JP6473423B2 - 修飾された免疫グロブリン重鎖配列を有する非ヒト動物 - Google Patents
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Description
本出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される、2013年2月20日に出願された米国仮特許出願第61/766,765号、及び2013年9月18日に出願された米国仮特許出願第61/879,338号に対する優先権の利益を主張する。
テキストファイル形式の配列リスト(「1270WO_SL.txt」と題され、2014年2月20日に作成され、87,000バイトのサイズである)が、参照によりその全体が本明細書に援用される。
定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列(即ち、再構成された重鎖VDJ配列)を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物、例えば、マウス及びラットなどの齧歯動物。幾つかの実施形態では、動物は、免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された重鎖可変領域(VDJ配列)核酸配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を有するように、遺伝子的に改変され、VDJ配列は、ヒトVDJ配列であり、定常領域遺伝子配列は、ヒトまたは非ヒトである。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物は、(1)再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第1のヌクレオチド配列は、軽鎖(例えば、κまたはλ軽鎖)定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第1のヌクレオチド配列と、(2)ヒトまたは非ヒト軽鎖(例えば、κまたはλ軽鎖)可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である)であって、第2のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第2のヌクレオチド配列と、を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、再構成された重鎖可変ドメインは、スペーサーを介して重鎖J遺伝子セグメント(JH)配列に作動可能に連結される重鎖V遺伝子セグメント(VH)配列を含み、スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む。そのゲノム中に(i)定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列と、(ii)1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物、例えば、マウス及びラットなどの齧歯動物が提供される。そのゲノム中に(i)定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列と、(ii)1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、可変領域遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変領域遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジン残基をコードする。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物を作製する方法が、提供される。重鎖の不在下で抗原に結合することができ、ならびに/または再構成された重鎖可変ドメインに関連付けられ、及び/もしくはpH依存性抗原結合特徴を示すことができる、免疫グロブリン軽鎖(例えば、κまたはλ軽鎖)可変領域配列を産生するための方法が提供され、これは、二重特異性抗体を産生するために有用である。
異なる免疫グロブリン遺伝子座中に定置することによって適用することができる。再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列は、再構成された重鎖可変ドメイン配列が、ヒトかまたは非ヒトかのいずれかの重鎖または軽鎖定常配列に作動可能に連結されることができるように、重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座に標的化されることができる。再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列は、ヒト、非ヒト、または混合ヒト/非ヒト免疫グロブリン定常領域配列との作動可能な連結において、ゲノム中のどこにでも定置することができる。さらに、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、免疫グロブリン遺伝子座の追加の遺伝子修飾と組み合わせる(例えば、免疫グロブリン遺伝子座の追加の遺伝子修飾を含む動物と異種交配する)ことができる。例えば、軽鎖遺伝子座に標的化される再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列によって付与される集中された多様化は、重鎖遺伝子座内に挿入される軽鎖可変ドメイン遺伝子配列と対にされることができ、それによって、選択されるゲノムコンテクストのタイミング及び多様化(例えば、重鎖遺伝子座の多様化メカニズム)を完全に利用する動物を生成して、選択される抗体可変遺伝子配列(例えば、抗体軽鎖可変遺伝子配列)の多様性を増加させることができる。それに加えて、制限された(限定された)軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー(例えば、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒトVL遺伝子セグメントを上述の単一の再構成された重鎖配列と組み合わせて含む、制限された数の軽鎖可変遺伝子配列)を有するマウスを利用することによって、免疫グロブリン重鎖可変ドメインとより効率的に対を成すことができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを産生することができる。
グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域領域遺伝子配列に作動可能に連結される。種々の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列中に存在する。種々の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、軽鎖定常領域遺伝子配列との作動可能な連結において軽鎖遺伝子を形成するように再構成することが可能な再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントの完全な補体を含む。他の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、複数であるが完全な補体より少ない(即ち、野生型より少ない数)の再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントを含む。種々の態様では、再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントは、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の態様では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。別の態様では、本明細書に記載されるように、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む(即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列、即ち、予め再構成された重鎖VDJ配列を含む)核酸構築物が提供される。
動物(例えば、マウス、ラット、またはハムスターなどの齧歯動物)であって、ヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト軽鎖(例えば、κまたはλ軽鎖)定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。
(a)第1の対立遺伝子であって、
(i)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)、及び
(ii)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である)、を含む、第1の対立遺伝子と、
(b)第2の対立遺伝子であって、
(i)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインをコードする第3のヌクレオチド配列(即ち、第3のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である)、及び
(ii)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第4のヌクレオチド配列(即ち、第4のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)、を含む、第2の対立遺伝子と、を含む免疫グロブリン遺伝子座を有する、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。
ロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物(例えば、マウス及びラットなどの齧歯動物)が、提供される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスCκ定常領域である。
可能に連結される、2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される構成されていないヒト免疫グロブリン
軽鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(c)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(c)の核酸配列を、第2の抗原またはそのエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(c)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法も提供される。
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(c)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(c)の核酸配列を、第2の抗原またはそのエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(c)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法も提供される。
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(c)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(c)の核酸配列を、第2の抗原またはそのエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(c)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法も提供される。
ブリン重鎖遺伝子座であって、定常領域遺伝子配列は、非ヒト配列、ヒト配列、またはそれらの組み合わせを含む、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。
(a)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及び及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
(b)ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性である非ヒト動物であって、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を優勢的に免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現する、非ヒト動物が提供される。
(a)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
(b)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物が提供される。
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。特定の実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする。幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロ
ブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖VH遺伝子セグメント、ヒト重鎖D遺伝子セグメント、及びヒト重鎖JH遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖VHセグメント、ヒト生殖系列重鎖Dセグメント、及びヒト生殖系列重鎖JHセグメントに由来する。特定の実施形態では、ヒトVH遺伝子セグメントは、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、ヒトD遺伝子セグメントは、D1−1、D1−7、D1−14、D1−20、D1−26、D2−2、D2−8、D2−15、D2−21、D3−3、D3−9、D3−10、D3−16、D3−22、D4−4、D4−11、D4−17、D4−23、D5−12、D5−5、D5−18、D5−24、D6−6、D6−13、D6−19、D6−25、D7−27、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、ヒトJH遺伝子セグメントは、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列中に存在する。幾つかの実施形態では、実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、非ヒト動物は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。
(1)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
(2)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座を提供する。
幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である。
あって、
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)ゲノム中に、
(i)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び
(ii)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、を定置することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖可変ドメインをコードする。幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖可変ドメインをコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。特定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。特定の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である。幾つかの実施形態では、修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。
D1−1、D1−7、D1−14、D1−20、D1−26、D2−2、D2−8、D2−15、D2−21、D3−3、D3−9、D3−10、D3−16、D3−22、D4−4、D4−11、D4−17、D4−23、D5−12、D5−5、D5−18、D5−24、D6−6、D6−13、D6−19、D6−25、D7−27、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、スペーサーは、D4−4またはその多型変異体の配列をコードする。特定の実施形態では、ヒトJH遺伝子セグメントは、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、ヒトJHセグメントは、JH4−4またはその多型変異体である。幾つかの実施形態では、再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする。幾つかの実施形態では、実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、非ヒト動物は、そのゲノムの異所性遺伝子座に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。
(a)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
(b)ゲノム中に、スペーサーを介して重鎖J遺伝子セグメント(JH)に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント(VH)を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含み、スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、修飾された重鎖遺伝子座は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。
(a)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(b)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、修飾された非ヒト動物を提供する。
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。特定の実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物である。特定の実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、IgM、IgD、IgG、IgE、IgA、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする齧歯動物定常領域配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、齧歯動物κまたはλ定常領域核酸配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、ヒト生殖系列VHセグメント、ヒト生殖系列Dセグメント、及びヒト生殖系列JHセグメントから選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、内在性遺伝子座において定常領域核酸配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、内在性遺伝子座において軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、2つ以下のヒト免疫グロブリン非再構成VL遺伝子セグメントと、1つ、2つ、または3つ以上のヒト非再構成JL遺伝子セグメントとを含む。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択されるヒト生殖系列VH遺伝子セグメントに由来する。特定のでは、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒト生殖系列VH3−23遺伝子セグメントに由来する。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、VH3−23/X1X2/Jの配列をコードし、X1は、任意のアミノ酸であり、X2は、任意のアミノ酸である。特定の実施形態では、X1は、Glyであり、X2は、Tyrである。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能性Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。特定の実施形態では、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方は、内在性Adam6遺伝子である。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方をゲノムの異所性遺伝子座に含む。幾つかの実施形態では、ヒト可変領域VL及びJL遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを再構成及びコードすることが可能である。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、2つのヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む。特定の実施形態では、遺伝子セグメントは、生殖系列遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、非ヒト動物は、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のヒトVL遺伝子セグメント、及び2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントが、内在性軽鎖遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの
