト重鎖DNAのすぐ上流(5'側)の遺伝子座中に保持された。
より多くのヒト機能的VH遺伝子セグメントが第2のBAC(BAC2)に由来するヒトDNAの連続的挿入によりS1対立遺伝子中に挿入された最も5'側のVHの上流(5'側)に挿入された第2の対立遺伝子S2を構築した。BAC2に由来する挿入されたヒト配列は、位置106601551から位置106494909のヒト第14染色体の配列に対応し、機能的重鎖遺伝子セグメントVH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7を含む。
より多くのヒト機能的VH遺伝子セグメントが第3のBAC(BAC3)に由来するヒトDNAの連続的挿入によりS2対立遺伝子中に挿入された最も5'側のVHの上流(5'側)に挿入された第3の対立遺伝子S3を構築した。挿入されたヒト配列は、位置106759988から位置106609301のヒト第14染色体の配列に対応し、機能的重鎖遺伝子セグメントVH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、およびVH3-15を含む。
内因性重鎖遺伝子座中にS1、S2またはS3挿入のいずれかを担持するマウスを、標準的な手順を用いてES細胞から作製した。他の内因性重鎖遺伝子座を、マウスJH-Cμイントロン中にneoRを含む不活化配列の挿入により、マウス中で不活化した(「HA」対立遺伝子を生成するため)。標準的な5'-RACEを実行して、S1、S2およびS3マウス中でトランスジェニック重鎖軽鎖遺伝子座に由来するRNA転写物を分析した。
S3マウスは、ヒトVH遺伝子セグメントの高い使用を示し、ヒトVH遺伝子セグメントを用いるのは再配置された転写物の62%であり、マウスVκ遺伝子セグメントを用いるのはそれらの38%である(図13)。ヒトVH使用は以下の通り:S1:16%;S2:64%およびS3:62%であった(図13)。
また、S1〜S3マウスに由来するヒトVH使用の分布により、ヒトVH遺伝子セグメントの異なるレパートリーの挿入が、ヒトVHの使用を変化させ(図14)、かくして、発現されたヒト重鎖可変領域のレパートリーがマウス間で異なることも示された。いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、これがVH間での変化する競合に起因し、その相対的使用を決定すると推量している。かくして、本発明者らは、本発明者らが驚くべきことに遺伝子レパートリーセクター化により抗体重鎖および重鎖可変領域の異なるレパートリーを提供する方法を発見したことに気付いた。組合せ集団としてのS1、S2およびS3のコレクションは、所望の抗原に対して選択することができる抗体重鎖および抗体の新規レパートリーを生成するために有用であることに、本発明者らは気付いた。例えば、S1、S2およびS3マウス(例えば、内因性重鎖および軽鎖発現が不活化された場合、および場合によりマウスがヒト可変領域を含む軽鎖を発現する場合)を同じヒト抗原で免疫化し、マウス中の全抗体に由来する抗抗原抗体を、親和性および/または標的エピトープ認識もしくは別の望ましい特徴に基づいて選択することができる。
より多くのヒト機能的VH遺伝子セグメントがBAC(BAC6)に由来するヒトDNAの連続的挿入によるS1対立遺伝子中に挿入された最も5'側のVHの上流(5'側)に挿入された、第4の重鎖対立遺伝子(「V6」と命名)を構築することにより、VH遺伝子レパートリーのさらなるセクター化を実施した。BAC6に由来する挿入されたヒト配列は、位置107147078から位置106995083のヒト第14染色体の配列に対応し、機能的重鎖遺伝子セグメントVH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH 3-53、VH5-51、VH3-49を含む(図16)。
図15に示されるように、S2およびV6マウスは、S1マウスよりも多いヒトVH遺伝子セグメント使用を示した。V6と比較したS2における使用は、さらに異なっていた。図16も参照されたい。
まとめると、示差的使用およびかくして異なる重鎖およびヒト重鎖可変領域配列レパートリーを示す重鎖配列の分析を、遺伝子セクター化技術により生成することができる。レパートリーは、そのヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメント使用において異なっていた。さらに、マウスにより共有された特定のヒト遺伝子セグメントの割合を、本発明の遺伝子セクター化技術により発現プロフィールにおいて変化させることができる(図14および図16)。
(実施例5)
ヒトD遺伝子レパートリーの遺伝子セクター化による新規重鎖およびヒトV領域レパートリーの生成
D遺伝子セグメントセクター化の評価を、以下のように実施することができる。機能的ヒト遺伝子セグメントレパートリー(VH2-26からJH6まで、ヒトIgH遺伝子座の構造についてはIMGTデータベース; http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&group=IGKを参照されたい)をセクター化して、2つの異なるトランスジェニック重鎖対立遺伝子(S3FおよびS3FDと命名)および対応するマウスを生成する。内因性重鎖可変領域は、WO2011004192に記載の逆転により不活化される。トランスジェニック対立遺伝子をマウスにおいて発現させ、重鎖レパートリーをRNA転写物レベルで評価する。
実施例4に記載のものと同様のBAC挿入技術を用いて、第1のIGH BACからマウスAB2.1 ES細胞(Baylor College of Medicine)のIGH遺伝子座へのヒト重鎖遺伝子セグメントの挿入を実施して、重鎖対立遺伝子を作出して、S1対立遺伝子と命名する。この挿入はマウス第12染色体上の位置114666435と114666436の間で行い、これはマウスCμ領域の上流である。マウスVH、DおよびJH遺伝子セグメントは、挿入されたヒト重鎖DNAのすぐ上流(5'側)で遺伝子座中で保持される(およびその後、逆転されてより後の段階で不活化される)。
より多くのヒト機能的VH遺伝子セグメントが、第2のBAC(BAC2)に由来するヒトDNAの連続的挿入によりS1対立遺伝子中に挿入された最も5'側のVHの上流(5')に挿入された第2の対立遺伝子S2を構築する。BAC2に由来する挿入されたヒト配列は、位置106601551から位置106494909のヒト第14染色体の配列に対応し、機能的重鎖遺伝子セグメントVH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7を含む。
より多くのヒト機能的VH遺伝子セグメントが、第3のBAC(BAC3)に由来するヒトDNAの連続的挿入によりS2対立遺伝子中に挿入された最も5'側のVHの上流(5')に挿入された第3の対立遺伝子S3を構築する。挿入されたヒト配列は、位置106759988から位置106609301のヒト第14染色体の配列に対応し、機能的重鎖遺伝子セグメントVH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、およびVH3-15を含む。
そのヒトD遺伝子セグメントレパートリーにおいてのみ異なる、2つの異なる型の重鎖対立遺伝子を作製する:
バージョン1(S3Fと命名)は、ヒト遺伝子セグメントレパートリーVH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1、D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5およびJH6 (5'から3'の順序に)を有していた。
バージョン2(S3FDと命名)は、ヒト遺伝子セグメントレパートリーVH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1、D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5およびJH6 (5'から3'の順序に)を有していた。下線付きのセグメントはS3F中には見られない。
内因性重鎖遺伝子座中にS3FまたはS3FD挿入のいずれかを担持するマウスを、標準的な手順を用いてES細胞から作製する。他の内因性重鎖遺伝子座は、マウスJH-CμイントロンへのneoRを含む不活化配列の挿入によりマウス中で不活化される(「HA」対立遺伝子を生成するため)。標準的な5'-RACEを実行して、S3FおよびS3FDマウス中のトランスジェニック重鎖軽鎖遺伝子座に由来するRNA転写物を分析する。
重鎖配列の分析は示差的D遺伝子セグメント使用(S3FおよびS3FDレパートリーの両方に見出されるDセグメントについても)、ならびにおそらく異なるVおよび/またはJ遺伝子セグメント使用を示し、かくして、重鎖およびヒト重鎖可変領域配列レパートリーを遺伝子セクター化技術により生成することができると期待される。
(実施例6)
複数の逆転したヒト遺伝子セグメントがIg鎖再配置および発現のために用いられる
実施例3において、本発明者らはK1、K2およびK3マウスの作製を記載している。ヒト第2染色体のVκ遺伝子クラスターに由来するさらなるDNAを挿入することにより、K4マウスを以下のように作製した。
より多くのヒト機能的Vκ遺伝子セグメントが、第4のBACに由来するヒトDNAの連続的挿入によりK3対立遺伝子中に挿入された最も5'側のVκの上流(5'側)に挿入された第4の対立遺伝子、K4を構築した。挿入された配列は、位置[90062244]から位置[90276666]のヒト第2染色体の配列に対応し、機能的カッパ遺伝子セグメント[Vκ3D-20、Vκ1D-17、Vκ1D-16、Vκ1D-13、Vκ1D-12、Vκ3D-11、Vκ1D-43、Vκ1D-8、Vκ3D-7]を含む(図17)。これらの10個のVκは、Vκセグメントの遠位クラスター中にあり、天然では生殖系列ヒト第2染色体中のJκエクソンと反対の向きにあるが、このトランスジェニック対立遺伝子中では近位ヒトJκおよびマウスCκに逆転された。
