CN115747187B - 一种重组酶UvsX及其表达基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于酶工程及微生物工程领域，具体涉及一种重组酶UvsX及其表达基因和应用。本发明选择埃希氏杆菌属T6病毒编码重组酶UvsX的基因为模板，通过密码子偏好优化和表达载体的构建优化，获得了表达量提高了12倍的重组酶UvsX菌株，并通过优化表达条件及纯化工艺，获得了纯度95%以上具有酶活性的重组UvsX酶。通过本发明获得的重组酶UvsX质粒可用于制备重组菌株，以大肠杆菌为重组表达宿主，实现了重组酶UvsX的高效表达。

Description

一种重组酶UvsX及其表达基因和应用

技术领域

本发明属于酶工程及微生物工程领域，具体涉及一种重组酶UvsX及其表达基因和应用。

背景技术

近年来分子生物学发展非常迅速，在IVD及制药等多个领域有着广泛的应用，其中DNA的扩增使分子生物学中的非常重要的一环。1968年发明的pcr技术是最广泛的DNA扩增技术，它是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，在分子诊断上广泛应用，然而此技术需要精准的温控***，对三个反应步骤中温度的进行精准控制，此外整个PCR反应时间也相对较长。

随着分子生物学的不断发展，一种新的不需要借助精密温度循环***且反应时间较短的等温核酸扩增技术被发明，这就是重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，RPA)技术。

重组酶聚合酶扩增技术是在由多种酶和蛋白的参与下，在恒温条件下实现核酸指数扩增的技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。它主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶UvsX、单链DNA结合蛋白GP32和链置换DNA聚合酶BsuL。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，在扩增时，重组酶UvsX结合到引物上，并与引物结合形成复合物，这些复合物与DNA模板的序列互补。单链DNA与解开的单链DNA结合，使其稳定，链置换DNA聚合酶Bsul结合在核酸蛋白复合体的3’端，进行链延伸，形成互补链，新合成的单链与原始互补链配对，从而实现DNA的指数增长。RPA优于PCR的两个优点是：一、可以消除使用专门的设备来提供温度控制，二、反应速度快、时间短，更适合应用于POCT。

重组聚合酶扩增技术中重组酶UvsX发挥重要作用，在RPA的反应中它的用量较多，然野生型UvsX基因在大肠杆菌中表达量极低，即使密码子优化后表达量仍较低，这导致后续纯化的纯度也低，纯化难度加大，纯化步骤增加，从而催生量产成本高，不足满足产业化应用。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种重组酶UvsX及其表达基因和应用，通过OPTIMIZER网站选择埃希氏杆菌属T6病毒编码重组酶UvsX的基因为模板，通过密码子偏好优化和TEV蛋白酶单点突变，获得了表达量提高的重组酶UvsX，所述重组酶UvsX的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种重组酶UvsX的表达基因，包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