少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、VL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、ヒスチジンコドンの付加、または対応するヒト生殖系列VLセグメント配列によってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、付加または置換されるヒスチジンコドンは、CDR3中に存在する。幾つかの実施形態では、ヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントであり、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、107位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、関心の抗原による刺激に際して、抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現し、抗原結合タンパク質は、ヒトVL及びJL遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含み、抗原結合タンパク質は、ヒトVL遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸位置に、少なくとも1つのヒスチジン残基を含む、請求項107に記載の非ヒト動物。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、抗原に応答して抗原結合タンパク質の集団を発現し、集団内の全ての抗原結合タンパク質は、(a)再構成されたヒト可変領域核酸配列に由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と、(b)非ヒト動物のゲノム中のヒトVL遺伝子セグメント及びJL遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖と、を含み、ヒトVL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及び/またはJH遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)非ヒト動物の修飾されたゲノム中に、
(i)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、ならびに
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメント、を定置することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物である。特定の実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列ならびにヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、野生型非ヒト動
物の対応するヌクレオチド配列またはその付近に定置される。幾つかの実施形態では、再構成された免疫グロブリンヒト重鎖可変領域核酸配列ならびにヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、ゲノム中の異所性遺伝子座に定置される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性Adam6a遺伝子,Adam6b遺伝子、またはその両方を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子,Adam6b遺伝子、またはその両方をゲノムの異所性遺伝子座に含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列は、ラットまたはマウスCκ定常領域核酸配列である。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、2つのヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態では、非ヒト動物は、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のヒトVL遺伝子セグメント、及び2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントは、内在性軽鎖遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、VL遺伝子セグメントのうちのすくなくとも1つは、ヒスチジンコドンの付加、または対応するヒト生殖系列VLセグメント配列によってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、付加または置換されるヒスチジンコドンは、CDR3中に存在する。特定の実施形態では、ヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントであり、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントのものであり、3つの非ヒスチジンコドン置換は、105位、106位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、107位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される。
(a)非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)ま
たはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(d)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法を提供する。
ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、細胞表面受容体は、Fc受容体である。またより特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域
核酸配列、及び
(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(d)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法を提供した。
ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、細胞表面受容体は、Fc受容体である。特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(d)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法を提供した。
ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖
系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、細胞表面受容体は、Fc受容体である。特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば、以下が提供される。
(項目1)
その生殖系列ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物。
(項目2)
前記非ヒト動物は、哺乳動物である、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目3)
前記哺乳動物は、齧歯動物である、項目2に記載の非ヒト動物。
(項目4)
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目3に記載の非ヒト動物。
(項目5)
前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列に関してホモ接合性である、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目6)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目7)
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、Fcをコードする、項目6に記載の非ヒト動物。
(項目8)
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目7に記載の非ヒト動物。
(項目9)
前記非ヒト動物は、齧歯動物であり、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目10)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される、項目6〜9のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目11)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖VH遺伝子セグメント、ヒト重鎖D遺伝子セグメント、及びヒト重鎖JH遺伝子セグメントに由来する、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目12)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖VHセグメント、ヒト生殖系列重鎖Dセグメント、及びヒト生殖系列重鎖JHセグメントに由来する、項目11に記載の非ヒト動物。
(項目13)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列をコードする、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目14)
実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目15)
前記非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、異所的に存在する、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目16)
前記再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、前記非ヒト動物に対して免疫原性ではない、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目17)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目18)
前記非ヒト動物は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖V遺伝子セグメント(VL)及び再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖J遺伝子セグメント(JL)をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目19)
前記再構成されていない軽鎖V遺伝子セグメント(VL)及び前記再構成されていない軽鎖(JL)遺伝子セグメントをコードする前記ヌクレオチド配列は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目18に記載の非ヒト動物。
(項目20)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、齧歯動物及びヒト定常領域遺伝子配列から選択される、項目19に記載の非ヒト動物。
(項目21)
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される、項目20に記載の非ヒト動物。
(項目22)
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖(VL)遺伝子セグメント及び前記再構成されていないヒト免疫グロブリン(JL)遺伝子セグメントは、内在性齧歯動物遺伝子座において、齧歯動物免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目18に記載の非ヒト動物。
(項目23)
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目24)
重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、非ヒト生殖細胞のゲノム中の非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、前記定常領域遺伝子配列は、非ヒト配列、ヒト配列、またはそれらの組み合わせを含む、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目25)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目24に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目26)
前記内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目25に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目27)
非ヒト動物を作製する方法であって、
(a)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
(b)前記ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含む、方法。
(項目28)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される、項目27に記載の方法。
(項目31)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する、項目27に記載の方法。
(項目32)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する、項目27に記載の方法。
(項目33)
前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目27に記載の方法。
(項目34)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目27に記載の方法。
(項目35)
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である、項目27に記載の方法。
(項目36)
項目24に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性である非ヒト動物であって、前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を優勢的に前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現する、非ヒト動物。
(項目37)
(a)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
(b)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む、非ヒト動物。
(項目38)
前記非ヒト動物は、哺乳動物である、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目39)
前記哺乳動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目38に記載の非ヒト動物。
(項目40)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目41)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目42)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目43)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目44)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目45)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目46)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする、項目44または45のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目47)
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目48)
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目49)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖VH遺伝子セグメント、ヒト重鎖D遺伝子セグメント、及びヒト重鎖JH遺伝子セグメントに由来する、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目50)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖VHセグメント、ヒト生殖系列重鎖Dセグメント、ヒト生殖系列重鎖JHセグメントに由来する、項目49に記載の非ヒト動物。
(項目51)
前記ヒトVH遺伝子セグメントは、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目49に記載の非ヒト動物。
(項目52)
前記ヒトD遺伝子セグメントは、D1−1、D1−7、D1−14、D1−20、D1−26、D2−2、D2−8、D2−15、D2−21、D3−3、D3−9、D3−10、D3−16、D3−22、D4−4、D4−11、D4−17、D4−23、D5−12、D5−5、D5−18、D5−24、D6−6、D6−13、D6−19、D6−25、D7−27、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目49に記載の非ヒト動物。
(項目53)
前記ヒトJH遺伝子セグメントは、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目49に記載の非ヒト動物。
(項目54)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目55)
前記遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、前記非ヒト動物の前記生殖系列中に存在する、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目56)
実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目57)
前記非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、前記非ヒト動物は、前記軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目58)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目59)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、前記非ヒト動物に対して免疫原性ではない、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目60)
前記遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、前記軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目61)
(1)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
(2)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座。
(項目62)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目61に記載の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座。
(項目63)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目61に記載の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座。
(項目64)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目61に記載の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座。
(項目65)
修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)前記ゲノム中に、
(i)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び
(ii)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、を定置することと、含む、方法。
(項目66)
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖可変ドメインをコードする、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖可変ドメインをコードする、項目65に記載の方法。
(項目68)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である、項目65に記載の方法。
(項目69)
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする、項目68または69に記載の方法。
(項目71)
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である、項目65に記載の方法。