K4マウスは、ヒトVκの高い使用を示し、ヒトVκを用いるのは再配置された転写物の94.5%であり、マウスVκを用いるのはそれらの5.5%のみである(図18)。K1、K2およびK3と比較して、K4はK1およびK2に対する改善されたヒトVκ使用(K1:78%; K2:83%)を示し、K3に対する類似する使用(K3:93%)を示した(図19)。遠位クラスターに由来するVκは全て、ヒトにおいては稀にしか用いられない(Cox, JPLら「A directory of human germ-lime Vκ segments reveals a strong bias in their usage」、Eur. J. Immunol. 1994. 24: 827〜836頁)。K4マウスに由来するヒトVκ使用の分布により、これらのVκが再配置および発現のために頻繁に用いられることが示された(図20)。これらのデータは、遠位クラスターに由来するこれらのVκはヒトにおいて稀にしか用いられないが、一度、それらが本発明のように逆転されたら、それらは非常によく用いられることを示している。K4マウスにおけるヒトVκ使用の分布により、ヒトVκBACの挿入がK1からK3マウスに対するVκの使用を変化させることも示された(図20)。本発明者らは、これらのVκ間の競合がその相対的使用を決定付けると仮定する。これは、Jκ使用にも適用される。第3のBAC挿入に関して、Jκ使用は増加し、これは第4のBAC挿入後に保持される(図21)。

Claims (145)

  1. 合成抗体重鎖配列レパートリーを提供する方法であって、
    (a)異なるヒトVH遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団を提供する工程であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割されるものである、工程
    を含み、
    (b)前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第1のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
    (c)前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第2のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
    (d)第1のVH遺伝子サブレパートリーが第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって第1の脊椎動物が、第2の脊椎動物により生成される重鎖配列レパートリーとは異なる重鎖配列レパートリーを生成することができる、方法。
  2. 前記集団が第3の非ヒト脊椎動物を含み、第3の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第3のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み、第3のVH遺伝子サブレパートリーが第1および第2のVH遺伝子サブレパートリーとは異なり、それによって、第3の脊椎動物が、第1および第2の脊椎動物により生成される重鎖配列レパートリーとは異なる重鎖配列レパートリーを生成することができる、請求項1に記載の方法。
  3. 前記集団により提供されるレパートリーが、機能的ヒトVH遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも6個の異なるヒトJH遺伝子セグメント、27個の異なるヒトDセグメントおよび少なくとも40個の異なるヒトVH遺伝子セグメントを提供する、請求項1または2に記載の方法。
  4. 前記集団により提供されるレパートリーが、少なくとも20、25、30、35または40個の異なるヒトVH遺伝子セグメントを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. それぞれのトランスジェニック重鎖遺伝子座のJセグメントがヒトJH遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの重鎖遺伝子座がヒトJH遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
  6. それぞれの重鎖遺伝子座が少なくとも2、3、4、5または6個の異なるヒトJH遺伝子セグメントを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. それぞれのトランスジェニック重鎖遺伝子座のDセグメントがヒトD遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの重鎖遺伝子座がヒトD遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. それぞれの重鎖遺伝子座が少なくとも5、10、15、20、25、26または27個の異なるヒトD遺伝子セグメントを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記脊椎動物の重鎖遺伝子座が同一のヒトDおよびJH遺伝子セグメントレパートリーを含むが、そのVH遺伝子レパートリーにおいて異なる、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. それぞれの重鎖遺伝子座がJ1、J2、J3、J4、J5およびJ6からなる群から選択される少なくとも2個のヒトJH遺伝子セグメント、場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. それぞれの重鎖遺伝子座が、D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26、D6-25およびD7-27からなる群から選択される少なくとも10個のヒトD遺伝子セグメント、場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記集団が請求項2に記載の第3の脊椎動物を含み、それぞれの脊椎動物が、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46、V3-48、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなる群から選択されるヒトVH遺伝子セグメントを含み、VH遺伝子レパートリーが実質的に完全なヒト機能的VH遺伝子レパートリーを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 内因性抗体重鎖発現が脊椎動物中で不活化されている、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 集団の脊椎動物を同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化する工程を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記脊椎動物の2つ以上または全部の免疫化が6ヶ月以下の間隔を空けられる、請求項14に記載の方法。
  16. 共通の望ましい抗体または重鎖特性(例えば、前記抗原に対する結合親和性)に基づいて、それぞれの前記免疫化された脊椎動物から1つまたは複数の重鎖または抗体を選択する工程を含み、選択された抗体または重鎖が、集団により提供されるヒトVH遺伝子セグメントレパートリーから誘導された重鎖可変領域配列を含む、請求項14または15に記載の方法。
  17. 選択された抗体または重鎖が選択された抗体または重鎖のレパートリー(選択されたレパートリー)を提供し、前記方法が所望の抗体または重鎖特性に基づいて(例えば、前記抗原もしくは異なる抗原に対する結合親和性;または抗体もしくは重鎖により結合したエピトープに基づいて)、選択されたレパートリーから1つまたは複数の抗体または重鎖を選択する工程をさらに含み、場合により、選択されたレパートリーが選択された抗体または重鎖をプールすることにより形成される、請求項16に記載の方法。
  18. 脊椎動物が、その重鎖遺伝子座(および場合により、1つまたは複数のその軽鎖遺伝子座)を除いて、同じ遺伝的背景を共有する、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 脊椎動物が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞が同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムが、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物DNA連結を含む)、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 合成抗体軽鎖配列レパートリーを提供する方法であって、
    (a)異なるヒトVL遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団を提供する工程であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割されるものである、工程
    を含み、
    (b)前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第1のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
    (c)前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第2のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
