CN105695472B - 一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法。本发明所述启动子的碱基序列中含有如SEQ ID NO.1所示的分离的多核苷酸序列。本发明的发明人，将所述启动子与GFP连接，转化枯草芽孢杆菌,检测启动子对外源基因（或蛋白）表达的影响。通过检测GFP的表达结果证明，该启动子具有启动子的活性，并受工业生产培养基PPB诱导活性增强。此外，本发明启动子与其他启动子进行比较，所诱导表达的GFP量比其他启动子高65%~114%，适用于外源蛋白或多肽在微生物的重组生产，并具有受诱导可调控的活性特征。

Description

一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法。
背景技术
启动子为RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因(gene)的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸(nucleotides)，那么启动子也应由核苷酸组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录(transcription)因子的这种蛋白质(proteins)结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases)的活动。这种酶指导着RNA复制。
启动子位于结构基因5’端上游的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。全酶是指酶蛋白及其辅酶构成的有功能的复合物。
随着生物工程技术的发展，越来越多的微生物发酵的方法应用于化学品、酶蛋白以及药剂的生产。其中，枯草芽孢杆菌由于其安全无毒、遗传背景清晰、分泌表达水平高等诸多优点，而成为工业用理想的宿主细胞。枯草芽孢杆菌中表达异源蛋白需要各种元件，其中，启动子对于表达水平的影响至关重要。目前成功用于枯草芽孢杆菌表达平台的启动子主要有P43、PamyQ、Pspac、PxylA等，这些启动子在实验室的富集培养基中表现良好，但鲜见它们被用于酶蛋白的工业放大生产。因此，有必要找到更高效的、适合于工业培养基生产表达的启动子，以适应发酵对表达水平越来越高的要求。
绿色荧光蛋白基因gfp可以作为启动子的一个报告基因，构建于启动子的下游，绿色荧光蛋白GFP的有无，表征启动子的作用；绿色荧光蛋白GFP的亮度，即绿色荧光蛋白GFP的产量，在同等条件下表征启动子的强弱。在启动子筛选或启动子功能比较中，可以用GFP的表达水平作为鉴定的标准。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸的碱基序列含有如SEQ ID NO.1所示序列。
优选地，所述分离的多核苷酸序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
Ctctcactaaatagcaagtcatatctgtccgtccttccttttttccgccaagtgctgtttcagctgcattctcgccctgtacagggtgctcttcaccttcgaaagactccagtccaaaacatcagcaatctcttcgtaagacagctcttgaaatatctgtcgaaatgctgaataaaatgactgaaaatctctgacatctgaaacaatccttttcgtttattaaggcctcacccgtttagacaaacggctataaaaaaagttttacaaatcggaacatttttcccctatcatttttcccgacttcatttgtcatttttttcagaataaatcgcatcattcgactcatgtctgattcaacacgtgcctctcggcttataccccgatgctggccgccggaagcctttccgggacgattctatcaattcatcagcggagtctagttttatattgcagaatgagagaatgctggtttattataacaatataagttttcattattttcaaaaagggggatttatt。
本发明的第二方面提供了前述分离的多核苷酸作为启动子的用途，所述启动子用于多种蛋白或多肽的表达。
优选地，所述启动子用于微生物反应器中多种蛋白或多肽的表达。
具体的，所述微生物反应器可以为微生物宿主细胞。
更具体的，所述启动子可用于在微生物宿主细胞中指导多种不同来源的蛋白或多肽的诱导表达。
优选地，所述微生物宿主细胞包括但不限于枯草芽孢杆菌。
进一步的，所述的多种不同来源的蛋白或多肽可以是任意分子量的蛋白质，如酶蛋白、各种植物来源蛋白、各种动物或细菌来源蛋白，以及抗体等。
本发明的第三方面提供了一种启动子，所述启动子的碱基序列中含有如SEQ IDNO.1所示的分离的多核苷酸序列。
优选地，所述启动子的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第四方面提供了所述启动子用于构建或改造表达载体的用途。
优选地，所述启动子用于构建或改造微生物反应器表达载体。
进一步优选地，所述的启动子可作为指导外源蛋白表达的元件用于构建或改造微生物反应器表达载体。
所述待改造微生物生物反应器表达载体包括但不限于枯草芽孢杆菌表达载体。所述枯草芽孢杆菌表达载体包括但不限于pMK4系列载体等。