(項目72)
前記修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、前記非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する、項目65に記載の方法。
(項目73)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目65に記載の方法。
(項目74)
スペーサーを介して重鎖Jセグメント(JH)配列に作動可能に連結される重鎖Vセグメント(VH)配列を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物であって、前記スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む、非ヒト動物。
(項目75)
前記非ヒト動物は、齧歯動物である、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目76)
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目75に記載の非ヒト動物。
(項目77)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目78)
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット定常領域遺伝子配列である、項目77に記載の非ヒト動物。
(項目79)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目80)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする、項目77〜79のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目81)
前記VH配列及び前記JH配列は、ヒトVH遺伝子セグメント及びヒトJH遺伝子セグメントに由来する、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目82)
前記ヒトVH遺伝子セグメントは、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目81に記載の非ヒト動物。
(項目83)
前記ヒトVH遺伝子セグメントは、VH3−23またはその多型変異体である、項目81に記載の非ヒト動物。
(項目84)
前記スペーサーは、ヒトD遺伝子セグメントに由来する配列をコードする、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目85)
前記ヒトD遺伝子セグメントは、D1−1、D1−7、D1−14、D1−20、D1−26、D2−2、D2−8、D2−15、D2−21、D3−3、D3−9、D3−10、D3−16、D3−22、D4−4、D4−11、D4−17、D4−23、D5−12、D5−5、D5−18、D5−24、D6−6、D6−13、D6−19、D6−25、D7−27、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目84に記載の非ヒト動物。
(項目86)
前記スペーサーは、D4−4またはその多型変異体の配列をコードする、項目84に記載の非ヒト動物。
(項目87)
前記ヒトJH遺伝子セグメントは、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目81に記載の非ヒト動物。
(項目88)
前記ヒトJHセグメントは、JH4−4またはその多型変異体である、項目81に記載の非ヒト動物。
(項目89)
前記再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目90)
実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の前記免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目91)
前記非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、前記非ヒト動物は、そのゲノムの異所性遺伝子座に、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目92)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、前記非ヒト動物に対して免疫原性ではない、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目93)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目94)
スペーサーを介して重鎖J遺伝子セグメント(JH)に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント(VH)を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、前記スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基をコードする、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目95)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目94に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目96)
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目95に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目97)
前記免疫グロブリン遺伝子座は、前記再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目94に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目98)
修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、
(a)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
(b)前記ゲノム中に、スペーサーを介して重鎖J遺伝子セグメント(JH)に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント(VH)を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含み、前記スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む、方法。
(項目99)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目98に記載の方法。
(項目100)
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される、項目98に記載の方法。
(項目102)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する、項目98に記載の方法。
(項目103)
前記修飾された重鎖遺伝子座は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目98に記載の方法。
(項目104)
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である、項目98に記載の方法。
(項目105)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目98に記載の方法。
(項目106)
前記修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、前記非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する、項目98に記載の方法。
(項目107)
そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、修飾された非ヒト動物。
(項目108)
前記非ヒト動物は、哺乳動物である、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目109)
前記哺乳動物は、齧歯動物である、項目108に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目110)
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目109に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目111)
前記重鎖定常領域核酸配列は、IgM、IgD、IgG、IgE、IgA、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする齧歯動物定常領域配列である、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目112)
前記軽鎖定常領域核酸配列は、齧歯動物κまたはλ定常領域核酸配列である、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目113)
前記再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、ヒト生殖系列VHセグメント、ヒト生殖系列Dセグメント、及びヒト生殖系列JHセグメントから選択される、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目114)
前記再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、内在性遺伝子座において前記定常領域核酸配列に作動可能に連結される、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目115)
前記1つ以上であるが前記野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、内在性遺伝子座において前記軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目116)
前記非ヒト動物は、2つ以下のヒト免疫グロブリン非再構成VL遺伝子セグメントと、1つ、2つ、または3つ、または3つ以上のヒト非再構成JL遺伝子セグメントとを含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目117)
前記ヒト生殖系列VH遺伝子セグメントは、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目113に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目118)
前記ヒト生殖系列VH遺伝子セグメントは、VH3−23遺伝子セグメントである、項目113に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目119)
前記再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目120)
前記再構成された重鎖可変領域核酸配列は、VH3−23/X1X2/Jの配列をコードし、X1は、任意のアミノ酸であり、X2は、任意のアミノ酸である、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目121)
X1は、Glyであり、X2は、Tyrである、項目120に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目122)
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能性Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目123)
前記Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方は、内在性Adam6遺伝子である、項目122に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目124)
前記修飾された非ヒト動物は、前記ゲノムの異所性遺伝子座にAdam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目125)
前記ヒト可変領域VL及びJL遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを再構成及びコードすることが可能である、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目126)
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、2つのヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目127)
前記遺伝子セグメントは、生殖系列遺伝子セグメントである、項目126に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目128)
前記非ヒト動物は、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む、項目126に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目129)
2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のヒトVL遺伝子セグメント、及び2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントが、内在性軽鎖遺伝子座に存在する、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目130)
前記ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目131)
前記VL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、ヒスチジンコドンの付加、または前記対応するヒト生殖系列VLセグメント配列によってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目132)
前記付加または置換されるヒスチジンコドンは、CDR3中に存在する、項目131に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目133)
前記ヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントであり、前記ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、前記ヒスチジンコドンでの置換を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目134)
前記置換は、前記ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目133に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目135)
前記置換は、前記ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目133に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目136)
前記置換は、前記ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目133に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目137)
前記置換は、前記ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、107位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目133に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目138)
前記非ヒト動物は、関心の抗原による刺激に際して、前記抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現し、前記抗原結合タンパク質は、前記ヒトVL及びJL遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含み、前記抗原結合タンパク質は、前記ヒトVL遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸位置に、少なくとも1つのヒスチジン残基を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目139)
前記非ヒト動物は、抗原に応答して抗原結合タンパク質の集団を発現し、前記集団内の全ての抗原結合タンパク質は、(a)前記再構成されたヒト可変領域核酸配列に由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と、(b)前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記ヒトVL遺伝子セグメント及び前記JL遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖と、を含み、前記ヒトVL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、前記対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目140)
修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及び/またはJH遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)前記非ヒト動物の前記修飾されたゲノム中に、
(i)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、ならびに
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメント、を定置することと、を含む、方法。
(項目141)
前記非ヒト動物は、齧歯動物である、項目140に記載の方法。
(項目142)
前記齧歯動物は、マウス、ラット、またはハムスターである、項目141に記載の方法。
(項目143)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目140に記載の方法。
(項目144)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列ならびに前記ヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、前記野生型非ヒト動物の対応するヌクレオチド配列またはその付近に定置される、項目140に記載の方法。
(項目145)
前記再構成された免疫グロブリンヒト重鎖可変領域核酸配列ならびに前記ヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に定置される、項目140に記載の方法。
(項目146)
前記非ヒト動物は、内在性Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、項目140に記載の方法。
(項目147)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を前記ゲノムの異所性遺伝子座に含む、項目140に記載の方法。
(項目148)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする、項目140に記載の方法。
(項目149)
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列は、ラットまたはマウスCκ定常領域核酸配列である、項目140に記載の方法。
(項目150)
前記ヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを再構成及びコードすることが可能である、項目140に記載の方法。
(項目151)
前記非ヒト動物は、2つのヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む、項目140に記載の方法。
(項目152)
前記非ヒト動物は、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む、項目151に記載の方法。
(項目153)
2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のヒトVL遺伝子セグメント、及び2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントが、内在性軽鎖遺伝子座に存在する、項目140に記載の方法。
(項目154)
前記ヒト免疫グロブリン軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目140に記載の方法。
(項目155)
前記VL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、ヒスチジンコドンの付加、または前記対応するヒト生殖系列VLセグメント配列によってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む、項目140に記載の方法。
(項目156)
前記付加または置換されるヒスチジンコドンは、CDR3中に存在する、項目155に記載の方法。
(項目157)
前記ヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントであり、前記ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、前記ヒスチジンコドンでの前記置換を含む、項目155に記載の方法。
(項目158)
