CN105705520B - 纤溶酶原激活剂抑制剂-1(pai-1)的抗体及其用途 - Google Patents

纤溶酶原激活剂抑制剂-1(pai-1)的抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供特异性结合1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI‑1)的抗体。本发明还提供药物组合物，以及编码抗PAI‑1抗体的核酸，用于生成这种抗体的重组表达载体和宿主细胞，或其片段。还提供在体外或在体内使用抗体来调控PAI‑1活性或检测PAI‑1的方法。本公开进一步提供生成处于活性构象状态的特异性结合PAI‑1的抗体的方法。

Description

纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)的抗体及其用途
相关文献的交叉引用
本申请要求2013年8月13日提交的美国临时申请号61/865,451和2014年5月22日提交的欧洲申请号14305757.8的优先权，其在本文以其整体通过提述并入。
发明背景
1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)是组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)(负责纤溶酶生成的关键丝氨酸蛋白酶)的主要抑制剂。PAI-1通过在血管区室中抑制纤溶酶原活化来调节纤维蛋白溶解。纤维蛋白溶解是用于降解通过凝血级联的活化而形成的纤维蛋白凝块的严密协调的过程。凝血/纤维蛋白溶解平衡的失调导致异常的血液凝集事件，如流血或栓塞性疾病。PAI-1还是细胞周围区室(血管内的和组织的)中纤溶酶原活化的关键调节物，在所述区室中，受体结合的纤溶酶原主要通过与尿激酶受体(uPAR)结合的尿激酶活化。通过抑制细胞周围的蛋白水解，PAI-1调节多种细胞功能，如胞外基质(ECM)降解，生长因子活化和从ECM释放，基质金属蛋白酶(MMP)活化，和细胞凋亡。近来，已通过PAI-1与辅因子(如玻璃粘连蛋白(vitronectin)，肝素，糖胺聚糖)、uPAR-尿激酶复合物或细胞受体(LRP：低密度脂蛋白受体相关蛋白)或整联蛋白(其影响细胞功能如粘附/解附、迁移、增殖和胞内生物活性)的相互作用鉴定了其非蛋白酶依赖性作用。通过这些细胞机制和抗纤维蛋白溶解作用，已在肿瘤生长和转移、纤维化、急性心肌梗塞和代谢疾病如动脉粥样硬化、肥胖和糖尿病中确立了PAI-1的致病作用。
人SERPINE1(PAI-1)基因位于第7染色体，其由八个内含子和九个外显子组成，并具有12,169b的大小(Klinger,K.W.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：8548,1987)。PAI-1是来自SERPIN(丝氨酸蛋白酶抑制剂)超家族的大约50kDa(379个氨基酸)的单链糖蛋白，其以活性构象合成，但在玻璃粘连蛋白(Vn)不存在下自发地变为休眠的(latent)。玻璃粘连蛋白，PAI-1的主要辅因子，以反应性中心环(RCL)稳定活性构象，所述环为大约20个暴露于表面上的氨基酸。PAI-1的两个主要靶(tPA和uPA)的抑制机制是***抑制。PAI-1的RCL区携带诱饵肽键(R346-M347，也称作P1-P1’)，其携带丝氨酸蛋白酶的裂解位点。首先形成与tPA或uPA的Michaelis复合物，随后催化三元组与诱饵肽键反应以形成酰基酶复合物，当裂解P1-P’1肽键之后，该复合物诱导强烈的构象变化。该构象变化导致裂解的PCL***β-链，且蛋白酶作为酰基酶保持与PAI-1的共价结合。在非生理情况下，该酰基酶复合物的水解可能诱导裂解的PAI-1的释放并使得活性蛋白酶游离(Blouse等，Biochemistry,48：1723,2009)。
PAI-1以高度可变的水平(nM范围)在血液中循环，且相对于t-PA或uPA浓度是过量的。PAI-1显示结构柔性，并可见于三种构象的一：(1)休眠的构象，(2)有活性的构象，或(3)底物构象(见图1)。PAI-1主要作为与玻璃粘连蛋白的非共价复合物(Kd～1nM)存在，其使得休眠性转换减少1.5至3倍。休眠的、裂解的或复合的PAI-1对玻璃粘连蛋白的亲和力显著减少。基质结合的玻璃粘连蛋白也位于细胞周围空间中的PAI-1处。内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞合成该种PAI-1，随后PAI-1通过血小板可在休眠形式下大量储藏(在α粒中)。PAI-1是溶液中tPA和uPA迅速且特异的抑制剂(二级速率常数为106至107M-1s-1)，但对于结合于纤维蛋白或其细胞受体的蛋白酶不具活性。其它蛋白酶如凝血酶、纤溶酶、活化的蛋白C也可由PAI-1抑制，但效力较低。
自从人PAI-1的第一个3D结构以休眠构象于1992年得到描述以来，已经解决了数个人PAI-1的3D结构(Mottonen等，Nature 355：270,1992)。这些3D结构包括底物中的PAI-1突变形式(Aertgeerts等，Proteins 23：118,1995)，稳定化的活性构象(Sharp等，Structure 7：111,1999)，复合于玻璃粘连蛋白-生长调节素(somatomedin)B结构域的PAI(Zhou等，Nat.Struct.Biol.10：541,2003)，或连同来自RCL环的抑制性五肽(Xue等，Structure 6：627,1998)。最近，休眠构象的小鼠PAI-1结构由Dewilde等(JStruct.Biol.171：95,2010)阐明，并公开了其在RCL位置，门户区，和α-螺旋A的位置方面与人PAI-1的差异。PAI-1中的结构/功能关系已通过使用超过600个突变蛋白加以研究(由DeTaeye等，Thromb.Haemost.92：898,2004综述)以定位该多功能性丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)的多种活性所涉及的结构域。
因为PAI-1可由几乎每种细胞类型(包括肝细胞、脂肪细胞、肾小球膜细胞、成纤维细胞、成肌纤维细胞和上皮细胞)合成，其表达在生理(例如血浆PAI-1水平的昼夜差异)和病理条件(例如肥胖、代谢综合征、胰岛素抗性、感染、炎性疾病、癌症)下差异巨大。认为PAI-1是急性期蛋白。PAI-1mRNA表达的转录调节由数种细胞因子和生长因子(例如TGFβ、TNFα、EGF、FGF、胰岛素、血管紧张素II&IV)，激素(例如醛甾酮、糖皮质激素、PMA、高葡萄糖)和应激因子(例如缺氧、活性氧类物质(reactive oxygen species)、脂多糖)诱导。
此外，PAI-1基因的启动子(位置-675)中的多态性影响表达水平。4G等位基因增加PAI-1水平，且4G/4G变体(发生于大约群体中的25％)与5G/5G(25％发生率)和4G/5G(50％发生率)相比诱导血浆PAI-1水平增加大约25％。4G/4G多态性与心肌梗塞(Dawson等，Arterioscler Thromb.11：183，1991)、特异类型的肺纤维化(特发性间质性肺炎)(Kim等，Mol Med.9：52，2003)相关，且4G/4G基因型供体组由于间质性纤维化和肾小管萎缩对于肾脏移植物丧失是独立的风险因子(Rerolle等，Nephrol.Dial.Transplant 23：3325，2008)。
在栓塞性疾病如动脉和静脉栓塞，急性心肌梗塞和动脉粥样硬化中，已将数种致病作用归咎于PAI-1。其在代谢疾病如胰岛素抗性综合征和肥胖中的涉及已得到充分确认。还已知PAI-1对于数种器官为促纤维化因子，并已显示其在纤维化组织(即肝、肺、肾、心、腹腔粘连、皮肤：瘢痕或硬皮病)中过表达(由Ghosh和Vaughan，J.Cell Physiol.227：493，2012综述)。在不同模型如肝(胆总管结扎或异型生物质)、肾(单侧输尿管阻塞模型(UUO))、肺(博来霉素吸入)中，PAI-1敲除(KO)小鼠免于纤维化(Bauman等，J.Clin.Invest.120：1950，2010；Hattori等，Am.J.Pathol.164：1091，2004；Chuang-Tsai等，Am.J.Pathol.163：445，2003)，而在心脏中，该缺失免于诱导性纤维化(Takeshita等，AM.J.Pathol.164：449，2004)，但易感年龄相关性心脏选择性纤维化(Moriwaki等，Cric.Res.95：637，2004)。已报导通过siRNA(Senoo等，Thorax65：334，2010)或经由化学化合物的抑制(Izuhara等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.28：672，2008；Huang等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.46：87，2012)下调PAI-1表达以减少肺纤维化，而野生型的PAI-1过表达(Eitzman等，J.Clin.Invest.97：232，1996)或仅保留玻璃粘连蛋白结合而非tPA抑制剂功能的PAI-1突变体加剧了肺纤维化(Courey等，Blood 118：2313，2011)。
胆总管结扎(BDL)肝纤维化由中和PAI-1的抗体减轻(美国专利号7,771,720)，而siRNA所致的下调减轻BDL和异型生物质诱导的肝纤维化(Hu等，J.Hepatol.51：102，2009)。PAI-1KO小鼠免于BDL中胆汁淤积诱导的肝损伤和纤维化(Bergheim等，J.Pharmacol.Exp.Ther.316：592，2006；Wang等，FEBS Lett.581：3098，2007；Wang等，Hepatology 42：1099，2005)且免于血管紧张素II诱导的肝纤维化(Beier等，Arch.Bioch.Biophys.510：19，2011)。
PAI-1KO小鼠在UUO模型中(Oda等，Kidney Int.60，587，2001)，在糖尿病肾病中(Nicholas等，Kidney Int.67：1297，2005)和血管紧张素II诱导的肾病中(Knier等，J.Hypertens.29：1602，2011；关于综述，参见Ma等Frontiers Biosci.14：2028，2009和EddyA.A.Thromb.Haemost.101：656，2009)免于肾纤维化。相反，过表达PAI-1的小鼠展现出更严重的纤维化和UUO之后增加的巨噬细胞募集(Matsuo等，Kidney Int.67:2221,2005；Bergheim等，J.Pharmacol.Exp.Ther.316:593,2006)。已显示非抑制性PAI-1突变体(PAI-1R)在大鼠中的实验性肾小球肾炎(thy1)中通过减少尿蛋白表达和肾小球基质积累(Huang等，Kidney Int.70：515，2006)保护小鼠免于发生纤维化。阻断PAI-1的肽在UUO小鼠中抑制胶原蛋白3、4和纤连蛋白(fibronectin)积累(Gonzalez等，Exp.Biol.Med.234：1511，2009)。
对于过去20年，PAI-1作为多种病理学的靶标已成为抑制其活性或调节其表达的深入研究的焦点。已设计了化学化合物(Suzuki等，Expert Opin.Investig.Drugs 20：255，2011)、单克隆抗体(Gils和Declerk，Thromb Haemost；91：425，2004)、肽、突变体(Cale和Lawrence，Curr.Drug Targets8：971，2007)、siRNA或反义RNA以抑制其多种功能或调节其表达。然而，尽管深入研究，仍需解决开发PAI-1治疗上有效的调控剂的问题。因此，在本领域存在对于抑制PAI-1活性的新型作用剂的需求，用于治疗PAI-1介导的人类疾病的用途。
发明简述
一方面，本文公开了一种特异性结合人1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:6中的CDR1(SEQ ID NO:34)，CDR2(SEQ ID NO:33)，和CDR3(SEQ ID NO:32)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7中的CDR1(SEQ ID NO:37)，CDR2(SEQ ID NO:36)，和CDR3(SEQ IDNO:35)。另一方面，该重链包含含有SEQ ID NO:6的重链可变区，且该轻链包含含有SEQ IDNO:7的轻链可变区。又一方面，重链可变区与SEQ ID NO:6为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且该轻链可变区与SEQ ID NO:7为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。所有％同一性近似值指示最小％同一性；本公开还涵盖比所述数值要高的％同一性。
另一方面，本文公开一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:34的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和包含SEQ IDNO:32的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，包含SEQ ID NO:36的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。在某些方面，该抗体重链包含与SEQID NO:6中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该抗体轻链包含与SEQ ID NO:7中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。
一方面，本文公开一种特异性结合人1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2中的CDR1(SEQ ID NO:22)，CDR2(SEQ ID NO:21)，和CDR3(SEQ ID NO:20)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3中的CDR1(SEQ ID NO:25)，CDR2(SEQ ID NO:24)，和CDR3(SEQ ID NO:23)。另一方面，该重链包含含有SEQ ID NO:2的重链可变区，且该轻链包含含有SEQ ID NO:3的轻链可变区。又一方面，该重链可变区与SEQ ID NO:2为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且该轻链可变区与SEQ ID NO:3为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:22的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:21的重链CDR2区，和包含SEQID NO:20的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:25的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:24的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:23的轻链CDR3区。在某些方面，该抗体重链包含与SEQ ID NO:26中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该抗体轻链包含与SEQ ID NO:3中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。
一方面，本文公开了一种特异性结合人1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:4中的CDR1(SEQ ID NO:28)，CDR2(SEQ ID NO:27)，和CDR3(SEQ ID NO:26)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5中的CDR1(SEQ ID NO:31)，CDR2(SEQ ID NO:30)，和CDR3(SEQ IDNO:29)。另一方面，该重链包含含有SEQ ID NO:4的重链可变区，且该轻链包含含有SEQ IDNO:5的轻链可变区。又一方面，该重链可变区与SEQ ID NO:4为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且该轻链可变区与SEQ ID NO:5为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
另一方面，本文公开了一种分离的特异性结合PAI-1的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:28的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:27的重链CDR2区，和包含SEQID NO:26的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:31的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:30的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:29的轻链CDR3区。在某些方面，该抗体重链包含与SEQ ID NO:4中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该抗体轻链包含与SEQ ID NO:5中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。
一方面，本文公开了一种特异性结合人1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:8中的CDR1(SEQ ID NO:40)，CDR2(SEQ ID NO:39)，和CDR3(SEQ ID NO:38)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:9中的CDR1(SEQ ID NO:43)，CDR2(SEQ ID NO:42)，和CDR3(SEQ IDNO:41)。另一方面，该重链包含含有SEQ ID NO:8的重链可变区，且该轻链包含含有SEQ IDNO:9的轻链可变区。又一方面，该重链可变区与SEQ ID NO:8为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且该轻链可变区与SEQ ID NO:9为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:40重链CDR1区，包含SEQ ID NO:39的重链CDR2区，和包含SEQ IDNO:38的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:43的轻链CDR1区，包含SEQ ID NO:42的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:41的轻链CDR3区。在某些方面，该抗体重链包含与SEQID NO:8中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该抗体轻链包含与SEQ ID NO:9中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。
一方面，本文公开了一种特异性结合人1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:10中的CDR1(SEQ ID NO:52)，CDR2(SEQ ID NO:51)，和CDR3(SEQ ID NO:50)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11中的CDR1(SEQ ID NO:55)，CDR2(SEQ ID NO:54)，和CDR3(SEQ IDNO:53)。另一方面，该重链包含含有SEQ ID NO:10的重链可变区，且该轻链包含含有SEQ IDNO:11的轻链可变区。又一方面，该重链可变区与SEQ ID NO:10为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且该轻链可变区与SEQ ID NO:11为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:52的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:51的重链CDR2区，和包含SEQID NO:50的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:55的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:54的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:53的轻链CDR3区。在某些方面，该抗体重链包含与SEQ ID NO:10中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该抗体轻链包含与SEQ ID NO:11中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。
一方面，本文公开了一种特异性结合人1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:12中的CDR1(SEQ ID NO:58)，CDR2(SEQ ID NO:57)，和CDR3(SEQ ID NO:56)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13中的CDR1(SEQ ID NO:61)，CDR2(SEQ ID NO:60)，和CDR3(SEQ IDNO:59)。另一方面，该重链包含含有SEQ ID NO:12的重链可变区，且该轻链包含含有SEQ IDNO:13的轻链可变区。又一方面，该重链可变区与SEQ ID NO:12为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且该轻链可变区与SEQ ID NO:13为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，且包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:58的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:57的重链CDR2区，和包含SEQID NO:56重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:61的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:60的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:59的轻链CDR3区。在某些方面，该抗体重链包含与SEQ ID NO:12中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该抗体轻链包含与SEQ ID NO:13中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。
一方面，本文公开了一种特异性结合人1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:14中的CDR1(SEQ ID NO:64)，CDR2(SEQ ID NO:63)，和CDR3(SEQ ID NO:62)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:15中的CDR1(SEQ ID NO:67)，CDR2(SEQ ID NO:66)，和CDR3(SEQ IDNO:65)。另一方面，该重链包含含有SEQ ID NO:14的重链可变区，且该轻链包含含有SEQ IDNO:15的轻链可变区。又一方面，该重链可变区与SEQ ID NO:14为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且该轻链可变区与SEQ ID NO:15为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:64的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:63的重链CDR2区，和包含SEQID NO:62的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:67的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:66的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:65的轻链CDR3区。在某些方面，该抗体重链包含与SEQ ID NO:14中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该抗体轻链与SEQ ID NO:15中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。
一方面，本文公开了一种特异性结合人1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:16中的CDR1(SEQ ID NO:70)，CDR2(SEQ ID NO:69)，和CDR3(SEQ ID NO:68)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:17中的CDR1(SEQ ID NO:73)，CDR2(SEQ ID NO:72)，和CDR3(SEQ IDNO:71)。
另一方面，该重链包含含有SEQ ID NO:16的重链可变区，且该轻链包含含有SEQID NO:17的轻链可变区。又一方面，该重链可变区与SEQ ID NO:16为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且该轻链可变区与SEQ ID NO:17为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:70的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:69的重链CDR2区，和包含SEQID NO:68的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:73的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:72的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:71的轻链CDR3区。在某些方面，该抗体重链包含与SEQ ID NO:16中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该抗体轻链包含与SEQ ID NO:17中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。
一方面，本文公开了一种特异性结合人1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:80中的CDR1(SEQ ID NO:46)，CDR2(SEQ ID NO:45)，和CDR3(SEQ ID NO:44)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:81中的CDR1(SEQ ID NO:49)，CDR2(SEQ ID NO:48)，和CDR3(SEQ IDNO:47)。
另一方面，该重链包含含有SEQ ID NO:80的重链可变区，且该轻链包含含有SEQID NO:81的轻链可变区。又一方面，该重链可变区与SEQ ID NO:80为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且该轻链可变区与SEQ ID NO:81为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:46的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:45的重链CDR2区，和包含SEQ IDNO:44的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:49的轻链CDR1区，包含SEQ ID NO:48的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:47的轻链CDR3区。在某些方面，该抗体重链包含与SEQID NO:80中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该抗体轻链包含与SEQ ID NO:81中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。
另一方面，本文公开了一种特异性结合1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:18中的CDR1(SEQ ID NO:76)，CDR2(SEQ ID NO:75)，和CDR3(SEQ ID NO:74)，所述轻链可变区包含SEQ ID 19中的CDR1(SEQ ID NO:79)，CDR2(SEQ ID NO:78)，和CDR3(SEQ IDNO:77)。另一方面，该重链包含含有SEQ ID NO:18的重链可变区，且该轻链包含含有SEQ IDNO:19的轻链可变区。又一方面，该重链可变区与SEQ ID NO:18为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且该轻链可变区与SEQ ID NO:19为99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ IDNO:76的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:75的重链CDR2区，和包含SEQ ID NO:74的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:79的轻链CDR1区，包含SEQ ID NO:78的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:77的轻链CDR3区。在某些方面，该抗体重链包含与SEQ ID NO:18中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该抗体轻链包含与SEQ ID NO:19中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。
一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:33的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:146的重链CDR2区，和包含SEQID NO:32的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:145的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。
一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:147的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和包含SEQID NO:32的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:36的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。