    (d)第1のVL遺伝子サブレパートリーが第2のVL遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって第1の脊椎動物が、第2の脊椎動物により生成される軽鎖配列レパートリーとは異なる軽鎖配列レパートリーを生成することができる、方法。
  21. 前記集団が第3の非ヒト脊椎動物を含み、第3の脊椎動物が定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第3のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み、第3のVL遺伝子サブレパートリーが第1および第2のVL遺伝子サブレパートリーとは異なり、それによって、第3の脊椎動物が、第1および第2の脊椎動物により生成される軽鎖配列レパートリーとは異なる軽鎖配列レパートリーを生成することができる、請求項20に記載の方法。
  22. それぞれのトランスジェニック軽鎖遺伝子座のJセグメントがヒトJL遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの軽鎖遺伝子座がヒトJκまたはJλ遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む、請求項20または21に記載の方法。
  23. 前記集団により提供されるレパートリーが、機能的ヒトVκ遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも5個の異なるヒトJκ遺伝子セグメントおよび少なくとも40個の異なるヒトVκ遺伝子セグメントを提供する、請求項20、21または22に記載の方法。
  24. 前記集団により提供されるレパートリーが、少なくとも20、25、30、35または40個の異なるヒトVκ遺伝子セグメントを含む、請求項20から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記集団により提供されるレパートリーが、機能的ヒトVλ遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも5個の異なるJλ遺伝子セグメントおよび少なくとも40個の異なるヒトVλ遺伝子セグメントを提供する、請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記集団により提供されるレパートリーが、少なくとも20、25、30、35または40個の異なるヒトVλ遺伝子セグメントを含む、請求項20から22および25のいずれか一項に記載の方法。
  27. それぞれの軽鎖遺伝子座が、少なくとも2、3、4、5または6個の異なるヒトJκまたはJλ遺伝子セグメントを含む、請求項20から26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記脊椎動物の軽鎖遺伝子座が同一のヒトJL遺伝子セグメントレパートリーを含むが、そのVL遺伝子レパートリーにおいて異なる、請求項20から27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 内因性抗体カッパおよび/またはラムダ軽鎖発現が脊椎動物中で不活化されている、請求項20から28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 脊椎動物の前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座がカッパ軽鎖遺伝子座である、請求項20から29のいずれか一項に記載の方法。
  31. 脊椎動物の前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座がラムダ軽鎖遺伝子座である、請求項20から29のいずれか一項に記載の方法。
  32. 集団の脊椎動物を同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化する工程を含む、請求項20から31のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記脊椎動物の2つ以上または全部の免疫化が6ヶ月以下の間隔を空けられる、請求項32に記載の方法。
  34. 共通の望ましい抗体特性(例えば、前記抗原に対する結合親和性)に基づいて、それぞれの前記免疫化された脊椎動物から1つまたは複数の抗体を選択する工程を含み、選択された抗体が、集団により提供されるヒトVL遺伝子セグメントレパートリーから誘導された軽鎖可変領域配列を含む、請求項32または33に記載の方法。
  35. 選択された抗体が選択された抗体のレパートリー(選択されたレパートリー)を提供し、前記方法が所望の抗体特性に基づいて(例えば、前記抗原もしくは異なる抗原に対する結合親和性;または抗体により結合したエピトープに基づいて)、選択されたレパートリーから1つまたは複数の抗体を選択する工程をさらに含み、場合により、選択されたレパートリーが選択された抗体をプールすることにより形成される、請求項34に記載の方法。
  36. 脊椎動物が、前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座(および場合により、1つまたは複数のその重鎖遺伝子座)を除いて、同じ遺伝的背景を共有する、請求項20から35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 脊椎動物が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞が同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムが、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物DNA連結を含む)、請求項20から36のいずれか一項に記載の方法。
  38. 所定の抗原に結合する抗体を選択する方法であって、
    (a)前記抗原に結合する抗体のレパートリー(第1のレパートリー)を提供する工程であって、前記抗体が、ヒト重鎖および軽鎖可変領域を含み、前記レパートリーが、
    i.軽鎖可変領域がヒトVλ遺伝子セグメントとヒトJL遺伝子セグメントとの再配置により生成される抗体のサブレパートリー(ラムダサブレパートリー);ならびに
    ii.軽鎖可変領域がヒトVκ遺伝子セグメントとヒトJL遺伝子セグメントとの再配置により生成される抗体のサブレパートリー(カッパサブレパートリー)
    を含む、工程;
    (b)所望の抗体特性(例えば、前記抗原に対する結合親和性)によるラムダサブレパートリーから1つまたは複数の抗体を選択する工程;
    (c)前記望ましい抗体特性によるカッパサブレパートリーから1つまたは複数の抗体を選択する工程であって、
    選択されたラムダおよびカッパ抗体のレパートリー(第2のレパートリー)が生成され、第2のレパートリーの抗体が前記抗原に結合するヒト可変領域を含む、工程;ならびに
    (d)望ましい抗体特性(例えば、前記抗原に対する結合親和性)に基づいて、前記第2のレパートリーから1つまたは複数の抗体を選択する工程
    を含み、
    工程(a)(i)において、ラムダサブレパートリーが前記抗原を用いる1つまたは複数の非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)(ラムダ脊椎動物)の免疫化により生成され、ラムダ脊椎動物が、カッパ型抗体(軽鎖可変領域がVκ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)よりも多くのヒトラムダ型抗体(軽鎖可変領域がヒトVλ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)を発現し;
    工程(a)(ii)において、カッパサブレパートリーが前記抗原を用いる1つまたは複数の非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)(カッパ脊椎動物)の免疫化により生成され、カッパ脊椎動物が、ラムダ型抗体(軽鎖可変領域がVλ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)よりも多くのヒトカッパ型抗体(軽鎖可変領域がヒトVκ遺伝子セグメントの再配置から誘導される抗体)を発現する、方法。
  39. ラムダ脊椎動物が、カッパ型抗体を実質的に発現しない、請求項38に記載の方法。
  40. 内因性カッパ抗体発現が、ラムダ脊椎動物中で実質的に不活性である、請求項38または39に記載の方法。
  41. カッパ脊椎動物が、ラムダ型抗体を実質的に発現しない、請求項38から40のいずれか一項に記載の方法。
  42. 内因性ラムダ抗体発現が、カッパ脊椎動物中で実質的に不活性である、請求項38から41のいずれか一項に記載の方法。
  43. ラムダサブレパートリーの形成が、カッパサブレパートリーの形成から6ヶ月以下の間隔を空けられる、請求項38から42のいずれか一項に記載の方法。
  44. 第2のレパートリーが、選択されたラムダおよびカッパ抗体をプールすることにより形成される、請求項38から43のいずれか一項に記載の方法。
  45. ラムダおよびカッパ抗体が、前記抗原への結合の親和性に基づいて選択される(より高い親和性がより低い親和性より好ましい)、請求項38から44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 親和性が表面プラズモン共鳴により決定される、請求項45に記載の方法。
  47. カッパおよびラムダ脊椎動物が、その軽鎖遺伝子座(および場合により、その重鎖遺伝子座)を除いて、同じ遺伝的背景を共有する、請求項38から46のいずれか一項に記載の方法。
