CN104762285B - 一种自内裂解大肠杆菌的裂解酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自内裂解大肠杆菌的裂解酶及其应用。本发明采用基因拼接的手段，构建了一个全新的裂解酶ClyN，该酶在大肠杆菌中表达后能导致宿主大肠杆菌的自裂解，释放出胞内表达的ATP和蛋白质。重组蛋白ClyN表达质粒能很好的在大肠杆菌BL21(DE3)中复制，在IPTG的诱导下表达15 min后即可观察到明显的诱导大肠杆菌自裂解的现象，诱导裂解效率为99.8%。当宿主细菌中表达有异源增强型绿色荧光蛋白（EGFP）时，EGFP会在大肠杆菌裂解后释放到溶液中，且其释放效率是直接超声破碎效率的89%。因此，ClyN能用于异源蛋白在大肠杆菌中表达后的提取与释放，具有广大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种自内裂解大肠杆菌的裂解酶及其应用。
背景技术
大肠杆菌是一类革兰氏阴性细菌，因为其遗传背景较为清楚，是分子生物学中常用的模式菌株，也是工业上一类很重要的工程菌株。大肠杆菌是很多外源蛋白的生产菌株，常被用来诱导生产各种蛋白质，如荧光蛋白（EGFP），琥珀酸、Harpin蛋白，干扰素等。为了获得大肠杆菌胞内表达的外源重组蛋白，通常需要离心收集宿主菌体，然后用超声波破碎，或者压力破碎。这需要大型的仪器设备，同时也消耗大量的能源。因此，寻找和开发一种温和的大肠杆菌自裂解的方法具有非常重要的意义。
噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染宿主细菌后晚期表达的一种细胞壁水解酶。裂解酶大小通常为25 kD~40 kD，在结构上由两个独立的功能域构成，N-端的催化功能域，和一个决定细胞结合位点的C-端细胞结合功能域（CBD），二者之间由一个小片段链接。序列分析表明，同一类裂解酶的催化域高度保守，而细胞结合域可变，这为构建新的嵌合裂解酶提供了可能。裂解酶具有很高的特异性，只能特异性的识别和裂解特定种类的细菌。此外，裂解酶作用位点很保守，加上噬菌体与细菌共同进化的特异性，宿主菌很难对其产生抗性。到目前为止，已有一些能在体外裂解大肠杆菌的天然裂解酶被报道，这些酶可以直接或者在膜透化剂（如EDTA）的辅助下自外裂解大肠杆菌，在体内表达时无法实现大肠杆菌的可控自裂解。目前尚没有利用裂解酶实现大肠杆菌可控自裂解后用于外源蛋白生产的报道。因此，寻找能在大肠杆菌中稳定、可控的表达，且表达后能高效裂解大肠杆菌的裂解酶具有非常重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能在大肠杆菌种可控表达，且表达后能导致大肠杆菌自裂解的裂解酶，为了叙述方便，我们命名为ClyN，其编码基因ClyN。
本发明提供的自内裂解大肠杆菌的裂解酶的编码基因ClyN的核酸序列如序列表中SEQ.ID.NO.1所示。
本发明提供的自内裂解大肠杆菌的裂解酶ClyN的蛋白序列如序列表中SEQ.ID.NO.2所示。
本发明还公开了一种将ClyN用于外源蛋白生产的方法。具体方法是：
将外源蛋白克隆至pBAD24表达载体，将ClyN克隆至pET28a（+）表达载体，然后将两个质粒共转大肠杆菌BL21(DE3)；
先将转化后的菌株培养在含有L-***糖的培养基中诱导外源蛋白的表达，然后加入IPTG诱导ClyN的表达，ClyN的表达会导致大肠杆菌的自裂解，释放出胞内所表达的外源蛋白。
所述的外源蛋白为任何能在大肠杆菌中表达的蛋白质，如荧光蛋白（EGFP），琥珀酸、Harpin蛋白，干扰素等。
本发明有以下的突出效果和优点：
ClyN能在大肠杆菌中稳定、可控的表达，且表达后能导致大肠杆菌的高效自裂解，释放出胞内所表达的外源蛋白，具有温和，高效、方便、无污染、低能耗等特点，可用于大肠杆菌中外源蛋白表达后释放。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。
附图说明
图1为ClyN基因PCR扩增结果。图中M为标准分子量marker。N为扩增ClyN的条带。
图2为ClyN诱导大肠杆菌自裂解后OD600的变化结果。实心方块所示为BL21(DE3)/pET28a（+）在IPTG诱导后OD600随时间的变化趋势，空心三角所示为BL21(DE3)/pET-ClyN在IPTG诱导后OD600随时间的变化趋势。
图3为ClyN诱导大肠杆菌自裂解后培养基中ATP的变化结果。纵坐标表示用荧光素酶试剂盒测试的培养基中的发光强度。
图4为ClyN诱导大肠杆菌自裂解效率的结果。将大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ClyN加入IPTG后稀释平板计数，用没有加IPTG的组为对照。
图5为ClyN诱导大肠杆菌自裂解后释放胞内表达的EGFP效率的结果。将BL21(DE3)/pET-ClyN/pBAD-EGFP菌株在含有L-***糖的培养基中过夜培养后，加入0.5 mM的IPTG诱导不同的时间，观测培养液中的荧光强度，并与直接超声破碎相比较。
图6为ClyN诱导大肠杆菌自裂解过程的结果。将BL21(DE3)/pET-ClyN/pBAD-EGFP菌株在含有L-***糖的培养基中过夜培养后，与1 mM的IPTG混合，用荧光显微镜监测菌体的变化。
具体实施方式
本发明设计和人工合成一种新的嵌合裂解酶ClyN。下列实施例中所用的方法如无特别说明均是常规的实验方法。实验中所用到的引物均由上海英骏公司提供。测序均在上海英骏公司完成。
实施例1、能诱导大肠杆菌自裂解的裂解酶的构建