本发明的第五方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个所述的启动子，由所述的启动子来指导外源蛋白的表达。具体如绿色荧光蛋白GFP。
优选地，所述表达载体为将现有表达载体中的启动子替换为本发明的前述启动子，或者在现有表达载体中添加本发明的前述启动子后获得。
本发明的一优选实施例中，在现有表达载体pMK4中添加了本发明所述的启动子后获得了新的表达载体。
更优选地，所述表达载体上的启动子的下游连接有GFP基因。
本发明的第六方面提供一种宿主细胞，所述细胞含有前述表达载体或基因组中整合有外源的所述启动子。
本发明的第七方面提供了一种蛋白或多肽的表达方法，包括下列步骤：
1)采用前述表达载体构建所述多种不同来源的蛋白或多肽的重组表达载体；
2)将步骤1)获得的重组表达载体转染宿主，并在合适表达所述蛋白或多肽的条件下培养所述宿主。
优选地，所述宿主可以为宿主细胞，在本发明一实施例中，所述宿主为枯草芽孢杆菌。
优选地，所述在合适表达所述蛋白或多肽的条件下具体为采用工业生产培养基PPB诱导。
优选的，所述步骤2)后，可从培养物中分离出所述蛋白或多肽，或者通过检测仪器检测所述多种不同来源的蛋白或多肽。在本发明一实施例中，所述蛋白或多肽为GFP。
通过常规的重组DNA技术即可构建所述多种不同来源的蛋白质或多肽的重组表达载体，例如将目的基因片段***所述表达载体的多克隆位点，并置于本发明所述启动子的控制之下。所述目的基因片段应当至少包含多种不同来源的蛋白质或多肽的基因的完整编码区。
获得的转有重组表达载体的宿主细胞可以用常规方法培养,表达外源蛋白质或多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自已知的各种合适的培养基或培养液，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养并表达外源蛋白质或多肽。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性或添加纯化标签通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破壁、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的发明人，将前述启动子与GFP连接，转化枯草芽孢杆菌,检测启动子对外源基因(或蛋白)表达的影响。通过检测GFP的表达结果证明，该启动子具有启动子的活性，并受工业生产培养基PPB诱导活性增强。此外，本发明启动子与其他启动子进行比较，所诱导表达的GFP量比其他启动子高65％～114％，外源蛋白或多肽在微生物的重组生产，并具有受诱导可调控的活性特征。
附图说明
图1是克隆了启动子P1398的表达质粒pMK4-P1398-gfp图。
图2是质粒pMK4-gfp、pMK4-P1398-gfp、pMK4-P43-gfp、pMK4-PxylA-gfp的构建流程图。
图3是克隆了启动子P1398、P43、PxylA的表达质粒pMK4-P1398-gfp、pMK4-P43-gfp、pMK4-PxylA-gfp在枯草芽孢杆菌中，在蛋白酶生产培养基培养条件下发酵后表达的荧光量图。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1构建质粒pMK4-P1398-gfp、pMK4-P43-gfp、pMK4-PxylA-gfp并在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白GFP
1.DNA片段的扩增
以2409-PstF(SEQ ID NO.2)和2409NdeR(SEQ ID NO.3)为引物，以1398基因组为模板，扩增P1398；以P43-PstF(SEQ ID NO.4)和P43-XmaR(SEQ ID NO.5)引物，以pMK44-gfp为模板，扩增P43；分别以gfp-ecoR(SEQ ID NO.6)和gfp-bamF(SEQ ID NO.7)、gfp-ecoR(SEQ ID NO.6)和Pxyl-gfp-ecoF(SEQ ID NO.8)为引物，以pGX1(SEQ ID NO.9)为模板，扩增PxylA-gfp(SEQ ID NO.10)、gfp(SEQ ID NO.11)。
2409-PstF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
Gatcctgcagctctcactaaatagcaagtcatatctg。
2409NdeR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
Catgcccgggatgaaaacttatattgttataataaaccagc。
P43-PstF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：ttggctgcagataggtggtatgttttc。
P43-XmaR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，
具体为：catacccggggtaccgctatcactttatattttac。
gfp-ecoR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：Cagtgaattcatttatttgtatagttcatccatgcc。