  48. カッパおよびラムダ脊椎動物が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞が同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムが、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物DNA連結を含む)、請求項38から47のいずれか一項に記載の方法。
  49. 異なるヒトVH遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割されるものであり、
    (a)前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第1のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
    (b)前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第2のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み;
    (c)第1のVH遺伝子サブレパートリーが、それぞれ互いに異なる第1および第2の抗体重鎖配列レパートリーの発現のための第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって集団が抗体重鎖配列の合成レパートリーを提供する、集団。
  50. 前記集団が第3の非ヒト脊椎動物を含み、第3の脊椎動物が定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVH遺伝子セグメント(第3のVH遺伝子サブレパートリー)、DセグメントおよびJセグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み、第3のVH遺伝子サブレパートリーが、第1および第2の抗体重鎖配列レパートリーと異なる第3の抗体重鎖配列レパートリーの発現のための第1および第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって集団が抗体重鎖配列の合成レパートリーを提供する、請求項49に記載の集団。
  51. 脊椎動物が同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている、請求項49または50に記載の集団。
  52. 前記集団により提供されるレパートリーが、機能的ヒトVH遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも6個の異なるヒトJH遺伝子セグメント、27個の異なるヒトDセグメントおよび少なくとも40個の異なるヒトVH遺伝子セグメントを提供する、請求項49、50または51に記載の集団。
  53. 前記集団により提供されるヒトVH遺伝子セグメントレパートリーが、少なくとも20、25、30、35または40個の異なるヒトVH遺伝子セグメントを含む、請求項49から52のいずれか一項に記載の集団。
  54. それぞれのトランスジェニック重鎖遺伝子座のJセグメントがヒトJH遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの重鎖遺伝子座がヒトJH遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む、請求項49から53のいずれか一項に記載の集団。
  55. それぞれの重鎖遺伝子座が少なくとも2、3、4、5または6個の異なるヒトJH遺伝子セグメントを含む、請求項49から54のいずれか一項に記載の集団。
  56. それぞれのトランスジェニック重鎖遺伝子座のDセグメントがヒトD遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの重鎖遺伝子座がヒトD遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む、請求項49から55のいずれか一項に記載の集団。
  57. それぞれの重鎖遺伝子座が少なくとも5、10、15、20、25、26または27個の異なるヒトD遺伝子セグメントを含む、請求項49から56のいずれか一項に記載の集団。
  58. 前記脊椎動物の重鎖遺伝子座が同一のヒトDおよびJH遺伝子セグメントレパートリーを含むが、そのVH遺伝子レパートリーにおいて異なる、請求項49から57のいずれか一項に記載の集団。
  59. それぞれの重鎖遺伝子座がJ1、J2、J3、J4、J5およびJ6からなる群から選択される少なくとも2個のヒトJH遺伝子セグメント、場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む、請求項49から58のいずれか一項に記載の集団。
  60. それぞれの重鎖遺伝子座が、D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26、D6-25およびD7-27からなる群から選択される少なくとも10個のヒトD遺伝子セグメント、場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む、請求項49から59のいずれか一項に記載の集団。
  61. 前記集団が請求項50に記載の第3の脊椎動物を含み、それぞれの脊椎動物が、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46、V3-48、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなる群から選択されるヒトVH遺伝子セグメントを含み、VH遺伝子レパートリーが実質的に完全なヒト機能的VH遺伝子レパートリーを含む、請求項49から60のいずれか一項に記載の集団。
  62. 内因性抗体重鎖発現が脊椎動物中で不活化されている、請求項49から61のいずれか一項に記載の集団。
  63. 集団の前記脊椎動物の2つ以上または全部が同じ抗原で免疫化されており、2回以上の免疫化が6ヶ月以下の間隔を空けられる、請求項49から62のいずれか一項に記載の集団。
  64. 脊椎動物が、その重鎖遺伝子座(および場合により、1つまたは複数のその軽鎖遺伝子座)を除いて、同じ遺伝的背景を共有する、請求項49から63のいずれか一項に記載の集団。
  65. 脊椎動物が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞が同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムが、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物DNA連結を含む)、請求項49から64のいずれか一項に記載の集団。
  66. 異なるヒトVL遺伝子セグメントのレパートリーを提供するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、前記レパートリーが前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割されるものであり、
    前記集団の第1の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第1のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
    前記集団の第2の脊椎動物が、定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第2のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み;
    第1のVL遺伝子サブレパートリーが、それぞれ互いに異なる第1および第2の抗体軽鎖配列レパートリーの発現のための第2のVL遺伝子サブレパートリーと異なり、それによって集団が抗体軽鎖配列の合成レパートリーを提供する、集団。
  67. 前記集団が第3の非ヒト脊椎動物を含み、第3の脊椎動物が定常領域の上流に動作可能に接続された1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント(第3のVL遺伝子サブレパートリー)およびJセグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座を含み、第3のVL遺伝子サブレパートリーが、第1および第2の抗体重鎖配列レパートリーと異なる第3の抗体重鎖配列レパートリーの発現のための第1および第2のVH遺伝子サブレパートリーと異なる、請求項66に記載の集団。
  68. 脊椎動物が同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている、請求項66または67に記載の集団。
  69. それぞれのトランスジェニック軽鎖遺伝子座のJセグメントがヒトJL遺伝子セグメントであり、場合により、それぞれの軽鎖遺伝子座がヒトJκまたはJλ遺伝子セグメントの実質的に完全な機能的レパートリーを含む、請求項66から68のいずれか一項に記載の集団。
  70. 前記集団により提供されるVL遺伝子セグメントレパートリーが、機能的ヒトVκ遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも5個の異なるJκ遺伝子セグメントおよび少なくとも40個の異なるヒトVκ遺伝子セグメントを提供する、請求項66から69のいずれか一項に記載の集団。
  71. 前記集団により提供されるVL遺伝子セグメントレパートリーが、少なくとも20、25、30、35または40個の異なるヒトVκ遺伝子セグメントを含む、請求項66から70のいずれか一項に記載の集団。
  72. 前記集団により提供されるVL遺伝子セグメントレパートリーが、機能的ヒトVλ遺伝子セグメントの実質的に完全なレパートリーを含み、場合により、少なくとも5個の異なるJλ遺伝子セグメントおよび30個の異なるヒトVλ遺伝子セグメントを提供する、請求項66から71のいずれか一項に記載の集団。