一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:147的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和包含SEQID NO:32的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:145的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。
一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:146的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和包含SEQID NO:32的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:145的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。
一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:34的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和包含SEQ IDNO:32的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，包含SEQ ID NO:145的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。
另一方面，本文公开了一种分离的单克隆抗体，其与下述分离的单克隆抗体结合PAI-1上基本上相同的表位，所述分离的单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含SEQ ID NO:6中的CDR1(SEQ ID NO:34)，CDR2(SEQ ID NO:33)，和CDR3(SEQID NO:32)，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO:7中的CDR1(SEQ ID NO:37)，CDR2(SEQ IDNO:36)，和CDR3(SEQ ID NO:35)。
某一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:76的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:75的重链CDR2区，和包含SEQID NO:74的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:79的轻链CDR1区，包含SEQ IDNO:78的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:77的轻链CDR3区。
一方面，本文公开了一种特异性结合人PAI-1的人源化单克隆抗体，其中该抗体包含：(a)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:82的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:91的轻链可变区，或其抗原结合片段；(b)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:83的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:92的轻链可变区，或其抗原结合片段；(c)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:84的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:93的轻链可变区，或其抗原结合片段；(d)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:85的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:91的轻链可变区，或其抗原结合片段；(e)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:85的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:93的轻链可变区，或其抗原结合片段；(f)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:86的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:94的轻链可变区，或其抗原结合片段；(g)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:87的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:95的轻链可变区，或其抗原结合片段；(h)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:88的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ IDNO:96的轻链可变区，或其抗原结合片段；(i)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:89的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:97的轻链可变区，或其抗原结合片段；(j)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:90的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:98的轻链可变区，或其抗原结合片段；(k)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:86的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ IDNO:93的轻链可变区，或其抗原结合片段；(l)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:86的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:95的轻链可变区，或其抗原结合片段；(m)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:89的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:93的轻链可变区，或其抗原结合片段；或(n)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:89的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQID NO:95的轻链可变区，或其抗原结合片段。又一方面，人源化重链可变区与任何之前公开的人重链可变区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且人源化轻链可变区与任何之前公开的人轻链可变区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：(a)重链框架区和包含SEQ ID NO:86的重链可变区，和(b)轻链框架区和包含SEQ ID NO:93的轻链可变区。在某些方面，该分离的单克隆重链包含与SEQ ID NO:86中的重链框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的重链框架区，且该分离的单克隆抗体轻链包含与SEQ ID NO:93中的框架区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同的轻链框架区。在某些其它方面，该分离的单克隆抗体重链包含与SEQ ID NO:86中的重链框架区95％相同的重链框架区，且该分离的单克隆抗体轻链包含与SEQ ID NO:93中的框架区95％相同的轻链框架区。
另一方面，本文公开了一种特异性结合人PAI-1的人源化单克隆抗体，其中该抗体包含重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:154的重链可变区，或其抗原结合片段；该轻链具有包含SEQ ID NO:153的轻链可变区，或其抗原结合片段。另一方面，本文公开了一种特异性结合人PAI-1的人源化单克隆抗体，其中该抗体包含重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:155的重链可变区，或其抗原结合片段，该轻链具有包含SEQ ID NO:153的轻链可变区，或其抗原结合片段。又一方面，人源化重链可变区与任何之前公开的人重链可变区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同，且人源化轻链可变区与任何之前公开的人轻链可变区99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其中该抗体结合包含SEQ ID NO:158的多肽。在另一个实施方案中，该分离的单克隆抗体结合包含SEQ IDNO:158的多肽的片段。在另一个实施方案中，该特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体结合包含SEQ ID NO:156和/或SEQ ID NO:158的多肽。在另一个实施方案中，该特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体结合包含SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158和/或SEQ ID NO:157的多肽。在另一个实施方案中，该特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体包含针对SEQ ID NO:1残基160、262、296-297、300-307和/或310-316的特异性结合亲和力。在某些实施方案中，本文公开的分离的单克隆抗体至少与SEQ ID NO:1的残基311，312，和313(D-Q-E)相互作用。在某些实施方案中，该抗体结合的PAI-1为人PAI-1。在其它实施方案中，该抗体结合的PAI-1为人PAI-1的活性形式。
在其它实施方案中，本文公开的特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体结合包含SEQ ID NO:161的多肽。在其它实施方案中，该分离的单克隆抗体结合包含SEQ ID NO:159和/或SEQ ID NO:161的多肽。在其它实施方案中，该分离的单克隆抗体结合包含SEQ IDNO:159、SEQ ID NO:160和/或SEQ ID NO:161的多肽。在另一个实施方案中，该特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体包含针对食蟹猴PAI-1(SEQ ID NO:162)残基44-64和/或残基307-321的特异性结合亲和力。在某些实施方案中，该抗体结合的PAI-1为食蟹猴PAI-1。在其它实施方案中，该抗体结合的PAI-1为食蟹猴PAI-1的休眠形式(latent form)。
又一方面，本文公开了一种分离的单克隆抗体，其竞争性抑制任何公开的抗体对PAI-1的结合。在一个实施方案中，本文公开了一种分离的单克隆抗体，其与本文公开的任何分离的单克隆抗体竞争结合和/或竞争性抑制本文公开的任何分离的单克隆抗体的结合。在某些实施方案中，该分离的单克隆抗体竞争或竞争性抑制对人PAI-1的结合。在某些实施方案中，该分离的单克隆抗体竞争或竞争性抑制对包含SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157和/或SEQ ID NO:158的多肽的结合。在另一个实施方案中，该分离的单克隆抗体竞争或竞争性抑制对包含SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160和/或SEQ ID NO:161的多肽的结合。在一个实施方案中，该分离的抗体与如下的分离的单克隆抗体竞争对包含SEQ ID NO:156、157和/或158的多肽的结合，该分离的单克隆抗体包含(a)重链框架区，包含SEQ ID NO:34的重链CDR1区，包含SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和包含SEQ ID NO:32的重链CDR3区；和(b)轻链框架区，包含SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，包含SEQ ID NO:145的轻链CDR2区，和包含SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。
另一方面，本文公开了编码本文公开的任何分离的单克隆抗体的核苷酸。
一方面，本文公开了一种治疗由增加的PAI-1表达或增加的对PAI-1的敏感性引起的病况的方法，其包括通过口服，通过注射用溶液胃肠外地，通过吸入，或局部地对患者或其它受试者施用药学上有效的量的PAI-1抗体。
一方面，本文公开了一种恢复纤溶酶生成的方法，其包括通过口服，通过注射用溶液胃肠外地，通过吸入，或局部地对有需要的患者或其它受试者施用药学上有效的量的PAI-1抗体。本文公开的胃肠外施用包括静脉内，滴注，动脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，直肠或***，静脉内，动脉内，皮下，和肌肉内形式的胃肠外施用。在一些实施方案中，对患者或其它受试者的施用包括多次施用。另一方面，恢复纤溶酶生成的方法促进包含纤维化组织水平增高的病况的治疗性处理。一些方面，该病况特征在于纤维化。在一些方面，该病况为纤维化、皮肤纤维化、***性硬化、肺纤维化、特发性肺纤维化、间质性肺病和慢性肺病。在其它方面，纤溶酶生成促进肝纤维化、肾纤维化，包括慢性肾病、血栓形成、静脉和动脉血栓形成、深静脉血栓形成，四肢(peripheral limb)缺血、散布性血管内凝固血栓形成(disseminated intravascular coagulation thrombosis)、有和无溶栓的急性缺血性中风或支架再狭窄的治疗性处理。
另一方面，本文公开了药学上有效的量的PAI-1抗体在制备用于治疗由增加的PAI-1表达或增加的对PAI-1的敏感性引起的病况的药物中的用途，包括通过口服，通过注射用溶液胃肠外地、通过吸入或局部地对患者或其它受试者施用。
一方面，该药物用于治疗包含纤维化组织水平增高的病况。在一些方面，该病况特征在于纤维化。在一些方面，该病况为纤维化、皮肤纤维化、***性硬化、肺纤维化、特发性肺纤维化、间质性肺病和慢性肺病。在其它方面，该药物用于治疗包含肝纤维化、肾纤维化，包括慢性肾病、血栓形成、静脉和动脉血栓形成、深静脉血栓形成、四肢(peripheral limb)缺血、散布性血管内凝固血栓形成(disseminated intravascular coagulationthrombosis)、有和无溶栓的急性缺血性中风或支架再狭窄的病况。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其中该抗体抑制肺纤维化。在某些实施方案中，该抗体抑制受试者肺中的纤维化。在某些实施方案中，该抗体抑制具有特发性肺纤维化(IPF)的受试者肺中的纤维化。在一些实施方案中，本文公开的分离的单克隆抗体诱导受试者中的纤维蛋白降解的增加。某些实施方案中，该抗体提高受试者血浆中的纤维蛋白降解。在一些其它实施方案中，本文公开的分离的单克隆抗体抑制受试者肺中的胶原积累。在一些实施方案中，该受试者具有IPF。在一些其它实施方案中，本文公开的分离的单克隆抗体提高受试者支气管肺泡灌洗液(BALF)中D-二聚体的水平。在一些实施方案中，该受试者具有IPF。在一些其它实施方案中，本文公开的分离的单克隆抗体特异性结合PAI-1，其中该抗体抑制受试者中纤维化所致肺重量增加。在一个实施方案中，该受试者具有IPF。
另一方面，本文公开了药学上有效的量的PAI-1抗体在制备用于治疗由增加的PAI-1表达或增加的对PAI-1的敏感性引起的病况的药物中的用途，包括通过口服，通过注射用溶液胃肠外地，通过吸入，或局部地对患者施用，其中该病况为特发性肺纤维化。
另一方面，本文公开了一种恢复纤溶酶生成的方法，其包括通过口服，通过注射用溶液胃肠外地，通过吸入，或局部地对患者或其它受试者施用药学上有效的量的PAI-1抗体，其中纤溶酶生成促进特发性肺纤维化的治疗性处理。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其中该抗体恢复受试者中的纤维蛋白溶解活性。在某些实施方案中，该抗体恢复具有急性缺血性中风的受试者中的纤维蛋白溶解活性。急性缺血性中风可以有或无溶栓。在一些实施方案中，该分离的单克隆抗体恢复凝块溶解。在某些实施方案中，该抗体在体外恢复凝块溶解。在其它实施方案中，该抗体以约2nM的IC50在体外恢复凝块溶解。
其它方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其中该抗体在受试者中恢复纤维蛋白分解。在一些实施方案中，该受试者具有急性缺血性中风。
另一方面，本文公开了药学上有效的量的PAI-1抗体在制备用于治疗由增加的PAI-1表达或增加的对PAI-1的敏感性引起的病况的药物中的用途，包括通过口服，通过注射用溶液胃肠外地，通过吸入，或局部地对患者施用，其中该病况为有和无溶栓的急性缺血性中风。
另一方面，本文公开了一种恢复纤溶酶生成的方法，其包括通过口服，通过注射用溶液胃肠外地，通过吸入，或局部地对有需要的患者或其它受试者施用药学上有效的量的PAI-1抗体，其中纤溶酶生成促进有和无溶栓的急性缺血性中风的治疗性处理。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其中该抗体抑制受试者中的粘连形成。在一些实施方案中，粘连形成在受试者经受手术或损伤之后发生。在一些实施方案中，受试者中的粘连形成在腹部。在其它实施方案中，粘连形成发生于受试者的肩、骨盆、心、脊柱、手和其它身体区域。
另一方面，本文公开了药学上有效的量的PAI-1抗体在制备用于治疗或预防由增加的PAI-1表达或增加的对PAI-1的敏感性引起的病况的药物中的用途，包括通过口服，通过注射用溶液胃肠外地，通过吸入，或局部地对患者施用，其中该病况为腹部粘连形成。
另一方面，本文公开了一种恢复纤溶酶生成的方法，其包括通过口服，通过注射用溶液胃肠外地，通过吸入，或局部地对有需要的患者或其它受试者施用药学上有效的量的PAI-1抗体，其中纤溶酶生成促进粘连形成的治疗性处理或预防。在一些实施方案中，受试者中的粘连形成在腹部。
另一方面，本文公开了一种分离的单克隆抗体，其结合PAI-1/玻璃粘连蛋白复合物。另一方面，本文公开了一种分离的单克隆抗体，其通过诱导PAI-1底物构象而中和PAI-1活性。在一个实施方案中，该抗体恢复或能够恢复纤溶酶生成。在另一个实施方案中，该分离的单克隆抗体诱导或能够诱导纤连蛋白降解。在还有另一个实施方案中，该分离的单克隆抗体诱导或能够诱导基质金属蛋白酶(MMP)活化。
另一方面，本文公开的分离的单克隆抗体为抗体片段。在一些实施方案中，该抗体为单链Fv抗体。在其它实施方案中，重链和轻链通过柔性接头而连接以形式单链抗体。在其它实施方案中，该抗体为Fab，Fab'，或(Fab')2抗体。
另一方面，本文公开了一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其中该抗体为结晶抗体。在一个实施方案中，本文公开了一种分离晶体，其包含单克隆抗体A44的Fab'片段，其中该Fab'片段由轻链序列SEQ ID NO:7和重链序列SEQ ID NO:6组成。在另一个实施方案中，本文公开了一种分离的晶体，其包含Fab'片段，其中该Fab'片段包含轻链序列SEQID NO:93和重链序列SEQ ID NO:86。在一个实施方案中，该分离的晶体包含不对称的单位细胞尺寸
Figure BDA0000958883060000174
和
Figure BDA0000958883060000173
在一个实施方案中，该分离的晶体属于P212121空间群。在另一个实施方案中，该分离的晶体包含
Figure BDA0000958883060000181
分辨率的x-射线衍射。在一个实施方案中，该分离的晶体保留结晶抗体的生物学活性。在一些实施方案中，该分离的晶体具有比结晶抗体的可溶性对应物要长的体内半衰期。
一方面，本文公开了一种药物组合物，其包含：(a)特异性结合PAI-1的结晶抗体和(b)至少一种包埋或封装晶体的药学赋形剂。
另一方面，本文公开了一种药物组合物，其包含药物可接受载体和治疗有效的量的本文公开的任何抗体。
一方面，本文公开了一种生成针对PAI-1的抗体的方法，其包括用由PAI-1或其片段与玻璃粘连蛋白构成的复合物免疫哺乳动物。
另一方面，本文公开了一种在ELISA中对PAI-1抗体筛选其阻断PAI-1作为tPA活性抑制剂的功能的能力的方法，其包括下述步骤：(a)使PAI-1结合至ELISA板；(b)将ELISA板与PAI-1抗体一起温育；(c)将ELISA板与tPA一起温育；(d)将ELISA板与经过标记的抗tPA抗体一起温育；并(e)测量由经过标记的抗tPA抗体发射的OD405；其中正读数(positivereadout)指示PAI-1抗体结合PAI-1但不阻断PAI-1和tPA之间共价键的形成，而负读数(negative readout)指示PAI-1抗体阻断tPA与PAI-1的相互作用。
另一方面，本文公开了一种筛选杂交瘤的方法。在某些实施方案中，该筛选方法包括使用固定化的抗小鼠抗PAI-1抗体进行逆向筛选的方法。在其它实施方案中，该筛选方法包括使用游离PAI-1作为配体或针对固定化的玻璃粘连蛋白进行的正向筛选测试。在某些实施方案中，应用该方法来测定抗体针对PAI-1/玻璃粘连蛋白复合物的亲和力。在一些实施方案中，该方法包括：将玻璃粘连蛋白固定化至表面；使PAI-1与固定化至表面的玻璃粘连蛋白接触，由此形成复合物；使包含复合物的表面与抗体接触；将结合至复合物的抗体与未结合的抗体分开；检测结合至复合物的抗体，并分析结合至复合物的抗体的水平以测定抗体对复合物的亲和力。
附图简述
图1描述了PAI-1和丝氨酸蛋白酶组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)之间机制的示意表示。PAI-1显示结构柔性，并可以休眠构象或(当其结合于玻璃粘连蛋白(Vn)时)活性构象存在。PAI-1的RCL区携带诱饵肽键(也称作P1-P1’)，其为丝氨酸蛋白酶的裂解位点。首先形成与tPA或uPA的Michaelis复合物，随后催化三元组与诱饵肽键反应以形成酰基酶复合物，当裂解P1-P’1肽键之后，该复合物诱导强烈的构象变化。酰基酶是由来自丝氨酸蛋白酶(tPA)的催化三元组的丝氨酸残基(黑色三角形)和来自底物的氨基酸(黑色圈)之间的共价键形成的不稳定复合物，其发生进一步水解。该构象变化导致裂解的PCL***β-链，且蛋白酶作为酰基酶保持与PAI-1的共价结合。在非生理情况下，该酰基酶复合物的水解可能诱导裂解的PAI-1的释放并使得活性蛋白酶游离。
图2描述了实施例2中所述的结合ELISA中抗体滴定的典型的标准曲线。抗体31C9、33B8和33HI是阳性对照，而IgG1是阴性对照。
图3描述了实施例4中所述的为了选择阻断PAI-1与tPA的相互作用的抗体的功能性ELISA。抗体33H1是阳性对照，IgG1是阴性对照，而A44鉴定为阳性抗体克隆。
图4描述了实施例4中描述的生色测试中A44和商业上可获得的抗体(33B8和33H1)对tPA的人PAI-1阻断活性的中和。
图5描述了来自不同融合产生的抗体选择对tPA的人PAI-1阻断活性的中和(参见实施例4)。
图6描述了在具有相似效力的生色测试中人PAI-1及其直系同源物阻断人tPA活性。
图7描述了实施例4中所述的生色测试中A44和33B8(商业上可获得的)抗体对人tPA的食蟹猴(cyno)和小鼠PAI-1阻断活性的中和。
图8描述了抗体33H8(将PAI-1从活性转化为休眠构象)、33H1(将PAI-1从活性转化为底物构象)和A44阻断PAI-1与tPA相互作用的作用机制的SDS-PAGE分析。泳道1分子量标记；泳道2：仅PAI-1；泳道3：仅tPA；泳道4：tPA存在下的PAI-1；泳道5：33B8+PAI-1+tPA；泳道6：33H1+PAI-1+tPA；泳道7：A44+PAI-1+tPA；泳道8：mAb是同种型对照抗体。
图9描述了抗体33H8(将PAI-1从活性转化为休眠构象)、33H1(将PAI-1从活性转化为底物构象)和从融合物C26、E16和E21开发的抗体阻断PAI-1与tPA相互作用的作用机制的SDS-PAGE分析。泳道1分子量标记；泳道2：仅PAI-1；泳道3：仅tPA；泳道4：tPA存在下的PAI-1；泳道5：33B8+PAI-1+tPA；泳道6：33H1+PAI-1+tPA；泳道7：C26+PAI-1+tPA；泳道8：E16+PAI-1+tPA；泳道9：E21+PAI-1+tPA；泳道10：mAb是同种型对照抗体。
图10描述了抗体33H8(将PAI-1从活性转化为休眠构象)、33H1(将PAI-1从活性转化为底物构象)和从融合物A39、B109和C45开发的抗体阻断PAI-1与tPA相互作用的作用机制的SDS-PAGE分析。泳道1分子量标记；泳道2：仅PAI-1；泳道3：仅tPA；泳道4：tPA存在下的PAI-1；泳道5：33B8+PAI-1+tPA；泳道6：33H1+PAI-1+tPA；泳道7：A39+PAI-1+tPA；泳道8：B109+PAI-1+tPA；泳道9：C45+PAI-1+tPA；泳道10：mAb是同种型对照抗体。
图11描述了下述鼠类抗体的轻链的比对：A105(SEQ ID NO:3)、A39(SEQ ID NO:5)、A44(SEQ ID NO:7)、A71(SEQ ID NO:9)、A75(SEQ ID NO:81)、B109(SEQ ID NO:11)、B28(SEQ ID NO:13)、C45(SEQ ID NO:15)、E16(SEQ ID NO:17)和E21(SEQ ID NO:19)。CDR以粗体凸显。
图12描述了下述鼠类抗体的重链的比对：A105(SEQ ID NO:2)、A39(SEQ ID NO:4)、A44(SEQ ID NO:6)、A71(SEQ ID NO:8)、A75(SEQ ID NO:80)、B109(SEQ ID NO:10)、B28(SEQ ID NO:12)、C45(SEQ ID NO:14)、E16(SEQ ID NO:16)和E21(SEQ ID NO:18)。通过IMGT定义的CDR以粗体凸显。
图13描述了鼠类A44轻链(SEQ ID NO:7)与vk1(SEQ ID NO:101)和vλ3(SEQ IDNO:102)的比对。
图14描述了鼠类A44轻链(SEQ ID NO:6)与vh2(SEQ ID NO:103)和vh4(SEQ IDNO:104)的比对。
图15描述了克隆A44人源化VL，其中比对了所有构建体。所有比对的序列(SEQ IDNO:91-98)进一步在下表25中描述。黑色框代表CDR域。凸显的残基与比对中紧邻上一排的残基在序列上不同。残基编号如IMGT所述。
图16描述了克隆A44人源化VH，其中比对了所有构建体。所有比对的序列(SEQ IDNO:82-90)进一步在下表25中描述。黑色框代表CDR域。凸显的残基与比对中紧邻上一排的残基在序列上不同。残基编号如IMGT所述。
图17描述了将PAI-1活性的抑制百分比作为mAB浓度的函数作图，并使用Biostatspeed软件的Imax确定IC50。
图18描述了同质重组6-His标记的Fab A44的纯化。
图19描述了使用与固定化APG抗体结合的人糖基化PAI-1的单次动力学分析的用Biacore 2000进行的SPR分析。来自单循环动力学的感应谱(sensorgrams)以灰色显示。拟合模型以黑色显示。
图20描述了如通过ELISA进行的UK-PAI-1复合物形成检测所确定的APG、APGv2和APGv4抗体对人血浆PAI-1的中和。将PAI-1活性的抑制百分比作为APG、APGv2或APGv4抗体的浓度的函数作图。
图21描述了通过浊度法动力学测量(作为时间(分钟)的函数在340nm的吸光度读数)检测的在tPA 1nM和PAI-1 3nM存在下A44V11(1、3或10nM)对人血浆凝块溶解的恢复。
图22描述了通过作为时间(分钟)的函数在340nm的吸光度检测的在tPA1nM和PAI-1 3nM存在下人IgG1阴性对照(1、3或10nM)缺乏对人血浆凝块溶解的恢复。
图23描述了多种浓度A44V11或人IgG1同种型阴性对照对人血浆凝块溶解的恢复。
图24描述了通过作为时间(分钟)的函数在340nm的吸光度检测的在tPA1nM和PAI-1 3nM存在下3nM的APG、APGV2或APGV4对人血浆凝块溶解的恢复。
图25描述了在多种浓度APG变体2和4对人血浆凝块溶解的恢复。
图26描述了在由A44V11或IgG同种型对照mAb在50nM和TGFβ5ng/ml处理之后48小时抗PAI-1对人LL29成肌纤维细胞上清的免疫印迹。
图27描述了在用PBS(对照)、纤溶酶原(Pg)、A44v11和纤溶酶原(A+Pg)或阴性人IgG和纤溶酶原(Neg+Pg)进行细胞处理48小时之后人原代肺成纤维细胞中的类属MMP活性(generic MMP activity)。
图28描述了在第4天用A44或IgG1在10mg/kg或PBS通过i.p.施用治疗之后，来自在第7天和第9天博来霉素(bleomycin)治疗的小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)(A)和肺溶解物(B)中人活性PAI-1水平。活性PAI-1通过ELISA(#HPAIKT Molecular Innovation)确定。抑制百分比通过将A44bleo和IgG bleo之间的差异除以IgG bleo和未经处理的(PBS)小鼠组之间的差异来计算。
图29描述了通过ELISA(Asserachrom D-Di,Diagnostica Stago)确定的在第4天用A44或IgG1在10mg/kg或PBS通过i.p.施用治疗之后，来自在第7天和第9天博来霉素治疗的小鼠的BALF中的小鼠D-二聚体水平。表示了与IgG的比较由A44诱导的D-二聚体的倍数增加。
图30描述了来自在第4天至第20天每3天以盐水或博来霉素治疗随后PBS(媒介)、IgG1或A44 10mg/kg i.p.施用之后21天，转基因人源化小鼠的右肺重量。
图31描述了在第4天至第20天每3天以盐水或博来霉素治疗随后PBS(媒介)、IgG1或A44 10mg/kg i.p.施用之后21天，转基因人源化小鼠中的羟脯氨酸肺含量。
图32描述了LPS攻击(100ug/kg iv)之前24小时来自由A44V11(A)mAb(n＝5)或IgG1同种型对照(B)(n＝4)(5mg/kg ip)处理的猴的血浆中活性PAI-1水平。在所示的时间点收获血液样品，并在血浆中使用ELISA(#HPAIKT，来自Molecular Innovation)确定活性PAI-1水平。
图33描述了LPS攻击(100ug/kg iv)之前24小时来自由A44V11(A)mAb(n＝5)或IgG1同种型对照(B)(n＝4)(5mg/kg ip)处理的猴的肝活检中的活性PAI-1水平。在所示的时间点在经麻醉的猴中收获肝活检，并使用ELISA(#HPAIKT，来自Molecular Innovation)确定裂解液中的活性PAI-1水平。
图34描述了LPS攻击(100ug/kg iv)之前24小时来自由A44V11(A)mAb(n＝5)或IgG1同种型对照(B)(n＝4)(5mg/kg ip)处理的猴的血浆中的D-二聚体水平。在所示的时间点收获血液样品，并在血浆中使用ELISA确定D-二聚体水平。
图35描述了LPS攻击(100ug/kg iv)之前24小时来自由A44V11(A)mAb(n＝5)或IgG1同种型对照(B)(n＝4)(5mg/kg ip)处理的猴中的纤溶酶-α2抗纤溶酶(PAP)复合物水平。在所示的时间点收获血液样品，并在血浆中使用ELISA(#Asserachrom PAP，来自Diagnostica Stago)确定PAP水平。