前記置換は、前記ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目157に記載の方法。
(項目159)
前記置換は、前記ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目157に記載の方法。
(項目160)
前記置換は、前記ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目157に記載の方法。
(項目161)
前記置換は、前記ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、107位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目157に記載の方法。
(項目162)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)前記免疫付与された非ヒト動物から、前記抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記細胞から、前記抗原に結合することができる前記軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法。
(項目163)
単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される、項目162に記載の方法。
(項目164)
前記抗原に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を含む前記細胞は、リンパ球である、項目162に記載の方法。
(項目165)
前記リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む、項目164に記載の方法。
(項目166)
前記方法は、(c)’前記リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む、項目162に記載の方法。
(項目167)
前記癌細胞は、骨髄腫細胞である、項目166に記載の方法。
(項目168)
前記(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される、項目162に記載の方法。
(項目169)
前記軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である、項目162に記載の方法。
(項目170)
前記重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である、項目162に記載の方法。
(項目171)
前記(d)の核酸配列は、前記動物の前記ゲノム中の前記再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む、項目162に記載の方法。
(項目172)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び、
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)前記非ヒト動物から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記(c)の細胞から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
(e)前記(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)前記(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が前記(d)の核酸によってコードされ、前記重鎖から独立して前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が前記第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法。
(項目173)
前記ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目172に記載の方法。
(項目174)
前記第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目172に記載の方法。
(項目175)
前記細胞表面受容体は、Fc受容体である、項目174に記載の方法。
(項目176)
前記Fc受容体は、FcRnである、項目175に記載の方法。
(項目177)
前記第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する、項目172に記載の方法。
(項目178)
前記第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目172に記載の方法。
(項目179)
前記第1の抗原は、Fc受容体であり、前記第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、前記抗原結合タンパク質は、前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記VL遺伝子セグメントに由来する1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む、項目172に記載の方法。
(項目180)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)前記免疫付与された非ヒト動物から、前記抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記細胞から、前記抗原に結合することができる前記軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法。
(項目181)
単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される、項目180に記載の方法。
(項目182)
前記抗原に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を含む前記細胞は、リンパ球である、項目180に記載の方法。
(項目183)
前記リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む、項目182に記載の方法。
(項目184)
前記方法は、(c)’前記リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む、項目180に記載の方法。
(項目185)
前記癌細胞は、骨髄腫細胞である、項目184に記載の方法。
(項目186)
前記(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される、項目180に記載の方法。
(項目187)
前記軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である、項目180に記載の方法。
(項目188)
前記重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である、項目180に記載の方法。
(項目189)
前記(d)の核酸配列は、前記動物の前記ゲノム中の前記再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む、項目180に記載の方法。
(項目190)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)前記免疫付与された非ヒト動物から、前記抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記細胞から、前記抗原に結合することができる前記軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法。
(項目191)
単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される、項目190に記載の方法。
(項目192)
前記抗原に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を含む前記細胞は、リンパ球である、項目190に記載の方法。
(項目193)
前記リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む、項目192に記載の方法。
(項目194)
前記方法は、(c)’前記リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む、項目190に記載の方法。
(項目195)
前記癌細胞は、骨髄腫細胞である、項目194に記載の方法。
(項目196)
前記(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される、項目190に記載の方法。
(項目197)
前記軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である、項目190に記載の方法。
(項目198)
前記重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である、項目190に記載の方法。
(項目199)
前記(d)の核酸配列は、前記動物の前記ゲノム中の前記再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む、項目190に記載の方法。
(項目200)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)前記非ヒト動物から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記(c)の細胞から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
(e)前記(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)前記(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が前記(d)の核酸によってコードされ、前記重鎖から独立して前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が前記第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法。
(項目201)
前記ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目200に記載の方法。
(項目202)
前記第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目200に記載の方法。
(項目203)
前記細胞表面受容体は、Fc受容体である、項目202に記載の方法。
(項目204)
前記Fc受容体は、FcRnである、項目203に記載の方法。
(項目205)
前記第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する、項目200に記載の方法。
(項目206)
前記第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目200に記載の方法。
(項目207)
前記第1の抗原は、Fc受容体であり、前記第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、前記抗原結合タンパク質は、前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記VL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む、項目200に記載の方法。
(項目208)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)前記非ヒト動物から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記(c)の細胞から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
(e)前記(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)前記(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が前記(d)の核酸によってコードされ、前記重鎖から独立して前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が前記第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法。
(項目209)
前記ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目208に記載の方法。
(項目210)
前記第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目208に記載の方法。
(項目211)
前記細胞表面受容体は、Fc受容体である、項目210に記載の方法。
(項目212)
前記Fc受容体は、FcRnである、項目211に記載の方法。
(項目213)
前記第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する、項目208に記載の方法。
(項目214)
前記第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目208に記載の方法。
(項目215)
前記第1の抗原は、Fc受容体であり、前記第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、前記抗原結合タンパク質は、前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記VL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む、項目208に記載の方法。
体を含む。二重特異性抗体は概して、2つの非同一の重鎖を含み、各重鎖は、異なる分子(例えば、2つの異なる免疫原上の異なるエピトープ)上か、または同一の分子(例えば、同一の免疫原上の異なるエピトープ)上かのいずれかで、異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が、2つの異なるエピトープ(第1のエピトープ及び第2のエピトープ)を選択的に結合することが可能な場合、第1のエピトープに対する第1の重鎖の親和性は、概して、第2のエピトープに対する第1の重鎖の親和性よりも少なくとも1〜2、または3、または4桁以上小さく、逆もまた同様となる。二重特異性抗体によって特異的に結合されるエピトープは、同一または異なる標的上(例えば、同一または異なるタンパク質上)であることができる。例示的な二重特異性抗体としては、腫瘍抗原に特異的な第1の重鎖と、細胞毒性マーカー、例えば、Fc受容体(例えば、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIなど)、またはT細胞マーカー(例えば、CD3、CD28など)に特異的な第2の重鎖とを有するものが挙げられる。さらに、第2の重鎖可変ドメインは、異なる所望の特異性を有する重鎖可変ドメインで置換されることができる。例えば、腫瘍抗原に特異的な第1の重鎖と毒素に特異的な第2の重鎖とを有する二重特異性抗体は、毒素(例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど)を腫瘍細胞へ送達するように対にされることができる。他の例示的な二重特異性抗体としては、活性化受容体(例えば、B細胞受容体、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcαRI、T細胞受容体など)に特異的な第1の重鎖と、抑制性受容体(例えば、FcγRIIB、CD5、CD22、CD72、CD300aなど)に特異的な第2の重鎖とを有するものが挙げられる。かかる二重特異性抗体は、細胞活性化(例えば、アレルギー及び喘息)に関連付けられる治療条件のために構築することができる。二重特異性抗体は、例えば、同一の免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同一の免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同一または異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列と融合させることができ、かかる配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞中に発現させることができる。典型的な二重特異性抗体は、3つの重鎖CDR、及びそれに続く(N末端からC末端へ)CH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを各々有する2つの重鎖と、エピトープ結合特異性を付与しないが、各重鎖に関連することができるか、または各重鎖に関連することができ、重鎖エピトープ結合領域によって結合されるエピトープのうちの1つ以上に結合することができるか、または各重鎖に関連することができ、重鎖のうちの一方または両方の一方または両方のエピトープへの結合を可能にする免疫グロブリン軽鎖とを有する。同様に、用語「三重特異性抗体」は、3つ以上のエピトープを選択的に結合することが可能な抗体を含む。
は、細胞は、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞(例えば、PER.C6(商標)細胞)など、1つ以上のウイルス遺伝子を含む。
モルまたはピコモル範囲内のKDを要することが多い。
ドメイン、及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖可変ドメインは、概して、生殖系列中に存在するV及びJセグメントのレパートリーに由来するVL及びJLセグメントを含む、軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされる。種々の有機体に関するV及びJ軽鎖セグメントに関する配列、場所、及び述語体系は、IMGTデータベース、www.imgt.orgに見出すことができる。軽鎖としては、例えば、その中にそれらが出現するエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される第1かまたは第2かのいずれかのエピトープを、選択的に結合しないものが挙げられる。軽鎖としてはまた、その中にそれらが出現するエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される1つ以上のエピトープに結合及び認識するか、または重鎖がそれらに結合及び認識するのを助けるものが挙げられる。共通のまたはユニバーサルな軽鎖としては、ヒトVκ1−39Jκ5遺伝子またはヒトVκ3−20Jκ1遺伝子に由来するものが挙げられ、またそれらの体細胞変異された(例えば、親和性成熟された)バージョンが挙げられる。二重軽鎖(DLC)としては、2つ以下のヒトVκセグメント、例えば、ヒトVκ1−39遺伝子セグメント及びヒトVκ3−20遺伝子セグメントを含む軽鎖遺伝子座に由来するものが挙げられ、またそれらの体細胞変異された(例えば、親和性成熟された)バージョンが挙げられる。
含んでもよい。
二重の抗原結合特性を有する多様な二重特異性抗体が開発されてきたが、従来の二重特異性抗体では、重鎖かまたは軽鎖かのいずれかの可変領域のみが各別々の抗原決定基の結合に寄与しているのに対し、標準的な抗体では、軽鎖と重鎖との両方の可変領域が同一の抗原決定基の結合に寄与することができるため、従来の二重特異性抗体における軽鎖または重鎖可変領域の特異性及び親和性は、ある程度犠牲にされなければならなかった。
的に有する動物(例えば、マウス)を(例えば、相同的組み換え媒介遺伝子の標的化によって)作製することを可能にする。何故なら、部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座は、正常に再構成、超変異、及び体細胞変異(例えば、クラススイッチ)するため、部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト可変領域を含む動物において抗体を生成する。これらの動物は、野生型動物に実質的に類似の体液性免疫系を示し、−動物が、ヒト可変領域遺伝子セグメントの完全なレパートリーを欠損している場合であっても−正常な細胞集団及び正常なリンパ器官構造を見せる。これらの動物(例えば、マウス)を免疫付与することは、可変遺伝子セグメント利用の幅広い多様性を見せる強固な体液性応答をもたらす。可変領域をコードするヌクレオチド配列は、特定及びクローン化され、次に、例えば、特定の使用に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプなどの任意の選択された配列と(例えば、インビトロシステムにおいて)融合されることができ、ヒト配列に完全に由来する抗体または抗原結合タンパク質をもたらすことができる。
免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、重鎖定常ドメインに作動可能に連結される再構成された重鎖可変ドメインの2つのコピー、3つのコピー、4つのコピー、またはそれ以上をコードするヌクレオチド配列を含むように、修飾される。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーをコードする。例えば、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つのコピーをコードすることができる。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のコピーをコードする。幾つかの実施形態では、遺伝子座は、重鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。