  73. 前記集団により提供されるVL遺伝子セグメントレパートリーが、少なくとも20、25または30個の異なるヒトVλ遺伝子セグメントを含む、請求項66から72のいずれか一項に記載の集団。
  74. それぞれの軽鎖遺伝子座が、少なくとも2、3、4、5または6個の異なるヒトJκまたはJλ遺伝子セグメントを含む、請求項66から73のいずれか一項に記載の集団。
  75. 前記脊椎動物の軽鎖遺伝子座が同一のヒトJL遺伝子セグメントレパートリーを含むが、そのVL遺伝子レパートリーにおいて異なる、請求項66から74のいずれか一項に記載の集団。
  76. 内因性抗体カッパおよび/またはラムダ軽鎖発現が脊椎動物中で不活化されている、請求項66から75のいずれか一項に記載の集団。
  77. 脊椎動物の前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座がカッパ軽鎖遺伝子座である、請求項66から76のいずれか一項に記載の集団。
  78. 脊椎動物の前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座がラムダ軽鎖遺伝子座である、請求項66から76のいずれか一項に記載の集団。
  79. 前記脊椎動物の軽鎖遺伝子座が同一のヒトJL遺伝子セグメントレパートリーを含むが、そのVL遺伝子レパートリーにおいて異なる、請求項66から78のいずれか一項に記載の集団。
  80. それぞれの軽鎖遺伝子座が、少なくとも2、3、4もしくは5個のヒトJκ遺伝子セグメントまたは少なくとも2、3、4もしくは5個のヒトJλ遺伝子セグメントを含む、請求項66から79のいずれか一項に記載の集団。
  81. 集団の前記脊椎動物の2つ以上または全部が同じ抗原で免疫化されており、2回以上の免疫化が6ヶ月以下の間隔を空けられる、請求項66から80のいずれか一項に記載の集団。
  82. 脊椎動物が、前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座(および場合により、1つまたは複数のその重鎖遺伝子座)を除いて、同じ遺伝的背景を共有する、請求項66から81のいずれか一項に記載の集団。
  83. 脊椎動物が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞が同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムが、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物DNA連結を含む)、請求項66から82のいずれか一項に記載の集団。
  84. 非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、それぞれの脊椎動物のゲノムが、
    (e)それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の重鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座;ならびに
    (f)それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の軽鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJL遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
    を含み;
    それぞれの脊椎動物において、トランスジェニック重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントがその定常領域に動作可能に連結され、トランスジェニック軽鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントがその定常領域に動作可能に連結され、免疫化の際に、脊椎動物が、重鎖遺伝子座の組換えにより生成された重鎖と、軽鎖遺伝子座の組換えにより生成された軽鎖とを含む抗体を生成することができ;
    前記集団が、
    (i)前記軽鎖遺伝子座が1つまたは複数のヒトVλ遺伝子セグメントを含み、再配置後に、遺伝子座がヒトVλ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖配列(ヒトラムダ軽鎖配列)を発現し、ラムダ脊椎動物がカッパ軽鎖配列よりも多くのラムダ軽鎖配列(Vκ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖の配列)を発現する第1の脊椎動物型(ラムダ脊椎動物);ならびに
    (ii)前記軽鎖遺伝子座が1つまたは複数のヒトVκ遺伝子セグメントを含み、再配置後に、遺伝子座がヒトVκ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖配列(ヒトカッパ軽鎖配列)を発現し、カッパ脊椎動物がラムダ軽鎖配列よりも多くのカッパ軽鎖配列(Vλ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖の配列)を発現する第2の脊椎動物型(カッパ脊椎動物)
    を含み;
    前記集団の脊椎動物を同じ抗原で免疫化して、ヒト重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体のレパートリーを生成することができ、前記レパートリーが第1の型の脊椎動物により生成されたヒトラムダ抗体のサブレパートリー(ラムダサブレパートリー)と、第2の型の脊椎動物により生成されたヒトカッパ抗体のサブレパートリー(カッパサブレパートリー)とを含む、
    集団。
  85. 脊椎動物が同じ抗原、場合により、ヒト抗原で免疫化されている、請求項84に記載の集団。
  86. ラムダ脊椎動物の免疫化が、カッパ脊椎動物の免疫化から6ヶ月以下の間隔を空けられる、請求項85に記載の集団。
  87. ラムダ脊椎動物が、カッパ型抗体を実質的に発現しない、請求項84から86のいずれか一項に記載の集団。
  88. 内因性カッパ抗体発現が、ラムダ脊椎動物中で実質的に不活性である、請求項84から87のいずれか一項に記載の集団。
  89. カッパ脊椎動物が、ラムダ型抗体を実質的に発現しない、請求項84から88のいずれか一項に記載の集団。
  90. 内因性ラムダ抗体発現が、カッパ脊椎動物中で実質的に不活性である、請求項84から89のいずれか一項に記載の集団。
  91. 請求項49から90のいずれか一項に記載の集団を含む動物舎または実験室。
  92. 選択された、または第2のレパートリーの抗体が、非ヒト脊椎動物の集団に由来する共通の抗原(例えば、ヒト抗原)への結合について選択された、請求項16、17、34もしくは35に記載の方法に従って生成された抗体の選択されたレパートリー、または請求項38に記載の方法に従って生成された抗体の第2のレパートリー。
  93. 脊椎動物が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座DNAを含むように遺伝子改変されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物先祖胚性幹細胞から誘導され、先祖幹細胞が同一であるか、または関連し、場合により、先祖幹細胞のゲノムが、非ヒト脊椎動物配列とヒト配列との連結である共通の配列連結を含む(例えば、先祖ゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物DNA連結を含む)、請求項92に記載のレパートリー。
  94. 集団が請求項49から91のいずれか一項に記載のものである、請求項92に記載のレパートリー。
  95. 非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)であって、それぞれの脊椎動物のゲノムが、
    (g)それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の重鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒトD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座;ならびに
    (h)それぞれの遺伝子座が1つまたは複数の軽鎖定常領域の上流に1つまたは複数のヒトVλ遺伝子セグメントレパートリーおよび1つまたは複数のヒトJλ遺伝子セグメントを含む、1つまたは複数のトランスジェニック免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
    を含み;
    再配置後に、軽鎖遺伝子座が、ヒトVλ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖配列(ヒトラムダ軽鎖配列)を発現し;
    カッパ(および場合により、内因性ラムダ)軽鎖発現が実質的に不活化されており、脊椎動物がカッパ軽鎖配列より多くのヒトラムダ軽鎖配列(Vκ遺伝子セグメントから誘導された可変領域配列を含む軽鎖の配列)を発現し;
    内因性重鎖発現が実質的に不活化されており;
    それぞれの前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座が実質的に完全なヒトの機能的Vλ遺伝子セグメントレパートリーを含む、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)。
