CN108265067A - 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法 - Google Patents

新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108265067A
CN108265067A CN201810002793.9A CN201810002793A CN108265067A CN 108265067 A CN108265067 A CN 108265067A CN 201810002793 A CN201810002793 A CN 201810002793A CN 108265067 A CN108265067 A CN 108265067A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primers
primer pairs
primer
duck reovirus
novel duck
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810002793.9A
Other languages
English (en)
Inventor
黄淑坚
李文锋
梅敏敏
李智丽
***
刘佑明
黄雯晶
李晓文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan University
Original Assignee
Foshan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan University filed Critical Foshan University
Priority to CN201810002793.9A priority Critical patent/CN108265067A/zh
Publication of CN108265067A publication Critical patent/CN108265067A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12211—Orthoreovirus, e.g. mammalian orthoreovirus
    • C12N2720/12222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法，包括步骤：1)以Trizol试剂提取新型鸭呼肠孤病毒尿囊液的总RNA；2)采用PrimeScriptTM One Step RT‑PCR Kit试剂盒对步骤1)提取的总RNA进行克隆，其中使用的特异性引物包括L1引物对、L2引物对和L3引物对中的任意一对，所述L1引物对包括L1‑F引物和L1‑R引物，所述L2引物对包括L2‑F引物和L2‑R引物，所述L3引物对包括L3‑F引物和L3‑R引物。本发明的有益效果是：建立一步法扩增NDRV的L组全长基因序列的RT‑PCR体系，避免了常规PCR扩增后还需对基因片段克隆、连接、多次测序等增加繁杂工作。全长的扩增，亦为NDRV L组编码的蛋白研究奠定基础。