ば、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、2つのヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む。幾つかの実施形態では、1つ以上(例えば、2、3、4、または5つ)のヒトVL遺伝子セグメント及び2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントは、内在性軽鎖遺伝子座に、例えば、内在性カッパ軽鎖遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、マウスは、機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、マウスは、非機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、1つ以上のヒトVH、1つ以上のヒトDH、及び1つ以上のヒトJH遺伝子セグメントは、マウスまたはラット重鎖定常領域配列に作動可能に連結される。
通またはユニバーサルな重鎖配列)は、再構成された重鎖配列を、カッパかまたはラムダかのいずれかの、マウス軽鎖遺伝子座中へ標的化することによって、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されることができる。したがって、他の実施形態でのように、この遺伝子的に改変された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。重鎖定常領域遺伝子配列との作動可能な連結においてヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、参照により本明細書に援用される米国付与前公開第2012/0096572号に記載される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、マウスまたはラットκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、マウスまたはラットλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。
子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、脾臓中のT1相における増加された細胞の頻度を有する。
9S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(例えば、Festing et al.(1999)Revised nomenclature for strain
129 mice,Mammalian Genome 10:836を参照、同様にAuerbach et al.(2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv− and C57BL/6−Derived Mouse Embryonic Stem Cell Linesも参照)から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾されたマウスは、前述の129系と前述のC57BL系(例えば、C57BL/6系)との混合である。別の実施形態では、マウスは、前述の129系の混合、または前述のC57BL/6系の混合である。幾つかの実施形態では、混合の129系は、129S6(129/SvEvTac)系である。別の実施形態では、マウスは、129/SvEv由来系とC57BL/6由来系との混合である。特定の実施形態では、マウスは、Auerbach et al.2000 BioTechniques 29:1024−1032に記載されるように、129/SvEv由来系とC57BL/6由来系との混合である。別の実施形態では、マウスは、BALB系、例えば、BALB/c系である。別の実施形態では、マウスは、BALB系(例えば、BALB/c系)と前述の別の系との混合である。
0−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、ヒトVセグメントは、VH3−23またはその多型変異体である。種々の実施形態では、本明細書に記載されるように、ヒトD遺伝子セグメントは、D1−1、D1−7、D1−14、D1−20、D1−26、D2−2、D2−8、D2−15、D2−21、D3−3、D3−9、D3−10、D3−16、D3−22、D4−4、D4−11、D4−17、D4−23、D5−12、D5−5、D5−18、D5−24、D6−6、D6−13、D6−19、D6−25、D7−27、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、ヒトまたは非ヒト動物重鎖定常領域配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態では、定常領域配列は、CH1、ヒンジ、CH2、及びCH3を含む。種々の実施形態では、本明細書に記載されるように、ヒトJ遺伝子セグメントは、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列をコードする(配列番号137)。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列から発現される再構成された重鎖可変ドメインは、ヒトVH3−23/X1X2/Jの配列を含む(X1は、任意のアミノ酸であり、X2は、任意のアミノ酸である)。幾つかの実施形態では、X1は、Glyであり、X2は、Tyrである。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインは、ヒトVH3−23/X1X2/JH4−4の配列を含む(X1は、任意のアミノ酸であり、X2は、任意のアミノ酸である)。幾つかの実施形態では、X2は、フェニル基を含むアミノ酸である。特定の実施形態では、X2は、Tyr及びPheから選択される。
生型と異なる−免疫付与に応答して生成される可変領域は、完全にヒトである。VELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウスは、重鎖及びκ軽鎖に関する免疫グロブリン遺伝子セグメントが、ヒト及びマウスにおいて類似して再構成するため、可能である。遺伝子座は、同一ではないが十分に類似しており、その結果、重鎖可変遺伝子遺伝子座のヒト化は、全てのVH、D、及びJH遺伝子セグメントを含有する約3百万の塩基対の連続したマウス配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの基本的に等価の配列をカバーする約百万の塩基の連続したヒトゲノム配列で置き換えることによって達成することができる。例えば、幾つかの実施形態では、Dセグメントは、抗原で免疫付与されたVELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウスの成熟B細胞中に発現される重鎖に由来し、Dセグメントは、2つ以下のアミノ酸を重鎖CDR3配列に送る。
列に作動可能に連結される。再構成された重鎖可変ドメインをコードする免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む(即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む)VELOCIMMUNE(登録商標)マウスは、本明細書に記載される態様、実施形態、方法などのいずれにおいても使用することができる。
及び/もしくはEU付番方式による428位(Kabat付番方式による459位)における修飾、またはEU付番方式による307位(Kabat付番方式による326位)もしくはEU付番方式による308位(Kabat付番方式による327位)(例えば、308F、V308F)、及びEU付番方式による434位(Kabat付番方式による465位)における修飾を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。1つの実施形態では、修飾は、EU付番方式による428L(例えば、M428L)及び434S(例えば、N434S)修飾(Kabat付番方式による459、例えば、M459L、及び465S(例えば、N465S)修飾)、EU付番方式による428L、259I(例えば、V259I)、及び308F(例えば、V308F)修飾(Kabat付番方式による459L、272I(例えば、V272I)、及び327F(例えば、V327F)修飾)、EU付番方式による433K(例えば、H433K)及び434(例えば、434Y)修飾(Kabat付番方式による464K(例えば、H464K)及び465(例えば、465Y)修飾)、EU付番方式による252、254、及び256(例えば、252Y、254T、及び256E)修飾(Kabat付番方式による265、267、269(例えば、265Y、267T、及び269E)修飾)、EU付番方式による250Q及び428L修飾(例えば、T250Q及びM428L)(Kabat付番方式による263Q及び459L修飾、例えば、T263Q及びM459L)、ならびにEU付番方式による307及び/または308修飾(例えば、307Fまたは308P)(Kabat付番方式による326及び/または327修飾、例えば、326Fまたは308P)を含み、修飾は、酸性環境(例えば、pHが約5.5〜約6.0にわたるエンドソーム内)でのFcRnに対する重鎖定常領域アミノ酸配列の親和性を増加させる。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU付番方式による252位〜257位のアミノ酸残基の間の少なくとも1つの修飾(即ち、Kabat付番方式によるアミノ酸265位〜270位の間の少なくとも1つの修飾)を含むヒトCH2アミノ酸配列をコードし、修飾は、酸性環境(例えば、pHが約5.5〜約6.0にわたるエンドソーム内)でのFcRnに対するヒトCH2アミノ酸配列の親和性を増加させる。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、307位〜311位のアミノ酸残基の間の少なくとも1つの修飾(即ち、Kabat付番方式によるアミノ酸326位〜330位の間の少なくとも1つの修飾)を含むヒトCH2アミノ酸配列をコードし、修飾は、酸性環境(例えば、pHが約5.5〜約6.0にわたるエンドソーム内)でのFcRnに対するCH2アミノ酸配列の親和性を増加させる。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトCH3アミノ酸配列をコードし、CH3アミノ酸配列は、EU付番方式による433位〜436位のアミノ酸残基の間の少なくとも1つの修飾(即ち、Kabat付番方式による464位〜467位のアミノ酸残基の間の少なくとも1つの修飾)を含み、修飾は、酸性環境(例えば、pHが約5.5〜約6.0にわたるエンドソーム内)でのFcRnに対するCH3アミノ酸配列の親和性を増加させる。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU付番方式によるM428L(Kabat付番方式459)、EU付番方式によるN434S(Kabat付番方式による465)、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU付番方式によるM428L(Kabat付番方式によるM459L)、EU付番方式によるV259I(Kabat付番方式によるV272I)、EU付番方式によるV308F(Kabat付番方式によるV327)、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU付番方式によるN434A変異(Kabat付番方式によるN465A変異)を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU付番方式によるM252Y(Kabat付番方式によるM265Y)、EU付番方式によるS254T(Kabat付番方式によるS267T)、EU付番方式によるT256E(Kabat付番方式によるT269E)、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列を
コードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU付番方式によるT250Q(Kabat付番方式によるT263Q)、EU付番方式によるM428L(Kabat付番方式によるM459L)、またはその両方から成る群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU付番方式によるH433K(Kabat付番方式によるH464K)、EU付番方式によるN434Y(Kabat付番方式によるN465Y)、またはその両方から成る群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
2、またはヒトIgG4ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列(EU付番方式に従う228〜236位のアミノ酸残基、Kabat付番方式に従う241〜249位のアミノ酸位置)と組み合わせて含むことができる。幾つかの実施形態では、キメラヒンジ領域は、ヒトIgG1またはヒトIgG4上部ヒンジに由来するアミノ酸残基、及びヒトIgG2下部ヒンジに由来するアミノ酸残基を含む。
異所性の場所に(例えば、そのゲノム中の内在性免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座に、またはその内在性遺伝子座中、例えば、内在性遺伝子座がゲノム中の異なる場所に定置もしくは移動される免疫グロブリン可変領域遺伝子座中に)含む。幾つかの実施形態では、例えば、全ての内在性機能性重鎖V、D、またはJ遺伝子セグメントの約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上、または約99%以上が、欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、例えば、内在性機能性重鎖V、D、またはJ遺伝子セグメントの少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%が、欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、カッパかまたはラムダかのいずれかの、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。
れていないヒト免疫グロブリンJ(JL)遺伝子セグメントは、齧歯動物免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子、例えば、κまたはλ軽鎖定常領域遺伝子に、内在性齧歯動物遺伝子座にて作動可能に連結される
設計される。またさらなる実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、107位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒトVL遺伝子セグメント、及び1つ以上、例えば、2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントを含み、ヒトVL遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってはコードされない少なくとも1つのヒスチジンコドンを含む。種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物は、関心の抗原による刺激に際して、ヒトVL遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を発現し、抗原結合タンパク質は、ヒトVL遺伝子セグメント内に導入される少なくとも1つのヒスチジンコドンによってコードされるアミノ酸位置に、少なくとも1つのヒスチジン残基を保持する。幾つかの実施形態では、動物は、抗原に応答して、抗原結合タンパク質の集団を発現し、集団内の全ての抗原結合タンパク質は、(a)ヒトVL遺伝子セグメント及びJL遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ヒトVL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つが、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、(b)再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされるヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と、を含む。
る。幾つかの実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、スペーサーは、単一のアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、2つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、3つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、4つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、5つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、6つのアミノ酸残基である。
えば、マウス)は、血液脳関門を横断することが可能な部分(例えば、トランスフェリン受容体)に対する低親和性抗体を作製するために使用され、低親和性抗体は、二重特異性であり、所望の標的に対する第2の結合特異性を含む(即ち、抗体は、横断部分に結合し、また横断部分とは異なる標的も結合する)。
することを含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、異所的に(例えば、そのゲノム中の内在性免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座に、またはその内在性遺伝子座中、例えば、内在性遺伝子座がゲノム中の異なる場所に定置もしくは移動される免疫グロブリン可変遺伝子座中に)存在する。幾つかの実施形態では、例えば、全ての内在性機能性V、D、またはJ遺伝子セグメントの約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上、または約99%以上が、欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、例えば、内在性機能性重鎖V、D、またはJ遺伝子セグメントの少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%が、欠失させられるか、または非機能性にされる。
構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、マウスまたはラットλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、κ軽鎖可変ドメインである。したがって、幾つかの実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、ヒトカッパ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、λ軽鎖可変ドメインである。したがって、幾つかの実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、ヒトラムダ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。
施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、内在性の場所(即ち、ヌクレオチド配列は、野生型非ヒト動物において配置される所)に存在する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、異所的に(例えば、そのゲノム中の内在性免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座に、またはその内在性遺伝子座中、例えば、内在性遺伝子座がゲノム中の異なる場所に定置もしくは移動される免疫グロブリン可変遺伝子座中に)存在する。幾つかの実施形態では、スペーサーは、単一のアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、2つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、3つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、4つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、5つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、6つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、重鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の2つのコピー、3つのコピー、4つのコピー、またはそれ以上をコードする。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、重鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーをコードする。
(a)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
(b)非ヒト動物のゲノム中に、軽鎖定常領域ヌクレオチド配列への作動可能な連結において再構成されたヒト重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスCκ定常領域である。
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖V、D、及び/またはJ遺伝子セグメント、
ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)非ヒト動物のゲノム中に、
(i)再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第1のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第1のヌクレオチド配列、及び
(ii)ヒトまたは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第2のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第2のヌクレオチド配列、を定置することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスCκ定常領域である。幾つかの実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖V、D、及び/またはJ遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)非ヒト動物のゲノム中に、