  96. それぞれの前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座が、V3-1、V2-8、V3-9、V3-10、V2-11、V3-12、V3-16、V2-18、V3-19、V3-21、V3-22、V2-23、V3-25、V3-27、V1-36、V5-37、V5-39、V1-40、V7-43、V1-44、V5-45、V7-46、V1-74、V9-49、V1-51、V5-52、V6-57、V4-60、V8-61およびV4-69からなる群から選択される少なくとも20、25、26、27、28もしくは29個のヒトVλ遺伝子セグメント;場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む、請求項95に記載の脊椎動物。
  97. それぞれの前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座が実質的に完全なヒトの機能的Jλ遺伝子セグメントレパートリーを含む、請求項95または96に記載の脊椎動物。
  98. それぞれの前記トランスジェニック軽鎖遺伝子座が、J1、J2、J3、J6およびJ7からなる群から選択される少なくとも3個または4個のヒトJλ遺伝子セグメント;場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む、請求項95から97のいずれか一項に記載の脊椎動物。
  99. それぞれの前記トランスジェニック重鎖遺伝子座が実質的に完全なヒトの機能的VH遺伝子セグメントレパートリーを含む、請求項95から98のいずれか一項に記載の脊椎動物。
  100. それぞれの前記トランスジェニック重鎖遺伝子座が、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46、V3-48、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなる群から選択される少なくとも30、35、36、37、38または39個のヒトVH遺伝子セグメント;場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む、請求項95から99のいずれか一項に記載の脊椎動物。
  101. それぞれの前記トランスジェニック重鎖遺伝子座が、J1、J2、J3、J4、J5、J6からなる群から選択される少なくとも4個または5個のヒトJH遺伝子セグメント;場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む、請求項95から100のいずれか一項に記載の脊椎動物。
  102. それぞれの前記トランスジェニック重鎖遺伝子座が、D1-1、D2-2、D3-3、D4-4、D5-5、D6-6、D1-7、D2-8、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D1-26、D6-25およびD7-27からなる群から選択される少なくとも15、20、21、22、23、24、25または26個のヒトD遺伝子セグメント;場合により、前記群の遺伝子セグメントの全部を含む、請求項95から101のいずれか一項に記載の脊椎動物。
  103. 非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、それぞれの脊椎動物が請求項95から102のいずれか一項に記載のものであり、前記集団が、請求項49から65のいずれか一項に記載の前記集団の2つ以上の脊椎動物間に分割されたヒトVH遺伝子セグメントレパートリーを提供する、集団。
  104. 非ヒト脊椎動物(場合により、マウスまたはラット)の集団であって、それぞれの脊椎動物が請求項95から102のいずれか一項に記載のものであり、前記集団が、第1、第2および第3の脊椎動物の間に分割されたヒトVH遺伝子セグメントレパートリーを提供し、
    第1の脊椎動物が、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41およびV2-5からなる群に由来する5個または6個の遺伝子セグメントを含むヒトVH遺伝子レパートリーを含み;
    第2の脊椎動物が、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46およびV3-48からなる群に由来する15、16、17、18、19、20または21個の遺伝子セグメントを含むヒトVH遺伝子レパートリーを含み;
    第3の脊椎動物が、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなる群に由来する10、11、12または13個の遺伝子セグメントを含むヒトVH遺伝子レパートリーを含み;
    脊椎動物のVH遺伝子レパートリーが互いに異なり;
    前記集団が、実質的に完全なヒトの機能的VH遺伝子セグメントレパートリーと、実質的に完全なヒトの機能的Vλ遺伝子セグメントとを提供し、抗原を用いる集団の脊椎動物の免疫化後に、実質的にカッパ鎖発現および内因性重鎖発現の非存在下で実質的に完全な機能的ヒトVHおよびVλレパートリーから誘導された抗体の合成レパートリーを生成することができる、集団。
  105. 第1の脊椎動物が、V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41およびV2-5からなるヒトVH遺伝子レパートリーを含み;
    第2の脊椎動物が、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46およびV3-48からなるヒトVH遺伝子レパートリーを含み;
    第3の脊椎動物が、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73およびV3-74からなるヒトVH遺伝子レパートリーを含む、
    請求項104に記載の集団。
  106. 脊椎動物がカッパ軽鎖を全く発現しない、請求項104または105に記載の集団。
  107. 所定の抗原に結合し、重鎖および軽鎖可変領域がそれぞれヒトVHおよびVλ遺伝子セグメントから誘導される抗体(ラムダ型抗体)を単離する方法であって、請求項95から102のいずれか一項に記載の脊椎動物または請求項103から106のいずれか一項に記載の脊椎動物の集団を抗原で免疫化する工程、および前記脊椎動物または集団からラムダ型抗体を選択する工程を含む方法。
  108. 前記抗原に結合する請求項107に従って選択された抗体またはその誘導体を、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と共に含む医薬組成物。
  109. 合成抗体重鎖配列レパートリーを提供する方法であって、内因性重鎖発現が実質的に不活性である2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割された重鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する工程を含み、ゲノム中のレパートリー遺伝子セグメントが、重鎖定常領域(例えば、Cミューおよび/またはCガンマ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のVH遺伝子セグメント、1つまたは複数のD遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJH遺伝子セグメントを含むトランスジェニック重鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが、VH、DおよびJH遺伝子セグメントから誘導された抗体重鎖配列の異なるレパートリーを発現することができ;
    遺伝子セグメントレパートリーが、
    (a)VH遺伝子レパートリー(例えば、ヒトVH遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトVH遺伝子レパートリー);
    (b)D遺伝子レパートリー(例えば、ヒトD遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトD遺伝子レパートリー);
    (c)JH遺伝子レパートリー(例えば、ヒトJH遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトJH遺伝子レパートリー)
    からなる群から選択され;
    場合により、遺伝子座中のDおよびJHセグメントがヒトDおよびJHセグメントである、方法。
  110. 合成抗体カッパ鎖配列レパートリーを提供する方法であって、内因性カッパ鎖(およびまた場合により内因性ラムダ鎖)発現が実質的に不活性である2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたカッパ鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する工程を含み、ゲノム中のレパートリー遺伝子セグメントが、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のVκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが、VκおよびJκ遺伝子セグメントから誘導された抗体カッパ鎖配列の異なるレパートリーを発現することができ;
    遺伝子セグメントレパートリーが、
    (a)Vκ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトVκ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー);
    (c)Jκ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトJκ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトJκ遺伝子レパートリー)
    からなる群から選択され;
    場合により、遺伝子座中のJκセグメントがヒトJκセグメントである、方法。