ATGAGCATCGCGGATCTGAAAAGCCGTCTGATCAAAGCGAGCACCAGCAAAATGACCGCGGAACTGACCACCTCCAAATTCTTCAACGAAAAAGACGTTATCCGTACCAAAATCCCGATGCTGAACATCGCGATCAGCGGTGCGATCGATGGTGGCATGCAGTCTGGCCTGACCATCTTCGCGGGTCCGTCCAAACACTTCAAAAGCAACATGAGCCTGACCATGGTTGCGGCGTACCTGAACAAATACCCGGACGCGGTTTGCCTGTTCTACGATAGCGAATTCGGCATCACCCCGGCGTACCTGCGTAGCATGGGCGTGGATCCGGAACGTGTTATCCACACCCCGATCCAGAGCGTTGAACAGCTGAAAATCGACATGGTTAACCAGCTGGAAGCAATCGAACGTGGCGAAAAAGTTATCGTGTTCATCGACTCTATCGGTAACATGGCGTCTAAAAAAGAAACCGAAGATGCGCTGAACGAAAAAAGCGTTGCGGATATGACCCGTGCGAAAAGCCTGAAATCCCTGTTCCGTATCGTTACCCCGTACTTCAGCATCAAAAACATCCCGTGCGTTGCGGTGAACCACACCATCGAAACCATCGAAATGTTCAGCAAAACCGTGATGACCGGTGGCACCGGCGTTATGTACTCCGCGGACACCGTTTTCATCATCGGCAAACGTCAGATCAAAGATGGCAGCGATCTGCAGGGTTACCAGTTCGTTCTGAACGTTGAAAAATCCCGTACCGTTAAAGAAAAATCTAAATTCTTCATCGACGTTAAATTCGATGGCGGCATCGATCCGTACTCTGGTCTGCTGGATATGGCGCTGGAACTGGGCTTCGTGGTGAAACCGAAAAACGGTTGGTATGCGCGTGAATTCCTGGATGAAGAAACCGGTGAAATGATCCGTGAAGAAAAAAGCTGGCGTGCGAAAGATACCAACTGCACTACCTTCTGGGGTCCGCTGTTCAAACACCAGCCGTTCCGTGACGCGATCAAACGTGCTTACCAGCTGGGCGCGATCGATTCTAACGAAATCGTTGAAGCGGAAGTTGATGAACTGATCAACAGCAAAGTTGAAAAATTCAAAAGCCCGGAAAGCAAAAGCAAAAGCGCGGCGGATCTGGAAACCGATCTGGAACAGCTGAGCGATATGGAAGAATTCAACGAATAA（SEQIDNO.1）

本发明的第二个目的是提供一种重组表达载体pET-32a-UvsX-TEV，包括pET-32a载体和***在所述pET-32a载体中的目的基因表达片段；所述pET-32a载体包括pET-32a载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列；所述多克隆位点包括Kpn I酶切位点和Xho I酶切位点；所述目的基因表达片段包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述目的基因表达片段的5’端具有Kpn I酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有Xho I酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向***所述多克隆位点序列的所述Kpn I酶切位点和所述Xho I酶切位点之间；所述重组表达载体上的酶切位点Thrombin凝血酶，被突变成TEV Protease酶切位点。

本发明的第三个目的是提供一种提高重组酶UvsX表达量的方法，包括以下步骤：

S1、将目的基因片段导入pET-32a载体，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有Kpn I酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有Xho I酶切位点黏性末端；

S2、将所述重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3），得到重组工程菌；

S3、对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述重组酶TrxA-UvsX；

S4、在重组酶液TrxA-UvsX中加入凝血酶切割TrxA蛋白，得到重组酶UvsX。

优选的，所述步骤S1中将所述目的基因表达片段导入pET-32a载体中得到重组表达载体的步骤之前，还包括以下步骤：

以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述上游引物包括Kpn I酶切位点，所述下游引物包括XhoI酶切位点；将所述PCR扩增产物***到pET-32a载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体；用限制性内切酶Kpn I和Xho I对所述克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。

优选的，所述上游引物序列信息如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物序列信息如SEQ ID NO.3所示。

ATCTGGGTACCATGAGCATCGCGGATCTGAA（SEQ ID NO.2）；

TGGTGCTCGAGTTATTCGTTGAATTCTTCCATATCGCTCAG（SEQ ID NO.3）。

优选的，步骤S3中对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述重组酶UvsX的步骤中，包括：在重组工程菌的菌落OD值为0.2～1.0时，加入终浓度为0.01mM/L～0.2mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，并在18℃～25℃诱导表达3h～9h，离心分离收集菌体，超声破碎菌体，离心分离收集上清，得到粗产物，将上述粗产物纯化，得到所述重组酶TrxA-UvsX。