gfp-bamF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
Cataggatccagtaaaggagaagaacttttcactggag。
Pxyl-gfp-ecoF的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：cagtgaattctagaatctaatattataac。
pGX1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：
gctggggactgaacgatnaagcattgaangttncgcgctggaactgaagnctggttctgnggcanttangcaggaagggttntttactgcnccctaggaggggggatggangaataacgttatatcttngaacntaaaggaaaangggaggtaaagggttgtcgtagtaggttccttataaaanggagntntatcccattcagggtaatgcgnaataatcgtntcncagaaaagatttatttagccaccagaanggtagattangcgtgatgaacgggcattcagaataccccagtncangtccaaaaaattaggccaaattataataaagaattatatgaaatggctaagtattctggtaaagatagtgattatttaataaatcaaaaagtctttgatgcattttataaatcacttaaaggtaaacaggtattagtttattcaggattatttaaagaggctaaaaagaaattaaaaaatggggatttagattacttaaaagaaattgatccaaccgaatatatctatcaaattttttatatttggaaacaaaaagagtatttagctagtgaactttatgacttaacagaacaagaaaaaagagaaattaatcacaaaatgatagacgaaatcgaggaagaacaataacaaaatataagtgctaacagctgacctcccgataacaccatgtagttattgggaggtcagctgttgaattatgcacgagtattttaaaagttattgtgatgacgacgataaacgattatcaaaagtataatgttaaaatgctttattatactaacgttatataaacattatactttcgttatacaaattttaaccctgttaggaactataaaaaatcatgaaaattttaatttgcatgtaactgggcagtgtcttaaaaaatcgacactgaatttgctcaaatttttgtttgtagaattagaatatatttatttggctcatatttgctttttaaaagcttctgtaggtttttaggcataaaactatatgatttacccctaaatctttaaaatgccccttaaaattcaaaataaaggcatttaaaatttaaatatttcttgtgataaagtttgttaaaaaggagtggttttatgactgttatgtggttatcgattataggtatgtggttttgtattggaatggcattttttgctatcaaggttattaaaaataaaaattagaccacgcatttatgccgagaaaatttattgtgcgttgagaagaacccttaactaaacttgcagacgaatgtcggcatagcgtgagctattaagccgaccattcgacaagttttgggattgttaagggttccgaggctcaacgtcaataaagcaattggaataaagaagcgaaaaaggagaagtcggttcagaaaaagaaggatatggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattctagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttgtatatgatgaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttgatggataaacttgttcacttaaatcaacccgggaacaaggaggaataaaaaatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttcggttatggtgttcaatgctttgcgagatacccagatcatatgaaacagcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataaatgtgtcgacctgcagccaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttgatagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatctggagctgtaatataaaaaccttcttcaactaacggggcaggttagtgacattagaaaaccgactgtaaaaagtacagtcggcattatctcatattataaaagccagtcattaggcctatctgacaattcctgaatagagttcataaacaatcctgcatgataaccatcacaaacagaatgatgtacctgtaaagatagcggtaaatatattgaattacctttattaatgaattttcctgctgtaataatgggtagaaggtaattactattattattgatatttaagttaaacccagtaaatgaagtccatggaataatagaaagagaaaaagcattttcaggtataggtgttttgggaaacaatttccccgaaccattatatttctctacatcagaaaggtataaatcataaaactctttgaagtcattctttacaggagtccaaataccagagaatgttttagatacaccatcaaaaattgtataaagtggctctaacttatcccaataacctaactctccgtcgctattgtaaccagttctaaaagctgtatttgagtttatcacccttgtcactaagaaaataaatgcagggtaaaatttatatccttcttgttttatgtttcggtataaaacactaatatcaatttctgtggttatactaaaagtcgtttgttggttcaaataatgattaaatatctcttttctcttccaattgtctaaatcaattttattaaagttcatttgatatgcctcctaaatttttatctaaagtgaatttaggaggcttacttgtctgctttcttcattagaatcaatccttttttaaaagtcaatattactgtaacataaatatatattttaaaaatatcccactttatccaattttcgtttgttgaactaatgggtgctttagttgaagaataaagaccacattaaaaaatgtggtcttttgtgtttttttaaaggatttgagcgtagcgaaaaatccttttctttcttatcttgataataagggtaactattgccggcgaggctagttacccttaagttattggtatgactggttttaagcgcaaaaaaagttgctttttcgtacctattaatgtatcgttttaaatgactagtaaaaaacatacatagaaaggggaaaaagcaactttttttattgtcatagtttgtgaaaactaagttgtttttatgtgttataacatggaaaagtatactgagaaaaaacaaagaaatcaagtatttcagaaatttattaaacgtcatattggtcctgtctgtgcttggagaaaagctagaaaagagcttgggtttatctttgatgatgcaatatattaagcagcccgagaaaaaggagtttatctttttaactttgactacacctaatgtaatgagtgatgaattagaaaatgaaataaaacgttataataattcttttagaaaacttataaagagaaaaaaagtaggtagtgttataaagggatatgttcgtaagttagagattacatataataaaaaaagagatgattataatcctcattttcatgtgttaattgcagtaaataaatcgtatttcacagataagagatattatattagccaacaagaatggttagatttatggcgtgatgtaacgggcatttcagaaataacacaagttcaagttcaaaaaataagacaaaataataataaagaattatatgaaatggctaagtattctggtaaagatagtgattatttaataaatcaaaaagtctttgatgcattttataaatcacttaaaggtaaacaggtattagtttattcaggattatttaaagaggctaaaaagaaattaaaaaatggggatttagattacttaaaagaaattgatccaaccgaatatatctatcaaattttttatatttggaaacaaaaagagtatttagctagtgaactttatgacttaacagaacaagaaaaaagagaaattaatcaccaaatgatagacgaaatcgaggaagancataaccaaagagaatcaaatggatttagttgaagattgcaatacatttctgtcttttgtagctgataaaactttagaaaaacagaaattatataaagctaattcttgtaaaaatcgattttgtcctgtctgtgcttggagaaaagctagaaaagatgcattgggtttatctttgatgatgcaatatattaagcagcaagagaaaaaggagtttatctttttaactttgactacacctaatgtaatgagtgatgaattagaaaatgaaataaaacgttataataattcttttagaaaacttataaagagaaaaaaagtaggtagtgttataaagggatatgttcgtaagttagagattacatataataaaaaaagagatgattataatcctcattttcatgtgttaattgcagtaaataaatcgtatttcacagataaaagatattatattagccaacaagaatggttagatttatggcgtgatgtaacgggcatttcagaaataacacaagt。