图36描述了腹膜内液(IPF)和子宫角裂解物中的活性PAI-1的水平。在腹膜内液(A)和子宫角裂解物(B)中的活性PAI-1水平。在第6小时和第7天的时间点，在用A44V11抗体处理的动物中，在腹膜内液(IPF)和子宫角(UH)裂解物二者中的活性PAI-1水平与同种型对照抗体处理的动物相比均较低，在第72小时时间点未观察到差异(通过Student T-检验计算*p<0.001)。
图37描述了同质重组6-His标记的Fab A44的纯化的另一个实例。
图38描述了与人wt PAI-1蛋白复合的同质重组6-His标记的的Fab A44的纯化。
图39(a)描述了Fab A44/PAI-1复合物的复合结晶，而图39(b)描述了最佳优化的晶体。
图40描述了Fab A44/PAI-1复合物的杆状单晶。
图41描述了Fab A44对人PAI-1的活性形式和食蟹猴PAI-1的休眠形式的识别。
图42描述了在(A)有活性的人PAI-1和(B)休眠的食蟹猴PAI-1中由FabA44识别的PAI-1表位。
图43描述了Fab A44/PAI-1复合物的重链互补位。
图44描述了Fab A44/PAI-1复合物的轻链互补位。
图45描述了食蟹猴、人、大鼠和小鼠PAI-1的提出的A44结合表位的序列比对。序列摘自SEQ ID NO:1(人PAI-1)、SEQ ID NO:162(食蟹猴PAI-1)、SEQ ID NO:163(小鼠PAI-1)和SEQ ID NO:164(大鼠PAI-1)。
图46描述了小鼠PAI-1结构与人PAI-1/A44V11复合物结构的比较。
图47显示了人PAI-1/A44V11复合物的结构和玻璃粘连蛋白结合于PAI-1的模型的比较。
图48描述了食蟹猴-PAI-1(SEQ ID NO:162)的胃蛋白酶肽覆盖；从150个重叠的胃蛋白酶肽获得了95.3％序列覆盖。
图49描述了在未结合(圆圈线)、APGv2结合(x-线)和A44v11结合(菱形线)状态中食蟹猴PAI-1肽的代表性氘摄取图。残基范围/位置来自SEQ ID NO:162。(A)大多数胃蛋白酶肽在食蟹猴PAI-1本身或与任一mAb结合之间未显示任何区别。(B)覆盖残基44-64的肽显示来自两种mAb结合状态的交换的相似保护。(C)并入残基295-322的肽在两种mAb结合状态下并入较少的氘，然而对于A44v11保护程度较大。
图50描述了食蟹猴PAI-1本身和结合于A44v11的氢/氘交换(HDX)比较。(A)在上的未结合状态和在下的结合状态之间的平均相对组分交换的蝶形图。各线对应于在10秒、1分钟、5分钟和240分钟时间点获得的数据。在(B)中，为对于食蟹猴PAI-1本身或结合于A44v11的来自上述(A)中的图的差异数据(以道尔顿)的图。
图51描述了食蟹猴PAI-1本身和结合于APGv2的HDX比较。在(A)中，为在上的未结合状态和在下的结合状态之间的平均相对组分交换的蝶形图。各线对应于在10秒、1分钟、5分钟和240分钟时间点获得的数据。在(B)中，为对于食蟹猴PAI-1本身或结合于APGv2的来自上述图(A)中的差异数据的图。
图52描述了食蟹猴PAI-1结合于A44v11和结合于APGv2的HDX比较。在(A)中，为在上的APGv2结合状态和在下的A44v11结合状态之间的平均相对组分交换的蝶形图。各线对应于在10秒、1分钟、5分钟和240分钟时间点获得的数据。在(B)中，为对于食蟹猴PAI-1结合于APGv2或A44v11的来自上述图(A)中的差异数据的图。
图53描述了通过HDX MS确定的食蟹猴-PAI-1:A44v11表位。显示保护免于A44v11抗体结合状态的交换的食蟹猴PAI-1(SEQ ID NO:162)的残基以粗体显示。从结晶研究确定的食蟹猴-PAI-1:A44v11表位的残基显示于框中。
发明详述
本发明提供特异性结合人PAI-1和调控PAI-1生物学功能的抗体及其片段。这种抗体对于治疗PAI-1相关疾病或病症(例如纤维化)特别有用。本发明还提供药物组合物，以及编码PAI-1抗体的核酸，用于生成这种抗体或其片段的重组表达载体和宿主细胞。本发明还涵盖在体外或在体内使用本文公开的抗体来检测PAI-1或调控PAI-1活性的方法。
I.定义
为了可以更加容易地理解本发明，首先定义某些术语。
如本文中使用的术语“人PAI-1”指包含下文所列氨基酸序列或由下文所列氨基酸序列组成的肽：
VHHPPSYVAHLASDFGVRVFQQVAQASKDRNVVFSPYGVASVLAMLQLTTGGETQQQIQAAMGFKIDDKGMAPALRHLYKELMGPWNKDEISTTDAIFVQRDLKLVQGFMPHFFRLFRSTVKQVDFSEVERARFIINDWVKTHTKGMISNLLGKGAVDQLTRLVLVNALYFNGQWKTPFPDSSTHRRLFHKSDGSTVSVPMMAQTNKFNYTEFTTPDGHYYDILELPYHGDTLSMFIAAPYEKEVPLSALTNILSAQLISHWKGNMTRLPRLLVLPKFSLETEVDLRKPLENLGMTDMFRQFQADFTSLSDQEPLHVAQALQKVKIEVNESGTVASSSTAVIVSARMAPEEIIMDRPFLFVVRHNPTGTVLFMGQVMEP(SEQ ID NO.1)，或其片段。
如本文中使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键相互连接的四条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链，及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含一个重链可变区(缩写为VH或VH)和一个重链恒定区(CH或CH)。重链恒定区包含三个结构域，CH1，CH2和CH3。每条轻链包含一个轻链可变区(缩写为VL或VL)和一个轻链恒定区(CL或CL)。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可进一步细分成高变区域，称作互补决定区(CDR)，期间穿插有称作框架区(FR)的更加保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端至羧基端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文中使用的术语抗体的“抗原结合片段”包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、通过酶法可得的、合成的或遗传工程的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何合适的标准技术衍生自例如完整抗体分子，所述技术如蛋白水解消化或重组遗传工程技术，其涉及操作和表达编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA。抗原结合部分的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的互补决定区(CDR))。其它工程化分子，如双抗体、三抗体、四抗体和迷你抗体也涵盖在表述“抗原结合片段”内。
如本文中使用的术语“CDR”或“互补决定区”表示在重和轻链多肽二者的可变区内找到的非连续抗原结合位点。这些特别的区域已经记载于Kabat等，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat等，Sequences of protein of immunological interest(1991)，和Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)和MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，其中定义包括彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。Kabat定义基于序列可变性。所有物种的所有IG和TR V区的IMGT唯一编号依赖于可变区结构的高度保守性(Lefranc，Mp等，Dev comp.Immunol.27：55-77，2003)。在比对超过5,000条序列后建立的IMGT编号考虑并组合框架和CDR的定义。Clothia定义基于结构环区的定位。接触定义(MacCallum等)基于对复合物晶体结构和抗体-抗原相互作用的分析。列出了涵盖通过上文引用的每一篇参考文献定义的CDR的氨基酸残基进行比较。在本文公开的一个实施方案中，术语“CDR”为通过Kabat定义来定义的CDR。在本文公开的另一个实施方案中，CDR为通过IMGT来定义的CDR。
如本文中使用的术语“框架(FR)氨基酸残基”指Ig链的框架区中的那些氨基酸。如本文中使用的术语“框架区”或“FR区”包括构成可变区的一部分，但不构成CDR(例如使用CDR的接触定义)的一部分的氨基酸残基。因此，可变区框架的长度介于约100-120氨基酸之间，但是只包括CDR以外的那些氨基酸。
本发明还涵盖本文公开的抗体的CDR氨基酸序列中的“保守氨基酸取代”，即不消除抗体对抗原，即PAI-1的结合的氨基酸序列修饰。保守取代为用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对该位置的氨基酸残基的极性或电荷影响很小或没有影响。例如，保守取代源自将多肽中的非极性残基用任何其它非极性残基替换。而且，多肽中的任何天然残基也可用丙氨酸取代，正如之前关于“丙氨酸扫描诱变”记载的(Cunningham等，Science 244：1081-85(1989))。保守氨基酸取代包括将一个类别的氨基酸用相同类别的氨基酸取代，其中类别通过共同物理化学氨基酸侧链特性和在自然界中找到的同源蛋白中的高取代频率(如例如通过标准Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵确定的)来定义。已经归类出六大类氨基酸侧链，包括：I类(Cys)；II类(Ser，Thr，Pro，Ala，Gly)；III类(Asn，Asp，Gln，Glu)；IV类(His，Arg，Lys)；V类(Ile，Leu，Val，Met)；和VI类(Phe，Tyr，Trp)。例如，Asp取代另一种III类残基如Asn，Gln，或Glu为保守取代。因此，将PAI-1抗体中预测为不重要的氨基酸残基用来自相同类别的另一种氨基酸残基取代。鉴定不消除抗原结合的氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见例如Brummell等，Biochem.32：1180，1993；Kobayashi等，ProteinEng.12：879，1999；和Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412，1997)。下文表1列出了保守氨基酸取代的一般规则。
表1:保守的氨基酸取代
Figure BDA0000958883060000261
Figure BDA0000958883060000271
保守氨基酸取代还涵盖非天然存在的氨基酸残基，它们通常是通过化学肽合成而非通过生物学***中的合成并入的。这些包括肽模拟物(peptidomimetics)，和氨基酸部分的其它反向或倒置形式。
对氨基酸序列的保守修饰(及对编码核苷酸的相应修饰)预期生成具有与天然存在的PAI-1抗体相似的功能和化学特征的PAI-1抗体。相反，对PAI-1抗体的功能或化学特征的实质性修饰可通过选择在其维持(a)取代区域中分子主链的结构，例如片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的效果方面显著不同的取代来实现。天然存在的残基可基于共同侧链特性来分组：
1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr；
3)酸性：Asp，Glu；
4)碱性：Asn，Gln，His，Lys，Arg；
5)影响链方向的残基：Gly，Pro；和
6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守性取代可涉及用这些类别之一的成员交换另一类别的成员。可将这种取代残基引入人PAI-1抗体中与非人PAI-1抗体同源的区域，或分子的非同源区域。
在某些方面，重或轻链可变区可以与本文公开的任何可变区序列99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，或90％相同。
如本文中使用的术语“特异性结合”指抗体或其抗原结合片段以低于1x10-6M、1x10-7M、1x 10-8M、1x 10-9M、1x 10-10M、1x 10-11M、1x 10-12M或更低的Kd结合抗原的能力。该术语还指抗体或其抗原结合片段以比其对非特异性抗原的亲和力大至少两倍的亲和力结合抗原的能力。
本公开还提供竞争性抑制抗体对本文公开的表位的结合的抗体，如通过本领域已知用于测定竞争性结合的任何方法测定的，例如本文中描述的免疫测试。在某些实施方案中，抗体将对表位的结合竞争性抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％。
如本文中使用的术语“抗原”指由抗体或其抗原结合片段识别的结合位点或表位。
如本文中使用的术语“载体”意在指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，指其中可连接别的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体为病毒载体，其中可将别的DNA区段连接入病毒基因组。某些载体能够在它们导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。可将其它载体(例如非附加体哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。这种载体在本文中称作“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，重组DNA技术中利用的表达载体常常处于质粒的形式。术语“质粒”和“载体”可互换使用。然而，本发明意图包括这种其它形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，它们发挥等同的功能。
就本发明而言，可采用众多表达载体***。例如，一类载体利用衍生自动物病毒如牛***瘤病毒(bovine papilloma virus)、多瘤病毒(polyoma virus)、腺病毒(adenovirus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、杆状病毒(baculovirus)、逆转录病毒(retroviruses)(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA组件。其它涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子***。另外，有DNA整合入染色体的细胞可通过导入一种或多种允许选择经过转染的宿主细胞的标志物来选择。标志物可以提供原养型给营养缺陷型宿主，生物杀伤抗性(例如抗生素)或针对重金属如铜的抗性。可将可选择标志物基因直接连接至要表达的DNA序列，或通过共转化导入同一细胞。最佳mRNA合成可能还需要别的组件。这些组件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在具体的实施方案中，与如上所述合成的重和轻链恒定区基因(例如人的)一起将克隆的可变区基因***表达载体。
更一般地，一旦制备编码抗体或其片段的载体或DNA序列，就可将表达载体导入合适的宿主细胞。也就是说，可转化宿主细胞。将质粒导入宿主细胞可通过本技术领域人员熟知的多种技术来实现。这些包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、包膜DNA的细胞融合、显微注射和完整病毒感染。参见Ridgway，A.A.G."MammalianExpression Vectors"Chapter 24.2，pp.470-472Vectors，Rodriguez and Denhardt，Eds.(Butterworths，Boston，Mass。1988)。本文公开的一个实施方案是经电穿孔将质粒导入宿主。在适合于轻链和重链生成的条件下培养转化的细胞，并测定重或轻链蛋白质合成。例示性测定技术包括酶联免疫吸附测试(ELISA)、放射免疫测试(RIA)或荧光激活细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等。
如本文中使用的术语“转化”应当以广义使用，指将DNA导入受体宿主细胞，其改变基因型并随后导致受体细胞中的改变。
“宿主细胞”指经过使用重组DNA技术构建且编码至少一种异源基因的载体转化的细胞。在关于从重组宿主分离多肽的工艺的描述中，除非另外清楚说明，术语“细胞”和“细胞温育物”可互换使用，表示抗体的来源。换言之，从“细胞”回收多肽可表示来自沉降完整细胞，或来自含有培养基和悬浮细胞二者的细胞培养物。
应当理解，该术语意在不仅指特定主题细胞，而且还指这种细胞的后代。因为后代中可由于突变或环境影响而发生某些修饰，所以这种后代事实上可能与亲本细胞不同，但是仍然包括在本文中使用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文中使用的术语“治疗”和“处理”指本文中描述的治疗性或预防性措施。“治疗”方法采用将本文公开的抗体或抗原结合片段施用于受试者，例如具有PAI-1相关疾病或病症(例如纤维化疾病)或倾向于患上这种疾病或病症的受试者，从而预防，治愈，延迟疾病或病症或者复发疾病或病症，降低疾病或病症或者复发疾病或病症的严重水平，或改善疾病或病症或者复发疾病或病症的一种或多种症状，或者为了延长受试者的存活，超出在这种治疗缺失下的预期。
如本文中使用的术语“PAI-1相关疾病或病症”包括发现改变的PAI-1水平或活性的疾病状态，其中有或无与疾病状态有关的症状。例示性PAI-1相关疾病或病症包括各种类型的纤维化。
如本文中使用的术语“有效的量”指在施用于受试者时，结合PAI-1的抗体或其抗原结合片段足以实现PAI-1相关疾病或病症的有效治疗，预后或诊断的量，如本文中描述。治疗有效的量可根据所治疗的受试者和疾病状况，受试者的重量和年龄，疾病状况的严重水平，施用的方式等而变化，本领域普通技术人员能容易地确定。施用剂量的范围可以是例如约1ng至约10,000mg，约1ug至约5,000mg，约1mg至约1,000mg，约10mg至约100mg本文公开的抗体或其抗原结合片段。可调整剂量方案以提供最佳治疗响应。有效的量还指抗体或其抗原结合片段的任何有毒或有害作用(即副作用)最小化或由有益作用超越的量。
如本文中使用的术语“受试者”或“哺乳动物”包括任何人或非人动物。
如本文中使用的术语“表位”指与抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点(称作互补位)相互作用的抗原决定簇。一种抗原可具有超过一个表位。因此，不同抗体可结合抗原上的不同区域且可具有不同生物学效果。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链不同区段的在空间上毗邻的氨基酸生成。线性表位由多肽链中的邻近氨基酸残基生成。
应该注意的是，除非上下文另有清楚说明，如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”和“一种”包括复数的指代物。
II.抗PAI-1抗体
一方面本发明提供特异性结合人PAI-1的抗体或其抗原结合片段。表2列出了本文公开的抗体的例示性VH、VL和CDR氨基酸序列和核苷酸序列。表2中所示CDR区是通过IMGT定义的。
表2:例示性抗PAI-1抗体或其片段的VH、VL和CDR氨基酸序列
Figure BDA0000958883060000301
Figure BDA0000958883060000311
Figure BDA0000958883060000321
Figure BDA0000958883060000331
在另一个实施方案中，本发明提供与包含SEQ ID NO:6和7分别所述的VH和VL区氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段结合相同表位或竞争性抑制的抗PAI-1抗体。这种抗体可使用常规竞争结合测试来鉴定，包括例如基于表面等离振子共振(SPR)的竞争测试。
III.经过修饰的抗PAI-1抗体
在某些实施方案中，本文公开的抗PAI-1抗体可包含一处或多处修饰。可使用本领域已知的任何技术来生成本文公开的修饰形式的抗PAI-1抗体。
i)降低免疫原性
在某些实施方案中，使用本领域已知的技术修饰本文公开的抗PAI-1抗体或其抗原结合片段以降低它们的免疫原性。例如，可对抗体或其片段进行嵌合化，人源化，或去免疫化。
在一个实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的。嵌合抗体为抗体的不同部分衍生自不同动物物种的抗体，如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于生成嵌合抗体或其片段的方法是本领域已知的。参见例如Morrison，Science 229：1202，1985；Oi等，BioTechniques 4：214，1986；Gillies等，J.Immunol.Methods 125：191，1989；美国专利No.5,807,715；No.4,816,567；和No.4,816,397，通过提述以其整体并入本文。可采用为生成“嵌合抗体”开发的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851，1984；Neuberger等，Nature 312：604，1984；Takeda等，Nature 314：452，1985)来合成所述分子。例如，可将编码小鼠抗PAI-1抗体分子的结合特异性的遗传序列与来自具有适当生物学活性的人抗体分子的序列融合到一起。如本文中使用的嵌合抗体为不同部分衍生自不同动物物种的分子，如那些具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的，例如人源化抗体。
在另一个实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段是人源化的。人源化抗体具有包含一个或多个来自非人抗体的互补决定区(CDR)和来自人抗体分子的框架区的结合特异性。通常，人框架区中的框架残基会用来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变或改进抗原结合。这些框架取代是通过本领域熟知的方法鉴定的，例如通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对于抗原结合重要的框架残基和通过序列比较以鉴定特定位置处的非常见框架残基。参见例如Queen等，美国专利No.5,585,089；Riechmann等，Nature 332：323，1988，通过提述以其整体并入本文。可使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，所述技术包括例如CDR嫁接(EP 239,400；国际公开文本No.WO91/09967；美国专利No.5,225,539；No.5,530,101；和No.5,585,089)、镶嵌或表面重建(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28：489，1991；Studnicka等，Protein Engineering 7：805，1994；Roguska等，PNAS 91：969，1994)，和链改组(美国专利No.5,565,332)。
在一个具体的实施方案中，采用的人源化方法是基于抗体的分子柔性在免疫识别时和过程中的影响(参见国际公开文本No.WO2009/032661，通过提述以其整体并入本文)。蛋白质柔性涉及蛋白质分子的分子运动。蛋白质柔性为完整蛋白质、蛋白质的一部分或单个氨基酸残基采取彼此显著不同的构象的总体的能力。关于蛋白质柔性的信息可通过实施蛋白质X-射线结晶学实验来获得(参见例如Kundu等，Biophys.J.83：723，2002)，核磁共振实验(参见例如Freedberg等，J.Am.Chem.Soc.120：7916，1998)或运行分子动力学(MD)模拟。蛋白质的MD模拟在计算机上进行且通过计算原子彼此的物理相互作用允许确定所有蛋白质原子在一段时间里的运动。MD模拟的输出为所研究的蛋白质在模拟时间段里的轨迹。轨迹为在模拟时段里定期(例如每1皮秒(ps))取样的蛋白质构象(也称作快照)的总体。通过分析快照的总体，能量化蛋白质氨基酸残基的柔性。因此，柔性残基为在该残基处于其中的多肽的背景中采取不同构象的总体的残基。MD方法是本领域已知的，参见例如Brooks等"Proteins：A Theoretical Perspective of Dynamics,Structure and Thermodynamics"(Wiley，New York，1988)。数种软件能够进行MD模拟，如Amber(参见Case等，J.Comp.Chem.26：1668，2005；Brooks等，J.Comp.Chem.4：187，1983；和MacKerell等(1998)于"The Encyclopedia of Computational Chemistry"vol.1：271-177，Schleyer等，编，Chichester：John Wiley&Sons)或Impact(参见Rizzo等，J.Am.Chem.Soc.122：12898，2000)。
大多数蛋白质复合物分享相对较大且平坦包埋的表面，而且已经显示结合配偶的柔性为它们的可塑性提供来源，使得它们能够在构象上彼此适应(Sundberg andMariuzza，Structure 8，R137-R142，2000)。因此，已经显示“诱导配合”的实例在蛋白质-蛋白质界面中发挥支配性作用。另外，数量稳步增长中的数据显示蛋白质实际上结合不同形状、尺寸和组成的配体(Protein Science 11：184-187，2002)，而且构象多样性看来是识别不同配偶的能力的必要成分(James等，Science 299：1362，2003)。柔性残基涉及蛋白质-蛋白质配偶的结合(Grunberg等，Structure 14，683，2006)。
柔性残基能采取多种构象，提供有可能受到记忆B细胞识别及触发免疫原性应答的相互作用区域的全体。因此，抗体人源化可通过修饰一些来自框架的残基来进行，使得由经过修饰的抗体展示的构象和识别区域的全体尽可能类似于人抗体所采取的那些。这可通过修饰有限数目的残基来实现，如下进行：(1)构建亲本mAb的同源性模型并运行MD模拟；(2)分析柔性残基并鉴定非人抗体分子的最柔性残基，以及鉴定有可能作为异质性或降解反应来源的残基或基序；(3)鉴定展示与亲本抗体最相似的识别区域全体的人抗体；(4)确定要突变的柔性残基，还突变有可能作为异质性和降解来源的残基或基序；并(5)检查已知的T细胞或B细胞表位的存在情况。可使用本文中教导的MD计算来寻找柔性残基，这使用考虑了水溶剂与蛋白质原子在模拟时间段里的相互作用的隐含溶剂模型进行。
一旦在可变轻和重链内鉴定出一套柔性残基，鉴定与感兴趣抗体的重和轻链可变区框架密切相似的一套人重和轻链可变区框架。这可例如针对抗体人生殖系序列数据库对一套柔性残基使用BLAST搜索来进行。也可通过比较亲本mAb的动力学与生殖系规范结构文库的动力学来进行。CDR残基和邻近残基排除在搜索之外以确保对抗原的高亲和力得到保留。随后替换柔性残基。
当数个人残基显示相似同源性时，选择还受到有可能影响人源化抗体溶液行为的残基性质的驱动。例如，极性残基常常会比疏水性残基更频繁地存在于暴露的柔性环。还突变作为不稳定性和异质性的潜在来源的残基，即使是在CDR中找到的。这将包括暴露的甲硫氨酸(因为亚砜形成可源自氧自由基)，酸不稳定键(如Asp-Pro二肽)的蛋白水解裂解(DrugDev.Res.61：137，2004)，以暴露的天冬酰胺残基和随后的小氨基酸如Gly、Ser、Ala、His、Asn或Cys找到的脱酰胺位点(J.Chromatog.837：35，2006)和N-糖基化位点，如Asn-X-Ser/Thr位点。通常，暴露的甲硫氨酸会用Leu取代，暴露的天冬酰胺可用谷氨酰胺或用天冬氨酸替换，或者可改变后续残基。对于糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)，可改变Asn或Ser/Thr残基。
对所得复合抗体序列检查已知的B细胞或线性T细胞表位的存在情况。实施搜索，例如用公众可得的免疫表位数据库(IEDB)(PLOS Biol.(2005)3(3)e91)进行。如果在复合序列内找到已知的表位，那么获取并取代另一套人序列。因此，与美国专利No.5,639,641的重建表面方法不同，该方法解决B-细胞介导的和T-细胞介导的免疫原性应答二者。该方法还避免有时在CDR嫁接时观察到的活性损失问题(美国专利No.5,530,101)。另外，在工程化和选择过程中还考虑了稳定性和溶解性问题，产生针对低免疫原性，高抗原亲和力和改进的生物物理学特性进行了优化的抗体。
在一些实施方案中，去免疫可用于降低抗体或其抗原结合片段的免疫原性。如本文中使用的术语“去免疫”包括改变抗体或其抗原结合片段以修饰T细胞表位(参见例如国际公开文本No.WO9852976A1，WO0034317A2)。例如，可以分析来自起始抗体的VH和VL序列，并且可以从每个V区生成人T细胞表位“图谱”，显示表位相对于互补决定区(CDR)和序列内其它关键残基的定位。分析来自T细胞表位地图的各个T细胞表位以鉴定改变最终抗体活性的风险较低的备选氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列备选VH和VL序列，并随后将这些序列并入一系列PAI-1特异性抗体或其片段，供本文公开的诊断和治疗方法使用，随后可以测试功能。通常，生成并测试12至24种变体抗体。随后将包含经过修饰的V和人C区的完整重和轻链基因克隆入表达载体，随后将质粒导入细胞系，用于生成完整抗体。随后在适当的生物化学和生物学测试中比较抗体，并鉴定最佳变体。
ii)效应器功能和Fc修饰
本文公开的抗PAI-1抗体可包含介导一种或多种效应器功能的抗体恒定区(例如IgG恒定区、人IgG恒定区、人IgG1或IgG4恒定区)。例如，补体的C1成分对抗体恒定区的结合可活化补体***。补体的活化在细胞病原体的调节(opsonization)和裂解中是重要的。补体的活化还刺激炎症应答，而且还可涉及自身免疫超敏感性。而且，抗体经Fc区结合多种细胞上的受体，抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。有一些对不同类别的抗体特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)，IgE(ε受体)，IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体对细胞表面上的Fc受体的结合触发一些重要且不同的生物学应答，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏，免疫复合物的清除，杀伤细胞对抗体包被靶细胞的裂解(称作抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)，炎症介质的释放，胎盘转移和免疫球蛋白生成的控制。在某些实施方案中，本文公开的抗体或其片段结合Fc-γ受体。在可替换的实施方案中，本文公开的抗PAI-1抗体可包含缺乏一种或多种效应器功能(例如ADCC活性)或不能结合Fc受体的恒定区。
本文公开的某些实施方案包括已经缺失或以其它方式改变一个或多个恒定区结构域中的至少一个氨基酸以提供期望的生物化学特征的抗PAI-1抗体，所述特征如与具有大致相同的免疫原性的完整的、未改变的抗体相比降低的或增强的效应器功能，非共价二聚化的能力，增加的定位至身体中特定部位(例如肿瘤部位或特定器官)的能力、缩短的血清半衰期或延长的血清半衰期。例如，用于本文中描述的诊断和治疗方法使用的某些抗体或其片段为结构域缺失抗体，其包含与免疫球蛋白重链相似的多肽链，但至少缺乏一个或多个重链结构域的一部分。例如，在某些抗体中，会缺失经过修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域，例如会缺失整个或部分CH2域。
在某些其它实施方案中，抗PAI-1抗体包含从不同抗体同种型衍生的恒定区(例如来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中两种或更多种的恒定区)。在其它实施方案中，抗PAI-1抗体包含嵌合铰链(即包含自不同抗体同种型的铰链域衍生的铰链部分的铰链，例如来自IgG4分子的上部铰链域和IgG1中部铰链域)。在一个实施方案中，抗PAI-1抗体包含来自人IgG4分子的Fc区或其部分和该分子核心铰链区中的Ser228Pro突变(Kabat编号)。