优选的，步骤S4在重组酶液TrxA-UvsX中加凝血酶切割TrxA蛋白，所述加入TEV酶与重组酶液TrxA-UvsX的质量比为1/300-1/100，切割缓冲液pH值为6.5-9.0，切割温度为2℃～20℃，切割时间为8-20h，切割完进行分离纯化，得到所述重组酶UvsX。

优选的，将所述粗产物纯化得到所述重组酶UvsX的步骤中，包括：将所述粗产物采用Ni亲和挂柱纯化，得到所述重组酶TrxA-UvsX；加入TEV酶进行切割，切割完的粗产物采用Ni柱亲和流穿纯化，再超滤浓缩，得到所述重组酶UvsX。

本发明的另一个目的是提供一种重组酶UvsX，通过如上述所述任一项所述的方法制得。

本发明的另一个目的是提供一种如上述所述的重组酶UvsX在重组酶聚合酶扩增RPA中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了重组酶UvsX及其表达基因和应用。本发明提供了一种重组酶UvsX的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；进一步通过重新构建表达载体、优化诱导表达条件及优化纯化工艺条件将重组酶UvsX的表达量提高了12倍；相比于市售的重组酶UvsX，本发明获得的重组酶UvsX酶活性也显著提高。另外，本发明获得的重组酶UvsX质粒可用于制备重组载体、重组菌株，以大肠杆菌为重组表达宿主，实现了重组酶UvsX的高效表达。

附图说明

图1为载体pET-32a载体图谱及多克隆位点图；

图2为表达载体pET32a以及UvsX酶基因双酶切凝胶电泳图；

图3为重组表达载体pET32a-UvsX的PCR检测阳性克隆电泳图；

图4为改造后表达载体pET32a-UvsX-TEV的图谱及多克隆位点图；

图5为表达载体pET32a-UvsX-TEV发酵液SDS-PAGE电泳检测图；

图6为发酵液用Ni纯化后的SDS-PAGE电泳检测图；

图7为重组酶TrxA-UvsX过Ni柱纯化，TEV酶切后再过Ni柱纯化的SDS-PAGE电泳检测图；

图8为重组酶UvsX、TrxA-UvsX与商品化UvsX在RPA反应下的核酸电泳图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明中涉及到的实验材料和试剂：

1、菌株与载体

感受态BL21（DE3）、感受态TOP10购于上海生工生物、pET-32a质粒购自生物风公司。

2、酶与试剂盒

限制性内切酶KpnI及XhoI、T4 DNAligase、Ex Taq 酶购于TAKARA，TEV酶购于NEB，Pfu购于Promega，SanPrep核酸纯化套件、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒购于上海生工生物。

3、培养基

LB培养基配制（L）：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g。

4、重组酶UvsX活性测定试剂购于TwistDx公司；市售UvsX酶购于TwistDx公司。

实施例1重组酶UvsX的基因的获取及合成

本发明利用OPTIMIZER网站对大肠杆菌T6噬菌体（ATCC 11303-B6）编码重组酶UvsX的DNA序列，所述编码重组酶UvsX的DNA序列如下SEQI DN O.4所示，根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化，获得重组酶UvsX的基因序列，所述重组酶UvsX的基因序列如下SEQ IDNO.1，将优化后的重组酶UvsX的基因（在5’端设计了Kpn I酶切位点，在3’端设计了Xho I酶切位点）连接至表达载体PUC57获得克隆载体PUC57-UvsX，该过程由上海生工生物公司完成。