(i)再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第1のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第1のヌクレオチド配列、及び
(ii)軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第2のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第2のヌクレオチド配列、を定置することと、を含む、方法が提供される。
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖V、D、及び/またはJ遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)非ヒト動物のゲノム中に、
(i)第1の対立遺伝子であって、
(1)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成
されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)、及び
(2)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である)、を含む、第1の対立遺伝子と、
(ii)第2の対立遺伝子であって、
(1)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインをコードする第3のヌクレオチド配列(即ち、第3のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である)、及び
(2)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第4のヌクレオチド配列(即ち、第4のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)、を含む、第2の対立遺伝子と、を定置することと、を含む、方法が提供される。
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖V、D、及び/またはJ遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)非ヒト動物のゲノム中に、
(i)重鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び
(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント、を定置することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスCκ定常領域である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖V、D、及び/またはJ遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)非ヒト動物のゲノム中に、
(i)軽鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、ならびに
(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメント、を定置することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスCκ定常領域である。
であり、X2は、任意のアミノ酸である)を含む再構成された重鎖可変ドメインをコードする。幾つかの実施形態では、X2は、フェニル基を含むアミノ酸である。特定の実施形態では、X2は、Tyr及びPheから選択される。幾つかの実施形態では、核酸配列は、ヒトまたは非ヒト動物軽鎖定常領域遺伝子配列をさらに含む。
を介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。幾つかの実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。
(a)非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、マウスカッパ配列またはマウスラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ラットカッパ配列またはラットラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラットである。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
(a)非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する
軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、マウスカッパ配列またはマウスラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ラットカッパ配列またはラットラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラットである。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
(a)非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、マウスカッパ配列またはマウスラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ラットカッパ配列またはラットラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラットである。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
(a)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に
、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球(例えば、B細胞)を採取することと、
(d)リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することと、
(e)ハイブリドーマ細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
(a)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)重鎖可変領域から独立して抗原に結合するVLアミノ酸配列を発現する免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球(例えば、B細胞)を特定することと、
(c)のリンパ球から、(c)のVLアミノ酸配列をコードする核酸配列をクローン化することと、を含む、方法が提供される。
(a)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第1のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第1のヌクレオチド配列と、(ii)ヒトまたは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である)であって、第2のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第2のヌクレオチド配列、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球(例えば、B細胞)を採取することと、
(d)リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することと、
(e)ハイブリドーマ細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
(a)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第1のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第1のヌクレオチド配列と、(ii)ヒトまたは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていな
いヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である)であって、第2のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第2のヌクレオチド配列、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)重鎖可変領域から独立して抗原に結合するVLアミノ酸配列を発現する免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球(例えば、B細胞)を特定することと、
(c)のリンパ球から、(c)のVLアミノ酸配列をコードする核酸配列をクローン化することと、を含む、方法が提供される。
(a)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球(例えば、B細胞)を採取することと、
(d)リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することと、
(e)ハイブリドーマ細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
(a)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)重鎖可変領域から独立して抗原に結合するVLアミノ酸配列を発現する免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球(例えば、B細胞)を特定することと、
(c)のリンパ球から、(c)のVLアミノ酸配列をコードする核酸配列をクローン化することと、を含む、方法が提供される。
載される方法によって産生される軽鎖可変領域、及びかかる軽鎖可変領域をコードする核酸配列も提供される。
ば、小胞体、ゴルジ、エンドソーム、リソソームなどの細胞内成分の内部で結合する。細胞表面に発現される標的分子の例としては、細胞表面に発現される受容体、膜結合リガンド、イオンチャネル、及び細胞膜に付着するか、または細胞膜に関連付けられる細胞外部分を有する任意の他の単量体または多量体ポリペプチド成分が挙げられる。本明細書に提供される多重特異性抗原結合分子によって標的化されることができる非限定的で例示的な細胞表面に発現される標的分子としては、例えば、サイトカイン受容体(例えば、IL−1、IL−4、IL−6、IL−13、IL−22、IL−25、IL−33などに対する受容体)、及びPRLRなどの他のタイプ1膜貫通受容体、GCGRなどのG−タンパク質共役型受容体、Nav1.7、ASIC1、またはASIC2などのイオンチャネル、MHC−Iなどの非受容体表面タンパク質(例えば、HLA−B*27)を含む細胞表面標的などが挙げられる。Tが細胞表面に発現される標的タンパク質である実施形態では、多重特異性抗原結合分子のD1成分は、例えば、細胞表面に発現される標的タンパク質と特異的に相互作用するT、またはリガンドもしくはリガンドの一部分に特異的に結合する、抗体または抗体の抗原結合断片であることができる。例えば、TがIL−4Rである場合、D1成分は、IL−4またはその受容体結合部分を含むか、またはIL−4またはその受容体結合部分から成ることができる。可溶性標的分子の例としては、サイトカイン、成長因子、ならびに他のリガンド及びシグナルタンパク質が挙げられる。本明細書に提供される多重特異性 抗原結合 分子によって標的化されることができる非限定的で例示的な可溶性標的タンパク質としては、例えば、IL−1、IL−4、IL−6、IL−13、IL−22、IL−25、IL−33、SOST、DKK1などが挙げられる。可溶性標的分子としてはまた、例えば、アレルゲン(例えば、Fel D1、Betv1、CryJ1)、病原体(例えば、カンジダアルビカンス、黄色ブドウ球菌など)などの非ヒト標的分子、及び病原性分子(例えば、リポ多糖類(LPS)、リポテコイック酸(LTA)、タンパク質A、毒素など)が挙げられる。Tが可溶性標的分子である実施形態では、多重特異性抗原結合分子のD1成分は、例えば、可溶性標的分子と特異的に相互作用するT、または受容体もしくは受容体の一部分に特異的に結合する、抗体または抗体の抗原結合断片であることができる。例えば、TがIL−4である場合、D1成分は、IL−4Rまたはそのリガンド結合部分を含むか、またはIL−4Rまたはそのリガンド結合部分から成ることができる。標的分子としてはまた、腫瘍関連抗原も挙げられる。
マウスまたはラット、カッパまたはラムダ)に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列(例えば、マウスまたはラット、カッパまたはラムダ)に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、ヒト軽鎖可変領域(VL)配列は、カッパ遺伝子配列である。
(a)本明細書に記載される第1の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第1の非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、第1の非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、免疫付与することと、
(b)第1の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された第1の非ヒト動物から、第1のリンパ球(例えば、B細胞)を採取することであって、第1のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト可変ドメインを含む、採取することと、
(d)親和性成熟された抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
(e)(d)の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列(例えば、ヒトラムダまたはカッパ配列)と共に第1の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第1のポリペプチド遺伝子を形成することと、
(f)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第2の非ヒト動物を、第2の関心の抗原で免疫付与することであって、第2の非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)非ヒト重鎖定常領域核酸配列に連結される再構成されていないヒトV、D、及びJ遺伝子セグメント、及び(ii)単一の再構成されたヒト軽鎖可変領域配列、を含む、免疫付与することと、
(g)第2の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(h)免疫付与された第2の非ヒト動物から、第2のリンパ球を採取することであって、第2のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト重鎖可変ドメインを含む、採取することと、
(i)第2の抗原に特異的に結合する親和性成熟された抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
(j)(i)の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列(例えば、ヒトIgG1定常配列)と共に第2の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第2のポリペプチド遺伝子を形成することと、
(k)第1の発現構築物及び第2の発現構築物を、第1のポリペプチド遺伝子及び第2のポリペプチド遺伝子を発現するのに好適な細胞内へ導入して、第2のポリペプチドの二量体を含む抗原結合タンパク質を形成することであって、第2のポリペプチドの各単量体は、第1のポリペプチドの単量体に関連付けられる、形成することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、第1の発現構築物及び第2の発現構築物は、別々のベクター上にある。種々の実施形態では、第1の発現構築物及び第2の発現構築物は、同一のベクター上にある。種々の実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、異なる。1つの実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、同一である。種々の実施形態では、第1の抗原は、細胞表面受容体であり、第2の抗原は、細胞表面に結合された可溶性抗原及び抗原から選択される。特定の実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体(例えば、FcRN)であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
(a)本明細書に記載される第1の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第1の非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、第1の非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第1のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第1のヌクレオチド配列、及び(ii)ヒトまたは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である)であって、第2のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第2のヌクレオチド配列、を含む、免疫付与することと、
(b)第1の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された第1の非ヒト動物から、第1のリンパ球(例えば、B細胞)を採取することであって、第1のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト可変ドメインを含む、採取することと、
(d)親和性成熟された抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
(e)(d)の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列(例えば、ヒトラムダまたはカッパ配列)と共に第1の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第1のポリペプチド遺伝子を形成することと、
(f)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第2の非ヒト動物を、第2の関心の抗原で免疫付与することであって、第2の非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)非ヒト重鎖定常領域核酸配列に連結される再構成されていないヒトV、D、及びJ遺伝子セグメント、及び(ii)単一の再構成されたヒト軽鎖可変領域配列、を含む、免疫付与することと、
(g)第2の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(h)免疫付与された第2の非ヒト動物から、第2のリンパ球を採取することであって、第2のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト重鎖可変ドメインを含む、採取することと、
(i)第2の抗原に特異的に結合する親和性成熟された抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
(j)(i)の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列(例えば、ヒトIgG1定常配列)と共に第2の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第2のポリペプチド遺伝子を形成することと、
(k)第1の発現構築物及び第2の発現構築物を、第1のポリペプチド遺伝子及び第2のポリペプチド遺伝子を発現するのに好適な細胞内へ導入して、第2のポリペプチドの二量体を含む抗原結合タンパク質を形成することであって、第2のポリペプチドの各単量体は、第1のポリペプチドの単量体に関連付けられる、形成することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、第1の発現構築物及び第2の発現構築物は、別々のベクター上にある。種々の実施形態では、第1の発現構築物及び第2の発現構築物は、同一のベクター上にある。幾つかの実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、異なる。幾つかの実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、同一である。種々の実施形態では、第1の抗原は、細胞表面受容体であり、第2の抗原は、細胞表面に結合された可溶性抗原及び抗原から選択される。特定の実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体(例えば、FcRN)であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
(a)本明細書に記載される第1の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含
有する第1の非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、第1の非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び(ii)2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)第1の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された第1の非ヒト動物から、第1のリンパ球(例えば、B細胞)を採取することであって、第1のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト可変ドメインを含む、採取することと、