在某些抗PAI-1抗体中，可使用本领域已知技术突变Fc部分以提高或降低效应器功能。例如，恒定区结构域的缺失或灭活(经由点突变或其它手段)可降低循环中的经过修饰的抗体的Fc受体结合，由此提高肿瘤定位。在其它情况中，符合本发明的恒定区修饰可缓和补体结合并因此缩短血清半衰期并降低偶联的细胞毒素的非特异性联合。还可使用恒定区的其它修饰来修饰二硫化物连接或寡糖部分(由于抗原特异性或柔性增加，允许增强的定位)。可使用熟知的免疫学技术容易地测量及量化修饰的所得生理学概况、生物利用度和其它生物化学效果，如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期，无需过度实验。
在某些实施方案中，本文公开的抗体中采用的Fc域为Fc变体。如本文中使用的术语“Fc变体”指相对于衍生所述Fc域的野生型Fc域具有至少一处氨基酸取代的Fc域。例如，在Fc域衍生自人IgG1抗体的情况中，所述人IgG1Fc域的Fc变体相对于所述Fc域包含至少一处氨基酸取代。
Fc变体的氨基酸取代可位于Fc域内的任何位置(即任何EU规则氨基酸位置)。在一个实施方案中，Fc变体在位于铰链域或其部分中的氨基酸位置处包含取代。在另一个实施方案中，Fc变体在位于CH2域或其部分中的氨基酸位置处包含取代。在另一个实施方案中，Fc变体在位于CH3域或其部分中的氨基酸位置处包含取代。在另一个实施方案中，Fc变体包含在位于CH4域或其部分中的氨基酸位置处取代。
本文公开的抗体可采用已知赋予效应器功能或FcR结合方面的改进(例如降低或增强)的任何本领域公认的Fc变体。所述Fc变体可包括例如下述中公开的任一氨基酸取代：国际PCT公开WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2，和WO06/085967A2或美国专利号5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253和No.7,083,784，其通过提述并入本文。在一个例示性实施方案中，本文公开的抗体可包含在EU位置268处包含氨基酸取代(例如H268D或H268E)的Fc变体。在另一个例示性实施方案中，本文公开的抗体可在EU位置239(例如S239D或S239E)或EU位置332(例如I332D或I332Q)处包含氨基酸取代。
在某些实施方案中，本文公开的抗体可包含Fc变体，该Fc变体包含改变抗体的抗原不依赖性效应器功能(特别是抗体的循环半衰期)的氨基酸取代。这种抗体展现与缺乏这些取代的抗体相比增加的或降低的对FcRn的结合，因此分别在血清中具有延迟的或缩短的半衰期。具有改进的对FcRn的亲和力的Fc变体预期具有更长的血清半衰期，而且这种分子在治疗哺乳动物的方法中具有有用的应用，其中期望施用的抗体的半衰期较长，例如治疗慢性疾病或病症。相反，具有降低的FcRn结合亲和力的Fc变体预期具有更短的半衰期，而且这种分子也是有用的，例如在缩短的循环时间可能是有益的情况中施用于哺乳动物，例如体内诊断成像或起始抗体较长时段存在于循环中时具有有毒副作用的情形。具有降低的FcRn结合亲和力的Fc变体还不太可能穿过胎盘，因此，在妊娠女性中治疗疾病或病症也是有用的。另外，可能期望降低的FcRn结合亲和力的其它应用包括期望脑、肾或肝定位的那些应用。在一个例示性实施方案中，本文公开的改变的抗体展现降低的从血管***穿过肾小球上皮的转运。在另一个实施方案中，本文公开的改变的抗体展现降低的从脑穿过血脑屏障(BBB)进入血管空间的转运。在一个实施方案中，具有改变的FcRn结合的抗体包含在Fc域的“FcRn结合环”内具有一处或多处氨基酸取代的Fc域。FcRn结合环由氨基酸残基280-299(依照Kabat编号)构成。国际PCT公开号WO05/047327中公开了改变FcRn结合活性的例示性氨基酸取代，通过提述将其并入本文。在某些例示性实施方案中，本文公开的抗体或其片段包含具有一处或多处下述取代的Fc域：V284E、H285E、N286D、K290E和S304D(Kabat编号)。
在其它实施方案中，用于本文中描述的诊断和治疗方法使用的抗体具有经过改变以降低或消除糖基化的恒定区，例如IgG1或IgG4重链恒定区。例如，本文公开的抗体还可包含Fc变体，该Fc变体包含改变抗体糖基化的氨基酸取代。例如，所述Fc变体可具有降低的糖基化(例如N-或O-连接的糖基化)。在例示性实施方案中，Fc变体包含降低的、正常情况下在氨基酸位置297(EU编号)处找到的N-连接聚糖的糖基化。在另一个实施方案中，抗体具有糖基化基序(例如含有氨基酸序列NXT或NXS的N-连接的糖基化基序)附近或之内的氨基酸取代。在一个具体实施方案中，抗体包含在氨基酸位置228或299(EU编号)处具有氨基酸取代的Fc变体。在更多具体的实施方案中，抗体包含IgG1或IgG4恒定区，该IgG1或IgG4恒定区包含S228P和T299A突变(EU编号)。
国际PCT公开号WO05/018572中公开了赋予降低的或改变的糖基化的例示性氨基酸取代，通过提述将其并入本文。在某些实施方案中，修饰本文公开的抗体或其片段以消除糖基化。这种抗体或其片段可称作“无糖”抗体或其片段(例如“无糖”抗体)。不受理论限制，认为“无糖”抗体或其片段可具有改进的体内安全性和稳定性概况。例示性无糖抗体或其片段包含缺乏Fc-效应器功能的无糖基化IgG4抗体Fc区，由此消除Fc介导的对表达PAI-1的正常生命器官的毒性的潜力。在其它实施方案中，本文公开的抗体或其片段包含经过改变的聚糖。例如，抗体可在Fc区的Asn297处的N-聚糖上具有数目减少的岩藻糖残基，即是无盐藻糖基化的。在另一个实施方案中，抗体可在Fc区的Asn297处的N-聚糖上具有数目改变的唾液酸残基。
iii)共价附着
可修饰本文公开的抗PAI-1抗体，例如通过将某分子共价附着至抗体，使得共价附着不阻止抗体特异性结合其关联表位(cognate epitope)。例如，但非限制，可通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、用已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、连接细胞配体或其它蛋白等修饰本文公开的抗体或其片段。可通过已知技术来进行多种化学修饰的任一种，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化等。另外，衍生物可含有一个或多个非经典氨基酸。
本文公开的抗体或其片段可以进一步在N-或C-端与异源多肽重组融合或者与多肽或其它组合物化学偶联(包括共价和非共价偶联)。例如，抗PAI-1抗体可以与在检测测试中作为标记物有用的分子和效应器分子如异源多肽、药物、放射性核素或毒素重组融合或偶联。参见例如国际PCT公开号WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995和EP 396,387。
抗PAI-1抗体可以与异源多肽融合以延长体内半衰期或用于免疫测试，使用本领域已知方法进行。例如，在一个实施方案中，可以将PEG与本文公开的抗PAI-1抗体偶联以延长它们的体内半衰期(Leong，S.R.，et al.，Cytokine16：106，2001；Adv.in DrugDeliv.Rev.54：531，2002；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions 30：512，2002)。
此外，本文公开的抗PAI-1抗体可以与标志物序列如肽融合以促进它们的纯化或检测。在某些实施方案中，标志物氨基酸序列为六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标签等等，其中许多是商业上可获得的。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824，1989中描述的，例如，六组氨酸提供便利的融合蛋白纯化。对纯化有用的其它肽标签包括但不限于“HA”标签(其对应于从流感血凝素蛋白衍生的表位(Wilson等，Cell 37：767，1984))和“flag”标签。
本文公开的抗PAI-1抗体可以以非偶联形式使用，或者可以与多种分子中的至少一个偶联，例如为了改进分子的治疗特性、促进靶标检测或患者的成像或治疗。在实施纯化时，可以在纯化之前或之后标记或偶联本文公开的抗PAI-1抗体。特别地，本文公开的抗PAI-1抗体可以与治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物学应答修饰剂、药学制剂或PEG偶联。
本发明进一步涵盖与诊断或治疗剂偶联的抗PAI-1抗体。抗PAI-1抗体可以在诊断上用于例如监测免疫细胞病症(例如CLL)的形成或进展，作为临床测试方法(例如用于测定给定治疗或预防方案的效力)的一部分。检测可通过将抗PAI-1抗体与可检测物质偶联来辅助。可检测物质的实例包括各种酶、辅基(prosthetic group)、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、各种正电子发射断层摄影术中使用的正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子。关于可以与抗体偶联，作为依照本发明的诊断剂使用的金属离子参见例如美国专利号4,741,900。合适的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的非限制性实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的非限制性实例包括伞形酮(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明(rhodamine)、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯(dansyl chloride)或藻红蛋白(phycoerythrin)；发光材料的非限制性实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的非限制性实例包括萤光素酶，萤光素和水母发光蛋白(aequorin)；合适的放射性材料的非限制性实例包括125I、131I、111In或99Tc。
用于本文公开的诊断和治疗方法使用的抗PAI-1抗体可以与细胞毒素(如放射性同位素、细胞毒性药物或毒素)、治疗剂、细胞抑制剂、生物学毒素、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物学应答修饰剂、药学制剂、免疫学活性配体(例如淋巴因子或其它抗体，其中所得分子结合赘生性细胞和效应器细胞如T细胞二者)或PEG偶联。
在另一个实施方案中，用于本公开的诊断和治疗方法使用的抗PAI-1抗体可以与降低肿瘤细胞生长的分子偶联。在其它实施方案中，所公开的组合物可包含与药物或前药偶联的抗体或其片段。本文公开的其它实施方案包含与特定生物毒素或它们的细胞毒性片段如蓖麻毒蛋白(ricin)、白树毒素(gelonin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)偶联的抗体或其片段的用途。要使用的偶联的或未偶联的抗体的选择将取决于癌症的类型和阶段、辅助治疗(例如化学疗法或外部照射)的使用和患者状况。可以理解的是，本技术领域人员能根据本文中的教导容易地进行这种选择。
可以理解的是在之前的研究中，用同位素标记的抗肿瘤抗体已经在动物模型中和在人的一些情况中成功用于破坏肿瘤细胞。例示性放射性同位素包括：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。放射性核素通过生成电离辐射发挥作用，电离辐射在核DNA中引起多处链断裂，导致细胞死亡。用于生成治疗性偶联物的同位素通常生成高能α-或β-粒子，它们具有较短的径长。这种放射性核素杀死密切接近它们的细胞，例如偶联物附着或进入的赘生性细胞。它们对非定位细胞影响很小或没有影响。放射性核素本质上没有免疫原性。
IV.抗PAI-1抗体或其抗原结合片段的表达
依照上文所述操作分离的遗传材料以提供本文公开的抗PAI-1抗体后，通常将基因***表达载体，用于导入可用于生成预期数量的要求保护的抗体或其片段的宿主细胞。
在其它实施方案中，可使用多顺反子构建体来表达本文公开的抗PAI-1抗体或其片段。在这种表达***中，可以从单一多顺反子构建体生成多种感兴趣基因产物如抗体重和轻链。这些***有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)，在真核宿主细胞中提供相对较高水平的本文公开的多肽。美国专利号6,193,980中公开了相容IRES序列，通过提述将其并入本文。本技术领域人员将理解，这种表达***可用于高效生成本申请中公开的全部多肽。
在一个实施方案中，用于抗体表达的宿主细胞系具有哺乳动物起源；本技术领域人员能确定最适合要在其中表达的预期基因产物的具体宿主细胞系。例示性宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)，HELA(人***)，CVI(猴肾系)，COS(CVI具有SV40T抗原的衍生物)，R1610(中国仓鼠成纤维细胞)，BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)，HAK(仓鼠肾系)，SP2/O(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)，RAJI(人淋巴细胞)，293(人肾)。在一个实施方案中，细胞系对从其表达的抗体提供改变的糖基化，例如无岩藻糖基化(例如PER.C6.RTM.(Cru细胞)或FUT8敲除CHO细胞系(Potelligent TM细胞)(Biowa，Princeton，N.J.))。在一个实施方案中，可使用NS0细胞。在某些具体实施方案中，可使用CHO细胞。宿主细胞系通常可从商业***、美国组织温育物保藏中心或已发表的文献获得。
体外生成允许放大规模以给出较大量的期望多肽。用于在组织培养条件下进行哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的，而且包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中，或固定化或俘获细胞培养，例如在中空纤维，微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷筒上。如果必要或想要，可以通过常规的层析方法来纯化多肽溶液，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素上的层析或(免疫)亲和层析。
编码本文公开的抗PAI-1抗体或其片段的基因也可在非哺乳动物细胞如细菌或酵母或植物细胞中表达。在这点上，可以理解的是也可转化各种单细胞非哺乳动物微生物如细菌；即那些能够在培养或发酵中生长的。对转化易感的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)，和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)。进一步可以理解的是在细菌中表达时，多肽可变成包含体的一部分。必须分离、纯化多肽，随后装配成功能性分子。
原核生物外，也可使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母(baker's yeast)是真核微生物中最常用的，尽管一些其它菌株是普遍可得的。为了酵母属中的表达，普遍使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979)；Kingsman等，Gene，7：141(1979)；Tschemper等，Gene，10：157(1980))。这种质粒已经含有TRP1基因，其为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics，85：12(1977))提供选择标志物。随后，作为酵母宿主细胞基因组的特征，trpl损害的存在为通过色氨酸缺失下的生长来检测转化提供有效环境。
V.药物制剂和施用抗PAI-1抗体的方法
另一方面，本发明提供包含抗PAI-1抗体或其片段的药物组合物。
本文公开的抗体或其片段的制备和施用至受试者的方法是本技术领域人员熟知的或本技术领域人员容易确定的。本文公开的抗体或其片段的施用途径可以是口服、胃肠外、通过吸入或局部。如本文中使用的术语胃肠外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或***施用。在某些实施方案中可使用静脉内、动脉内、皮下和肌肉内形式的胃肠外施用。虽然所有这些形式的施用清楚地涵盖在本文公开的范围内，但是施用的一种形式将是可注射溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的。通常，适合注射的药物组合物可包含缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨酯)，任选的稳定剂(例如人白蛋白)等。然而，与本文中的教导兼容的其它方法中，可以将多肽直接递送至不利细胞群的位点，由此提高患病组织对治疗剂的暴露。
用于胃肠外施用的制剂包括无菌的水性或非水性的溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、含醇/含水的溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学可接受载剂包括但不限于0.01-0.1M(例如0.05M)磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常用胃肠外媒介包括磷酸钠溶液、林格(Ringer)氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、含乳酸盐的林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介包括流体和营养补充物、电解液补充物如那些基于林格氏右旋糖的等。也可存在防腐剂和其它添加剂，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。更具体地，适用于注射使用的药物组合物包括无菌的水性溶液(在水溶性的情况中)或分散剂和用于实时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。在这种情况中，组合物必须是无菌的，而且流动性的程度应当易于注射。它在制造和贮存的条件下应当是稳定的，而且在一个实施方案中会针对微生物(如细菌和真菌)的污染作用提供防护。载剂可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其合适混合物。可以例如通过使用涂层如卵磷脂，通过维持所需粒度(在分散剂的情况中)及通过使用表面活性剂来维持恰当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂可实现针对微生物作用的防护，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等。在某些实施方案中，组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的作用剂，例如单硬脂酸铝和明胶可实现可注射组合物的延长吸收。
在任何情况中，可以通过以需要量在适当溶剂(根据需要含有一种或一组本文中列举的组分)中并入活性化合物(例如抗体自身或与其它活性剂组合)，随后过滤除菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介(其含有基础分散介质和需要的其它组分，来自上文列举的那些)来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，制备方法可以是真空干燥和冷冻-干燥，其从之前无菌过滤的溶液产生活性组分加任何别的预期组分的粉末。依照本领域已知方法在无菌条件下加工用于注射的制剂，填充入容器如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶，并密封。而且，制剂可以以试剂盒的形式包装和销售，如共同悬而未决的美国系列号09/259,337和美国系列号09/259,338中描述的那些，通过提述将每一篇并入本文。这种制品在一个实施方案中将具有标签或包装插页，指出相关组合物可用于治疗患有或有倾向患上自身免疫性或赘生性病症的受试者。
稳定化的本文公开的抗体或其片段用于治疗上文所述病况的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用的手段、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药疗和治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者为人，但是也可以治疗非人哺乳动物(包括转基因哺乳动物)。可使用本领域的技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以优化安全性和效力。
对于使用本文公开的抗体的被动免疫，剂量的范围可以为例如约0.0001至100mg/kg，更加通常地为0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主体重。例如，剂量可以为1mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1-10mg/kg的范围内，或在特定实施方案中至少1mg/kg。上述范围中间的剂量也意图在本文公开的范围内。
可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它方案对受试者施用这种剂量。一种例示性治疗要求在较长的时段(例如至少六个月)里施用多个剂量。其他例示性治疗方案要求每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。例示性剂量方案包括连续多天1-10mg/kg或15mg/kg、隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况中每种抗体施用的剂量可落在指示的范围内。
本文公开的抗体或其片段可在多个时机施用。单个剂量之间的间隔可以是例如每天、每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，通过测量患者中多肽或靶分子的血液水平来指示。在一些方法中，调整剂量以实现某种血浆抗体或毒素浓度，例如1-1000ug/ml或25-300ug/ml。或者，抗体或其片段可以作为持续释放制剂施用，在这种情况中要求不太频繁的施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。一般而言，人源化抗体显示最长的半衰期，随后是嵌合抗体和非人抗体。在一个实施方案中，本文公开的抗体或其片段可以未偶联形式施用。在另一个实施方案中，本文公开的抗体可以偶联形式施用多次。在另一个实施方案中，本文公开的抗体或其片段可以未偶联形式，随后以偶联形式施用，反之亦然。
施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，将含有本发明抗体或其混合物的组合物施用于并非已处于疾病状态的患者以增强患者的抵抗力。这种量定义为“预防有效的量”。在这种用途中，精确量再次取决于患者的健康状况和一般免疫力，但是通常范围为0.1至25mg每剂量，特别是0.5至2.5mg每剂量。在较长的时间段里以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在他们的余生继续接受治疗。
在治疗性应用中，有时需要相对较短的间隔的相对较高的剂量(例如约1至400mg/kg抗体每剂，其中5至25mg的剂量更常用于放射免疫偶联物，而更高的剂量用于细胞毒性-药物偶联分子)，直至疾病进展减慢或终止，且在特定实施方案中，直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。因此，可对患者施用预防方案。
在一个实施方案中，可以用编码本文公开的多肽的核酸分子(例如在载体中)治疗受试者。编码多肽的核酸的剂量范围为约10ng至1g、100ng至100mg、1ug至10mg或30-300ugDNA每位患者。感染性病毒载体的剂量为10-100或更多病毒体每剂量。
治疗剂可通过胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内方式施用，用于预防性或治疗性处理。可使用肌内注射或静脉内输注来施用本文公开的抗体。在一些方法中，将治疗性抗体或其片段直接注射入颅骨。在一些方法中，作为持续释放组合物或装置(如Medipad TM装置)施用抗体或其片段。
本文公开的作用剂可任选与有效治疗需要治疗(例如预防性的或治疗性)的病况或状况的其它作用剂组合施用。其他作用剂为那些本领域公知的且对于特定病症常规施用的。
90Y标记的本文公开的抗体的有效单次治疗剂量(即治疗有效的量)的范围为约5至约75mCi间，在一个实施方案中为约10至约40mCi。1311标记的抗体的有效单次治疗非骨髓消融剂量的范围为约5至约70mCi，在一个实施方案中为约5至约40mCi。1311标记的抗体的有效单次治疗消融剂量(即可要求自体骨髓移植)的范围为约30至约600mCi，在一个实施方案中为约50至少于约500mCi。与嵌合修饰抗体组合，由于与鼠抗体相比更长的循环半衰期，碘131标记的嵌合抗体的有效单次治疗非骨髓消融剂量的范围为约5至约40mCi，在一个实施方案中少于约30mCi。例如111In标记物的成像标准通常少于约5mCi。
虽然已经用131I和90Y得到了很多临床经验，但其它放射性标记物是本领域已知的且已经用于相似目的。仍有其它放射性同位素可用于成像。例如，与本发明的范围兼容的别的放射性同位素包括但不限于123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211A 213Bi。在这个方面，α、γ和β发射物都与本发明相容。而且，基于本公开文本，认为本技术领域人员能够容易地确定哪些放射性核素与选定治疗过程兼容，无需过度实验。为此，已经用于临床诊断的其他放射性核素包括125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga以及111In。还已经用多种放射性核素标记抗体，潜在用于靶向免疫疗法(Peirersz等，Immunol.Cell Biol.65：111，1987)。这些放射性核素包括188Re和186Re，以及较少见的199Au和67Cu。美国专利号5,460,785提供了其他关于这种放射性同位素的数据，通过提述并入本文。
如之前讨论，本文公开的抗体或其片段可以药学上有效的量施用，用于在体内治疗哺乳动物病症。在这点上，可以理解的是将配制公开的抗体或其片段使其促进施用及提升活性剂的稳定性。在某些实施方案中，依照本发明的药物组合物包含药学可接受的、无毒的、无菌的载体如生理盐水，无毒缓冲剂、防腐剂等。就本申请而言，本文公开的抗体(与或未与治疗剂偶联)的药学上有效的量应当认为表示足以实现有效结合靶标和实现益处(例如改善疾病或病症的症状或者检测物质或细胞)的量。在肿瘤细胞的情况中，多肽在某些实施方案中将能够与赘生性或免疫反应性细胞上的选定免疫反应性抗原相互作用并提供那些细胞的死亡增加。当然，本文公开的药物组合物可以单剂或多剂施用以提供药学上有效的量的多肽。
与本公开文本的范围一致，本文公开的抗体可依照上述治疗方法以足以产生治疗或预防效果的量施用于人或其它动物。本文公开的多肽可以依照已知技术通过组合本文公开的抗体与常规药学可接受载体或稀释剂而制备的常规剂量形式施用于这种人或其它动物。本技术领域人员将了解，药学可接受载体或稀释剂的形式和特征由将与它组合的活性组分的量、施用的途径和其它熟知的变量规定。本技术领域人员将进一步理解，包含一种或多种依照本发明的多肽类型的混合物可证明是特别有效的。
VI.治疗PAI-1相关疾病或病症的方法
本文公开的抗PAI-1抗体或其片段对于拮抗PAI-1活性是有用的。相应地，另一方面，本发明提供治疗PAI-1相关疾病或病症的方法，通过对有需要的受试者施用包含一种或多种本文公开的抗PAI-1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
适合治疗的PAI-1相关疾病或病症包括但不限于病理生理状况如肾、肝或肺纤维化或预防腹部粘连形成。
腹内粘连的发生是人生病的一项主要起因。粘连的并发症可以像危及生命的肠梗阻一样严重，但是女性中的慢性骨盆痛和***也是腹膜粘连的常见结果。大多数粘连是由手术诱发的，但是在一些情况中还显示是由炎症、子宫内膜异位症、化学性腹膜炎、放射治疗、异物反应和连续流动式腹膜透析引起的。腹膜损伤引起局部炎症应答，导致纤维蛋白沉积。由组织纤溶酶原激活剂(tPA)减少和纤溶酶原激活剂抑制剂PAI-1和PAI-2增多引起的腹膜纤维蛋白溶解活性的损伤后不足假设允许沉积的纤维蛋白以组织成永久粘连。
当前可获得且有效的治疗选择(像
Figure BDA0000958883060000491
)受到只可用于开放式通路(剖腹手术)的限制，不能用于腹腔镜检查。对潜在治疗的搜索正在进行中。
在某些例示性实施方案，本文公开的抗体可用于治疗肾纤维化及相关急性肾损伤以及慢性肾病，它们是末期肾衰竭的主要起因。
本技术领域人员能够通过常规实验确定抗体(或别的治疗剂)对于治疗PAI-1相关疾病或病症目的而言的有效、无毒量。例如，多肽的治疗活性量可根据如受试者的疾病阶段(例如I期对IV期)、年龄、性别、医学并发症(例如免疫抑制病况或疾病)和重量和抗体在所述受试者中引发预期应答的能力等因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗响应。例如，可以每天施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急水平所示按比例减少的剂量。然而，通常有效剂量预期在约0.05至100毫克每千克体重每天的范围中，在一个实施方案中，在约0.5至10毫克每千克体重每天的范围中。
本文公开的不同方面及其实施方案可以彼此组合。另外，上文所述任何方面及其实施方案可以与本文中下文描述的任何具体方面和实施方案组合。
下文给出用来进一步例示本发明的一些具体方面和实施方案：
具体方面和实施方案的描述
权利要求1.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链框架区和重链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:34的重链CDR1区，含SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:32的重链CDR3区；和
(b)轻链框架区和轻链可变区，该轻链可变区包含含SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:145的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。
权利要求2.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链框架区和包含SEQ ID NO:86的重链可变区，和
(b)轻链框架区和包含SEQ ID NO:93的轻链可变区。
权利要求3.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)与权利要求2的抗体的重链可变区至少95％相同的重链可变区，和/或
(b)与权利要求2的抗体的轻链可变区至少95％相同的轻链可变区。
权利要求4.一种分离的单克隆抗体，其与权利要求1的抗体结合基本上相同的表位。
权利要求5.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链框架区和重链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:34的重链CDR1区，含SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:32的重链CDR3区；和
(b)轻链框架区和轻链可变区，该轻链可变区包含含SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:36的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。
权利要求6.权利要求5的抗体，其中该重链可变区包含SEQ ID NO:6，且该轻链可变区包含SEQ ID NO:7。