（1）在南京金斯瑞生物科技有限公司全序列合成能表达裂解酶ClyN的ClyN基因DNA序列。合成序列装入pUC57质粒中。以ClyN基因为模板，在目的基因的两端分别加入NcoI和XhoI的酶切位点，引物设计如下：
正向引物：5- ATATCCATGGGCATGCCTCCATCATTACG -3 (SEQ.ID.NO.3)
NcoI
反向引物：5- TATACTCGAGGTAGTTCAGGGTCTGGCCTG -3 (SEQ.ID.NO.4)
XhoI
以2 μl基因为模板，各加入引物1 μg进行PCR扩增，PCR扩增程序如下：1）94 ℃，5min；2）94 ℃，30 sec，62 ℃，45 sec，72 ℃，45 sec，30个循环；3）72 ℃，10 min；将产物进行凝胶电泳回收，电泳图谱如图1，ClyN的基因大小为861 bp，与所设计的裂解酶的大小一致。
（2）将ClyN基因连入表达质粒pET28a(+)中得到重组载体pET-ClyN，然后将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET-ClyN。
实施例2、ClyN诱导大肠杆菌自裂解的验证
将大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ClyN培养至OD600=0.8左右，加入IPTG至0.5 mM后用酶标仪监测菌液在600 nm吸收值的变化。同时，用没有加IPTG的菌液作为负对照。最后得到的裂解曲线见附图2。结果显示ClyN能诱导宿主菌株的快速自裂解从而导致在600 nm吸收值快速降低。
实施例3、ClyN诱导大肠杆菌自裂解后培养基中ATP的变化结果的验证
将大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ClyN培养至OD600=0.8左右，加入IPTG至0.5 mM后，用荧光素酶检测试剂盒检测菌液中发光值的变化。同时，用没有加IPTG的菌液作为负对照。试验得到的发光曲线见附图3。结果显示ClyN诱导宿主大肠杆菌自裂解后能在培养液中检测到大量的ATP。
实施例4、ClyN诱导大肠杆菌自裂解效率的结果的验证
将大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ClyN培养至OD600=0.8左右，加入IPTG至0.5 mM后稀释平板计数，用没有加IPTG的稀释液作为负对照，所得到的结果见附图4。结果显示ClyN能高效的诱导宿主大肠杆菌的自裂解，其裂解效率为99.8%。
实施例5、ClyN诱导大肠杆菌自裂解后释放胞内表达的EGFP效率的结果的验证。
以EGFP作为外源蛋白的代表，将EGFP基因克隆至表达质粒pBAD24中得到pBAD-EGFP质粒，将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ClyN中得到EGFP工程菌株BL21(DE3)/pET-ClyN/pBAD-EGFP。将菌株BL21(DE3)/pET-ClyN/pBAD-EGFP过夜培养在含有0.2% L-***糖的LB液体培养基中，诱导EGFP基因的表达。次日，将菌体重悬至新鲜LB中。取等体积的该菌液数份（每份100 ml），分别加入0.5 mM的IPTG后继续培养0.5, 1, 2 h。培养结束后测定培养液上清中的荧光强度。为了方便比较，实验中设立两个对照，一个为重悬后培养液中的荧光强度（即培养0 h时的荧光强度，此为空白对照）。另一份重悬后直接超声破碎（超声3 s，停5 s，共超声处理30 min），测定上清中的荧光强度（此为阳性对照）。通过比较培养液上清中的荧光强度来衡量ClyN诱导自裂解效率与传统的超声破碎效率。试验得到的鉴定结果见附图5。结果显示ClyN能高效的诱导EGFP的释放，其释放效率相当于超声破碎效率的89%。
实施例6、ClyN诱导大肠杆菌自裂解过程的结果的验证
将用L-***糖诱导过夜的BL21(DE3)/pET-ClyN/pBAD-EGFP细菌收集后加IPTG至1 mM，然后将菌液滴在1% LB-琼脂固体上，将LB-琼脂固体切成小方块，用高分辨率荧光显微镜对细菌的状态进行实时监测，观察细菌裂解的动态过程。试验得到的鉴定结果见附图6。结果显示ClyN能在诱导表达后15 min诱导宿主细菌的自裂解和胞内EGFP蛋白的释放。
Claims (5)
1.一种自内裂解大肠杆菌的裂解酶ClyN，其蛋白序列如序列表中SEQ.ID.NO.2所示。
2.编码权利要求1所述自内裂解大肠杆菌的裂解酶的基因ClyN，其核酸序列如序列表中SEQ.ID.NO.1所示。
3.将权利要求1所述的裂解酶ClyN应用于大肠杆菌的自内裂解的方法，其特征在于，将ClyN的基因导入大肠杆菌内，以表达的ClyN蛋白质作为自内裂解大肠杆菌的手段。
4.将权利要求1所述的裂解酶ClyN用于外源蛋白生产的方法，其特征在于：
将外源蛋白克隆至pBAD24表达载体，将ClyN克隆至pET28a(+)表达载体，然后将两个质粒共转大肠杆菌BL21(DE3)；
先将转化后的菌体培养在含有L-***糖的培养基中诱导外源蛋白的表达，然后加入IPTG诱导ClyN的表达，ClyN的表达会导致大肠杆菌的自裂解，释放出胞内所表达的外源蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的外源蛋白为荧光蛋白、琥珀酸、Harpin蛋白或干扰素。
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