ATGTCTATTGCAGATTTAAAATCCCGTTTGATTAAAGCTTCCACTTCTAAAATGACTGCTGAGCTGACTACATCTAAATTCTTTAATGAAAAGGATGTAATCCGTACAAAAATCCCAATGCTTAATATTGCTATTTCTGGTGCGATTGATGGCGGTATGCAGTCTGGTTTAACTATTTTCGCAGGGCCTTCTAAACACTTTAAATCAAATATGTCTTTGACTATGGTTGCAGCGTATTTGAACAAATATCCTGACGCGGTTTGTCTATTCTATGATAGCGAATTTGGTATTACTCCAGCTTATTTGCGATCCATGGGAGTTGACCCGGAACGTGTAATTCATACGCCAATCCAGTCAGTTGAACAGCTGAAAATTGATATGGTGAACCAGCTTGAAGCTATTGAGCGTGGTGAAAAAGTTATTGTATTCATCGACTCAATTGGTAATATGGCTTCCAAGAAAGAAACGGAAGATGCCTTGAATGAAAAATCTGTGGCAGATATGACTCGTGCTAAATCACTGAAGTCATTATTCCGTATTGTTACTCCTTATTTTAGCATTAAAAATATTCCATGTGTTGCGGTTAACCATACAATTGAAACAATTGAAATGTTTAGTAAAACCGTGATGACAGGTGGTACAGGCGTAATGTATTCGGCTGATACTGTATTCATTATCGGTAAGCGTCAGATTAAAGATGGTTCTGATCTTCAGGGGTATCAATTTGTTCTAAATGTAGAAAAATCTCGTACCGTTAAAGAAAAAAGTAAATTCTTTATTGATGTTAAATTTGACGGTGGTATCGATCCTTATTCTGGATTGTTAGATATGGCTCTAGAATTAGGATTTGTAGTAAAACCAAAAAATGGCTGGTATGCTCGTGAATTTCTTGACGAAGAAACTGGCGAGATGATTCGCGAAGAAAAATCTTGGCGTGCAAAAGATACTAACTGCACTACATTCTGGGGTCCTTTATTTAAGCATCAACCATTCCGAGATGCTATTAAACGTGCTTATCAGTTAGGTGCTATTGATAGTAATGAAATTGTTGAAGCTGAAGTTGATGAATTGATTAACTCAAAGGTTGAAAAATTTAAATCTCCAGAAAGTAAAAGTAAATCAGCTGCTGATTTAGAAACTGACCTAGAGCAGTTAAGTGATATGGAAGAATTTAATGAATAA（SEQ ID NO.4）；

实施例2重组酶UvsX表达载体的构建和重组菌的构建

2.1重组酶UvsX表达载体的构建

利用限制性内切酶KpnI和XhoI对克隆载体PUC57-UvsX和pET-32a载体进行双酶切，酶切体系如表1，酶切条件为：37℃，4h，对酶切产物进行凝胶电泳及回收。采用T4连接酶将UvsX基因连接到pET-32a载体中，连接体系如下表2所示，连接条件为：4℃，过夜连接，再转入大肠杆菌TOP10菌株（购于上海生工生物），实验过程如下：取全部连接产物(10μL)，加入100μL的TOP10感受态细胞溶液中，冰浴30min，42℃热激90s后静置于冰浴中15-20min，加入800μL LB培养基，37℃、200r/min恒温培养1h，取出EP管，4000r/min离心5min，弃上清液同时保留200μL，混匀菌体沉淀后均匀涂布Amp抗性平板上，37℃恒温培养过夜第二天挑取平板上的单菌落于10mL的LB培养基中过夜培养，采用SanPrep核酸纯化套件（质粒提取）试剂盒抽对菌液进行质粒提取，分别进行双酶切鉴定及PCR鉴定，鉴定正确后测序验证其序列正确性，从而成功构建重组表达载体pET-32a-UvsX。

表1 酶切体系

表2 连接体系

所述双酶切鉴定包括如下步骤：取提取的质粒，进行双酶切，双酶切的体系如表1所示，再取酶切质粒进行1%琼脂糖凝胶核酸电泳检测，紫外灯下观察电泳胶。

所述PCR鉴定过程包括如下步骤：取质粒按照表3反应体系、表4扩增程序进行PCR反应，其中上下游引物分别为SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3。再取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察电泳胶。