权利要求7.一种分离的单克隆抗体，其与权利要求5的抗体结合基本上相同的表位。
权利要求8.一种特异性结合人PAI-1的人源化单克隆抗体，其中该抗体包含：
(a)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:82的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:91的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(b)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:83的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:92的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(c)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:84的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:93的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(d)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:85的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:91的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(e)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:85的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:93的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(f)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:86的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:94的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(g)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:87的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:95的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(h)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:88的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:96的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(i)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:89的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:97的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(j)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:90的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:98的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(l)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:86的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:95的轻链可变区，或其抗原结合片段；
(m)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:89的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:93的轻链可变区，或其抗原结合片段；或
(n)重链和轻链，该重链具有包含SEQ ID NO:89的重链可变区，或其抗原结合片段，且该轻链具有包含SEQ ID NO:95的轻链可变区，或其抗原结合片段。
权利要求9.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含
(a)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:22的重链CDR1区，含SEQ ID NO:21的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:20的重链CDR3区；该轻链可变区包含含SEQID NO:25的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:24的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:23的轻链CDR3区，
(b)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:28的重链CDR1区，含SEQ ID NO:27的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:26的重链CDR3区；该轻链可变区包含含SEQID NO:31的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:30的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:29的轻链CDR3区，
(c)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:40的重链CDR1区，含SEQ ID NO:39的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:38的重链CDR3区；该轻链可变区包含含SEQID NO:43的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:42的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:41的轻链CDR3区，
(d)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:46的重链CDR1区，含SEQ ID NO:45的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:44的重链CDR3区；该轻链可变区包含含SEQID NO:49的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:48的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:47的轻链CDR3区，
(e)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:52的重链CDR1区，含SEQ ID NO:51的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:50的重链CDR3区；该轻链可变区包含含SEQID NO:55的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:54的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:53的轻链CDR3区，
(f)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:58的重链CDR1区，含SEQ ID NO:57的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:56重链CDR3区；该轻链可变区包含含SEQID NO:61的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:60的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:59的轻链CDR3区，
(g)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:64的重链CDR1区，含SEQ ID NO:63的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:62的重链CDR3区；该轻链可变区包含含SEQID NO:67的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:66的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:65的轻链CDR3区，
(h)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:70的重链CDR1区，含SEQ ID NO:69的重链CDR2区，和含SEQ ID NO:68的重链CDR3区；该轻链可变区包含含SEQID NO:73的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:72的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:71的轻链CDR3区；或
(i)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含SEQ ID NO:76的重链CDR1区，含SEQ ID NO:75重链CDR2区，和含SEQ ID NO:74的重链CDR3区；该轻链可变区包含含SEQID NO:79的轻链CDR1区，含SEQ ID NO:78的轻链CDR2区，和含SEQ ID NO:77的轻链CDR3区。
权利要求10.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其与权利要求8或权利要求9的人源化单克隆抗体结合PAI-1上基本上相同的表位。
权利要求11.一种恢复纤溶酶生成的方法，其包括通过口服、通过注射用溶液胃肠外地、通过吸入或局部地对有需要的受试者施用药学上有效的量的PAI-1抗体。
权利要求12.权利要求11的方法，其中该方法治疗包含纤维化组织水平增高的病况。
权利要求13.权利要求12的方法，其中该病况为纤维化、皮肤纤维化、***性硬化、肺纤维化、特发性肺纤维化、间质性肺病、慢性肺病、肝纤维化、肾纤维化、慢性肾病、血栓形成、静脉和动脉血栓形成、深静脉血栓形成、四肢(peripheral limb)缺血、散布性血管内凝固血栓形成(disseminated intravascular coagulation thrombosis)、有和无溶栓的急性缺血性中风或支架再狭窄。
权利要求14.权利要求11、12或13的方法，其中该PAI-1抗体包括上述权利要求任一项的抗体。
权利要求15.药学上有效的量的PAI-1抗体在制备用于治疗由PAI-1水平增高或对PAI-1的敏感性增高所引起的病况的药物中的用途，包括通过口服、通过注射用溶液胃肠外地、通过吸入或局部地对患者施用。
实施例
本发明通过下述实施例进一步说明，所述实施例不应视为进一步限制。贯穿本申请中引用的序列表、附图和所有的参考文献、专利和公开的专利申请的内容明确地通过提述并入本文。
此外，依照本发明，可采用本技术领域内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。参见，例如Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning：A LaboratoryManual,Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York(在本文中为“Sambrook等，1989”)；DNA Cloning：A PracticalApproach,Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney,ed.(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRLPress,(1986)]；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)。
实施例1：杂交瘤生成：用PAI-1蛋白免疫小鼠和抗体生成
开发了将与人(h)和食蟹猴(cyno)活性PAI-1(糖基化或非糖基化形式)交叉反应并将中和PAI-1的抑制活性并恢复下游的纤溶酶产生由此成为治疗肾、肝或肺纤维化或预防腹部粘连形成和瘢痕瘤瘢痕形成的有效治疗剂的抗体。已描述了通过单克隆抗体中和PAI-1抑制性功能属于三种机制：(1)通过空间位阻阻断PAI-1对tPA或uPA的结合，(2)将PAI-1转化为休眠构象，或(3)将PAI-1转化为底物构象。
a)抗体
从细胞分泌的PAI-1为活性构象，其通过其以亚纳摩尔亲和力结合于玻璃粘连蛋白而稳定化。PAI-1在37℃数分钟内，而在室温数小时内发生自发的构象变化从活性构象成为休眠构象。一旦结合于玻璃粘连蛋白，PAI-1对构象变化更具抗性，这将活性构象的PAI-1的半衰期从数分钟延长至数小时。为了在受免疫的动物中延长活性构象的PAI-1的半衰期并允许小鼠免疫***识别活性PAI-1构象，使用了玻璃粘连蛋白和PAI-1的复合物用于免疫。
在昆虫细胞中产生的人糖基化PAI-1购自Innovative Research(Cat#IGLYHPAI-A)。玻璃粘连蛋白(Cat#IHVN)和tPA(Cat#HTPA-TC)也购自Innovative Research。为了产生免疫原，将PAI-1与玻璃粘连蛋白以1：1摩尔比在室温温育1小时，或与tPA以1：1摩尔比在37℃温育15分钟。所有免疫原使用无菌盐水作为稀释剂来制备。
b)免疫
实施了本领域中已知的标准杂交瘤产生方案以产生抗体。文献中之前描述的标准方法使用PAI-1本身或PAI-1/tPA复合物。相反，本发明人生成了针对PAI-1的活性构象的抗体。使用PAI-1/玻璃粘连蛋白复合物作为生成针对PAI-1的抗体的新手段使用。采用了下文概述的三方面策略生成抗体：
(1)用PAI-1/玻璃粘连蛋白复合物对小鼠进行经典免疫以获得小鼠脾细胞以用于与作为融合配偶的小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤；
(2)用PAI-1/tPA复合物对小鼠进行经典的免疫以获得小鼠脾细胞以用于与作为融合配偶的小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤；和
(3)用PAI-1本身对小鼠进行经典的免疫以获得小鼠脾细胞以用于与作为融合配偶的小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤。
在研究中对于每种抗原(仅PAI-1，Vn/PAI-1复合物，tPA/PAI-1复合物)使用三只小鼠。所述小鼠为9-20周龄的未免疫
Figure BDA0000958883060000552
雌性BALB/c小鼠(Charles River，品系编号028)。在第0天，对九只小鼠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的PAI-1本身、Vn/PAI-1或tPA/PAI-1复合物进行腹膜内免疫。将每只小鼠总共10ug的抗原以1：1体积对体积比混合于SigmaAdjuvant System(Sigma cat#6322)，总体积为每只小鼠200μl。在第14天，对小鼠用相同量的抗原进行增强，所述抗原以如在第0天相同的方式制备。在第21天，收集血液样品以用于PAI-1特异性抗体效价评估。用PAI-1/tPA复合物免疫的小鼠对PAI-1显示非常低特异性反应性和高抗tPA效价，而不用于下游融合。
在第51天，选择具有最高的抗-PAI-1特异性抗体效价和最低的针对与PAI-1复合的蛋白(即Vn或tPA)的效价的小鼠，同时对小鼠和大鼠PAI-1直系同源物具有最高效价的那些小鼠用于进行融合。将选择用于融合的小鼠用PBS中的PAI-1本身或PAI-1/Vn复合物增强，其中抗原总量为10ug每只小鼠以1：1比例与Sigma Adjuvant System(Sigma cat#6322)混合，其总体积为如上所述的200μl每只小鼠。在第55天，通过CO2室处死小鼠，通过心脏穿刺收集血液，并收获脾用于杂交瘤产生。之后，对另外四只小鼠进行了相同的步骤(在第一只小鼠用于融合之后2-4个月)。
使用实施例2中所述的ELISA方法(结合ELISA)对于PAI-1本身和PAI-1/tPA在三只小鼠上，对于PAI-1/Vn在两只小鼠上进行了血清滴定。
表3：用PAI-1、PAI-1/Vn或PAI-1/tPA免疫的小鼠的血清效价
Figure BDA0000958883060000551
Figure BDA0000958883060000561
用PAI-1/tPA复合物免疫的小鼠并未达到高特异性效价标准，且未用于融合(表3)。基于表3中呈现的血清效价，选择了共5只针对PAI-1具有高特异性效价的小鼠用于融合。
b)融合
选择了五只针对PAI-1具有最高特异性效价的小鼠用于融合。在融合日，将小鼠在CO2室中处死，通过心脏穿刺收集血液，并将脾取出并置入含有10ml不含血清的杂交瘤融合培养基(IMDM；Iscove's Modified Dulbecco's Medium500ml(HyClone SH30259.01)的培养皿。通过镊子将脾细胞的纤维弹性包衣挤去，并将脾细胞在10ml不含血清的IMDM(包括初始旋出物)中洗涤两次。
将细胞在Countess Automated Cell Counter中计数。随后将融合配偶细胞(骨髓瘤：FO(ATCC ref CRL-1646))和脾细胞以1：2至1：10(以细胞数量计)的比例合并于一个50ml试管中，并在970rpm离心10分钟(缓慢离心)以形成松散的沉淀。将经预热(在37℃)的1ml PEG(75mM Hepes 50％w/v中的PEG1500Roche产品号783641(10783641001))在1分钟的期间逐滴添加至细胞沉淀，并在每滴PEG添加之后混合细胞。将沉淀与PEG再温育1分钟，随后用1分钟添加10ml不含血清的IMDM培养基，使得10ml中最初的1ml用30秒添加。将细胞在970rpm缓慢离心10分钟以保持活力。将融合的细胞以200ul在96孔板中铺板于选择培养基(200ml Gibco Hybridoma(SFM#12045)，20ml 10％HyClone SuperLow IgG Defined FBS(#SH30898.03)，2ml青霉素/链霉素，4ml(Hybridoma Fusion and Cloning Supplement(Roche Diagnostics 11363 735 001(50X))和4ml HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶)中)。在约10至14天之后或当孔中的培养基变成黄色时，组分已可用于筛选。随后将来自形成的杂交瘤的上清通过ELISA检测(实施例2)结合于PAI-1和PAI-1/Vn复合物的抗体的存在。
实施例2：筛选针对PAI-1-玻璃粘连蛋白复合物的特异性的对于杂交瘤上清的结合ELISA
来自五个所选小鼠的脾的各个融合产生约5000个克隆，其需要就对PAI-1/Vn复合物的结合进行筛选作为第一步初步筛选。杂交瘤上清的初步筛选使用ELISA针对PAI-1或PAI-1-玻璃粘连蛋白复合物的ELISA平行进行以选择特异性结合复合于玻璃粘连蛋白的PAI-1的杂交瘤。用于ELISA的材料如下所述：Immulon 4HBX ELISA平板(Dynax产品号N0541216)；人单体玻璃粘连蛋白，5ug/ml(Innovative Research产品号IHVN)；糖基化的人PAI-1(活性形式)(Molecular Innovations产品号GLYHPAI-A)；有些融合中未糖基化的小鼠PAI-1(Molecular Innovations产品号MPAI-A)；二抗，其为HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Labs#115-035-166)；和ABTS底物：Roche Diagnostics(#11204 521 001)。
使用的对照抗体为：
a)33B8，针对PAI-1的小鼠单克隆抑制性抗体(IgG1；Innovative Research产品号IMA-33B8)；
b)33H1，针对PAI-1的小鼠单克隆抑制性抗体(IgG1；Innovative Research产品号IMA-33H1)；
c)31C9，针对PAI-1的小鼠单克隆非抑制性抗体(IgG1；Innovative Research产品号IMA-31C9)；和
d)1B7.11，IgG1同种型对照抗体(抗TNP mAb-从购自ATCC的杂交瘤细胞系(Cat#TIB-191)内部产生)
ELISA方法如下所述：将平板用PBS中的5ug/ml Vn在4℃以50ul/孔包被过夜；第二天将平板用200ul PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA/PBS)封闭1小时；将平板用200ul/孔PBS洗涤四次；将1％BSA/PBS中的2ug/ml的活性PAI-1以50ul/孔添加至平板并温育1小时；将平板用200ul/孔PBS洗涤四次；将1％BSA/PBS中的抗体稀释或来自初始96孔板的杂交瘤上清以50ul/孔添加至ELISA平板；将平板在室温(RT)温育1小时；将平板用200ul/孔洗涤四次；添加1％BSA/PBS中的HRP-抗小鼠IgG 50ul 1：2000并在室温温育1小时；将平板用200ul/孔PBS洗涤四次；将50ul/孔的ABTS底物(一丸溶解于5ml)添加至平板，随后在BioTek SynergyHT仪器上使用OD405对平板读数。结合ELISA中对于抗体滴定的典型标准曲线示于图2。抗体31C9，33B8和33H1用作阳性对照，而IgG1用作阴性对照。表4显示在生成的约5000个克隆中，675个克隆对于结合PAI-1和PAI-1/Vn两者为阳性。随后对这些克隆筛选PAI-1亲和力。
表4:与PAI-1和PAI-1/Vn二者结合都为阳性的克隆数
融合 免疫原 小鼠# 与PAI-1和PAI-1/Vn结合都为阳性的克隆#
A PAI-1/Vn 2 131
B PAI-1 2 146
C PAI-1/Vn 3 145
D PAI-1 3 104
E PAI-1 1 149
实施例3：通过亲和力排序对杂交瘤上清进行的Biacore筛选
对具有低解离率的高亲和力抗体的进一步选择由Biacore进行。Biacore杂交瘤上清筛选以如下之一进行：(1)使用抗小鼠固定化的抗PAI-抗体进行的反向筛选或(2)使用游离的PAI-1作为配体或针对固定化的Vn进行的正向筛选测定。
使用的仪器为BIACORE 2000或BIACORE 3000(GE Healthcare)，其设计用于实时生物分子相互作用分析(BIA)。使用的传感芯片为CM5芯片(GE Healthcare)，其表面上具有羧甲基化的右旋糖苷基质。每个传感芯片具有四个平行的流通池(Fc)。每个流通池与抗小鼠IgG Fc mAb经由标准的氨基偶联根据生产商关于芯片制备的方法偶联。
在Biacore反向筛选测定中，选择ELISA阳性杂交瘤上清，并将其经过0.2μm滤器过滤，随后将其注射至Biacore芯片表面。将每个杂交瘤上清注射至流通池Fc2-Fc4的一个流通池上，且杂交瘤上清中的IgG会由抗小鼠IgG Fc mab捕获至芯片表面，而Fc1单独留作参照池。随后将PBS中的人PAI-1蛋白注入Fc1至Fc4。也将PBS缓冲液注射至芯片表面作为空白。在减去Fc1和空白缓冲液运行的信号之后，使用Scrubber 2软件分析来自上清的抗体对PAI-1蛋白的结合亲和力(KD)/解离率(kd)并进行排序。
在Biacore正向筛选测定中，将纯化的人玻璃粘连蛋白蛋白固定化于CM5芯片流通池Fc1至Fc4。将人或食蟹猴PAI-1捕获至所有流通池上。随后将经过滤的选定的杂交瘤上清以每流通池一份注射于捕获的PAI-1上，但是Fc1除外，其留作参照流通池。也将PBS缓冲液注射至芯片表面作为空白。在减去Fc1和空白缓冲液运行的信号之后，使用Scrubber 2软件(版本2.0a，2005；BioLogic Software，BioLogic Software Rty Ltd.，116Blamey Court，Campbell，ACT 2612Australia)分析杂交瘤上清中抗体对玻璃粘连蛋白捕获的PAI-1的结合亲和力并进行排序。
表5显示从融合A、B、C、D和E选择阳性和阴性抗体克隆。因为筛选的抗体克隆数量庞大，并未显示所有的数据。仅将针对人和食蟹猴PAI-1蛋白显示优势结合解离率(kd<10-41/s)的抗体克隆选用于功能性生色测定。
表5:Biacore测定中与人PAI-1结合的杂交瘤上清的亲和力/解离率筛选
Figure BDA0000958883060000591
实施例4：对于杂交瘤上清筛选的功能性ELISA以选择阻断PAI-1与tPA相互作用的抗体
为了允许选择功能性抗体，开发了新型ELISA以允许区分仅结合于PAI-1的抗体和阻断PAI-1作为tPA抑制剂的功能的那些抗体(功能性ELISA)。
将杂交瘤上清在新型功能性ELISA中筛选以鉴定具有阻断tPA-PAI-1相互作用的能力的来自不同克隆的杂交瘤上清。功能性ELISA的设计如下所述：(1)如果抗体与PAI-1结合但所述抗体结合并不阻断PAI-1和tPA之间的共价键形成，则抗tPA抗体将结合于tPA(其通过PAI-1结合于平板)并给出正(positive)读数；(2)如果抗体阻断PAI-1，并因此通过改变PAI-1构象或通过空间位阻阻断tPA相互作用，则所述抗-tPA抗体将无法结合于平板，而读数将是负的(negative)(较低OD405)。平行地，在实施例2中所述的ELISA中结合PAI-1测试杂交瘤上清。因为杂交瘤上清中的抗体的量是未知的，将低于对照读数(即低于同种型对照读数)视为鉴定出的感兴趣的抗体。由于上清中差异的抗体浓度，在一些情况下，阻断仅为部分地。
将链霉亲和素包被的平板(NUNC#436014)在RT用50ul/ml的1％BSA/PBS中的2ug/ml生物素-PAI-1(N端生物素标记的人PAI-1，活性组分；Molecular Innovations产品号NTBIOPAI-A)温育2小时。将平板用200ul1％BSA/PBS在RT封闭1小时，并用200ul/孔PBS洗涤四次。将纯化的抗体稀释和杂交瘤上清以50ul/孔添加至孔，并温育15分钟。将平板用200ul/孔PBS洗涤四次。将1ug/ml的双链tPA(Innovative Research产品号HTPA-TC)以50ul/孔添加至平板，并在RT温育30分钟。将平板用200ul/孔PBS洗涤四次。将1：3000稀释的抗tPA HRP偶联抗体(Life Span Technologies，cat#LS-C39721)添加至平板，并温育45分钟。将平板用200ul/孔PBS洗涤四次。将50ul/孔的ABTS(一片溶解于5ml；RocheDiagnostics#11 204 521 001)添加至平板，并给予时间允许显色。在BioTek Synergy HT仪器上使用OD405读数平板。具有低于IgG同种型对照的值的OD表明阻断了tPA对PAI-1的结合。
在一些情况下，在Biacore上清筛选之前进行了功能性ELISA，且其作为杂交瘤培育中更重要的选择步骤。以33H1作为阳性对照，IgG1为阴性对照，而A44为鉴定出的阳性抗体克隆的代表曲线示于图3。
表6:用于杂交瘤上清筛选以选择阻断PAI-1与tPA相互作用的抗体的功能性ELISA
Figure BDA0000958883060000601
Figure BDA0000958883060000611
筛选了超过200份上清。表6显示对阳性和阴性杂交瘤上清的选择。每个融合物约10个杂交瘤显示在功能性ELISA中阻断PAI-1对tPA结合的能力。基于来自杂交瘤上清的数据，选择杂交瘤进行测序和中等规模抗体产生。尽管D4并未良好地结合于非糖基化的PAI-1，但基于其Biacore中对糖基化PAI-1的结合将其选用于纯化和测序。将纯化的抗体在Biacore进一步表征其亲和力动力学，并在生色和细胞测定中表征其与商业上可获得的抗体相比的效力。
实施例5：通过5’-RACE(cDNA末端的快速扩增)进行的测序和小鼠抗体纯化
从一系列融合生成的针对特定靶的抗体可具有相同的序列。通过在抗体生成的早期阶段进行抗体基因测序，消除了任何可能的冗余抗体，且正确的抗体基因序列指导抗体选择和人源化，以及嵌合抗体构建。
5’-RACE是从信使RNA模板在确定的内部位点和mRNA的3’或5’末端的未知序列之间扩增核酸序列的方法。该种具有单侧特异性的扩增方法已描述为“单侧”PCR或“锚定”PCR。先导抗体的原始可变性鼠类抗人PAI-1抗体序列通过5’-RACE cDNA测序确定，并通过N端蛋白测序确认。
为了确定可变重链(VH)和轻链(VL)IgG序列，将来自杂交瘤细胞的总RNA使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN，产品号74104)根据生产商的指示分离。简言之，将细胞(5x106个细胞)在350ul试剂盒的RLT缓冲液中裂解，随后在离心柱上捕获总RNA。RNA在试剂盒的TE缓冲液中洗脱，并保存于冰上。
第一链cDNA使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(ClonTech，产品号634923)制备。根据生产商的指示进行5’-RACE方法。将VH和VL链cDNA分别通过聚合酶链式反应(CPR)使用SMARTerTM试剂盒提供的5’引物和下面列出的3’VH和VL基因特异性引物分别扩增：
重链3’-引物：5’-TATGCAAGGCTTACAACCACA-3’(SEQ ID NO:105)
轻链3’-引物：5’-CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAG-3’(SEQ ID NO:106)
将扩增的VH和VL基因使用TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen，产品号K4520-01)分别克隆入TOPO载体。根据生产商的指示进行所述步骤。为了转化细菌，将反应混合物添加入感受态大肠杆菌细胞，并在冰上温育20分钟。将含有大肠杆菌细胞和反应混合物的试管在42℃加热40秒，并添加250微升试剂盒的SOC培养基。在将大肠杆菌在37℃在300rpm振荡下温育60分钟之后，将细菌在含有100微克每ml青霉素(ampicillin)的LB琼脂平板上涂布，随后在37℃温育过夜。
在通过PCR确认***的VH和VL基因之后，选择了五个细菌克隆，并在含有100微克每ml青霉素的LB培养液中增殖用于质粒DNA制备。质粒DNA使用QIAprep Spin MiniprepKit(QIAGEN，产品号27104)根据生产商的指示分离。杂交瘤的VH和VL IgG基因通过Sanger方法测序，且CDR使用Contact定义(MacCallum等)来确定。
单克隆抗体在CELLine生物反应瓶(Wilson Wolf Manufacturing Corp.；Cat.#CL350或产品号CL1000)中根据生产商的指示在不含血清的培养基(Gibco Cat.#12045)中产生并通过Protein A/G层析(GE Healthcare Life Sciences，Cat.#28-4083-47和#28-4082-53)纯化。在Biacore进一步表征纯化抗体的亲和力动力学，并在生色和细胞测定中表征其与商业上可获得的抗体相比的效力。
实施例6：使用纯化抗体的功能性生色测试