PxylA-gfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：
Gaattctagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttgtatatgatgaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttgatggataaacttgttcacttaaatcaacccgggaacaaggaggaataaaaaatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttcggttatggtgttcaatgctttgcgagatacccagatcatatgaaacagcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataa。
Gfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：
Atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttcggttatggtgttcaatgctttgcgagatacccagatcatatgaaacagcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataa。
PCR反应体系如下：
PCR基本程序如下：
所扩增DNA片段长度：P1398长506bp，P43长282bp，PxylA-gfp长906bp，gfp长729bp。其中，P1398的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
Ctctcactaaatagcaagtcatatctgtccgtccttccttttttccgccaagtgctgtttcagctgcattctcgccctgtacagggtgctcttcaccttcgaaagactccagtccaaaacatcagcaatctcttcgtaagacagctcttgaaatatctgtcgaaatgctgaataaaatgactgaaaatctctgacatctgaaacaatccttttcgtttattaaggcctcacccgtttagacaaacggctataaaaaaagttttacaaatcggaacatttttcccctatcatttttcccgacttcatttgtcatttttttcagaataaatcgcatcattcgactcatgtctgattcaacacgtgcctctcggcttataccccgatgctggccgccggaagcctttccgggacgattctatcaattcatcagcggagtctagttttatattgcagaatgagagaatgctggtttattataacaatataagttttcattattttcaaaaagggggatttatt。
所有扩增产物不经纯化，直接进行原模板的酶切消解反应，反应体系：
10×Buffer Tango 6.7μL
Dpn I 0.7μL
PCR原液 48μL
混匀后放于37℃恒温箱过夜反应，然后利用AxyPrep PCRTM Cleanup Kit对消模板PCR产物进行纯化，4℃冰箱保存备用。
所有质粒均以pMK4(购自BGSC)为载体质粒，构建流程见图2，具体如下所述。2.pMK4-gfp的构建
首先用限制性内切酶EcoR I、BamH I分别切质粒pMK4和gfp片段，酶切体系如下：
漩涡混合器混匀，手掌离心机离心后放于37℃恒温箱酶切。其中，pMK4的酶切产物在酶切反应6h后加入去磷酸化酶FastAP，37℃恒温箱反应2h。
去磷酸化酶切体系如下：
pMK4酶切液 20μL
FastAP 1μL
10×Fast Buffer 2.3μL
gfp片段直接切6h，然后，用AxyPrep PCRTM Cleanup Kit纯化pMK4和Pspac-cre的酶切产物，4℃冰箱保存备用。
用上述酶切纯化产物做酶连反应，反应体系如下：
把反应体系混匀后置于干式恒温器中，设置温度为16℃，反应3h后取出反应液直接做转化实验或放于4℃冰箱保存。
3.pMK4-PxylA-gfp的构建
首先用限制性内切酶Pst I分别切质粒pMK4和PxylA-gfp片段，酶切体系如下：
漩涡混合器混匀，手掌离心机离心后放于37℃恒温箱酶切。其中，pMK4的酶切产物在酶切反应6h后加入去磷酸化酶FastAP，37℃恒温箱反应2h；PxylA-gfp直接切6h。然后纯化后备用。
用上述酶切纯化产物做酶连反应，反应体系如下：
37℃做酶连反应3h，然后用酶连液做转化。
4.pMK4-P1398-gfp与pMK4-P43-gfp的构建
首先用限制性内切酶Pst I、Xma I分别切质粒pMK4-PxylA-gfp和P1398/P43片段，酶切体系如下：
漩涡混合器混匀，手掌离心机离心后放于37℃恒温箱酶切。其中，pMK4-PxylA-gfp的酶切产物在酶切反应6h后加入去磷酸化酶FastAP，37℃恒温箱反应2h；P1398、P43片段直接切6h。然后，用AxyPrep PCRTM Cleanup Kit纯化酶切产物，4℃冰箱保存备用。
用上述酶切纯化产物做酶连反应，反应体系如下：