表3 PCR反应体系

表4 PCR扩增程序

其中，载体pET-32a载体的基因序列信息可参考网址：http://www.biofeng.com/zaiti/dachang/pet32a.html。

其中，图1为pET-32a载体图谱及多克隆位点图。图2为克隆载体pET32a-UvsX的双酶切结果图，从图中可以见载体pET32a-UvsX被双酶切后形成两个条带，分别为5810bp的pET-32a和1182bp的UvsX基因，结果表明双酶切验证载体pET32a-UvsX构建正确。图3为PCR检测结果图。从图中可见构建的重组表达载体pET-32a-UvsX可以扩增出1182bp的条带得到重组表达载体，结果表明PCR验证载体pET32a-UvsX构建正确。

2.2重组酶UvsX表达载体的蛋白酶切位点突变

将重组表达质粒pET32a-UvsX的蛋白酶切位点Thrombin（凝血酶），突变成TEVProtease酶切位点，重组酶UvsX表达载体PCR产物扩增过程如下：（1）以表达载体pET-32a-UvsX为模板，通过TEV蛋白酶酶切位点突变引物进行PCR扩增，其中，TEV蛋白酶酶切位点突变引物上游引物如SEQ ID NO.5所示，所述下游引物序列信息如SEQ ID NO.6所示。

GCCCAGATCTGGGTACCGAGAATCTTTATTTTCAGGGGCCATGGCTGATATCGGATC（SEQ IDNO.5）；

GTGGTGGTGGTGGTGCTCGA（SEQ ID NO.6）。

扩增体系如表5所示，扩增程序如表6所示；（2）将获得的PCR扩增产物，通过琼脂糖电泳进行分析，将目标PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（购于上海生工）进行纯化，其中，PCR产物大小为1260bp；（3）将限制性内切酶Kpn I酶与Xho I酶加入纯化后的PCR产物中进行双酶切，酶解反应2小时后，纯化回收双酶切产物，分别胶回收双酶切PCR产物1200bp片段及双酶切pET-32a-UvsX质粒的5800bp的大片段；（4）采用T4连接酶连接酶切后的PCR产物及pET-32a-UvsX载体片段，获得重组表达载体pET-32a-UvsX-TEV。（5）将表达载体pET-32a-UvsX-TEV热激转化进TOP10感受态细胞，涂布平板过夜培养，第二天挑取单菌落，抽提质粒，先进行双酶切鉴定，再进行PCR鉴定，鉴定正确后测序验证其序列正确性。实验中采用实施例1所述实验方法进行转化、质粒提取、双酶切验证、PCR鉴定及测序实验。

构建完成的pET-32a-UvsX-TEV载体图谱及多克隆位点为图4所示，。

表5重组酶UvsX表达载体PCR产物扩增体系

表6 PCR扩增程序

2.3重组酶UvsX表达工程菌构建

取构建成功的pET-32a-UvsX-TEV质粒，转化进大肠杆菌BL21（DE3）菌株（购于上海生工生物），转化条件采用实施例1，并涂布于LB平板，过夜培养，挑取单菌落。以上下游引物分别为SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3进行菌落PCR验证，实验中采用实施例1所述实验方法进行菌落PCR验证。根据菌液PCR结果确定阳性转化子，提取阳性转化子的质粒进行测序鉴定，然后将测序正确的单菌落确定为UvsX酶重组工程菌，培养至OD为0.6-0.8，保种。

实施例3重组酶UvsX诱导表达及亲和层析纯化

3.1重组酶UvsX诱导表达

重组表达质粒pET32a-UvsX-TEV在大肠杆菌中表达重组酶TrxA-UvsX。实验过程如下：

将筛选得到的UvsX酶重组工程菌接种于10mL LB液体培养基中，加Kan抗生素至终浓度1mM，37℃，250rpm培养过夜，次日按1:100的比例转接于200mL LB培养基中，加Kan抗生素至终浓度1mM，37℃，250rpm培养至OD值为0.6-0.8，加入终浓度为0.01mM/L-0.2mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，并在20℃诱导表达3-9h，离心（4℃，8000rpm，5min）分离收集菌体，按照菌体与Buffer A（Tirs-HCl 20mM，氯化钠500mM，咪唑，10mM，调pH至7.0）质量比为1：10混合，超声破碎大肠杆菌，破碎条件：冰水浴中超声3s，暂停8s，功率为400W，时间20min。取菌体破碎液跑SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达量。