将纯化的抗体在生色测试中测试其阻断PAI-1的能力。PAI-1抑制tPA功能，因此，阻断PAI-1的抗体会导致tPA功能的恢复。生色测试利用蛋白水解酶，其通过水解一个或多个肽键作用于其天然底物(蛋白和肽)。该过程通常是高度特异性的，其含义是仅邻接特定氨基酸的肽键裂解。生色底物为与蛋白水解酶反应导致形成可定量的颜色的肽。生色底物是人工合成的，并设计为对于所述酶具有相似于天然底物的选择性。附于生色底物肽部分的是化学基团，当其在酶裂解后释放时产生颜色。颜色变化可用分光光度法追踪，并与蛋白水解酶活性成比例。
使用生色测试确认抗体中和PAI-1作为tPA抑制剂功能的能力。tPA能够从生色底物S2288释放pNA。在溶液中，S228不具颜色，然而在暴露于tPA并随后释放pNA之后，溶液产生黄色，这可在OD405读数。可用2-3个小时观察颜色形成以确定酶反应的动力学。PAI-1能够以浓度依赖性方式阻断tPA的酶活性。
进行两步生色测试。所有试剂在将其添加至底物溶液的步骤前均为10x浓度。在第一步中，PAI-1的tPA抑制效力使用生色测试测量(具有固定的tPA浓度的PAI-1滴定)。分析PAI-1滴定曲线以确定对于PAI-1阻断tPA活性的IC50。随后，选择从曲线计算出的IC80用于进一步探询抗体中和PAI-1阻断功能和恢复tPA酶活性的能力。将等体积(25ul)的tPA(14nM)(Innovative Research，Cat.no.IHTPA-TC)和糖基化的(活性形式)人PAI-1(Molecular Innovations，Cat.no.GLYHPAI-A)或非糖基化的(活性形式)小鼠PAI-1(Molecular Innovations Cat.#IMPAI)合并，并使用从108nM开始的PAI-1的3倍系列稀释和固定浓度的tPA温育。所有蛋白稀释用1％BSA/PBS制备。将混合物在96孔微滴定板的孔中在室温温育15分钟。随后将根据生产商的指示稀释的200ul生色底物S2288(1.25mM)(Chromogenix，Cat.no.S-820852)添加至孔，并在2小时内每10分钟记录在405nm的OD405吸光度变化以测量剩余tPA活性。对于对照，在tPA不存在下(无酶反应)测量背景，阳性对照为无PAI-1(100％tPA活性)，而阴性对照为相对于tPA 10倍过量的PAI-1(完全阻断tPA活性)。对于33B8，A44，33H1和IgG1的代表性曲线，参见图4。
对于第二步，通过利用PAI-1中和测试评估抗体抑制活性PAI-1和恢复tPA功能的能力来确定抗体的功能性质。对于该步骤，将活性PAI-1 12.5ul(在56nM)与等体积的含有1％BSA(Sigma，Cat.no.A3059)的PBS(Invitrogen，Cat.no.14190-144)或从2uM起的抗体的系列3倍稀释温育。将对照和未知抗体在0.1至300nM范围的浓度(5倍稀释)和3nM PAI-1来温育，并将tPA添加至混合物。将所有成分在室温以10x浓度温育，并进一步用tPA底物S2288稀释，所述SS2288在tPA裂解之后，颜色从澄清变为黄色。在37℃持续2小时内每10分钟在OD405读数样品。允许混合物在96孔微滴定板的孔中在室温反应30分钟以实现抗体-抗原复合物形成。随后将25ul的tPA(14nM，这对应于tPA活性的IC80抑制)添加至孔，并在室温温育15分钟。最终，将200ul1.25mM根据生产商的指示稀释的底物S2288添加至混合物。记录在405nm的吸光度变化在2小时内每10分钟测量剩余tPA活性。百分之百PAI-1活性定义为在抗体不存在下观察到的PAI-1活性。通过抗体对PAI-1活性的中和根据在抗体存在下测得的剩余PAI-1活性来计算。对照为IgG1作为同种型对照(阴性)而33H1mAb和33B8mAb作为阳性对照。对于B28，E16，E21，A75和IgG1的代表性曲线，参见图5。
在两步生色测定***中测试抑制人tPA的人PAI-1的直系同源物。直系同源物的滴定如上所述对人PAI-1(对于滴定的代表性曲线，参见图6)进行，而tPA活性通过生色方法(对于33B8和A44针对食蟹猴和小鼠PAI-1的代表性曲线，参见图7)。用于该测定的人tPA的最终浓度为1.4nM。将12.5ul活性PAI-1(56nM)用等体积的含有1％BSA的PBS或从2uM开始的抗体的系列3倍稀释温育。允许混合物在96孔微滴定板的孔中在室温反应30分钟。随后将25ul的tPA(14nM)添加至孔，并在室温温育15分钟。为了完成反应，将200ul tPA底物S2288(Chromogenix)(1.25mM)添加至混合物。PAI-1直系同源物从Molecular Innovations获得：小鼠PAI-1(野生型活性组分；cat#MPAI)；大鼠PAI-1(野生型活性组分；cat#RPAI)；和兔PAI-1(稳定突变体；cat#RbPAI-I91L)；食蟹猴PAI-1(活性食蟹猴PAI-1)在大肠杆菌中内部产生。由于兔和大鼠直系同源物在Biacore筛选中不良的解离率(数据未显示)，未针对这些直系同源物进行抗体筛选。
表7:在功能性生色测定中抗体针对PAI-1的直系同源物和糖基化状态的活性
Figure BDA0000958883060000651
Figure BDA0000958883060000661
每个融合的一个或多个抗体在该测定中呈现了阻断食蟹猴和人PAI-1抑制功能二者的能力，其中约14个抗体具有中度至强的阻断活性。A39和B28具有独特的分布，即这两种抗体阻断糖基化hPAI-1但针对人或食蟹猴非糖基化PAI-1不具活性。除了C26，这些抗体均无法有效地阻断小鼠PAI-1活性(在10倍人PAI-1的内)。
实施例7：单克隆抗体的作用机制
单克隆抗体可通过三种不同的机制抑制PAI-1：a)通过空间位阻，b)通过结合后将PAI-1转化为休眠构象，和c)通过将PAI-1转化为tPA的底物构象而非抑制剂(“底物构象”)。PAI-1在与丝氨酸蛋白酶相互作用后与tPA形成共价键。
使用生色测试和SDS-PAGE技术鉴定抗体的作用机制。如上关于功能性生色测试所述进行了单克隆抗体(或对照抗体)、PAI-1和tPA之间的反应。将样品与Laemmli样品缓冲液混合，并在非还原条件下载入SDS-PAGE凝胶，并运行30分钟。之后，将凝胶用考马斯蓝染色以使PAI-1的蛋白、复合物和裂解形式显色。使用具有已知作用机制的对照单克隆抗体作为对比物。已知33B8将PAI-1转化为休眠构象，而已知33H1将PAI-1转化为底物构象。该测定可正面地(positively)鉴定底物构象，但无法区分休眠构象或空间位阻。代表性SDS-凝胶示于图8，9和10。
表8:单克隆抗体的作用机制
Figure BDA0000958883060000662
Figure BDA0000958883060000671
A44，C26，C45和E21通过将PAI-1从活性构象转化为底物构象来阻断PAI-1活性。A39和B109具有不同的作用机制，但该测定无法区分这些抗体是通过将PAI-1从活性构象转化为休眠构象或通过空间位阻来阻断PAI-1活性。
实施例8：纯化的抗体的结合动力学
在动力学测量中，将抗体在25℃反向评估。在反向测定中，将PAI-1抗体捕获于在CM5芯片上制备的抗小鼠IgG Fc抗体表面，随后注射PAI-1蛋白(人或食蟹猴)从40nM开始的系列2x稀释。选择50ul/分钟的高流速以避免质量运输限制。允许两千秒的解离时间以适应选定的抗体的缓慢解离率。在每轮抗体-PAI-1结合之后，芯片通过甘氨酸-HCl，pH 1.7缓冲液再生。动力学数据分析使用Biacore BIAevaluation软件进行。感应谱通过减去参照的流通池的值和空白缓冲液值进行双重参照。使用模拟的具有局部Rmax的动力学1：1(Langmuir)模型拟合感应谱。测试的抗体数据示于下表9。
表9:通过Biocore反向测定的结合动力学
Figure BDA0000958883060000672
进一步分析了代表性抗体的结合动力学，并将其与玻璃粘连蛋白和PAI-1的复合物在Biacore正向测定中加以比较。在正向测定中，将人玻璃粘连蛋白通过氨偶联固定化于流通池Fc1至Fc4中的CM5芯片上。随后将人PAI-1捕获于流通池Fc2-Fc4中的玻璃粘连蛋白表面作为配体。将Fc1留作参照池。将抗体从40nM开始稀释2x，并注入Fc1至4。动力学数据分析使用Biacore BIAevaluation软件进行。感应谱首先通过减去参照池的值和空白缓冲液值进行双重参照，随后使用具有全局Rmax的1：1(Langmuir)模型拟合。
表10:Biacore正向测定中A44与人玻璃粘连蛋白捕获的人PAI-1的结合动力学
Figure BDA0000958883060000673
表10中的数据表明A44结合游离的人PAI-1以及玻璃粘连蛋白复合物中的PAI-1。
实施例9：原代人细胞中的功能测定
为了进一步调查每种抗体恢复原代人细胞下游纤溶酶产生的能力，使用了纤溶酶生成测定。仅使用了在生色测定中显示高效力和在Biacore中显示良好亲和力的抗体在该测定中进行测试。
在第1天，将人原代肝星形细胞(Sciencell CA，产品号SC5300)以20000细胞/孔在37℃在5％CO2下铺板于饥饿培养基(DMEM Gibco+glutamax-14.5g/L D-葡萄糖，丙酮酸(31966-021)，0.2％胎牛血清gold PAA(A11-152))。在第2天，为了中和PAI-1活性，将抗体用重组PAI-1(Molecular Innovation，cat#IGLYHPAI-A，重组糖基化人PAI-1，最终浓度5nM)在室温预温育15分钟。与此同时，将tPA(Molecular Innovations(cat#HTPA-TC)，无酚红的DMEM中的5nM)与细胞在37℃温育15分钟。在洗去未结合的tPA之后，将PAI-1/mAb混合物添加于细胞，随后通过添加glu-纤溶酶原/底物混合物(Glu-Pg：Sigma产品号9001-91-6；0.5μM最终浓度)和纤溶酶生色底物：(CBS00.65Stago产品号00128，0.5mM最终浓度)来测量残余tPA活性。
纤溶酶原至纤溶酶的活化通过使用恒温于37℃的分光光度计(IEMS，Thermofisher)每45秒在A405/492nm进行动力学读数来检测。Biolise软件(Thermofischer)计算生色底物裂解的最大速率：纤溶酶产生表示为Vmax:计算出的每分钟A405/492nm的最大速率(mDO/分钟)。随后用作为参照的tPA本身(100％抑制)和PAI-1(无mAb，即无抑制)计算PAI-1抑制，并使用Biostat speed软件作图以计算IC50和Imax。
表11:人原代肝星形细胞中纤溶酶原的生成
Figure BDA0000958883060000681
Figure BDA0000958883060000691
实施例10：通过Biacore竞争测定进行的抗体结合表位探查
在Biacore竞争测定中对具有优异结合和阻断活性的选定组的抗PAI-1抗体探查其潜在的结合表位。在该测定中，将新鉴定出的抗体以及几种商业上可获得的、具有已知的在人PAI-1上的结合位点抗PAI-1抗体设置为竞争对人PAI-1蛋白的结合。将每种抗体使用标准的氨偶联反应固定化于Biacore CM5芯片中的流通池上。除了克隆B28，所有测试的抗体在氨偶联之后保留了结合位点活性。将人PAI-1蛋白捕获于芯片上固定化的抗体，随后注入每种抗体作为分析物。仅与来自固定化的抗体在人PAI-1上具有不同的结合位点的分析物抗体在Biacore中显示附加的结合信号。对于每种固定化的抗体，将该竞争实验重复两次，且结果示于下表。
表12:来自Biacore竞争测定的结合表位的总结
Figure BDA0000958883060000692
当A44固定化并结合PAI-1时，C45(分析物抗体)无法结合于A44所结合的PAI-1。因此，C45竞争A44在PAI-1上结合的同一结合位点(在表12中标示为“c/c”)，或A44对PAI-1的结合干扰C45对PAI-1的结合。当在相反方向重复该实验时，该分析得到确认。具体而言，当C45为固定化的抗体并结合于PAI-1时，作为分析物抗体的A44无法结合于与C45结合的PAI-1(在表12中标示为“c/c”)。在相似的分析中，A71和A75竞争PAI-1上的相同位点。Biacore分析确认A44和C45，以及A71和A75当结合于PAI-1时彼此竞争或彼此干扰。
相反地，商业上可获得的抗体33H1和33B8并不与A44竞争。当A44为固定化的抗体并结合于PAI-1时，33H1和33B8两者均仍能够结合于与A44结合的PAI-1(在表12中标示为“b/b”)。这在反向实验中得到确认。当PAI-1结合于固定化的33H1或固定化的33H8时，A44仍然能够结合于PAI-1。因此，商业上可获得的抗体33H1和33B8并不与A44竞争或干扰其对PAI-1的结合。
有趣的是，一些固定化的抗体(即B109)阻断分析物抗体(即33B8)结合于捕获的PAI-1蛋白；然而，当将固定化的抗体和分析物抗体的位置互换时(例如，将该对在芯片上互换)，该抗体对不再彼此竞争对PAI-1的结合。例如，当B109为结合于PAI-1的固定化的抗体时，33B8无法结合于PAI-1。然而，当33B8为结合于PAI-1的固定化的抗体时，B109能够结合于PAI-1。关于该结果一种可能的解释是当固定化的抗体结合于PAI-1时，PAI-1可能转换为对于第二或分析物抗体不利的构象，并阻止分析物抗体结合(例如，当B109是固定化的抗体而33B8是分析物抗体时)。然而，当抗体对互换时，固定化的抗体可能以这样一种方式结合，使得PAI-1构象相对未改变，因此允许分析物抗体结合于结合的PAI-1(即，分析物抗体B109能够结合与固定化的抗体33B8结合的PAI-1)。因此，在33B8和B109之间观察到的竞争并非因为在PAI-1上重叠的结合位点，而更可能是由于当结合于B109时PAI-1中的构象变化。
另一个令人感兴趣的观察结果是当通过氨偶联固定化时，B28丧失了对人PAI-1的结合，这表明B28的CDR区涉及具有伯胺基团的氨基酸。
实施例11：选择用于人源化的小鼠单克隆抗体
表13显示表征来自五次进行的融合的最具活性的单克隆抗体的体外数据的总结。基于这些数据，选择A44进行人源化，因为A44在生色测定和在纤溶酶生成方面为最具效力的抗体，并在Biacore中具有最高亲和力。
表13:单克隆抗体针对人糖基化的PAI-1的亲和力和效力总结
Figure BDA0000958883060000711
表1中所示的重链和轻链序列在图12中比对，且如IMGT所定义的CDR以粗体凸显。基于表13中呈现的该体外数据，选择A44进行人源化。
实施例12：抗PAI-1A44Fab的工程化：人源化，稳定化，和不想要的序列基序的突变
采用数种下述讨论的方法来人源化、稳定化针对PAI-1的A44鼠类抗体并优化其序列基序。
1)人源化
所用的人源化方案已描述于PCT/US08/74381(US20110027266)，其通过提述以其全文并入本文。使用鼠类A44的可变轻链(VL)和可变重链(VH)序列在Molecular OperatingEnvironment(MOE；v.2010.10；Chemical Computing Group)中构建抗PAI-1A44轻链(LC)和重链(HC)的同源性模型。使用下述模板：轻链框架区-1D5I(在框架区中具有94％同一性)、重链框架区-3KSO(在框架区中具有96％同一性)、L1-1D5I(94％同一性)、L2-1D5I(94％同一性)、L3-1AXS(72％同一性)、H1-1IC7(82％同一性)、H2-1MBU(68％同一性)和H3-2WDB(62％同一性)。H3环特别难以建模，因为Trp是第一个残基。尽管2WDB是较短的环，但其也在环起始处具有Trp和相同的在H3环末端的Phe-Asp-Tyr序列。重建Glu-105(LC)和His-99的侧链，并将后续模型使用MOE中实施的标准步骤能量最小化。随后在500K温度实施了对鼠类A44的最小化3D同源性模型的分子动力学(MD)模拟1.1纳秒(ns)，其中对蛋白骨架具有在Generalized Born隐溶剂中的限制。对于最后1ns，每100皮秒(ps)从该第一MD运行提取了十个不同的构象。随后将这些不同的构象分别提交于MD模拟，在300K温度，持续2.3ns，并对蛋白骨架无限制。随后，对于10次MD运行的每一次，使用来自MD轨迹的最后2000张快照(每ps一张)对于每个鼠类A44氨基酸计算其与参照中心位置的均方根偏差(rmsd)。通过比较给定氨基酸十次不同MD运行的平均rmsd与所有A44鼠类氨基酸的总体平均rmsd，可决定是否该氨基酸在MD过程中观察到具有足够的柔性，从而视为可能与T细胞受体相互作用并参与免疫应答活化。在所述鼠类A44抗体中，37个氨基酸鉴定为具柔性，其中排除了CDR及其周围
Figure BDA0000958883060000721
随后将在20ns(10x 2ns)过程中62个最具柔性的A44氨基酸的运动与49个人生殖系同源性模型(对于每一个均运行了10x 2ns MD模拟)的相应的柔性氨基酸的运动相比较。这49个人生殖系模型是通过***性合并7个最常见的人生殖系轻链(vk1，vk2，vk3，vk4，vλ1，vλ2，vλ3)和7个最常见的人生殖系重链(vh1a，vh1b，vh2，vh3，vh4，vh5，vh6)构建的。vk1-vh2人生殖系抗体的柔性氨基酸与鼠类A44抗体的柔性氨基酸相比显示0.58 4D相似性；因此，使用vk1-vh2生殖系抗体人源化A44抗体，着重于柔性氨基酸。vλ3-vh4人生殖系显示次高的4D相似性，0.57，并也用作A44抗体人源化的基础。对于鼠类A44和vk1-vh2氨基酸的逐对氨基酸关联，将2个序列基于2个对应的同源性模型的α碳的最优3D叠加进行比对。鼠类A44和vλ3-vh4的逐对氨基酸关联以相似方式进行。图13显示了鼠类A44轻链与vk1和vλ3的比对。图14显示了鼠类A44重链与vh2和vh4的比对。
2)稳定化
a)基于已知的方法
提出将与其相应的经典序列(canonical sequence)相比具有低出现频率的轻链和重链的氨基酸(排除CDR)突变为最频繁出现的氨基酸(ΔΔGth>0.5kcal/mol；(E.Monsellier，H.Bedouelle.J.Mol.Biol.362，2006，p.580-593))。对于LC和HC的共同突变的这种最初列表限制于在最接近的人生殖系(vk1-vh2)中发现的氨基酸。将在CDR周围最邻近区域(5埃“Vernier”区(J.Mol.Biol.224，1992，p.487-499))建议的变化从考虑中排除。这导致在LC中的两个稳定化突变(参见表15)和在HC中的五个稳定化突变(参见表16)。考虑了其它准则以考虑这些突变用于潜在地稳定化抗PAI-1A44抗体。这些准则是在表面有利的亲水性变化或对突变体基于分子力学预测的稳定化。同样，考虑了其它根据文献报导成功的稳定化突变(E.Monsellier&H.Bedouelle，J.Mol.Biol.，362，2006，p.580-593；B.J.Steipe等J.Mol.Biol，1994，240，188-192)(参见表17和18)，然而，未提出其它突变。
表15:轻链中提出的稳定化变化
残基 提出的变化 计算的ΔΔGth 接受变化与否
Lys-3 Val 2.23998 否-不在生殖系中
Met-11 Leu 0.766432 人源化中已变化
Tyr-12 Ser 2.04389 人源化中已变化
Leu-36 Val 2.17091 否-Vernier
Lys-42 Gln 0.939652 否-不在生殖系中
Thr-46 Leu 2.01966 否-Vernier
Gln-69 Thr 2.16357 否-Vernier
Tyr-80 Ala 2.92454 人源化中已变化
Met-83 Leu 2.57007 人源化中已变化
Gly-84 Ala 0.597822 是
Ile-85 Thr 1.27255 是
表16:重链中提出的稳定化变化
Figure BDA0000958883060000731
Figure BDA0000958883060000741
表17:评估的稳定化突变的组合
Figure BDA0000958883060000742
表18*:评估的稳定化突变
Figure BDA0000958883060000743
b)基于3D和MD的方法
之前已报导了基于3D和MD的方法(Seco J.，Luque F.J.，Barril X.，J.Med.Chem.2009Apr 23：52(8)：2363-71；Malin Jonsson等，J.Phys.Chem.B 2003，107：5511-5518)。抗体的疏水区通过在二元溶剂(水中的20％异丙醇，20ns产生模拟)中分析Fab的分子动力学模拟而明确地鉴定出。完成了在Schrodinger’s maestro软件(v.8.5.207)中使用疏水性表面图的附加分析。通过这两种方法分析的蛋白表面非常亲水。尽管使用了这两种技术，未发现任何残基导致在表面上的任何疏水片区，因此未提出抗聚集突变。
3)通过移植进行的人源化
之前已报导了使用移植技术的人源化(P.T.Jones，P.H.Dear，J.Foote，M.S.Neuberger，G.Winter，Nature 1986，321：522-525)。所述人源化首先以鉴定与抗PAI1A44可变结构域轻链和重链最接近的两个人生殖系开始。这通过对于***列举(对于κ和λ链，所有可能的V和J域的组合，对于重链为V、D和J域的组合)的所有人生殖系进行BLAST检索完成。BLAST检索使用由National Center for Biotechnology Information(NCBI)提供的Sequence Information Retrieval and Analysis(SIRA)服务所连结的局域网应用进行。
最接近的人生殖系鉴定为分别与抗PAI1A44可变结构域轻链和重链具有70％和67％的序列同一性。使用内部VBASE生殖系序列，发现轻链与VκI-O18(大约64％同一性)基因座接近而重链与VH4亚家族的4-30(大约69％同一性)基因座接近。对于mA44轻链(A44LC)和对于IGVK1-33-01_IGKJ4-01(IGVK1)将CDR区(基于Kabat)和Vernier残基标示为斜体。定义于J.Mol.Biol.，1992，224，487的Vernier残基以下划线表示。人源化突变(粗体)通过对两个比对的序列进行逐对比较来获得，其中排除了如上定义的CDR&Vernier区残基(在鼠类中也以下划线表示)。将来自鼠类轻链的T46L和Q69T和鼠类重链中的M2V(Vernier区残基)突变为主要为保守的人生殖系序列作为通过移植进行的人源化方法的一部分(LC5a，HC5a)。在另一个变体中，如初始鼠类序列中所见保留这三个Vernier区残基(LC5b，HC5b)。
Figure BDA0000958883060000751
Figure BDA0000958883060000761
次接近的人生殖系被鉴定为分别与抗PAI1A44可变结构域轻链和重链具有59％和58％序列同一性。使用内部VBASE生殖系，发现该轻链与VκIII-L6(～56％同一性)基因座接近而该重链与VH6亚家族的6-01基因座接近。CDR区(基于Kabat)和Vernier区以斜体标示。Vernier区(如定义于J.Mol.Biol.，1992，224，487)以下划线标示。人源化突变通过对两个比对的序列进行逐对比较来获得并以粗体显示，其中排除了如上定义的CDR&Vernier区残基(在鼠类中也以下划线表示)。
Figure BDA0000958883060000762
Figure BDA0000958883060000771
4)不想要的序列基序的突变
考虑了下述的序列基序：Asp-Pro(酸不稳定键)，Asn-X-Ser/Thr(糖基化，X＝任何除Pro外的氨基酸)，Asp-Gly/Ser/Thr(在柔性区中的琥珀酰亚胺/异天冬氨酸形成)，Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys(暴露的脱酰胺位点)，和Met(在暴露区中的受氧化)。鼠类抗PAI1A44的VL和VH域具有两个潜在的糖基化位点：LC中的N52RS(在CDR2中)和在HC中的N72TS。一个暴露的脱酰胺位点存在于HC的CDR1(N31G)。在初始鼠类序列中鉴定了三个潜在的琥珀酰亚胺形成位点：LC中的D56G(CDR2末端)，以及HC中的D27S(在CDR1中)和D89T。LC中存在问题的基序N52RS和D56G，均在CDR2中。因为这些突变出现在CDR中，它们通过在两个提出的下述工程化序列(LC2和LC4)进行突变得以解决。N52保守地突变为Gln，而D56突变为Glu。在HC中存在四个存在问题的残基。前两个发生于CDR1：潜在的琥珀酰亚胺形成位点，D27S，和脱酰胺位点N31G。两个其它存在问题的基序也发生于第三框架区。在CDR1中，将D27突变为E以避免琥珀酰亚胺的形成，而将N31改变为Q。分别将N72和D89改变为Q和E。这些存在问题的基序在下文所述的工程化的序列HC2a和HC4中得以解决。HC2b变体仅含有N31G脱酰胺位点的突变。
将所得的人源化序列针对IEDB数据库(见于万维网immuneepitope.com，2009年6月版本；Vita R.，Zarebeski L.，Greenbaum J.A.，Emami H.，Hoof I.，Salimi N.，DamleR.，Sette A.，Peters B.The immune epitope database 2.0Nucleic Acids Res.2010，Jan，38(Database issue)：D854-62.Epub 2009，nov 11)进行BLAST来探查序列相似性以确保所有序列均不包含任何已知的人B或T细胞表位(70％同一性用作通过BLAST检索获得的结果的界限，并仅考虑来自人物种的结果)。DeClerck等(国际公开号WO 2002034776)公开了PAI-1的抗体结合表位，其中无一对于本文公开的表位存在问题。
对于鼠类A44LC，根据Kirschmann等(The Journal of Immunology，1995，155，5655-5662)存在一个人表位。其与下文所示的14氨基酸区段具有～71％同一性。该题述序列为未经质谱法验证的部分序列。对于该肽未报导任何结合数据。该表位见于所有提出的LC变体。当对HC进行相似的检索时未鉴定出潜在存在问题的表位。
5)抗PAI1可变结构域的原始序列
CDR以粗体凸显，而Vernier区(如由Foote&Winter，J.Mol.Biol.，1992，224：487-499定义)以下划线标示。
Figure BDA0000958883060000781
生殖性指数(germinality index)＝70％(相对于IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])
Figure BDA0000958883060000782
生殖性指数＝67％(相对于IGHV4-59-02_IGHD6-137-01_IGHJ4-02[VH44-30])
6)工程化的序列
将4D人源化和移植方法应用于最接近的两个人生殖系序列
a)工程化的轻链序列
使用最接近的生殖系序列vk1，LC1a含有七个源自4D人源化方法的突变。LC1b对于次接近的人生殖系序列v13具有12个源自4D人源化的突变。LC2与LC1a相比含有CDR2中2个额外的突变。这些突变解决了潜在的糖基化位点(N52RS)和潜在的琥珀酰亚胺形成位点(D56G)。LC3对于最接近的生殖系序列含有来自4D人源化的突变，并具有2个稳定化突变。LC4组合了人源化、稳定化和不想要的基序突变。CDR和Vernier区以斜体表示，Vernier残基以下划线表示，人源化突变以粗体表示，存在问题的基序以双缺失线表示，而稳定化突变以小写显示。图16和17显示这些突变的总结。
Figure BDA0000958883060000791
对于序列LC1a在IEDB数据库中未发现其它人表位。LC1a生殖性指数＝76％(相对于IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。
Figure BDA0000958883060000792
除了上述第4部分中所述的表位外，K39PGQSPKTLI与KPGQPPRLLI具有70％序列同一性(Kirschmann等J.Immun.，1995，155，5655-5662)。根据报导该肽对于所有就其进行测试的HLA-DR等位基因具有IC50>100,000nM。LC1b生殖性指数＝67％(相对于IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。
Figure BDA0000958883060000801
对于序列LC2在IEDB数据库中未发现其它人表位。
LC2生殖性指数＝76％(相对于IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。
Figure BDA0000958883060000802
对于序列LC3在IEDB数据库中未发现其它人表位。LC3生殖性指数＝78％(相对于IGKVI-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。
Figure BDA0000958883060000803
对于序列LC4在IEDB数据库中未发现其它人表位。LC4生殖性指数＝78％(相对于IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。
Figure BDA0000958883060000804
除了上述第4部分中所述的表位外，A43PKLLIYRAN与APKLLIYAASSL具有80％序列同一性(Kirschmann等J.Immun.，1995，155，5655-5662)。对于该肽未确定其分子量，且无结合数据的报导。LC5a生殖性指数(germinality index)＝85％(相对于IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。
Figure BDA0000958883060000811
对于序列LC5b在IEDB数据库中未发现其它人表位。
LC5b生殖性指数＝83％(相对于IGKV1-33-01_IGKJ4-01[VκI-O18])。
Figure BDA0000958883060000812
除了上述第4部分中所述的表位外，K39PGQAPRTLI与KPGQPPRLLI具有80％序列同一性(Kirschmann等J.Immun.，1995，155，5655-5662)。据报导该肽对于所有就其进行测试的HLA-DR等位基因具有IC50>100,000nM。LC5c生殖性指数＝79％(相对于IGKV3-11-02_IGKJ4-01[VκIII-L6])。所有轻链突变的概述示于图15。
b)工程化的重链序列
HC1a对于最接近的人生殖系序列含有八个源自4D人源化方法的突变。HC1b对于次接近的人生殖系序列具有六个源自4D人源化的突变。HC2a与HC1a相比含有四个额外的突变以解决不想要的序列基序。H2b仅解决了CDR1中的脱酰胺位点(N31G)。HC3含有来自HC1a的人源化突变，并具有五个其它的稳定化突变。HC4含有来自HC1a的人源化突变，来自HC3的稳定化突变，和来自HC2a的解决存在问题的基序的突变。CDR和Vernier区以斜体表示，Vernier残基以下划线表示，人源化突变以粗体表示，存在问题的基序以双缺失线表示，而稳定化突变以小写显示。
Figure BDA0000958883060000813
对于序列HC1a在IEDB数据库中未鉴定出人表位。HC1a生殖性指数＝68％(相对于IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。
Figure BDA0000958883060000821
对于序列HC1b在IEDB数据库中未鉴定出人表位。HC1b生殖性指数＝73％(相对于IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。
Figure BDA0000958883060000822
对于序列HC2a在IEDB数据库中未鉴定出人表位。HC2a生殖性指数＝67％(相对于IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。
Figure BDA0000958883060000823
对于序列HC2b在IEDB数据库中未鉴定出人表位。HC2b生殖性指数＝67％(相对于IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。
Figure BDA0000958883060000824
对于序列HC3在IEDB数据库中未鉴定出人表位。HC3生殖性指数＝72％(相对于IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。
Figure BDA0000958883060000831
对于序列HC4在IEDB数据库中未鉴定出人表位。HC4生殖性指数＝70％(相对于IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。
Figure BDA0000958883060000832