  111. 合成抗体ラムダ鎖配列レパートリーを提供する方法であって、内因性ラムダ鎖(およびまた場合により内因性カッパ鎖)発現が実質的に不活性である2つ以上の非ヒト脊椎動物のゲノムにわたって分割されたラムダ鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する工程を含み、ゲノム中のレパートリー遺伝子セグメントが、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のVλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが、VλおよびJλ遺伝子セグメントから誘導された抗体ラムダ鎖配列の異なるレパートリーを発現することができ;
    遺伝子セグメントレパートリーが、
    (a)Vλ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトVλ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー);
    (c)Jλ遺伝子レパートリー(例えば、ヒトJλ遺伝子レパートリーまたは実質的に完全な機能的ヒトJλ遺伝子レパートリー)
    からなる群から選択され;
    場合により、遺伝子座中のJλセグメントがヒトJλセグメントである、方法。
  112. 合成抗体軽鎖配列レパートリーを提供する方法であって、
    内因性ラムダ鎖(およびまた場合により、内因性カッパ鎖)発現が実質的に不活性である、第1群の非ヒト脊椎動物のゲノム中のVκ遺伝子レパートリーであって、ゲノム中のVκ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ、例えば、ヒトCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが実質的にラムダ軽鎖発現の非存在下でVκおよびJκ遺伝子セグメントから誘導された抗体カッパ軽鎖配列のレパートリーを発現することができる、Vκ遺伝子レパートリー;ならびに
    内因性カッパ鎖(およびまた場合により、内因性ラムダ鎖)発現が実質的に不活性である、第2群の非ヒト脊椎動物のゲノム中のVλ遺伝子レパートリーであって、ゲノム中のVλ遺伝子が、軽鎖定常領域(例えば、Cκおよび/またはCλ、例えば、ヒトCλ)の上流に機能的に接続された1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック軽鎖遺伝子座の一部として提供され、ゲノムが実質的にカッパ軽鎖発現の非存在下でVλおよびJλ遺伝子セグメントから誘導された抗体ラムダ軽鎖配列のレパートリーを発現することができる、Vλ遺伝子レパートリー
    を提供する工程を含み、
    場合により、Vκ遺伝子レパートリーがヒトVκ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー)であり、Vλ遺伝子レパートリーがヒトVλ遺伝子レパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー)であり、遺伝子座中のJκセグメントがヒトJκセグメントであり、遺伝子座中のJλセグメントがヒトJλセグメントであり;
    場合により、第1群および第2群のゲノムが実質的に完全なヒトの機能的VH遺伝子レパートリーを含む、方法。
  113. 抗体を作製するための非ヒト脊椎動物の集団であって、請求項112に記載の第1群および第2群の脊椎動物を含み、場合により、集団の脊椎動物が同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている、集団。
  114. 抗体重鎖配列、抗体軽鎖配列、抗体カッパ鎖配列、抗体ラムダ鎖配列の合成レパートリー、または請求項49から91、103から106および113のいずれか一項に記載の非ヒト脊椎動物の集団から得られた抗体のレパートリー;もしくは請求項95から102のいずれか一項に記載の脊椎動物から得られたレパートリー。
  115. 脊椎動物の集団が同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている、請求項114に記載のレパートリー。
  116. 脊椎動物の集団がナイーブである、請求項114に記載のレパートリー。
  117. 脊椎動物のゲノムが共通のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座または共通のヒト/非ヒト脊椎動物DNA連結を含む、請求項114から116のいずれか一項に記載のレパートリー。
  118. レパートリーのメンバーが共通の抗原に結合し、同じ研究プログラムにおいて作製された、請求項114から117のいずれか一項に記載のレパートリー。
  119. 合成抗体重鎖レパートリーを提供する方法であって、
    (a)少なくとも第1および第2の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)のゲノムにわたってヒトVH遺伝子セグメントレパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVH遺伝子レパートリー)を分割する工程であって、前記レパートリーが、
    ヒトの重鎖遺伝子座の遠位VH遺伝子クラスターに対応するVH遺伝子セグメントの第1のクラスター;および
    ヒトの重鎖遺伝子座の近位VH遺伝子クラスターに対応するVH遺伝子セグメントの第2のクラスター
    を含み、近位クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターの近くに配置され、
    遠位クラスターが、1つまたは複数のD遺伝子セグメント、1つまたは複数のJH遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第1の脊椎動物の重鎖遺伝子座中に提供され;
    近位クラスターが、1つまたは複数のD遺伝子セグメント、1つまたは複数のJH遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第2の脊椎動物の重鎖遺伝子座中に提供され;
    近位VH遺伝子クラスターが、第1の脊椎動物の重鎖遺伝子座中の遠位クラスターとD遺伝子セグメントとの間に存在しない(場合により、さらなるVH遺伝子セグメントが第1の脊椎動物の重鎖遺伝子座中の遠位クラスターとD遺伝子セグメントとの間に存在しない)、工程、ならびに
    (b)第1および第2の脊椎動物の前記重鎖遺伝子座を発現させて、合成抗体重鎖のレパートリーを提供する工程
    を含む、方法。
  120. 第3の脊椎動物がヒトの重鎖遺伝子座の中央VH遺伝子クラスターに対応するVH遺伝子セグメントの第3のクラスターを含み、中央クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターと近位クラスターとの間に配置され、中央クラスターが1つまたは複数のD遺伝子セグメント、1つまたは複数のJH遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第3の脊椎動物の重鎖遺伝子座中に提供され、第3の脊椎動物の重鎖遺伝子座が前記ヒトの配置に対応する配置に遠位、中央および近位クラスターを含まず(場合により、第3の脊椎動物の重鎖遺伝子座が遠位および近位クラスターを含まない)、前記方法が第3の脊椎動物の前記重鎖遺伝子座を発現させる工程をさらに含み、それによって合成抗体重鎖のレパートリーが第1、第2および第3の脊椎動物遺伝子座からの発現により提供される、請求項119に記載の方法。
  121. 脊椎動物が同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている、請求項119または120に記載の方法。
  122. 脊椎動物がナイーブである、請求項119または120に記載の方法。
  123. 脊椎動物が軽鎖遺伝子座の共通のコレクションを有する、請求項119から122のいずれか一項に記載の方法。
  124. 所望の特性(例えば、抗原結合に対する親和性)に従って前記レパートリーから1つまたは複数の抗体重鎖(例えば、抗体の一部として)を選択する工程を含む、請求項119から123のいずれか一項に記載の方法。
  125. 合成抗体カッパ鎖レパートリーを提供する方法であって、
    (a)少なくとも第1および第2の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)のゲノムにわたってヒトVκ遺伝子セグメントレパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVκ遺伝子レパートリー)を分割する工程であって、前記レパートリーが、
    ヒトのカッパ鎖遺伝子座の遠位Vκ遺伝子クラスターに対応するVκ遺伝子セグメントの第1のクラスター;および
    ヒトのカッパ鎖遺伝子座の近位Vκ遺伝子クラスターに対応するVκ遺伝子セグメントの第2のクラスター
    を含み、近位クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターの近くに配置され、
    遠位クラスターが、1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第1の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中に提供され;
    近位クラスターが、1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第2の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中に提供され;