SDS-PAGE电泳结果如图5所示，其中，泳道1为诱导前菌体破碎；泳道2为诱导3h的菌体破碎；泳道3为诱导6h的菌体破碎；泳道4为诱导9h的菌体破碎。结果表明诱导6小时目的蛋白有表达，且表达量已达最高量，增加诱导时间表达量不再增加。

3.2重组酶UvsX的纯化

采用Ni亲和挂柱纯化上述粗酶液，得到所述重组酶TrxA-UvsX，实验过程如下：

（1）取上述（超声破碎液，4°C，12000rpm离心45min，收集上清，用0.22μm过滤膜过滤上清，上样至Ni层析柱；

（2）用Buffer B（Tirs-HCl 20mM，氯化钠500mM，咪唑，20mM，调pH至7.0）洗杂蛋白，Buffer C（Tirs-HCl 20mM，氯化钠500mM，咪唑，200mM，调pH至7.0）洗脱TrxA-UvsX重组酶；

（3）SDS-PAGE分析纯化后样品；

（4）在洗脱液TrxA-UvsX中，加入TEV酶的与重组酶液TrxA-UvsX的质量比为1/200，切割缓冲液pH值为7.0，切割温度为4℃，切割时间为16h；切割完加Buffer D（Tirs-HCl20mM，氯化钠500mM，调pH至7.0）稀释10倍，上样至Ni层析柱进行分离纯化，收集流穿液，超滤得到所述重组酶UvsX，进行SDS-PAGE电泳检测。

SDS-PAGE电泳结果如图6-7所示，其中，如图6所示，泳道1为菌体破碎；泳道2为菌体破碎后上清；泳道3为破碎后沉淀；泳道4为0.22μm滤膜过滤上清；泳道5为流穿液；泳道6为50mM咪唑洗杂液；泳道7为200mM咪唑洗脱液组。结果说明TrxA-UvsX蛋白几乎为上清表达，纯化后的TrxA-UvsX重组酶条带单一。

如图7所示，泳道1为过Ni柱得到的TrxA-UvsX；泳道2为加TEV酶切的重组酶TrxA-UvsX；泳道3为200mM咪唑洗脱收集挂柱蛋白；泳道4为过Ni柱流穿液。由图中泳道2可知大部分TrxA-UvsX被TEV酶切成分子量47KD的UvsX酶及12KD的TrxA蛋白，小部分未切开；泳道4得到单一分子量为47KD的蛋白，结果说明经过纯化步骤可得到分子大小正确的UvsX酶条带。

综上所述，采用Ni亲和挂柱纯化上述粗酶液，可以获得纯度大于90%的重组酶TrxA-UvsX。在纯化的重组酶TrxA-UvsX中加入TEV酶进行切割，切割完的粗产物再采用Ni柱亲和流穿纯化，取流穿液再超滤浓缩，得到纯度大于95%的重组酶UvsX。

实施例4重组酶UvsX的酶活检测

RPA反应测定重组酶UvsX的酶活，方法如下：在RPA检测中，以新冠N蛋白的基因质粒为模板，并设计了可以扩增121bp DNA的引物，引物信息如SEQIDNO.8与SEQIDNO.9所示，所述新冠N蛋白的基因质粒的序列信息如SEQIDNO.7所示。模板与引物均为生工生物合成。RPA反应体系如表7-8，RPA反应的扩增程序如表9。

ACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGA（SEQIDNO.7）；

AGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT（SEQIDNO.8）；

TTGGCCTTTACCAGACATTTTGCTCTCAAGCTG（SEQIDNO.9）。

表7 RPA反应体系（10×reactionbuffer）

表8 RPA反应体系配制（50μL）

表9 RPA扩增程序

RPA反应后，用1％脂糖凝胶电泳，在0.5×TBE缓冲液中电泳检测。结果如图8，泳道1、2为购买的商品UvsX酶，泳道3、4为TEV酶切后纯化得到的重组UvsX酶，泳道5、6为过Ni柱纯化得到的TrxA-UvsX酶。泳道7、8为不加UvsX酶。结果说明融合表达TrxA-UvsX酶无活性，切割掉TrxA蛋白的重组UvsX酶具有活性，该方法制备的重组酶UvsX经RPA反应测定具有UvsX酶的活性，相比于商品的UvsX酶，自产的重组UvsX酶得到的产物条带更亮且杂带更少。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种重组酶UvsX的表达基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组表达载体pET-32a-UvsX-TEV，其特征在于，包括pET-32a载体和***在所述pET-32a载体中的目的基因表达片段；所述pET-32a载体包括PET-32a载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列；所述多克隆位点包括Kpn I酶切位点和Xho I酶切位点；所述目的基因表达片段包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述目的基因表达片段的5’端具有Kpn I酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有Xho I酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向***所述多克隆位点序列的所述Kpn I酶切位点和所述Xho I酶切位点之间；所述重组表达载体上的酶切位点Thrombin凝血酶，被突变成TEV Protease酶切位点。

3.一种提高重组酶UvsX表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将目的基因片段导入pET-32a载体，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有Kpn I酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有Xho I酶切位点黏性末端；

S2、将所述重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3），得到重组工程菌；

S3、对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述重组酶TrxA-UvsX；

S4、在重组酶液TrxA-UvsX中加入TEV蛋白酶切割TrxA蛋白，得到重组酶UvsX。

4.根据权利要求3所述提高重组酶UvsX表达量的方法，其特征在于，所述步骤S1中将所述目的基因表达片段导入pET-32a载体中得到重组表达载体的步骤之前，还包括以下步骤：

以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述上游引物包括Kpn I酶切位点，所述下游引物包括XhoI酶切位点；将所述PCR扩增产物***到pET-32a载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体；用限制性内切酶Kpn I和Xho I对所述克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。

5.根据权利要求4所述提高重组酶UvsX表达量的方法，其特征在于，所述上游引物序列如SEQID NO.2所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求3所述提高重组酶UvsX表达量的方法，其特征在于，步骤S3中对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述重组酶UvsX的步骤中，包括：在重组工程菌的菌落OD值为0.2～1.0时，加入终浓度为0.01mM/L～0.2mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，并在18℃～25℃诱导表达3h～9h，离心分离收集菌体，超声破碎菌体，离心分离收集上清，得到粗产物，将上述粗产物纯化，得到所述重组酶TrxA-UvsX。

7.根据权利要求3所述提高重组酶UvsX表达量的方法，其特征在于，步骤S4在重组酶液TrxA-UvsX中加TEV蛋白酶切割TrxA蛋白，所述加入TEV酶与重组酶液TrxA-UvsX的质量比为1/300-1/100，切割缓冲液pH值为6.5-9.0，切割温度为2℃～20℃，切割时间为8-20h，切割完进行分离纯化，得到所述重组酶UvsX。

8.根据权利要求6所述提高重组酶UvsX表达量的方法，其特征在于，将所述粗产物纯化得到所述重组酶UvsX的步骤中，包括：将所述粗产物采用Ni亲和挂柱纯化，得到所述重组酶TrxA-UvsX；加入TEV酶进行切割，切割完的粗产物采用Ni柱亲和流穿纯化，再超滤浓缩，得到所述重组酶UvsX。

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