对于序列HC5a在IEDB数据库中未鉴定出人表位。HC5a生殖性指数＝84％(相对于IGHV4-59-02_IGHD6-13-01_IGHJ4-02[VH4 4-59])。
Figure BDA0000958883060000833
对于序列HC5b在IEDB数据库中未鉴定出人表位。HC5b生殖性指数＝84％(相对于IGHV4-59-02_IGHD6-13-01_IGHJ4-02[VH4 4-59])。
Figure BDA0000958883060000834
对于序列HC5c在IEDB数据库中未鉴定出人表位。HC5c生殖性指数＝78％(相对于IGHV6-1-02_IGHD6-13-01_IGHJ4-02[VH6 6-01])。
所有重链突变的概述示于图16。
c)重链和轻链变体序列的组合
对于移植，构建了三个版本的轻链(LC5a，LC5b，LC5c)和三个版本的重链(HC5a，HC5b，HC5c)。LC5a含有16个突变，其源自移植于最接近的人生殖系序列并保留鼠类CDR和大部分鼠类Vernier区残基。两个鼠类Vernier残基，T46和N69不存在于任何人生殖系序列，并保守地突变。LC5b含有14个突变，其源自移植于最接近的人生殖系序列并保留鼠类CDR和全部鼠类Vernier区残基。LC5c含有22个突变，其源自移植于次接近的人生殖系序列并保留鼠类CDR和全部鼠类Vernier区残基。
HC5a含有20个突变，其源自移植于最接近的人生殖系序列并保留鼠类CDR和大部分鼠类Vernier区残基，除了M2V。在人生殖系序列中的该位置，Met以非常低的倾向出现。HC5b含有20个突变，其源自移植于最接近的人生殖系序列并保留鼠类CDR和全部鼠类Vernier区残基。HC5c含有23个突变，其源自移植于次接近的人生殖系序列并保留鼠类CDR和全部鼠类Vernier区残基。
总共制备了十种组合(总结于表19)：
●LC1a x HC1a(基于最接近的生殖系序列解决4D人源化的突变)
●LC1b x HC1b(基于次接近的生殖系序列解决4D人源化的突变)
●LC2x HC2a(解决4D人源化和不想要的序列的突变)
●LC2x HC2b(解决4D人源化和不想要的序列的突变)
●LC1a x HC2b(解决4D人源化和不想要的序列的突变)
●LC3x HC3(解决4D人源化和稳定化的突变)
●LC4x HC4(解决4D人源化、不想要的序列和稳定化的突变)
●LC5a x HC5a(解决通过移植进行的人源化，保留CDR且并入3个保守Vernier修饰的突变)
●LC5b x HC5b(解决通过移植进行的人源化，保留CDR和Vernier区的突变)
●LC5c x HC5c(解决通过移植进行的人源化，保留CDR和Vernier区的突变)
表19:十种LC x HC组合的总结
Figure BDA0000958883060000841
Figure BDA0000958883060000851
表21:抗PAI-1A44抗体的八种LC变体的突变
Figure BDA0000958883060000852
Figure BDA0000958883060000861
表22:抗PAI1A44抗体的九种HC变体的突变
Figure BDA0000958883060000862
Figure BDA0000958883060000871
总之，在人源化过程中生成了十种变体。在下文所述的数个体外测定中进行这些变体表达和表征。
7)人源化变体的表征
基于上述实施例中给出的计算机建模，生成了十种变体(通过4D人源化生成变体1-8，和通过CDR移植生成变体9-10，变体3和10是基于次接近的生殖系构建的)。制备了人源化A44的轻链和重链DNA的可变区用于HEK293表达。在将对应的DNA克隆入pXL质粒后生成蛋白(New England Biolabs；对于HC为NheI/Eco47III，对于LC为NheI/BsiWI)。将人源化序列就HEK表达进行密码子优化，并将基因通过GeneArt(Life Technologies的子公司)合成。将所得的质粒在FreeStyleTM 293Expression System(Invitrogen，Cat#K9000-01)中共转染和瞬时表达。变体3和10表达非常不良，且并未进一步对其进行操作。将所有其它的变体表达并使用蛋白A柱纯化。分析凝胶显示变体5和7中的重链(数据未显示)和变体6和9中的轻链部分地糖基化(约5-10％)。将剩余八种变体在使用hPAI的生色测定中和在人星形细胞中使用糖基化人PAI的纤溶酶生成测定中进行测试。结果示于表23。
表23:纤溶酶生成中人源化变体的表征和生色测定
Figure BDA0000958883060000872
变体6和9在纤溶酶生成测定中显示最佳效力，但在轻链中具有部分(5％-10％)糖基化。基于这些结果，使用来自变体6和9的重链和来自变体5和7的轻链的组合产生新变体11-14。表24总结了所有构建的变体。
表24:人源化变体
变体# 描述 SEQ ID NO
A44-hv1 LC1a x HC1a 109
A44-hv2 LC1b x HC1b 110
A44-hv3 LC2x HC2a 111
A44-hv4 LC1a x HC2b 112
A44-hv5 LC2x HC2b 113
A44-hv6 LC3x HC3 114
A44-hv7 LC4x HC4 115
A44-hv8 LC5a x HC5a 116
A44-hv9 LC5b x HC5b 117
A44-hv10 LC5c x HC5c 118
A44-hv11 LC2x HC3 119
A44-hv12 LC4X HC3 120
A44-hv13 LC2x HC5b 121
A44-hv14 LC4x HC5b 122
表25:DNA序列人源化变体
Figure BDA0000958883060000881
Figure BDA0000958883060000891
Figure BDA0000958883060000901
Figure BDA0000958883060000911
除了不良表达的变体3和10外，在Biacore中针对人和食蟹猴PAI-1和玻璃粘连蛋白-PAI-1复合物测试了所有的变体。数据展示于表26。
表26:Biacore中人源化变体的表征
Figure BDA0000958883060000912
Figure BDA0000958883060000921
Biacore数据并未揭示人源化变体间的显著差异。所有人源化变体，除了变体8，均在可接受范围内显示对食蟹猴PAI-1和人PAI-1以及复合于玻璃粘连蛋白的PAI-1的亲和力。与亲本A44相比较，人源化并未显示改变抗体亲和力。
尽管人源化变体的亲和力和效力在生色和Biacore测定中并无显著差异，但对于一些变体，在细胞测定中变体恢复纤溶酶生成的能力显著低于亲本小鼠抗体(参见下表27，其总结了生色测定和细胞测定的比较)。对人源化变体11-14测试了在细胞测定中阻断PAI-1的能力。
表27:纤溶酶生成中人源化变体11-14的表征
Figure BDA0000958883060000922
变体11至14显示了在纤溶酶生成测定中的良好效力，并在其它体外测定中进一步表征。
8)人肝中人源化变体的表征
人源化变体11-14的额外筛选使用从人血浆和人纤维化肝样品内源产生的人PAI-1进行。
PAI-1活性通过测定该丝氨酸蛋白酶抑制剂与96孔板上固定化的尿激酶形成稳定复合物的能力来评估。在洗涤了未结合的PAI-1之后，uPA-PAI-1复合物通过使用多克隆抗PAI-1抗体来检测。随后将结合的多克隆抗PAI-1抗体(其与样品中的活性PAI-1成比例)通过使用辣根过氧化物酶偶联的二抗(Molecular Innovation Cat.no.HPAIKT)来检测。将多种浓度的A44人源化变体在室温用人或食蟹猴重组PAI-1(0.31nM最终浓度)温育15分钟，随后使用上述的ELISA通过uPA-PAI-1复合物测试功能性活性PAI-1。将样品与人PAI-1标准相比较。将来自具有高活性PAI-1水平的高BMI患者的人血浆稀释4倍，并用增加量的A44人源化变体来温育。剩余的活性PAI-1水平使用通过ELISA的uPA-PAI-1复合物检测来确定。还通过纤溶酶产生测试了食蟹猴重组PAI-1中和以确认交叉反应性。
表28:人源化变体阻断内源PAI-1活性的能力
Figure BDA0000958883060000931
将人纤维化肝样品(由Biopredic International，Rennes，France从肝结肠转移的手术切片提供)如下所述匀浆：将称重的冷冻肝样品在含有陶瓷珠的干试管(产品号03961-1-003，Bertin Technology，France)中使用Precellys匀浆机(Bertin Technology，France；4℃，在6800rpm进行2x30秒)匀浆，随后使用1ml/g的裂解缓冲液(TBS中的NaCl1.5M-Tris缓冲溶液0.1M Tris+0.15M NaCl pH7.4)溶解。在4℃在5000g离心10分钟之后，收获上清中的肝裂解物，并在-80℃冷冻储藏。总蛋白浓度使用标准BCA测定，且活性和总PAI-1水平(通过由Mol Innov产品号HPAIKT&产品号MPAIKT-TOT提供的UK-PAI复合物ELISA确定)根据生产商的指示进行，即使用Biostat Calibration软件将标准人PAI-1浓度针对A450nm作图。如上文所述评估用稀释至2.5nM活性PAI-1的肝裂解物温育的增加浓度的A44人源化变体，并分析数据。对于每个mAb浓度计算PAI-1活性的抑制(不含mAb的PAI-1活性为0％抑制，用IgG1并无显著和剂量依赖性的PAI-1抑制)。将PAI-1活性的抑制百分比作为mAb浓度的函数作图，并使用Biostat speed软件的Imax确定IC50。数据示于图17和表29。
表29:人肝中通过A44-hv11的PAI-1活性中和
IC50(nM) Imax(％)
A44-hv11(1nM) 0.0365 99.997
A44-hv11(2nM) 0.0503 99.99
A44-hv11(3nM) 0.0465 99.99
平均值+/-sem 0.0444+/-0.004 99.99
根据上述数据，选择A44-hv11在附加的结构研究和其它体外和体内研究中进一步表征。
实施例13：通过移植进行的APG抗体的人源化
之前已报导了使用移植技术进行的人源化(P.T.Jones，等，Nature 1986，321：522-525)。抗PAI1鼠类抗体APG的人源化始于来自德国专利申请号DE2000153251的鼠类轻链(SEQ ID NO:148)和鼠类重链(SEQ ID NO:149)；该鼠类抗体也描述于Debrock等，Biochimica et Biophysica Acta，1337(2)：257-266(1997)。对该鼠类抗体的HC和LC链的生殖系和规范类型的鉴定分别产生了muIGHV1-39和muIGKV14-111。随后，鉴定了与抗PAI1APG可变结构域轻链和重链相近的人生殖系的列表，并根据百分比同一性排序。两个步骤均通过对于***列举(对于κ和λ链，所有可能的V和J域的组合，对于重链为V、D和J域的组合)的所有人生殖系进行BLAST检索来完成。BLAST检索使用http：//www.imgt.org.(参见Ehrenmann，等Cold Spring Harbor Protocols 2011.6(2011))提供的IMGT/DomainGapAlign工具进行。最接近的人生殖系鉴定为与抗PAI1APG可变结构域轻链和重链分别具有67.4％和63.3％序列同一性。使用IMGT数据库，发现所述轻链与HuIGKV1-33接近而重链与HuIGHV1-46接近。发现规范类型匹配下与抗PAI1APG可变结构域重链最接近的人生殖系为HuIGHV7-4-1，具有62.2％的序列同一性。
对于亲本鼠类APG(mAPG)轻链(mAPG)轻链(SEQ ID NO:148)，IGKV1-33-01_IGKJ4-01(IGKV1a)(SEQ ID NO:107)和IGKV1-33-01_IGKJ2-02(IGKV1b)(SEQ ID NO:150)(参见下表30)，CDR区(对于APG，基于Kabat和IMGT的组合)和Vernier残基以斜体表示。如定义于Foote，等J.Mol.Biol.224(2)：487-99(1992)的Vernier残基以下划线表示。人源化突变(以粗体表示)通过对两个比对的序列进行逐对比较获得，其中排除如上文定义的CDR和Vernier区残基(在mAPG序列中也以下划线表示，表30)。对鼠类APG抗体并未进行进一步工程化。这些人源化的抗体命名为APGv2和APGv4。
表30:APG人源化序列
Figure BDA0000958883060000951
工程化序列
将4D人源化和移植方法应用于上述的人生殖系序列匹配。对于工程化的轻链序列，APGv2含有移植入人IGKV1-33生殖系的鼠类轻链CDR(APGv2生殖性指数＝94％，相对于IGKV1-33-01_IGKJ2-01)。对于工程化重链序列，APGv2和APGv4分别含有移植入人类IGHV7-4-1和IGHV1-46生殖系的鼠类重链CDR(APG_VH2生殖性指数＝91％，相对于IGHV7-4-1-02_IGHD6-25-01_IGHJ4-02；APG_VH4生殖性指数＝91％，相对于IGHV1-46-01_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)。参见上表30。
重链和轻链变体序列的组合
为了移植，构建了一个版本的轻链(APGv2_VL2；SEQ ID NO:153)和两个版本的重链(APGv2_VH2；SEQ ID NO:154和APGv4_VH4；SEQ ID NO:155)。APG_VL2含有15个源自移植于最接近的人生殖系序列并保留鼠类CDR和Vernier区残基的突变。APG_VH2含有21个源自移植于最接近的人生殖系序列、具有匹配的规范类型并保留鼠类CDR和Vernier区残基的突变。APG_VH4含有20个源自移植于最接近的人生殖系序列并保留鼠类CDR和Vernier区残基的突变。对于该移植方案，CDR的分界大致地基于文献中可获得的多种不同定义。
●APG_VL2x APG_VH2(解决通过移植进行的人源化，保留CDR和Vernier区的突变)
●APG_VL2x APG_VH4(解决通过移植进行的人源化，保留CDR和Vernier区的突变)
在该人源化过程中生成了两个mAPG变体，其命名为APGv2和APGv4。表达这些变体并如下所述在数种体外测定中表征。
实施例14：通过表面等离子共振进行的对于APG抗体的亲和力动力学
通过表面等离子共振(SPR)对小鼠APG和两个人源化变体(APGv2&APGv4)使用Biacore 2000仪器(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)研究对人糖基化PAI-1(GLYHPAI-A，Molecular Innovation)的亲和力。
首先，使用常规氨偶联制备传感芯片CM5(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)的表面用于捕获小鼠和人抗Fc(抗人IgG(Fc)抗体和抗小鼠IgG抗体试剂盒，GE Healthcare)。将所有的单克隆抗体(mAb)使用HBS-EP运行缓冲液稀释至5nM。将每个纯化的mAb在不同的流通池表面捕获3分钟。将人PAI-1以多种浓度(2.5，5，10，20和40nM)注入，其中之间的解离时间较短，而最后的解离时间较长(接触时间：120秒，短解离：90秒；长解离：1800秒，流速：50μl/min)。在每轮抗体-PAI-1结合之后芯片通过甘氨酸-HCl，pH 1.7缓冲液再生。动力学数据分析使用Biacore BIAevaluation软件进行。将感应谱通过减去参照的流通池值和空白缓冲液值进行双重参照。将感应谱通过使用具有局部Rmax的模拟的动力学1：1(Langmuir)模型进行拟合(参见图19)。对于三个APG抗体的数据示于表31。
表31：通过Biacore反向测定的结合动力学
Figure BDA0000958883060000971
实施例15：人血浆中APG抗体的表征
根据本文中公开的功能测定(参见，例如上述实施例6和9)对小鼠APG和人源化的变体APGv2和APGv4筛选其阻断PAI-1的能力。简言之，PAI-1活性通过该丝氨酸蛋白酶抑制剂与96孔板上固定化的尿激酶形成稳定复合物的能力来进行评估。在洗去了未结合的PAI-1之后，uPA-PAI-1复合物通过使用多克隆抗PAI-1抗体来检测。随后将结合的多克隆抗PAI-1抗体(其与样品中的活性PAI-1成比例)使用辣根过氧化物酶偶联的二抗根据制造商的说明(Molecular Innovation，产品号HPAIKT)来检测。
将多种浓度的APG人源化变体(APGv2，APGv4)或亲本小鼠APG抗体在室温用未稀释的具有高活性PAI-1水平的人血浆温育15分钟。剩余的活性PAI-1水平如上所述(参见，例如实施例6)并根据生产商的指示使用通过ELISA的uPA-PAI-1复合物检测来确定。
对于每个mAb浓度计算PAI-1活性的抑制。将PAI-1活性的百分比抑制作为APG人源化变体(APGv2，APGv4)或亲本小鼠APG抗体的浓度的函数进行作图。使用Biostat speed软件在三次独立实验(一式两次)之后用于确定IC50和Imax(参见图20)。数据呈现于下表32。
表32:人血浆中纤溶酶原的生成
抗体 IC<sub>50abs</sub>平均值±sem(nM) I<sub>max</sub>平均值(％)
mAPG 1.81 89.7
APGv2 9.62E-1 94.5
APGv4 1.28 94.4
实施例16：人血浆中的凝块溶解测定：A44V11，mAPG和APG变体活性
纤维蛋白溶解***在中风患者中常常改变。可使用凝块溶解测定来通过测量纤维蛋白降解的程度来确定纤维蛋白溶解活性。一般地，参见Lindgren，A.等Stroke 27：1066-1071(1996)。凝块溶解测定在其它文献中更详细描述。参见，例如Beebe，等Thromb.Res.47：123-8(1987)；Tilley等，J.Vis.Exp.67：e3822。
A44V11和其它PAI-1中和抗体的功能活性使用人血浆凝块溶解测定来确定。简言之，本文中应用的测定使用组织因子/Ca2+的混合物在tPA存在下和已知抑制凝块溶解的PAI-1浓度诱导凝块形成。纤维蛋白聚合诱导浊度的增加，其通过在340nm的吸光度测量来检测。抗体恢复凝块溶解的能力通过将增加剂量的抗体与正常的血小板贫乏的人血浆温育来确定。
简言之，凝块溶解实验在微滴定板中进行。将经柠檬酸处理的人血浆(BiopredicInternational，Rennes，France)用稀释于测定缓冲液(NaCl，Tris-HCl pH＝7.4)的抗PAI-1抗体或同种型对照IgG温育。在室温温育15分钟之后，将人糖基化PAI-1(GLYHPAI-A，Molecular Innovation)添加至3nM的最终浓度，并再温育10分钟。随后将t-PA(sctPA，Molecular Innovation)添加至1nM的最终浓度。凝块形成通过包含在钙测定缓冲液(CaCl2)中稀释至7.5mM的最终浓度的组织因子(
Figure BDA0000958883060000981
Siemens HealthcareDiagnostics，Marburg，Germany)的活化混合物来诱导。
在340nm的吸光度的动力学读数用iEMS微板读数器(ThermoFischer)或SectrostarNano(BMG Labtech)每30秒进行达5小时。为了定量对凝块溶解的作用，使用GraphPad Prism Software计算曲线下面积(AUC)，其反映了凝块形成和凝块溶解之间的平衡。抗体处理之后凝块溶解的恢复根据下述计算确定：
Figure BDA0000958883060000982
IC50和Imax使用Biostat speed软件计算。
1nM浓度的t-PA在2小时内产生正常血浆的完全溶解。3nM浓度的PAI-1抑制t-PA诱导的凝块溶解。添加t-PA或PAI-1本身并不影响凝块形成。既不添加t-PA也不添加PAI-1不影响凝块形成。
A44V11抗PAI-1抗体恢复了人血小板贫乏的血浆的凝块溶解(参见图21)，而同种型IgG1并非如此(参见图22)。A44V11呈现2nM的IC50和在100nM处103％的Imax(参见图23)。
APG抗PAI-1抗体的人源化变体也恢复了人血小板贫乏的血浆的凝块溶解(参见图24)。APGv2显示2.1nM的IC50和在100nM处114％的Imax。APGv4显示2.8nM的IC50和在100nM处116％的Imax(参见图25)。凝块溶解数据总结于下表33。
表33:通过抗PAI-1抗体的凝块溶解抑制
抗体 IC<sub>50</sub>(nM) Imax@100nM
A44V11 1.38 113％
APG V2 2.08 114％
APG V4 2.82 116％
mAPG 2.34 123％
实施例17：对原代人肺细胞中PAI-1的A44V11中和的评估
在基于肺细胞的***中调查了抗体A44V11对PAI-1的中和作用。TGFβ视为最强力和通用的促纤维形成细胞因子。已显示在培养的鼠类胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞)中，TGFβ诱导PAI-1表达并抑制t-PA和纤溶酶的活性，以及胶原蛋白降解。参见Liu，R-M.AntioxidRedox Signal.10(2)：303-319(2008)。将来自ATCC(Manassas，Virginia)的原代肺成纤维细胞株LL29(CCL-134)和LL97A(CCL-191)在12孔板中以200,000个细胞每孔的浓度铺板过夜。将细胞用A44V11抗体或同种型对照(IgG)和TGFβ(R&D Systems，Minneapolis，Minn.，cat.#100-B-001)以5ng/ml的浓度温育48小时。在48小时之后，收获细胞上清，并用兔pAb抗PAI-1(abcam，ab66705)通过Western Blot分析用于检测PAI-1形式。
在TGFβ刺激之后用A44V11抗体处理的细胞显示PAI-1条带为双条带，这对应于PAI-1的裂解形式(参见图26，泳道5)。用对照IgG处理的细胞并未显示该双条带形成(参见图26，泳道6)。该研究说明用A44V11处理原代人肺细胞诱导内源PAI-1底物构象，这允许PAI-1受蛋白酶裂解。
实施例18：A44V11增加MMP的活化
纤溶酶可活化MMP，其为降解大多数ECM蛋白的酶，ECM蛋白包括胶原蛋白，其为纤维化组织主要的蛋白成分。就此考虑，纤溶酶常常提及为MMP的通用激活剂(参见Loskutoff，等J.Clin.Invest.106(12)：1441-43(2000))。PAI-1通过阻断纤溶酶生成，随后抑制成纤维细胞凋亡减少MMP活化和基质降解。在基于肺细胞的***中调查了A44v11刺激MMP活化的能力。将来自ATCC(Manassas，Virginia)的原代肺成纤维细胞LL29(CCL-134)和LL97A(CCL-191)以250,000个细胞每孔的浓度在12孔板中铺板过夜。将细胞用A44V11或同种型对照(IgG)和Lys-Plasminogen(Molecular Innovation，cat.#HGPG-712)以0.1μM的浓度温育48小时。在48小时之后，收获细胞上清，并使用Sensolyte520Generic MMP Assay试剂盒(AnaSpec，Fremont，CA，cat.#71158)根据生产商的指示检测多种MMP(包括，例如MMP-1，2，3，7，8，9，12，13和14)的活性。
如图27中所示，A44V11在人肺成纤维细胞中刺激纤溶酶相关性MMP的活化。该图显示两个单独的代表性实验。用A44V11和纤溶酶原处理的细胞当与用阴性IgG1抗体处理的细胞相比时显示显著增加的活化。该研究说明A44V11在纤溶酶介导的现象中刺激MMP活化。
实施例19：在肺纤维化小鼠模型(博来霉素攻击)中A44V11效力的分析
由博来霉素诱导的实验性肺纤维化是由充足文献支持的、充分研究的纤维生成模型。该肺纤维化模型类似于在人体中所见，并已用于评估潜在的治疗剂的作用，以及基础研究(参见，例如Molina-Molina等Thorax 61：604-610(2006))。
在博来霉素处理的小鼠中进行的药效学研究(纤维化模型)
表达人PAI-1的转基因小鼠(人源化的PAI-1转基因小鼠)通过用对应的人野生型PAI-1基因CDS(NCBI Ref.no.NM_000602.3；NC_000007.13)(参见Klinger，K.W.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：8548(1987))在C57BL/6x 129小鼠(The JacksonLaboratory，Bar Harbor，Maine)中内源小鼠PAI-1基因调节序列的调控下取代小鼠PAI-1(SERPINE1)基因CDS(外显子和内含子)(NCBI Ref.no.NM_008871)生成。分子克隆和转基因小鼠的生成根据常规技术并根据生产商和饲养员的指示进行。人PAI-1的表达和小鼠PAI-1的无表达在纯合小鼠中确认。mRNA和蛋白水平分别通过标准qPCR和通过ELISA确认。将8-9周龄且体重22-25g的雌性纯合人源化PAI-1转基因小鼠用于这些步骤。自由提供啮齿类的食物和水。
小鼠通过经由微雾化器的气管内注射以2mg/kg的剂量接受溶解于0.9％NaCl中的50μl
Figure BDA0000958883060001011
(Sanofi，France)。对照小鼠接受50μl的0.9％NaCl。对于这些步骤，将小鼠用异氟烷(TEM，Lormont，France)通过吸入麻醉，随后用18G套管插管。所述套管连接于输送氧/异氟烷混合物的换气装置以维持麻醉。在麻醉之后，将雾化器引入套管中用于将博来霉素直接注入肺中。随后对小鼠拔管，并允许其从麻醉恢复。在第4天，随机分入3个组之后，对小鼠以PBS(1mg/ml)中10mg/kg腹膜内施用A44v11或阴性对照小鼠IgG1来治疗一次。
在博来霉素攻击之后规定的时间点(第7天或第9天)，将小鼠用甲苯噻嗪(xylazine)/***(ketamine)混合物麻醉，并通过开胸处死。血液收集通过在柠檬酸包被的试管上心内收获来进行。钳住左支气管，并取出左肺，并用固定器(
Figure BDA0000958883060001012
LeicaBiosystems，Buffalo Grove，IL)在受控压力下固定用于组织学分析。随后将套管置入气管用于支气管-肺泡灌洗(BAL)步骤(注入1.5ml的0.9％NaCl，并以三次0.5ml注入进行收获)。随后收获右肺的四个肺叶，切割为两片，并裂解用于蛋白分析。所有实验依照欧洲伦理法进行，并经内部的伦理委员会批准(CEPAL，sanofi)。
A44V11水平使用ELISA(Molecular Innovation，cat.#HPAIKT)用包被的生物素化人PAI-1平板确定，并使用硫标签标记的抗小鼠IgG二抗(MesoScale Discovery，Gaithersburg，Maryland)检测。对于在第七天用A44V11处理的小鼠，结果为血浆中为200nM，BALF中为11nM，且肺裂解液中为12nM。
如图28中所示，在第4天腹膜内施用单剂(10mg/kg)A44V11在博来霉素攻击之后第7天处死的小鼠中于BAL液和肺裂解液中均实现了人活性PAI-1几乎完全的抑制。对于第9天的动物，A44V11(10mg/kg)在肺裂解液中实现了人活性PAI-1的几乎完全抑制，但在BALF中仅实现了部分抑制。
可测量D-二聚体，一种纤维蛋白降解产物，以评估纤维蛋白分解的程度。为了测量纤维蛋白降解，将BALF中D-二聚体水平通过ELISA(Asserachrom D-Di，DiagnosticaStago，Asnieres，France)根据生产商的指示检测。A44V11处理组中BALF中的D-二聚体浓度与IgG1阴性对照组相比在第7天增加至大约2.8倍而在第9天增加至1.6倍，表明A44V11处理增加纤维蛋白降解(参见图29)。
进行了其它研究以进一步评估A44V11减少用博来霉素攻击的小鼠肺中的纤维化的活性。对于这些研究，对小鼠进行与上述药效学研究相似的方法，只不过研究持续长度为博来霉素攻击起21天，且用抗体(10mg/kg的A44V11或IgG1对照抗体)的处理从第4天直至第20天每三天重复一次。在博来霉素攻击之后第21天，如上所述将动物处死。
已知肺重量的增加是增加的纤维化的指征。在所有实验组中，对于小鼠确定右肺重量，作为纤维化的测量。如图30中所示，博来霉素滴注诱导了右肺重量的增加，其通过在10mg/kg重复的A44V11抗体给药部分抑制。使用IgG1阴性对照抗体的重复给药并未抑制由于博来霉素攻击造成的右肺重量的增加。当与用IgG1阴性对照抗体处理的相似的博来霉素诱导的小鼠相比时，在A44V11处理的小鼠中博来霉素诱导的右肺重量增加的减少是统计学显著的(p<0.001)。统计分析通过单向ANOVA随后Newman-Keuls检验进行。该结果表明A44V11在人源化PAI小鼠肺中抑制博来霉素诱导的纤维化，而对照IgG1抗体则不会。
肺中胶原蛋白积累是另一个已知的纤维化指征。为了测定胶原蛋白积累，制备了来自在第21天处死的小鼠的肺组织，并通过HPLC分离，随后测量羟脯氨酸。该技术在他处有详细记载，例如Hattori，等J Clin Invest.106(11)：1341-1350(2000)。简言之，肺组织通过在酸性条件(6M HCl)于105℃水解22小时，随后蒸发制备。肺组织中的伯胺通过OPA(邻苯二醛)阻断，而脯氨酸/羟脯氨酸使用NBD(4-氯-7-硝基苯并呋咱；4-chloro-7-benzofurazan)(Santa Cruz Biotech.，Santa Cruz，CA)特异性标记。随后将水解物在SynergiTM 4μm Hydro-RP
Figure BDA0000958883060001021
LC Column 150x3mm柱(Phenomenex，Torrance，CA，cat.#00F-4375-Y0)上使用HPLC(Shimazu Corp.，Kyoto，Japan)在乙腈梯度下分离。使用已知量的羟脯氨酸的标准曲线作为参照对峰进行定量。定量数据的代表示于图31。
通过羟脯氨酸含量检测的肺胶原蛋白积累在博来霉素攻击的动物中增加。肺胶原蛋白积累的增加通过以10mg/kg重复的A44V11抗体给药显著减少(p<0.08)(参见图31)。使用IgG1阴性对照抗体的重复给药并未抑制由于博来霉素攻击造成的肺胶原蛋白积累增加。当与用IgG1阴性对照抗体处理的相似的博来霉素诱导的小鼠相比时，在A44V11处理的小鼠中博来霉素诱导的胶原蛋白积累增加的减少是显著的(p<0.05)。A44V11处理的小鼠与IgG1对照处理的小鼠相比显示出少大约44％的胶原蛋白积累增加。
实施例20：猴中在LPS攻击模型中A44V11活性的评估
应用猴中的急性脂多糖(LPS)攻击模型确定A44V11的体内PAI-1中和效力。LPS攻击模型描述于Hattori，等J Clin Invest.106(11)：1341-1350(2000)。评估了A44V11mAb对在猴血浆和肝样品中的PAI-1的活性。具体而言，设计实验以评估高剂量的LPS(100μg/kg-IV)对用A44V11(5mg/kg，IP)或IgG1(阴性对照，5mg/kg，腹膜内给药)预处理(24小时之前)的麻醉的猴中PAI-1的血浆和组织水平的作用。实验依照欧洲伦理法进行，并通过内部伦理委员会批准(CEPAL，sanofi)。
将重量为4至9kg的食蟹猴(雄性和雌性)在长期麻醉(至少8小时)前禁食过夜，所述麻醉包括用Zoletil 50(Virbac，Taguig City，Philippines)以0.12至0.16mL/kg进行IM诱导，随后吸入空气/氧和异氟烷(1至3％)的气体混合物。猴体温使用加热垫维持在生理范围内。在导管***之后，将LPS(Serotype0127-B8)以1分钟单次大量给药(bolus)以100μg/kg(0.4mL/kg)的剂量施用于副头静脉。在多个时间点，取血液样品和肝样品。收获血液样品(在柠檬酸盐/EDTA中)并离心分离血小板贫乏的血浆。肝活检和最终尸检储藏于-80℃。
活性PAI-1，D-二聚体和纤溶酶α2抗纤溶酶水平使用商业上可获得的ELISA测定(Mol.Innovation，cat.#HPAIKT；Asserachrom D-Dimer；Plasmin-A2antiplasmin，Diagnostica Stago)根据生产商的指示来确定。
在血浆中，活性PAI-1水平在所有施用A44v11的猴中从约30ng/ml减少至低于10ng/ml(参见图32(A))。在LPS施用(100ug/kg)之后不存在活性PAI-1水平的增加(参见图32(A))。与之相对，用阴性IgG1对照处理的猴在LPS施用之后显示活性PAI-1水平的强烈增加，其最大值发生于约4小时(大约50至约250ng/ml)(参见图32(B))。因此，用阴性IgG1对照的处理并未减少血浆中在LPS施用之后强烈增加的活性PAI-1水平(参见图32(B))。