把反应体系混匀后置于干式恒温器中，设置温度为16℃，反应3h后取出反应液做转化实验。
5.酶连产物的转化及质粒构建验证
酶连产物的转化实验，具体操作如下：
a)从-80℃冰箱取1管DH5α感受态细胞，置于冰盒中融化；
b)取10μL酶连液，快速加到DH5α感受态，移液枪打混匀，放于冰盒中，静置10min；
c)放在42℃水浴锅中，热激1min 30s；
d)加入500μL LB培养基，37℃，200r/min孵育1h；
e)取200μL转化液涂板，37℃培养过夜。
阳性克隆的验证：
随机挑取几株转化子的单克隆菌落，接种到液体LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜，提取质粒，用EcoR I酶切，酶切体系同上，跑DNA凝胶电泳进行验证。所有构建均经测序确认质粒序列无误。其中，克隆了启动子P1398的表达质粒pMK4-P1398-gfp如图1所示。
6.gfp表达质粒的转化与表达
本实施例中，将pMK4-P1398-gfp、pMK4-P43-gfp、pMK4-PxylA-gfp、pMK4-gfp等质粒转化进入枯草芽孢杆菌1A976中，转化pMK4-P1398-gfp的具体操作如下，其他质粒方法相同：
首先，把平板活化的单菌落接种到3mL LB试管中，37℃、200rpm培养10～12h，然后，取300μL转接到预热的3mL LB试管中，加入滤膜灭菌的的木糖母液至终浓度为1％，37℃、200rpm培养3h后分装到2mL Eppendorf管中，加入质粒pMK4-P1398-gfp，加入量100μgDNA/100μL转化液，然后孵育，在37℃摇床中200rpm培养1.5h后涂5μg/mL的氯霉素抗性板，37℃恒温箱过夜培养筛选。
本实施案例中，把pMK4-P1398-gfp、pMK4-P43-gfp、pMK4-PxylA-gfp、pMK4-gfp等转化枯草芽孢杆菌1A976，筛选得到的菌株接种到蛋白酶生产培养基中，蛋白酶生产培养基组分为为玉米粉6.5％、豆粕4％、麸皮5.5％、Na2HPO4·12H2O 0.3％、KH2PO4 0.03％(均为质量分数)。50mL培养基置于500mL三角瓶中进行摇瓶发酵，30℃，200r/min，每隔12h取一次样。细胞发酵液梯度稀释100倍，取200μL置于96孔板中，利用酶标仪进行产物的检测。选择激发光波长485nm，检测光波长520nm。测定结果见图3，在蛋白酶发酵生产的工业培养基PPB中，P1398转录表达的GFP荧光值持续升高。在前24小时内，P1398-GFP的表达量不如PxylA-GFP；而在48小时时，P1398-GFP的表达量比PxylA-GFP高19％，比P43-GFP高48％；在菌株连续发酵到84小时时，P1398-GFP的表达量比PxylA-GFP高59％，比P43-GFP高88％；在120小时，P1398-GFP的表达量比PxylA-GFP高114％，比P43-GFP高65％。上述结果表明，相对廉价的工业生产培养基PPB对P1398有明显的诱导表达的效应。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (14)

1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述分离的多核苷酸作为启动子的用途，所述启动子用于多种蛋白或多肽的表达。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述启动子用于微生物反应器中多种蛋白或多肽的表达。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述微生物反应器为微生物宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述微生物宿主细胞为枯草芽孢杆菌。
6.一种启动子，所述启动子的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
7.如权利要求6所述的启动子用于构建或改造表达载体的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述启动子用于构建或改造微生物反应器表达载体。
9.一种表达载体，所述表达载体含有至少一个如权利要求6所述的启动子，由所述的启动子来指导外源蛋白的表达。
10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体上的启动子的下游连接有GFP基因。
11.一种宿主细胞，所述细胞含有如权利要求9或10所述表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求6所述启动子。
12.一种蛋白或多肽的表达方法，包括下列步骤：1)采用如权利要求9或10所述表达载体构建蛋白或多肽的重组表达载体；
2)将步骤1)获得的重组表达载体转染宿主，并在合适表达所述蛋白或多肽的条件下培养所述宿主。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述宿主为枯草芽孢杆菌。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述在合适表达所述蛋白或多肽的条件下具体为采用工业生产培养基PPB诱导。
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