(d)親和性成熟された抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
(e)(d)の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列(例えば、ヒトラムダまたはカッパ配列)と共に第1の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第1のポリペプチド遺伝子を形成することと、
(f)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第2の非ヒト動物を、第2の関心の抗原で免疫付与することであって、第2の非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)非ヒト重鎖定常領域核酸配列に連結される再構成されていないヒトV、D、及びJ遺伝子セグメント、ならびに(ii)単一の再構成されたヒト軽鎖可変領域配列、を含み、単一の再構成されたヒト軽鎖可変領域配列は、ステップ(c)の軽鎖可変ドメインをコードするVL遺伝子セグメントと同一のVL遺伝子セグメントに由来する、免疫付与することと、
(g)第2の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(h)免疫付与された第2の非ヒト動物から、第2のリンパ球を採取することであって、第2のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト重鎖可変ドメインを含む、採取することと、
(i)第2の抗原に特異的に結合する親和性成熟された抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
(j)(i)の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列(例えば、ヒトIgG1定常配列)と共に第2の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第2のポリペプチド遺伝子を形成することと、
(k)第1の発現構築物及び第2の発現構築物を、第1のポリペプチド遺伝子及び第2のポリペプチド遺伝子を発現するのに好適な細胞内へ導入して、第2のポリペプチドの二量体を含む抗原結合タンパク質を形成することであって、第2のポリペプチドの各単量体は、第1のポリペプチドの単量体に関連付けられる、形成することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、第1の発現構築物及び第2の発現構築物は、別々のベクター上にある。種々の実施形態では、第1の発現構築物及び第2の発現構築物は、同一のベクター上にある。種々の実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、異なる。種々の実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、同一である。種々の実施形態では、第1の抗原は、細胞表面受容体であり、第2の抗原は、細胞表面に結合された可溶性抗原及び抗原から選択される。種々の実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体(例えば、FcRN)であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
(a)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、ならびに(ii)1つ以上のヒト免疫グロブリンVL及び
JL遺伝子セグメント、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球(例えば、B細胞)を採取することであって、リンパ球は、マウス免疫グロブリン定常ドメインに融合されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む親和性成熟された抗体を発現する、採取することと、
(d)親和性成熟された抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードする第1の核酸配列を特定することと、
(e)(d)の第1の核酸配列を、ヒト軽鎖定常領域核酸配列と共に第1の発現ベクターにフレーム内でクローン化することと、
(f)宿主細胞内へ、(i)第1の核酸配列をヒト軽鎖定常領域核酸配列と共にフレーム内に含む、第1の発現ベクター、及び(ii)ヒト重鎖定常領域に融合される第1の抗原特異的重鎖可変ドメインをコードする第2の核酸配列を含む、第2の発現ベクター、を導入することと、
(g)宿主細胞を培養して、多重特異性抗体の発現を可能にすることと、
(h)多重特異性抗体を単離することであって、多重特異性抗体は、第1の抗原特異的重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、多重特異性抗体の重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとは別個の抗原結合特異性を示す、単離することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。幾つかの実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性抗体であり、ステップ(f)は、ヒト重鎖定常領域配列と融合される第2の抗原特異的重鎖可変ドメインをコードする第3の核酸配列を含む第3の発現ベクターを導入することをさらに含む。
(a)本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成された重鎖可変ドメイン、ならびに(ii)1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメント、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球(例えば、B細胞)を採取することであって、リンパ球は、マウス免疫グロブリン定常ドメインに融合されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む親和性成熟された抗体を発現する、採取することと、
(d)親和性成熟された抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードする第1の核酸配列を特定することと、
(e)(d)の第1の核酸配列を、ヒト軽鎖定常領域核酸配列と共に第1の発現ベクターにフレーム内でクローン化することと、
(f)宿主細胞内へ、(i)第1の核酸配列をヒト軽鎖定常領域核酸配列と共にフレーム内に含む、第1の発現ベクター、及び(ii)ヒト重鎖定常領域に融合される第1の抗原特異的重鎖可変ドメインをコードする第2の核酸配列を含む、第2の発現ベクター、を導入することと、
(g)宿主細胞を培養して、多重特異性抗体の発現を可能にすることと、
(h)多重特異性抗体を単離することであって、多重特異性抗体は、第1の抗原特異的重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、多重特異性抗体の重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとは別個の抗原結合特異性を示す、単離することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。幾つかの実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性抗体であり、ステップ(f)は、ヒト重鎖定常領域配列と融合される第2の抗原特異的重鎖可変ドメインをコードする第3の核酸配列を含む第3の発現ベクターを導入することをさらに含む。
リン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供される。かかる方法は、
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(d)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む。
幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現
構築物において採用することと、
(f)(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(d)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む。
幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記(c)の細胞から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
(e)(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(d)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む。
幾つかの実施形態では、ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
ことが可能な免疫グロブリン軽鎖を含む、抗体集団を産生する。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された遺伝子座によって発現される免疫グロブリン軽鎖は、10−6、10−7、10−8、10−9、または10−10以下の親和性(KD)で、重鎖可変領域の不在下で関心の抗原に特異的に結合することが可能である。
えば、マウス)は、約5.92×105個の細胞の骨髄中未熟B細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、齧歯動物(例えば、マウス)は、約6.67×105個の細胞の骨髄中未熟B細胞集団を含む。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物(例えば、マウス)の例示的な骨髄中未熟B細胞は、IgM、B220、及び/またはそれらの組み合わせ(例えば、IgM+、B220int)の発現によって特徴付けられる。
ス)と概ね同一の移行(例えば、T1、T2、及びT3)B細胞集団を含む、末梢脾臓B細胞集団を含む。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物(例えば、マウス)の例示的な脾臓中移行B細胞集団(例えば、T1、T2、及びT3)は、IgM、CD23、CD93、B220、及び/またはそれらの組み合わせの発現によって特徴付けられる。
B細胞集団を含む。
数のサブタイプを含有し、齧歯動物では出生後2〜3週間、またヒトでは1〜2年まで完全には形成されない。この領域内のMZ B細胞は、典型的には、高レベルのsIgM、CD21、CD1、CD9を、低〜極僅かなレベルのsIgD、CD23、CD5、及びCD11bと共に発現し、それは、濾胞性(FO)B細胞及びB1 B細胞からそれらを表現型的に区別するのに役立つ。B1 B細胞と同様に、MZ B細胞は、独立した方法でT細胞内において初期適応的免疫応答へ迅速に入ることができる。MZ B細胞は、循環に入り脾臓内で捕捉される全身性の血液感染性抗原に対する防御の第一線として、良好に定置される。それらは、細菌細胞壁成分に対して特に反応し、脂質特異性抗体の重要な源であると考えられる。MZ B細胞はまた、加速された一次抗体応答にさらに寄与する形質細胞の分化に関する増大された傾向を有するそれらのFO B細胞対応物より、低い活性化閾値を見せる。
に修飾された齧歯動物(例えば、マウス)の例示的な脾臓中濾胞性B細胞集団(例えば、FO−I及びFO−II)は、IgM、IgD、CD21/35、CD93、B220、及び/またはそれらの組み合わせの発現によって特徴付けられる。
egion)の発生を駆動する。
実施例
先行研究は、hVH3−23は熱安定性のヒト可変重鎖遺伝子セグメントであり、またヒトレパートリーにおいて最も一般的に使用される可変セグメントのうちの1つであることを示している。したがって、再構成された重鎖可変配列(以下、「ユニバーサル重鎖」または「UHC」)を設計するために、コドン最適化ヒトVH3−23、D4−4(リーディングフレーム2または3)、及びJH4(またはJH6)遺伝子セグメントが選択された。
G1368(mIgG1)ベクターにライゲートされることができるような方法で設計した。発現分析のために、pIDTSMART内の4つのUHC遺伝子(1−4)を、pRG1301(hIgG1)またはpRG1368(mIgG1)のXho I/Sap I部位へサブクローン化し、各発現構築物を、CHO細胞内へ別々に導入した。導入後、4つの候補VDJ配列の全ては、十分なレベルで発現し、発現したペプチドは、異なるκ及びλ軽鎖と対を成すことが可能であった。
再構成されたヒトVDJ配列を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築を、細菌人工染色体(BAC)DNAを使用して、細菌細胞(BHR)内で一連の相同的組み換え反応によって実行した。再構成された重鎖可変ドメインを発現する遺伝子的に改変されたマウスの作成のための幾つかの標的化構築物を、VELOCIGENE(登録商標)遺伝子改変技術を使用して生成した(例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許第6,586,251号及びValenzuela,D.M.et al. (2003),High−throughput engineering of the mouse genome coupled with high−resolution expression analysis,Nature Biotechnology 21(6):652−659を参照)。
hVH3−23プロモータ(配列番号139)、(3)再構成されたhVH3−23(D)JH4ヌクレオチド配列(配列番号136)、(4)hJH4イントロン(配列番号140)、及び(5)BHR(MAID1115)のためのマウス相同ボックスを含有した。
びに5’及び3’相同アームを含有するpDBa0049構築物で標的化した。pDBa0049構築物の標的化は、VI421クローンからIGCR1及びスペクチノマイシンカセットを除去し、新規のAscI制限部位及びクロラムフェニコールカセットを、Adam6b遺伝子の下流へ導入した。成功的に標的化されたクローン(VI444)を含有する細菌細胞を、クロラムフェニコール及びカナマイシン選択を介して選択した(図3の4.BHR(Cm+Kan))。
全てのマウスは、Regeneron Pharmaceuticalsにて特定の病原体を含まない条件で飼育及び繁殖された。3匹の野生型(WT)同腹仔対照マウス(16週齢、雄、n=2、バックグラウンド:75%C57/BL6及び25%129)、及び2〜4匹のMAID6032HET F0マウス(図9、9週齢、雄、n=2、バックグラウンド:50%C57/BL6及び50%129)を屠殺し、血液、脾臓、及び骨髄を動物から採取した。それに加えて、4匹の野生型(WT)同腹仔対照マウス(10週齢、雄2匹及び雌2匹)、及び4匹のMAID6032ホモ接合性(「HO」)F2マウス
(10週齢、雄3匹、雌1匹)を屠殺し、血液、脾臓、及び骨髄を動物から採取した。血液は、EDTA(Cat#365973)を用いてBDマイクロティナ(microtainer)管内へ収集した。骨髄は、完全RPMI媒質(ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Hepe、2−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、及びゲンタマイシンを補充したRPMI媒質)で洗い流すことによって、大腿骨から収集した。末梢血液、脾臓及び骨髄調製物からの赤血球を、ACK溶解緩衝液で溶解し、完全RPMI媒質で洗浄した。
本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたヘテロ接合性のF0マウス(MAID6032HET)の、遺伝子的に修飾された対立遺伝子に(即ち、再構成されたVH3−23/D/JH4の単一のコピーを含有する対立遺伝子に)由来する抗体を産生する能力を調べるために、野生型または6032ヘテロ接合性マウスから単離した血液、脾臓、骨髄細胞を使用して蛍光活性化細胞分類(FACS)分析を実施した。
HO)の、遺伝子的に修飾された対立遺伝子に(即ち、再構成されたVH3−23/D/JH4の単一のコピーを含有する対立遺伝子に)由来する抗体を産生する能力を調べるために、蛍光活性化細胞分類(FACS)分析を、野生型または6032ホモ接合性マウスから単離した脾臓及び骨髄細胞を使用して上述の通りに実施した。
のマウス(即ち、再構成された重鎖可変配列の2つのコピーを含む:MAID6032HO)は、野生型(図13C及び13D)と比較してラムダ配列の僅かな減少を伴うが、正常な脾臓成熟及び未熟B細胞集団を産生することができることを示唆した。また、脾臓内で、MAID6032HOマウスは、T1集団B細胞の僅かな減少及び辺縁帯B細胞の増加を示した(図13E)。
5匹のWT(75%C57BL6/25%129バックグラウンド)及び3〜4匹のMAID6032HETマウスを、2.35μgの抗原X、10μgのCpGオリゴヌクレオチド(ODN1826、InvivoGen、cat#tlrl−1826)、及び25μgのリン酸アルミニウムゲルアジュバント(Brenntag、cat#7784−30−7)を含有する0.025mlの混合物で、足蹠に免疫付与した。マウスを、同一の用量で6回ブーストした。最初の免疫付与後15日目及び24日目に、麻酔をしたマウスから、眼窩後方血液を使用してBD血清分離器管(BD、cat#365956)内に血液を収集し、製造者の指示に従って血清を収集した。
実施例3.1:2つのヒト軽鎖Vセグメントを含むマウスの生成のためお標的化ベクターの構築
2つのヒトVκ遺伝子セグメント(例えば、ヒトVκ1−39及びヒトVκ3−20遺伝子セグメント、即ち、二重軽鎖(「DLC」))を含有する2つの改変された軽鎖遺伝子座を構築した(図20)。1つの改変された軽鎖遺伝子座は、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントを再構成されていない構成で含有した(DLC−5J)。第2の改変された軽鎖遺伝子座は、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び1つのヒトJκ遺伝子セグメントを再構成されていない構成で含有した(DLC−1J)。2つの追加の改変された軽鎖遺伝子座の各々に関して、ヒト遺伝子セグメントは、B細胞中のヒト遺伝子セグメントのインビボ再構成を可能にするように、組み換えシグナル配列と3’隣接した。
子座を含有する陽性ES細胞クローンを、改変されたDLC−5J軽鎖遺伝子座に特異的なプローブを使用して、Taqman(商標)スクリーニング及び核型分析によって確認した。DLC−5J ES細胞のES細胞スクリーニングに使用したプライマー及びプローブの配列は、下の表9に描写され、また配列リストに含まれる。
配列の上流及び下流に含む、改変されたDLC−5J遺伝子座内の配列は、図24A〜24Dに提示され、また配列番号83に記載される。
フローサイトメトリー.DLCマウスにおけるB細胞集団及びB細胞発生を、脾細胞及び骨髄調製物のフローサイトメトリー分析によって検証した。2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(n=4)、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び1つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(n=4)、ならびに野生型マウス(n=4)からの細胞懸濁液を、標準的な方法を使用して作製し、蛍光標識された抗体で染色した。
座(Hκ)での置き換えに関してホモ接合性のマウス、ならびに2つのヒトVκ遺伝子セグメントと、5つのヒトJκ遺伝子セグメント(DLC−5J)または1つのヒトJκ遺伝子セグメント(DLC−1J)のうちのいずれかとを含有する改変されたκ軽鎖遺伝子座に関してホモ接合性のマウスの骨髄及び全脾臓から精製した。相対的発現を、マウスCκ領域の発現に正規化した(1群当たりn=3〜5匹のマウス)。結果は、図32及び図33に示される。
ベクター(TOPO(登録商標)TA Cloning(登録商標)Kit,Invitrogen)へクローン化し、クローン化部位に隣接する場所でベクター内に配置されたM13順(GTAAAACGAC GGCCAG、配列番号92)及びM13逆(CAGGAAACAG CTATGAC、配列番号93)プライマーを用いて配列決定した。各脾臓標本からの10個のクローンを、配列決定した。配列を、IMGT/V−QUEST参照ディレクトリセットからのマウス及びヒト免疫グロブリンセットと比較して、Vκ/Jκ利用を決定した。表10は、各脾細胞標本からのRT−PCRクローンにて観察された選択されたクローンに関するVκ/Jκ組み合わせを記載する。表11は、DLC−5Jホモ接合性マウスからの選択されたRT−PCRクローンのヒトVκ/ヒトJκ及びヒトJκ/マウスCκ分岐のアミノ酸配列を記載する。小文字は、可変領域のアミノ酸配列における変異、または組み換え中のN及び/もしくはP付加の結果として生じる非テンプレート付加を示す。
実施例4.1:各々4つのヒスチジン置換を含有する2つのVカッパセグメントを含むマウスの改変及び生成
ヒスチジン置換を、Vκ1−39及びVκ3−20ULCマウスに関して上述される通り、二重軽鎖遺伝子座内へ導入した。手短に述べると、図23A(下)に描写されるDLC配列を、図34に描写されるプライマーを使用して部位特異的突然変異生成に供し、初めにVκ1−39配列を修飾し、その後Vκ3−20配列を修飾した。得られた二重軽鎖配列は、105位、106位、108位、及び111位にて生殖系列配列内に導入されたヒスチジンを有するVκ1−39セグメント、105位、106位、107位、及び109位にて生殖系列配列内に導入されたヒスチジンを有するVκ3−20セグメント、なら