在肝活检裂解液中，观察到相似的现象。用A44V11mAb处理的猴并未在LPS处理之后显示活性PAI-1水平的增加(参见图33(A))。与之相对，LPS施用在来自阴性IgG1对照处理的猴的肝活检裂解液中诱导了活性PAI-1的强烈增加(高至3ng/mg)(参见图33(B))。
与PAI-1中和同时，发现A44V11处理的猴中D二聚体水平(参见图34(A))通常高于在阴性IgG对照处理的猴中(参见图34(B))，因此表明猴中的A44V11处理也诱导了血浆中的纤维蛋白降解的增加。
最终，当与阴性IgG对照处理的猴中的纤溶酶-α2抗纤溶酶(PAP)复合物水平相比时，A44V11处理的猴的血浆样品显示PAP复合物水平的增加(参见图35(A)和(B))。在A44V11存在下PAP复合物和D二聚体的增加表明纤溶酶生成的增加。
实施例21：在腹腔粘连小鼠模型中A44V11活性的评估
用抗PAI-1抗体A44V11处理对粘连形成的效果在小鼠子宫角的手术损伤模型中评估。所述小鼠子宫角接近和电烙步骤破坏了浆膜表面，导致子宫组织的热损伤，并在愈伤过程中使得损伤组织表面接近，这最终导致未处理的动物中100％的手术后粘连。该模型和手术步骤之前已描述于Haney A.F.等，(1993).Fertility和Sterility，60(3)：550-558。
对于这些粘连研究，使用了上述生成的、表达人源化PAI-1转基因、大约9周龄、重量约20g的转基因雌性小鼠。将四十二只成熟的转基因雌性小鼠分为两组，并对其进行设计用于在子宫角(UH)之间产生粘连的手术步骤，如详细描述于Haney A.F.等，(1993)。简言之，将每只动物根据IACUC指南用异氟烷麻醉用于手术，并在剑突尾侧大约1.0cm进行了常规的中线剖腹术。鉴定了UH，用单个7-0Prolene缝线(Ethicon Inc.，Somerville，N.J)小心地穿过每个角的肌肉壁在中部接近，在输卵管和子宫输卵管接合处紧接下侧系住。小心不损伤卵巢的血液供应。为了诱导电烙损伤，对每个子宫角的中侧表面使用了双极的电烙单元(Valley Lab Surgistat，Solid state Electrosurgery Unit，Model no.B-20)，覆盖大约2x6mm的区域。电烙单元设定如下：伏特100，130Hz，50-60Amps。使用3mm宽的烧烙尖，其设定为3的纯凝结电流，通电，并在每个角的两处烧灼点接触组织1秒。肌肉切开用5-0Vicryl，BV-1锥形针(Ethicon Inc.)以连续缝线样式闭合。皮肤用5-0Prolene，BV-1锥形针(Ethicon Inc.)以横褥式缝合样式闭合。
在产生UH损伤之后，将第1组动物用0.16mL体积的同种型对照抗体(30mg/kg)处理，将其施于烧烙伤口。将第2组动物用0.16mL体积的A44V11抗体(30mg/kg)以相似方式处理。对于每组，将动物在6小时(n＝5)，72小时(n＝4)，或在第7天(n＝12)处死(参见下表34)。安排在72小时和在第7天处死的动物在手术48小时之后腹膜内(IP)注射第二剂抗体(30mg/kg)。
表34:子宫角损伤研究的处理方案
Figure BDA0000958883060001051
注意：全部动物具有在处理前通过缝合和烧灼烧伤生成的接近的子宫角。
效力评估和分析
在所示的时间点将动物处死，并评估粘连的形成。简言之，从子宫分叉到输卵管正下方接近的缝合处测量角的长度。将围绕子宫角的两个外侧缝线去除，并在显微镜的帮助下测量并记录子宫角之间粘连的长度，并注释存在或不存在(是/否)。同样，记录任何涉及粘连形成的组织，但不包括在粘连区的长度中。使用Shapiro-Wilk检验检查子宫角之间粘连的长度的平均百分比的分布的正态性。如果正态分布，将各组使用Tukey Kramer分析彼此比较，如果不正态分布，则用Wilcoxon Rank-Sum分析。在所有情况下，p-值≤0.05视为统计学显著。用A44V11处理的动物在接近的子宫角之间显示显著较低的粘连形成长度的百分比(参见表35)。
表35.子宫角长度测量结果
Figure BDA0000958883060001052
*p＝通过Wilcoxon Rank Sum分析、卡方近似的相对于同种型对照的统计学显著。
活性PAI-1和tPA水平的检测
在安乐死之后，收集动物的血液(血浆)、腹膜内液(IPF)和子宫角样品用于评估。样品的收集使用常规技术进行。对血浆、IPF和子宫角样品使用ELISA评估活性PAI-1和tPA水平(Human PAI-1Activity ELISA kits,Cat.#HPAIKT,Molecular Innovations,Novi,MI)。数据使用Excel、JMP和Prism Graph pad软件处理。在所有情况下，p-值≤0.05视为统计学显著。在第6小时和第7天时间点，在用A44V11处理的动物相对于同种型对照在IP液和子宫角裂解物中发现了活性PAI-1水平的减少(参见图36)。在6小时处IPF中活性PAI-1的水平的减少是在用A44处理的动物中与同种型对照相比在6小时时间点在IP液中显示的统计学显著结果(根据Student T检验p<0.001)。
实施例22：人源化抗体A44V11的晶体结构
Fab A44V11的表达和纯化
重组Fab(rFab)从瞬时转染的HEK293细胞使用编码轻链或C末端His标签的重链的两个质粒获得。在离心和过滤之后，将来自细胞上清的rFab用于固定化金属亲和树脂。在从树脂洗脱之后，将rFab针对PBS彻底透析并储藏于4℃。
称作食蟹猴PAI-1的食蟹猴PAI-1的来源：
重组成熟食蟹猴PAI-1(24-402)作为包涵体在大肠杆菌中表达，且重组蛋白使用常规方法纯化。
人PAI-1的来源：
重组成熟人PAI-1(24-402)购自Molecular Innovations Inc.(产品号CPAI)。其通过引入突变(N150H，K154T，Q319L，M354I)稳定化于活性构象，如Berkenpas等(1995，EMBOJ.，14，2969-2977)所述。
复合物的制备和纯化：
将重组Fab和抗原以1.5：1摩尔比混合，在室温温育30分钟，并将所述复合物通过用25mM MES pH 6.5，150mM NaCl平衡的Superdex 200PG柱(GE Healthcare)上的制备性大小排阻进一步纯化。
Fab A44V11+食蟹猴PAI-1复合物的结晶
将复合物在25mM MES pH 6.5，150mM NaCl中浓缩至10mg/ml。其在16-24％乙醇，100mM Tris pH 8.5中结晶。使用乙二醇(30％)作为冷冻保护剂。将晶体在空间组P321
Figure BDA0000958883060001071
中在ESRF的ID29束线中衍射至约
Figure BDA0000958883060001072
数据用XDS和Scala的组合处理(GlobalPhasing Ltd.，Cambridge，UK)。
复合物Fab A44V11/Cyno-PA1-1的结构确定
使用Prime in Maestro(Schrodinger，New York，NY)构建了Fab可变结构域的模型。恒定结构域从公开的结构3FO2获得。使用了两个人PAI-1的不同模型：休眠构象获得自1LJ5，活性构象获得自1OC0。Matthews系数(VM，每单位蛋白分子量的晶体体积)的计算表明在不对称单元中存在多至四个复合物(VM2.2，假设复合物大小为90千道尔顿(KD)。Molecular Replacement使用Phaser(CCP4套件)(McCoy，等J.Appl.Cryst.40：658-674(2007)进行，其鉴定出休眠PAI-1的两个单体和Fab的两个可变结构域。对于恒定结构域清晰可见额外的密度，其必须手动配置。对于该对应于VM为4.3(71％溶剂)的溶液也仔细检查了堆积一致性。该结构用Buster(GlobalPhasing)使用非晶体学对称优化至29.2％的Rfree(R因子25.8％)。恒定结构域不受晶体堆积稳定化，并在电子密度图中解析不佳。
Fab A44V11+人PAI-1复合物的结晶
蛋白结晶是通过x射线晶体学方法进行生物分子结构确定的瓶颈。蛋白结晶方面的成功直接与用于结晶实验的蛋白分子的质量成比例，而最重要的质量标准是溶液中蛋白的纯度和同质性(分子和构象二者)。
起初，为了确定PAI-1/Fab mAb复合物结构，使用天然mAb A44通过木瓜蛋白酶消化制备其Fab片段。该Fab规模放大制备导致异质的Fab片段，其与人野生型(wt)PAI-1蛋白复合并以该复合物纯化。将获得的蛋白复合物浓缩至7mg/ml浓度并在800种单独的结晶条件下在两种不同温度，4℃和19℃筛选结晶化。未检测到结晶化命中。为了改善蛋白复合物的同质性，产生了重组6-His标记的Fab A44，将其纯化并与人野生型PAI-1蛋白复合(参见图36)。
该复合物结晶化筛选导致在20％PEG10K+0.1M乙酸钠pH 4.6条件下的第一次结晶化命中。通过常规结晶方法Microseed Matrix Seeding和原位Trypsinolysis结晶化来优化结晶并未显著改善的晶体质量。获得的最佳晶体为针状的，且在x射线衍射中无法充分解析用于结构确定
Figure BDA0000958883060001081
复合物晶体结晶化的失败可潜在地由复合物构象异质性解释。已知野生型PAI-1分子采纳三种不同的构象(活性、休眠和基质)，其可干扰结晶。为了改善晶体的质量，产生了与休眠PAI-1复合的6-His标记的A44Fab(参见图37)。
产生了对应的复合物，并针对从头开始的结晶并在之前用于6-His标记的FabA44/wt PAI-1蛋白复合物的条件下进行筛选。在测试的超过1000种条件下唯一的结晶化命中鉴定为在20％PEG3350+0.2M乙酸铵+4％MPD+50mM Mes pH6条件下的复合物(参见图39(a))。在充分优化之后获得了3D结晶。使用同步加速器高强度X射线束的X射线衍射测试未显示衍射迹象(参见图39(b)，描述代表性优化的结晶)。
为了减少蛋白各部分的柔性，决定重组产生A44Fab片段，但不含人工标签如之前使用的6-His标签。为了进一步增加成功结晶化的机会，PAI-1的活性形式突变体(N150H，K154T，Q319L，M354I)购自Molecular Innovations(Cat.#CPAI，novi，MI)并用于与缺乏人工标记的Fab A44蛋白进行复合物制备。将该复合物在25mM MES pH 6.5，150mM NaCl中浓缩至12mg/ml。可接受的杆状单晶在10％PEG3350，100mM硫酸铵中获得，并通过添加30％乙二醇冷冻保护(参见图40)。将这些晶体衍射至
Figure BDA0000958883060001082
分辨率，且在充分的冷冻保护优化之后，得到适于结构确定的X射线衍射数据组
Figure BDA0000958883060001083
同步加速器SOLEIL(Saint-Aubin，France)的束线Proxima 1在
Figure BDA0000958883060001084
收集了数据组。空间群为P212121(a＝105，b＝152c＝298)。数据使用XDSme脚本(XDS ref，Xdsme ref)处理。
复合物Fab A44V11/人PAI-1的结构确定
Pointless(CCP4)在空间群鉴定中仅表明40％置信度。因此，以Amore(CCP4)进行了初始Molecular Replacement以测试P222点群的所有可能的空间群变体：毫无疑义地确认了P212121。用Phaser(Phaser，CCP4)的最终Molecular Replacement鉴定出不对称单元中Fab的可变结构域/活性PAI-1的四个二聚体。恒定结构域在电子密度图中人工添加。将结构使用非晶体学对称用Buster(GlobalPhasing)优化至28％的Rfree(R因子24.1％)。
表位和互补位结构分析
在食蟹猴和人复合物中鉴定出形成的表位和互补位，并将复合物相互比较。对于与人和食蟹猴PAI-1复合的A44V11，将晶体结构确定至
Figure BDA0000958883060001091
两个结构的层叠(参见图40)显示A44V11的互补位对于PAI-1的休眠和活性形式两者是相似的。Fab A44识别人PAI-1的活性形式和食蟹猴PAI-1的休眠形式。图42描述了由Fab A44在活性人PAI-1(图42(A))和休眠的食蟹猴PAI-1(图42(B))二者中识别的PAI-1表位。识别休眠构象的互补位是识别活性构象的互补位的一部分。
PAI-1多数情况下与A44V11的重链相互作用，如可通过对相互作用的表面面积的分析所见。活性人PAI-1和重链之间的相互作用的表面面积(4个复合物的平均值)为
Figure BDA0000958883060001092
活性人PAI-1和轻链之间的相互作用的表面面积(4个复合物的平均值)为
Figure BDA0000958883060001093
休眠的食蟹猴PAI-1和重链之间的相互作用的表面面积(2个复合物的平均值)为
Figure BDA0000958883060001094
休眠的食蟹猴PAI-1和轻链之间的相互作用的表面面积(2个复合物的平均值)为
Figure BDA0000958883060001095
关于重链和轻链的互补位的描述，分别参见图43和44。
A44V11互补位部分的残基示于下表36。斜体的残基涉及与活性PAI-1但非休眠形式的相互作用，而下划线的残基仅与休眠形式相互作用。所有其它残基均涉及两种界面。
表36：参与PAI-1互补位的A44V11残基
Figure BDA0000958883060001096
Figure BDA0000958883060001101
尽管人和食蟹猴PAI-1分子的不同构象，相同的残基涉及与Fab A44的相互作用(显示于下面人PAI-1序列中的粗体残基)(SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0000958883060001109
对于人PAI-1的A44V11结合表位的缩写如下所述：
E-X-X-Q(SEQ ID NO:156)；
L-X-R(SEQ ID NO:157)；
T-D-X-X-R-Q-F-Q-A-D-F-T-X-X-S-D-Q-E-P-L(SEQ ID NO:158)。
总之，识别Fab A44的PAI-1的食蟹猴和人表位在两种构象中是相同的。Fab A44识别人和食蟹猴PAI-1两者，但可能不识别小鼠或大鼠PAI-1。
实施例23：A44V11特异性和交叉反应性的确定
为了确定A44V11的特异性和反应性，使用A44V11表位的序列(见上)在其它蛋白中使用用ScanProsite(SIB Swiss Institute of Bioinformatics)数据库的基序检索来检索相似的表位。对于更多细节，参见Artimo，P.等Nucleic Acids Res.40(W1)：W597-603(2012)。所有在检索中定位的表位序列匹配涉及PAI-1，表明A44V11抗体对PAI-1具特异性。
也将A44V11表位与其它已知的X射线结构(3D检索)使用计算机概貌分析并根据Med-SuMo的分子建模相比较，所述分子建模检测和比较蛋白表面的生化功能，包括例如氢键、电荷、疏水和芳香基团。Med-SuMo分子建模在Jambon，等Bioinformatics 21(20)：3929-30(2005)中进行了进一步描述。A44V11表位的3D检索在人α-1-抗胰蛋白酶(AAT1)中定位出相似的基序。然而，在进一步研究后，发现AAT1基序与A44V11表位具有显著差异，使得A44V11不太可能结合。因此，A44V11表位的序列类型和3D类型分析表明存在的与其它人蛋白的交叉反应性应为最小。
将针对A44V11的人和食蟹猴PAI-1表位与来自小鼠和大鼠PAI-1的提出的表位相比较。序列摘自SEQ ID NO:1(PAI-1人)，SEQ ID NO:162(PAI-1食蟹猴)，SEQ ID NO:163(PAI-1小鼠)，和SEQ ID NO:164(PAI-1大鼠)。大鼠和小鼠PAI-1分别与人PAI-1具有75％和79％序列同一性。不同PAI-1序列的比对显示大鼠/小鼠和人/食蟹猴序列在其相应的表位之间存在显著差异，表明A44V11不太可能识别大鼠或小鼠PAI-1(参见图45)。例如，小鼠PAI-1氨基酸Ser300、Thr302、Gln314不同于人/食蟹猴PAI-1的相应氨基酸。这些残基中的不同代表了提出的表位中的变化，使得小鼠PAI-1无法由A44V11识别。小鼠PAI-1与复合物人PAI-1/A44V11的结构的结构比较(图46)进一步表明不应能从A44V11抗体获得人和小鼠活性两者。
为了进一步验证A44V11鉴定出的表位，将人和食蟹猴A44V11表位与玻璃粘连蛋白的结合区相比较。与玻璃粘连蛋白的生长调节素B结构域复合的人PAI1的结构已公开(1OC0)。比较了这两种复合物的结构(参见图47)。结构比较表明A44V11的结合不会影响PAI-1与玻璃粘连蛋白的相互作用。
将A44V11表位与其它公开的抗PAI1抗体的表位相比较。未发现A44V11表位与其它公开的抗PAI-1抗体MA-55F4C2和MA-33H1存在重叠，后者结合128-156区的残基(参见Debrock等Thromb Haemost，79：597-601(1998))。
最终，A44V11抗体的特异性和缺乏交叉反应性通过Biacore确认。基于A44V11表位预测的独特序列和3D结构，分子建模研究强烈地表明A44V11对人和食蟹猴PAI-1具特异性。
实施例24：通过氢/氘交换质谱(HDX MS)进行的表位映射
将通过质谱法(MS)监测的氢/氘交换(HDX)应用于本文公开的PAI-1结合抗体以进一步表征每种抗体的表位。HDX MS对于比较相同蛋白的多种状态是特别有用的技术。详细的方法学和将HDX MS应用于蛋白疗法公开于Wei等，Drug Discovery Today，19(1)：95-102(2014)。简言之，如果将水性的全H2O溶剂用具有不同光谱性质的氢同位素取代，则可追踪该交换过程。对于大多数现代HDX实验，使用氘化的水即“重水”(D2O)。具体地，结合于骨架氮的氢(也称作骨架酰胺氢)可用于探查蛋白构象。参见，例如Marcsisin等Anal BioanalChem.397(3)：967-972(2010)。蛋白的暴露和动态区会迅速交换，而蛋白的保护和刚性区会较慢交换。所有相关条件(pH、温度、离子强度等)维持恒定，因此仅结构(溶剂可接近性，氢键)差异影响该交换。抗体与PAI-1的相互作用会阻断抗原某些部分的标记，因此基于结合位点(表位)产生不同的读数。
实验方法：
食蟹猴PAI-1(10uM)，结合于A44v11的食蟹猴PAI-1(各10μm)和结合于APGv2的食蟹猴PAI-1(各10μm)的储液在PBS，pH 7.2中制备。通过在室温温育1小时允许蛋白溶液达到结合平衡。基于<50pM的Kd值，在下述的标记条件下，每种抗体：抗原复合物为>99％结合。
氘交换、淬灭和样品注入由自动机器人***(LEAP Tech.，Carrboro，NC)处理。将蛋白溶液的等分试样用标记缓冲液(99.9％D2O中的PBS，pD 7.2)稀释10倍，并允许在20℃温育10秒、1分钟、5分钟或4小时。在氘交换结束时的时间点，标记反应通过将50μL标记溶液添加至相同体积的预冷却(0℃)100mM磷酸钠，4M盐酸胍，0.5M TCEP，pH 2.5来淬灭。未氘化的对照以相同方式用H2O中的PBS稀释10倍来制备。
将每个淬灭的样品(50μL，每种蛋白50pmol)立即注射入具有HDX Technology的Waters nanoAcquity(Waters Corp.，Milford，MA)。将蛋白用维持在20℃的2.1mm x 30mmEnzymate BEH胃蛋白酶柱(Waters Corp.)在线消化。所有层析元件在超高效液相色谱(UPLC)***的冷却室内维持在0.0±0.1℃。捕获所得的肽并在100μL/分钟脱盐3分钟，随后在1.0x 100.0mm ACQUITY UPLC HSS T3柱(Waters Corp.)上以12分钟的2-40％乙腈/水梯度以40μL/分钟进行分离。氘水平未针对反向交换(back exchange)进行校正，并且据报道氘水平是相关的。所有对比实验在相同条件下进行，消除了对反向交换校正的需要。所有反应进行一式三次。注射间的肽遗留通过在每次运行后对所有柱注射50μL的1.5M盐酸胍，0.8％甲酸，和4％乙腈来消除。
在以HDMSe模式运行的、配置有标准电喷雾源的Waters Synapt G2-Si装置(Waters Corp.)获得质谱。装置设定如下：毛细管为3.5kV，取样锥为30V，源补偿为30V，源温度为80℃，解析温度为175℃，锥气体为50L/小时，解析气体为600L/小时，而雾化器气体为6.5巴(bar)。质谱在50-1700的m/z范围获得。质量准确性在每次运行中通过同时经由lockmass探针输注100fmol/uL人Glu1]-Fibrinopeptide B来维持。
未氘化的胃蛋白酶肽的MSE鉴定使用ProteinLynx Global Server软件(WatersCorp.)进行。对于每种肽的氘摄入使用DynamX 2.0软件(Waters Corp.)确定。相对氘水平通过将对于未氘化的肽同位素分布的质心从来自氘标记肽相应的质心减去来计算。氘摄入图通过软件自动生成。
对于PAI-1状态监测氘摄入
在线胃蛋白酶消化之后，鉴定出了150个相互重叠的食蟹猴PAI-1胃蛋白酶肽，导致95.3％的序列覆盖(参见图48)。在所有150个肽中对于三种蛋白状态监测氘摄入(从10秒至4小时)：(1)仅食蟹猴PAI-1；(2)结合于食蟹猴PAI-1的A44v11；和(3)结合于食蟹猴PAI-1的APGv2。
大多数食蟹猴PAI-1肽在三种状态之间显示几乎相同的氘摄入，这表明在食蟹猴PAI-1和这些区中的任一mAb之间不存在相互作用。参见图49(A)，其描述了该结果的一个代表性肽区(残基139-152)。与之相对，并入残基44-64的肽当结合于A44v11或APGv2时(图49(B))显示显著的免于交换的保护(减少的氘摄入)。此外，并入残基295-322的肽当结合于A44v11或APGv2时(图49(C))也显示显著的免于交换的保护。就此原因，当食蟹猴PAI-1结合于A44v11而非APGv2时保护的水平更大(参见图49(C))。这表明A44v11与APGv2相比，当结合于食蟹猴PAI-1时，可提供更大的免于交换的总体保护。
比较研究：
对于比较研究，对于所有150个从三种食蟹猴PAI-1状态中的每一种生成的肽监测氘摄入(一般地，参见Wei，等，Drug Discovery Today，19(1)：95-102(2014))。将来自三种状态每一种的数据图彼此比较，并生成蝶形图以便于数据解释(参见，例如图50(A)，51(A)，和52(A))。对于每个蝶形图，x轴是对于比较的150个肽的每一个计算的肽中点位置，i；y轴为平均相对组分交换(比例)。
还对食蟹猴PAI-1状态间的每次比较生成了不同的图(参见，例如图图50(B)，51(B)，和52(B))。在这些图中，将来自一个状态的氘摄入从另一个减去，并相似地作图为蝶形图。对于每种肽差异的总和由垂直棒代表。水平虚线代表单次测量(±0.5Da)或差异的和(±1.1Da)超出了测量的误差并可视为两种状态之间的真实差异的值。其它关于该技术的细节公开于Houde D.等，J.Pharm.Sci.100(6)：2071-86(2011)。
首先，将食蟹猴PAI-1本身与A44v11：食蟹猴PAI-1结合状态相比较(图50)。对于该比较的蝶形图示于图50(A)。该比较的差异图示于图50(B)。在结合于A44v11的食蟹猴PAI-1与游离形式的食蟹猴PAI-1之间观察到的差异主要位于食蟹猴PAI-1的两个区中。一个区接近N末端(残基44-64)，而另一个区接近C末端(残基307-321)(参见图50(B))。
其次，将食蟹猴PAI-1本身与APGv2：食蟹猴PAI-1结合状态相比较(图51)。对于该比较的蝶形图示于图51(A)。该比较的差异图示于图51(B)。在结合于APGv2的食蟹猴PAI-1与游离形式的食蟹猴PAI-1之间观察到的差异主要位于食蟹猴PAI-1的两个区中。一个区接近N末端，而另一个区接近C末端，其相似于A44v11：食蟹猴PAI-1结果。与食蟹猴PAI-1复合的APGv2和A44v11均具有当在结合状态显示减少的氘摄入的肽，这可表明两种抗体的表位是相似的。
最终，将两种抗体结合的食蟹猴PAI-1状态相互比较(图52)。该比较的蝶形图示于图52(A)。该比较的差异图示于图52(B)。A44v11：食蟹猴-PAI-1和APGv2：食蟹猴-PAI-1之间观察到的差异位于食蟹猴PAI-1的C末端区(参见图52(B))。
实施例25：抗体A44v11和APGv2的表位比较
使用HDX MS进一步限定A44v11和APGv2抗体的表位。通过使用在HDX MS中生成的重叠肽，可将抗体表位精制至略好于肽浓度分辨率(例如，参见图48)。将显示显著的免于与A44V11结合交换的保护的肽的HDX MS数据进行进一步分析以确定食蟹猴-PAI-1：A44v11相互作用的表位。发现对于食蟹猴PAI-1的A44V11表位的HDX数据与使用晶体学方法确定的表位一致。使用HDX MS鉴定的食蟹猴PAI-1的A44V11表位显示于图53(粗体)，和下述缩写形式：
T-T-G-G-E-T-R-Q-Q-I-Q(SEQ ID NO:159)；
R-H-L(SEQ ID NO:160)；
T-D-M-X-X-X-F-Q-A-D-F-T-S-L-S-N-Q-E-P-L-H-V(SEQ ID NO:161)。
将显示显著的免于与APGv2结合交换的保护的食蟹猴-PAI-1肽的HDXMS数据进行分析以进一步确定食蟹猴-PAI-1：APGv2相互作用的表位。对于A44v11和APGv2的HDX MS表位映射数据显示表位位于相同区，如图52中一般性所见。在残基307-321的区中，相同肽对于A44v11和APGv2二者的抗体结合状态显示保护。然而，当食蟹猴PAI-1结合于A44v11而非APGv2时保护的水平更大(参见图49(C))。该发现在图52(B)中更加明显，其描述了食蟹猴PAI-1的残基307-321区中不同的峰。这表明在食蟹猴PAI-1与A44V11和APGv2抗体任一者之间产生的特异性接触中存在差异。因此，看来尽管A44V11和APGv2的表位位于PAI-1的相似区，各抗体的表位并不相同。
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Figure IDA0000958883130000021
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Claims (8)

1.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链框架区和重链可变区，所述重链可变区的互补决定区为：SEQ ID NO:34的重链CDR1区，SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和SEQ ID NO:32的重链CDR3区；和
(b)轻链框架区和轻链可变区，所述轻链可变区的互补决定区为：SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，SEQ ID NO:145的轻链CDR2区，和SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。
2.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链框架区和SEQ ID NO:86的重链可变区，和
(b)轻链框架区和SEQ ID NO:93的轻链可变区。
3.一种特异性结合PAI-1的分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链框架区和重链可变区，所述重链可变区的互补决定区为：SEQ ID NO:34的重链CDR1区，SEQ ID NO:33的重链CDR2区，和SEQ ID NO:32的重链CDR3区；和
(b)轻链框架区和轻链可变区，所述轻链可变区的互补决定区为：SEQ ID NO:37的轻链CDR1区，SEQ ID NO:36的轻链CDR2区，和SEQ ID NO:35的轻链CDR3区。
4.权利要求3的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:6的重链可变区和SEQ ID NO:7的轻链可变区。
5.一种特异性结合人PAI-1的人源化单克隆抗体，其中所述抗体包含：
(a)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:82的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:91的轻链可变区；
(b)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:83的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:92的轻链可变区；
(c)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:84的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:93的轻链可变区；
(d)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:85的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:91的轻链可变区；
(e)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:85的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:93的轻链可变区；
(f)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:86的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:94的轻链可变区；
(g)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:87的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:95的轻链可变区；
(h)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:88的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:96的轻链可变区；
(i)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:89的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:97的轻链可变区；
(j)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:90的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:98的轻链可变区；
(l)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:86的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:95的轻链可变区；
(m)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:89的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:93的轻链可变区；或
(n)重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:89的重链可变区，且所述轻链具有SEQ IDNO:95的轻链可变区。
6.药学上有效量的权利要求1-5中任一项的PAI-1抗体在制备供一种治疗以纤维化为特征的状况的方法使用的药物中的用途，其中所述方法包括通过口服、通过注射用溶液胃肠外地、通过吸入或局部地将药学上有效量的所述PAI-1抗体施用至有需要的受试者。
7.权利要求6的用途，其中所述状况为皮肤纤维化，***性硬化，肺纤维化，间质性肺病，慢性肺病，肝纤维化，肾纤维化，慢性肾病，血栓形成，静脉和动脉血栓形成，深静脉血栓形成，四肢(peripheral limb)缺血，散布性血管内凝固血栓形成(disseminatedintravascular coagulation thrombosis)，有和无溶栓的急性缺血性中风，或支架再狭窄。
8.权利要求6的用途，其中所述状况为特发性肺纤维化。
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