    近位Vκ遺伝子クラスターが、第1の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJκ遺伝子セグメントとの間に存在しない(場合により、さらなるVκ遺伝子セグメントが第1の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJκ遺伝子セグメントとの間に存在しない)、工程、ならびに
    (b)第1および第2の脊椎動物の前記カッパ鎖遺伝子座を発現させて、合成抗体カッパ鎖のレパートリーを提供する工程
    を含む、方法。
  126. 第3の脊椎動物がヒトのカッパ鎖遺伝子座の中央Vκ遺伝子クラスターに対応するVκ遺伝子セグメントの第3のクラスターを含み、中央クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターと近位クラスターとの間に配置され、中央クラスターが1つまたは複数のJκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第3の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座中に提供され、第3の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座が前記ヒトの配置に対応する配置に遠位、中央および近位クラスターを含まず(場合により、第3の脊椎動物のカッパ鎖遺伝子座が遠位および近位クラスターを含まない)、前記方法が第3の脊椎動物の前記カッパ鎖遺伝子座を発現させる工程をさらに含み、それによって合成抗体カッパ鎖のレパートリーが第1、第2および第3の脊椎動物遺伝子座からの発現により提供される、請求項125に記載の方法。
  127. 合成抗体ラムダ鎖レパートリーを提供する方法であって、
    (a)少なくとも第1および第2の非ヒト脊椎動物(例えば、マウスまたはラット)のゲノムにわたってヒトVλ遺伝子セグメントレパートリー(例えば、実質的に完全な機能的ヒトVλ遺伝子レパートリー)を分割する工程であって、前記レパートリーが、
    ヒトのラムダ鎖遺伝子座の遠位Vλ遺伝子クラスターに対応するVλ遺伝子セグメントの第1のクラスター;および
    ヒトのラムダ鎖遺伝子座の近位Vλ遺伝子クラスターに対応するVλ遺伝子セグメントの第2のクラスター
    を含み、近位クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターの近くに配置され、
    遠位クラスターが、1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第1の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中に提供され;
    近位クラスターが、1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第2の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中に提供され;
    近位Vλ遺伝子クラスターが、第1の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJλ遺伝子セグメントとの間に存在しない(場合により、さらなるVλ遺伝子セグメントが第1の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中の遠位クラスターとJλ遺伝子セグメントとの間に存在しない)、工程、ならびに
    (b)第1および第2の脊椎動物の前記ラムダ鎖遺伝子座を発現させて、合成抗体ラムダ鎖のレパートリーを提供する工程
    を含む、方法。
  128. 第3の脊椎動物がヒトのラムダ鎖遺伝子座の中央Vλ遺伝子クラスターに対応するVλ遺伝子セグメントの第3のクラスターを含み、中央クラスターが前記ヒト遺伝子座中の遠位クラスターと近位クラスターとの間に配置され、中央クラスターが1つまたは複数のJλ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の定常領域の上流の前記第3の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座中に提供され、第3の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座が前記ヒトの配置に対応する配置に遠位、中央および近位クラスターを含まず(場合により、第3の脊椎動物のラムダ鎖遺伝子座が遠位および近位クラスターを含まない)、前記方法が第3の脊椎動物の前記ラムダ鎖遺伝子座を発現させる工程をさらに含み、それによって合成抗体ラムダ鎖のレパートリーが第1、第2および第3の脊椎動物遺伝子座からの発現により提供される、請求項127に記載の方法。
  129. 脊椎動物が同じ抗原(例えば、ヒト抗原)で免疫化されている、請求項125から128のいずれか一項に記載の方法。
  130. 脊椎動物がナイーブである、請求項125から128のいずれか一項に記載の方法。
  131. 脊椎動物が重鎖遺伝子座の共通のコレクションを有する、請求項125から130のいずれか一項に記載の方法。
  132. 所望の特性(例えば、抗原結合に対する親和性)に従って前記レパートリーから1つまたは複数の抗体カッパまたはラムダ鎖(例えば、抗体の一部として)を選択する工程を含む、請求項125から131のいずれか一項に記載の方法。
  133. ゲノムが、定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック抗体鎖遺伝子座を含み、遺伝子座が1つまたは複数の逆転された脊椎動物種遺伝子セグメントを含み、逆転された遺伝子セグメントが、そのようなセグメントの脊椎動物種生殖系列方向とは反対である5'-3'方向で遺伝子座中に存在し、非ヒト脊椎動物または細胞が、逆転された遺伝子セグメントから誘導された配列を含む抗体鎖配列を発現することができる、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスもしくはラット)または脊椎動物細胞(場合により、マウス細胞もしくはラット細胞)。
  134. 逆転された遺伝子セグメントがV遺伝子セグメントである、請求項133に記載の脊椎動物または細胞。
  135. 前記脊椎動物種が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ニワトリ、魚類、鳥類、爬虫類、ラクダ科動物、ウシ、チンパンジー、非ヒト霊長類および霊長類から選択される、請求項133または134に記載の脊椎動物または細胞。
  136. 前記脊椎動物種がヒトである、請求項133から135のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
  137. ゲノムが、定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJ遺伝子セグメントを含むトランスジェニック抗体鎖遺伝子座を含み、遺伝子座が1つまたは複数の逆転されたヒト遺伝子セグメントを含み、逆転されたヒト遺伝子セグメントが、そのようなセグメントのヒト生殖系列方向とは反対である5'-3'方向で遺伝子座中に存在し、脊椎動物または細胞が、逆転された遺伝子セグメントの組換えから誘導された可変領域を含む抗体鎖配列を発現することができる、非ヒト脊椎動物(場合により、マウスもしくはラット)または脊椎動物細胞(場合により、マウス細胞もしくはラット細胞)。
  138. 逆転された遺伝子セグメントがヒトVκ遺伝子セグメントであるか、またはそれを含む、請求項133から137のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
  139. Vκ遺伝子セグメントが、Vκ2D-40、1D-39、1D-33、2D-30、2D-29、2D-28、2D-26、3D-20、1D-17、1D-16、3D-15、1D-13、1D-12、3D-11、1D-43、1D-8および3D-7のうちの1つまたは複数を含む、請求項138に記載の脊椎動物または細胞。
  140. Vκ遺伝子セグメントがヒトVκ2D-40を含む、請求項133から139のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
  141. Vκ遺伝子セグメントがヒトVκ1D-39を含む、請求項133から140のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
  142. 人工ヒト抗体可変領域レパートリーを提供する方法であって、非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞の抗体鎖遺伝子座中の1つまたは複数のJ遺伝子セグメントおよび定常領域の上流に1つまたは複数のヒトV遺伝子セグメント(逆転された遺伝子セグメント)を挿入する工程を含み、V遺伝子セグメントがそのようなセグメントのヒト生殖系列方向と反対である5'-3'方向で遺伝子座中に存在し、非ヒト脊椎動物または細胞(またはその細胞から誘導された非ヒト脊椎動物子孫)が逆転された遺伝子セグメントの組換えから誘導された可変領域配列を含む抗体鎖配列を発現することができる、方法。
  143. 脊椎動物または細胞または逆転された遺伝子セグメントが、請求項133から142のいずれか一項に記載の通りである、請求項142に記載の方法。
  144. 人工ヒト抗体可変領域レパートリーを提供する方法であって、請求項133から142のいずれか一項に記載の脊椎動物から血清または1つもしくは複数のリンパ球細胞を単離する工程、および場合により、血清または細胞から、所定の抗原に特異的に結合する1つまたは複数の抗体を単離する工程を含む、方法。
  145. 請求項144に記載の方法において単離された抗体、またはその断片もしくは誘導体。
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