びに全ての5つのJκセグメント(Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5)を含有した。その後の改変ステップは、FRT−UB−NEO−FRTカセットを有する5’アーム、ならびにマウスIgκエンハンサー及び定常領域を有する3’アームの付着を含んだ。この標的化ベクターを、図35Aに描写される通り、マウスIgκ可変遺伝子座(κ可変及びジョイニング遺伝子セグメントを含む)の欠失を含むES細胞内へ電気穿孔した(組み換えシグナル配列、RSSは、この図では省略される)。標的化されたES細胞を、表1、5、8、及び9内の上述の領域(特に、1633h2、1635h2、neo、Jxn 1−39/3−20、mIgKd2、及びmIgKp15)を検出するプライマー及びプローブ、ならびに下記の表12に記載されるプライマー及びプローブの2つの追加のセットを使用して、上述の対立遺伝子アッセイの修飾によってスクリーニングした。これらのプライマー及びプローブの2つの追加のセットの配列は、配列リストに含まれる。
3つのヒスチジン置換を、二重軽鎖マウスの各Vκ1−39及びVκ3−20内へ導入した。手短に述べると、図23A(下)に描写されるDLC配列を、図36描写されるプライマーを使用して部位特異的突然変異生成に供し、初めにVκ1−39配列を修飾し、その後Vκ3−20配列を修飾した。得られた二重軽鎖配列は、106位、108位、及び111位にて生殖系列配列内に導入されたヒスチジンを有するVκ1−39セグメント、105位、106位、及び109位生殖系列配列内に導入されたヒスチジンを有するVκ3−20セグメント、ならびに全ての5つのJκセグメント(Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5)を含有した。その後の改変ステップは、FRT−UB−NEO−FRTカセットを有する5’アーム、ならびにマウスIgκエンハンサー及び定常領域を有する3’アームの付着を含んだ。この標的化ベクターを、図37Aに描写される通り、マウスIgκ可変遺伝子座(κ可変及びジョイニング遺伝子セグメントを含む)の欠失を含むES細胞内へ電気穿孔した(RSSは、この図では省略される)。標的化されたES細胞を、表1、5、8、及び9内の上述の領域(特に、1633h2、1635h2、neo、Jxn1−39/3−20、mIgKd2、及びmIgKp15)を検出するプライマー及びプローブ、ならびに下記の表13に記載されるプライマー及びプローブの2つの追加のセットを使用して、上述の対立遺伝子アッセイの修飾によってスクリーニングした。これらのプライマー及びプローブの2つの追加のセットの配列は、配列リストに含まれる。
ネオマイシンカセットは、マウス内に保持される。
改変されたヒトヒスチジン置換二重軽鎖遺伝子座を担持するマウスを、内在性λ軽鎖遺伝子座の欠失を含有するマウスと繁殖させて、二重軽鎖遺伝子座に由来する改変されたヒスチジン置換軽鎖をその唯一の軽鎖として発現する子孫を生成する。
脾臓B細胞mRNAからのVカッパ単位複製配列を、逆転写酵素PCR(RT−PCR)及びハイスループットスクリーニングを使用して調製した。
重鎖遺伝子座中に再構成された重鎖可変領域核酸配列を含むマウス(MAID6031、「UHCマウス」)を、上述の通り生成した。手短に述べると、UHCマウスにおいて、全ての内在性機能性重鎖可変遺伝子セグメントを欠失させ、内在性重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるhVH3−23/D/JH4をコードする単一の再構成された重鎖可変領域核酸配列で置き換えた。
ると、1つの改変された軽鎖遺伝子座は、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び5つのヒトJκ遺伝子セグメント(Jκ1−5)を再構成されていない構成で含有し、内在性マウスκ定常領域配列(MAID1911(DLC−5J)、図19E)に作動可能に連結される。他の改変された軽鎖遺伝子座は、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び1つのヒトJκ(Jκ1)遺伝子セグメントを再構成されていない構成で含有し、内在性マウスκ定常領域配列に作動可能に連結される(MAID1913(DLC−1J)、図21D)。2つの追加の改変された軽鎖遺伝子座の各々に関して、ヒト遺伝子セグメントは、B細胞中のヒト遺伝子セグメントのインビボ再構成を可能にするように、組み換えシグナル配列と3’隣接した。
本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたホモ接合性「DLC×UHC」(MAID1912HO6032HO)マウスの、遺伝子的に修飾された対立遺伝子(例えば、重鎖遺伝子座中に再構成されたVH3−23/D/JH4の単一のコピーを含有する対立遺伝子、及び軽鎖遺伝子座中に2つのヒトVκ、5つのヒトJκ遺伝子を含有する対立遺伝子)に由来する抗体を産生する能力を調べるために、蛍光活性化細胞分類(FACS)分析を実施例3にあるように実施した。
5匹のWT(75%C57BL6/25%129バックグラウンド)及び7匹のF2 MAID1912HO6031HET(ホモ接合性DLC×ヘテロ接合性UHC)マウスを、2.35μgの抗原X、10μgのCpGオリゴヌクレオチド(ODN1826、InvivoGen、cat#tlrl−1826)、及び25μgのリン酸アルミニウムゲルアジュバント(Brenntag、cat#7784−30−7)を含有する0.025mlの混合物で、足蹠に免疫付与した。マウスを、同一の用量で6回ブーストした。最初の免疫付与後0日目、15日目、及び23日目に、麻酔をしたマウスから、眼窩後方血液を使用してBD血清分離器管(BD、cat#365956)内に血液を収集し、製造者の指示に従って血清を収集した。免疫付与の第2のラウンドを、免疫付与の第1のラウンドの5週間後に上述の通りに実施した。
D1912HO6031HET(ホモ接合性DLC×ヘテロ接合性UHC)マウスは、免疫付与の第2のラウンド後、野生型マウスによって産生されるものに匹敵するレベルで抗原特異的IgG抗体を産生することが可能であった。
したがって、これらのマウスは、2つのヒトVL遺伝子セグメント(Vκ1−39またはVκ3−20遺伝子セグメント)のうちの1つ及びヒトJκセグメントの再構成に由来する逆キメラ軽鎖(ヒト軽鎖可変ドメイン及びマウスCκ)と、単一の再構成されたヒト重鎖可変遺伝子セグメンに由来する逆キメラ重鎖(ヒト重鎖可変ドメイン及びマウスCH)とを含む抗体を産生する。逆キメラ抗体(即ち、これらの逆キメラ鎖から成る抗体)は、関心の抗原による免疫付与後に獲得される。
同様に、ヒスチジン修飾された二重軽鎖を含む改変されたヒト軽鎖遺伝子座を担持するマウス(例えば、本明細書に上述されるヒスチジン修飾を有する2つのヒトVL遺伝子セグメントを含むマウス)を、内在性マウス重鎖可変遺伝子座のユニバーサルヒト重鎖遺伝子座(本明細書に上述される単一の再構成されたヒト重鎖可変ドメインを含む遺伝子座)での置き換えを含有するマウスと繁殖させる。したがって、これらのマウスは、2つのヒスチジン修飾されたヒトVL遺伝子セグメント(Vκ1−39またはVκ3−20遺伝子セグメント)のうちの1つ及びヒトJκセグメントの再構成に由来する逆キメラ軽鎖(ヒト軽鎖可変ドメイン及びマウスCκ)と、単一の再構成されたヒト重鎖可変ドメインに由来する逆キメラ重鎖(ヒト重鎖可変ドメイン及びマウスCH)とを含む抗体を産生する。逆キメラ抗体は、関心の抗原による免疫付与後に獲得される。かかるマウスにおいて生成されるpH依存性ヒト抗体を、当該技術分野において既知であるか、または上述の抗体単離及びスクリーニング方法を使用して特定する。
カッパ軽鎖遺伝子座中に再構成された重鎖可変領域核酸配列を含むマウス(MAID6079、「カッパ上UHCマウス」)を、重鎖遺伝子座を標的化するために上述のものに類似した方法によって生成した。手短に述べると、カッパ上UHCマウスにおいて、全ての内在性機能性軽鎖カッパ可変Vκ及びJκ遺伝子セグメントを欠失させ、内在性軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるhVH3−23/D/JH4をコードする単一の再構成された重鎖可変領域核酸配列で置き換えた。再構成されたヒト重鎖可変ドメイン配列を含有するゲノム遺伝子座の作成のための最終標的化構築物は、5’〜3’へ、(1)約22500bpのマウスゲノム配列を内在性Ig軽鎖遺伝子座の上流に含有する5’相同アーム、(2)5’FRT部位、(3)ネオマイシンカセット、(4)3’FRT部位、(5)2239bpのhVH3−23プロモータ(配列番号139)、(6)再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列(hVH3−23/D/JH4、配列番号136)、(7)JhH4イントロン(配列番号140)、及び(8)約75000bpのマウスゲノム配列をマウスJL遺伝子セグメントの下流に含有する3’相同アームを含
有する。修飾を担持するヘテロ接合性マウスを、互いに繁殖させて、遺伝子的に修飾された遺伝子座のみからの免疫グロブリン「軽」鎖を作製することが可能なホモ接合体(MAID6079HO)を生成した。MAID6079HO(ホモ接合性カッパ上UHC)マウスは、本明細書に記載されるユニバーサル重鎖(例えば、hVH3−23/hD/hJH4)の、全てのマウスVκ及びJκ遺伝子が欠失されたマウスカッパ(κ)軽鎖遺伝子座内への挿入を含む。
本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたホモ接合性「カッパ上UHCマウス」(MAID6079HO)マウスの、遺伝子的に修飾された対立遺伝子(例えば、カッパ軽鎖遺伝子座中に再構成されたVH3−23/D/JH4の単一のコピーを含有する対立遺伝子)に由来する抗体を産生する能力を調べるために、蛍光活性化細胞分類(FACS)分析を実施例3にあるように実施した。
軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス(MAID6079HO、ホモ接合性「カッパ上UHCマウス」)を、上述の通り生成した。これらのマウスを、重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性(MAID1994HO)のマウス(重鎖上カッパ(「KoH」)マウス)と交配した。MAID1994ホモ接合性KoHマウスは、マウスIg重鎖定常鎖遺伝子座(即ち、欠失されたマウスIg重鎖遺伝子座))内に挿入された、長IGCR及びマウスADAM6と共に、40個のヒトVκ遺伝子及び全てのヒトJκ遺伝子を含む。KoHは、これまでに説明されており、例えば、参照により本明細書に援用される米国付与前公開第2012/0096572号を参照されたい。
原体を含まない条件で飼育及び繁殖された。2匹のVELOCIMMUNE(登録商標)(MAID1242HO1640HO(「VI3」)、参照により本明細書に援用される米得特許第8,502,018号を参照)マウス(15週齢、雌、n=2、バックグラウンド:28%C57/BL6、13%129、及び59%Balb/c)、4匹のMAID1994HO6079HO F2マウス(図56、13〜14週齢、雄、n=2、バックグラウンド:25%C57/BL6、25%129、及び50%Balb/c)、及びMAID6079野生型同腹仔対照マウスを屠殺し、脾臓及び骨髄を動物から採取した。骨髄は、完全RPMI媒質(ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Hepe、2−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、及びゲンタマイシンを補充したRPMI媒質)で洗い流すことによって、大腿骨から収集した。脾臓及び骨髄調製物からの赤血球を、ACK溶解緩衝液で溶解し、完全RPMI媒質で洗浄した。
本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたホモ接合性「KoH×カッパ上UHC」(MAID1994HO6079HO)マウスの、遺伝子的に修飾された対立遺伝子(例えば、再構成されたVH3−23/D/JH4の単一のコピーを含有する対立遺伝子、及び重鎖遺伝子座中にカッパ軽鎖可変領域核酸配列を含有する対立遺伝子)に由来する抗体を産生する能力を調べるために、蛍光活性化細胞分類(FACS)分析を実施例3にあるように実施した。
の範囲内である。
* * *
Claims (28)
- ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする核酸を産生する方法であって、
齧歯動物のリンパ球、または該リンパ球から産生されたハイブリドーマ由来の該ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を獲得するステップであって、該齧歯動物は、生殖系列ゲノム中、
(i)内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、内在性重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列であって、該再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、VH3−23/X1X2/JHの配列をコードし、ここで、X1が任意のアミノ酸であり、X2が任意のアミノ酸である、配列、および
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された少なくとも1つの再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメント(VL)、および少なくとも1つの再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖J遺伝子セグメント(JL)を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
を含む、ステップを含み、
ここで、該リンパ球が
(a)該内在性重鎖定常領域遺伝子配列に連結された、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域VH3−23/X1X2/JH遺伝子由来であり、かつ
(b)該ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと対を成す
免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する、方法。 - 前記核酸を獲得する前に、関心の抗原で前記齧歯動物に免疫付与し、該抗原に対する前記齧歯動物に免疫応答を開始させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記リンパ球が、前記関心の抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する、請求項2に記載の方法。
- 増幅された再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、少なくとも1つの体細胞超変異を含む、請求項3に記載の方法。
- X1がGlyであり、X2がTyrである、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒトJH遺伝子セグメントが、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、およびそれらの多型変異体からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列が、VH3−23/GY/JH4−4(配列番号137)の配列をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記重鎖定常領域遺伝子配列が、CH1、ヒンジ、CH2、CH3およびそれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載の方法。
- 実質的に全ての内在性機能性VH、D、およびJH遺伝子セグメントが、前記齧歯動物の前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、請求項1に記載の方法。
- 前記軽鎖定常領域遺伝子配列が、齧歯動物およびヒト定常領域遺伝子配列から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの再構成されていないヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメント、および前記少なくとも1つの再構成されていないヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントが、内在性遺伝子座において、齧歯動物免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、請求項10に記載の方法。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VLおよびJL遺伝子セグメントを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記野生型よりも少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VLおよびJL遺伝子セグメントが、内在性遺伝子座において、齧歯動物軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、請求項13に記載の方法。
- 付加または置換されたヒスチジンコドンが、CDR3中に存在する、請求項14に記載の方法。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、2つの再構成されていないヒトVκ遺伝子セグメント配列および1つ以上の再構成されていないJκ遺伝子セグメント配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記2つの再構成されていないヒトVκ遺伝子セグメントが、各々、1つ以上の非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む、ヒトVκ1−39およびVκ3−20遺伝子セグメントである、請求項16に記載の方法。
- 前記ヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントが、(IMGT付番方式にしたがう)105位、106位、107位、108位、109位、111位、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置にて1つ以上のヒスチジンを含む、ヒト軽鎖可変ドメインを再構成およびコードすることができ、該1つ以上のヒスチジンが、1つ以上の置換に由来する、請求項17に記載の方法。
- 前記リンパ球がB細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記齧歯動物が、ハムスター、ラット、およびマウスからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記齧歯動物が、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含むマウスである、請求項20に記載の方法。
- 前記軽鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト動物定常領域遺伝子配列である、請求項1に記載の方法であって、該方法が、適切なヒト定常領域核酸配列をコードする配列を含むヌクレオチドと共にフレーム内で核酸をクローン化することをさらに含む、方法。
- ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む細胞を獲得する方法であって、生殖系列ゲノム中、
(i)内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、内在性重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列であって、該再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、VH3−23/X1X2/JHの配列をコードし、ここで、X1が任意のアミノ酸であり、X2が任意のアミノ酸である、配列、および
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された少なくとも1つの再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメント(VL)、および少なくとも1つの再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖J遺伝子セグメント(JL)を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
を含む齧歯動物からリンパ球を単離するステップを含み、
ここで、該リンパ球が
(a)該内在性重鎖定常領域遺伝子配列に連結された、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域VH3−23/X1X2/JH遺伝子由来であり、かつ
(b)該ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと対をなす
免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する、方法。 - 前記単離されたリンパ球からハイブリドーマを産生することをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 請求項23〜24のいずれか1項に記載の方法によって獲得された細胞。
- 請求項23〜24のいずれか1項に記載の方法にしたがい獲得された細胞、または請求項25に記載の細胞を培養することを含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを作製する方法。
- 前記細胞が、重鎖定常領域遺伝子配列に連結された、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域VH3−23/X1X2/JH遺伝子由来の免疫グロブリン重鎖可変ドメインと対を成すヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする核酸を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞が、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと対を成すことができるヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする第2の核酸をさらに含む、請求項26に記載の方法。
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