Description

新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，特别涉及一种新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法。
背景技术
“新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)”是自2005年在福建、浙江等省突发的新的重大疫病，发病率5％～32.5％，病死率差异较大，为4％～20％，鸭日龄愈小，发病率、病死率愈高，该病主要引起肝脏不同程度点/斑块状出血和坏死、脾脏肿大坏死、心脏和法氏囊出血等。
NDRV为分节段的ds RNA正呼肠孤病毒，该病毒含有10个RNA节段，编码14种蛋白；总基因组包括3个大基因片段(L1,L2,L3)，3个中基因片段(M1,M2,M3)和4个小基因片段(S1,S2,S3,S4)。目前关于S组基因的研究较多，关于L组基因序列研究较少。研究表明NDRVL组基因序列片段长分别为3959bp,3830bp,3907bp，分别编码λA蛋白(1294氨基酸)，λB蛋白(1260氨基酸)，λC蛋白(1286氨基酸)；λA是内衣壳的主要结构之一，λB蛋白是内衣壳的次要成分，而λC蛋白是五聚体蛋白，能贯穿病毒的核心与外衣壳，具有多种功能。
常规PCR反应只适合扩增3kb以内的基因片段，不适用于长片段的扩增，对于长片段基因序列，一般选择分段设计引物以扩增目的序列，为后续目的基因片段克隆、连接、多次测序等增加繁杂工作。
发明内容
本发明旨在提供3对扩增NDRV的L组基因全长特异性引物的序列，有效减少了后续目的基因片段克隆、连接、多次测序等繁杂工作。
本发明所采取的技术方案是：
一种新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法，包括步骤：
1)提取新型鸭呼肠孤病毒尿囊液的总RNA；
2)采用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit试剂盒对步骤1)提取的总RNA进行克隆，其中使用的特异性引物包括L1引物对、L2引物对和L3引物对中的任意一对，所述L1引物对包括L1-F引物和L1-R引物，所述L2引物对包括L2-F引物和L2-R引物，所述L3引物对包括L3-F引物和L3-R引物，各引物的序列分别如表1所示。
表1 NDRV的L组基因特异性扩增引物
上述试剂盒反应体系包括：
运行程序为：50℃30min；94℃变性3min；98℃10s，68℃4min做35个循环；72℃再延伸10min。
本发明的有益效果是：建立一步法扩增NDRV的L组全长基因序列的RT-PCR体系，避免了常规PCR扩增后还需对基因片段克隆、连接、多次测序等增加繁杂工作。全长的扩增，亦为NDRV L组编码的蛋白研究奠定基础。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法
1)以Trizol试剂提取新型鸭呼肠孤病毒尿囊液的总RNA；
2)采用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit试剂盒对步骤1)提取的总RNA进行克隆，其中使用的特异性引物包括L1引物对、L2引物对和L3引物对中的任意一对，所述L1引物对包括L1-F引物和L1-R引物，所述L2引物对包括L2-F引物和L2-R引物，所述L3引物对包括L3-F引物和L3-R引物。
试剂盒反应体系25μl，包括：
运行程序为：50℃30min；94℃变性3min；98℃10s，68℃4min做35个循环；72℃再延伸10min。
实施例2：新型鸭呼肠孤病毒L组基因的鉴定
(1)将实施例1的反应体系扩大到50μl，通过胶回收试剂盒得到纯化的目的基因片段。
使用pMD18-T载体连接试剂盒的反应体系10μl：纯化产物4.5μl，2×LigaseBuffer(Ligation Solution)5μl,pMD18-T载体0.5μl。在冰盒上操作，将以上各种反应试剂加入一个灭菌的PCR管，混匀后，16℃作用4h，继续4℃静置过夜。
(2)将上述液体转入100μl DH5α感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再迅速放回冰上10min，加入500μl新鲜LB液体培养基，37℃230r/min振荡培养60min后,枪头至EP管底部吸取50μl菌液在自制的蓝白斑LB琼脂平板上涂布均匀，将平皿在37℃倒置培养14h。
(3)挑取可疑白色单菌落，接种于含氨苄的LB肉汤中，37℃振荡培养10h，振荡培养的第5～10h期间均可用Premix Ex TaqTM热启动酶的PCR反应体系进行菌液PCR鉴定。
Premix Ex TaqTM热启动酶的PCR反应体系：酶12.5μl；F引物和R引物各1μl；RNaseFree Water 8.5μl。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法
<130> 2018
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctttttctc cgaacgccga aatgag 26
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatgaataac ctccaacgag agtcgacg 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctttttcct caccatgcga gtcaac 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatgaataat tcctcgagcc atgctgg 27
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcttttacac ccatggctca gattagag 28
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gatgagtaac acccttctac tggaggc 27

Claims (1)

1.一种新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法，其特征在于，包括步骤：
1)提取新型鸭呼肠孤病毒尿囊液的总RNA；
2)采用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit试剂盒对步骤1)提取的总RNA进行克隆，其中使用的特异性引物包括L1引物对、L2引物对和L3引物对中的任意一对，所述L1引物对包括L1-F引物和L1-R引物，所述L2引物对包括L2-F引物和L2-R引物，所述L3引物对包括L3-F引物和L3-R引物，各引物的序列分别如SEQ ID №1～6所示。
CN201810002793.9A 2018-01-02 2018-01-02 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法 Pending CN108265067A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810002793.9A CN108265067A (zh) 2018-01-02 2018-01-02 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810002793.9A CN108265067A (zh) 2018-01-02 2018-01-02 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108265067A true CN108265067A (zh) 2018-07-10

Family

ID=62773257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810002793.9A Pending CN108265067A (zh) 2018-01-02 2018-01-02 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108265067A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113355460A (zh) * 2021-06-18 2021-09-07 广东省农业科学院动物卫生研究所 用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1566334A (zh) * 2003-07-08 2005-01-19 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 新的呼肠病毒、其抗体、疫苗及它们的用途
CN1565628A (zh) * 2003-07-08 2005-01-19 中国人民解放军军事医学科学院仪器测试分析中心 呼肠病毒基因组及其编码蛋白质在sars相关的研究中的用途
CN102675469A (zh) * 2012-03-08 2012-09-19 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 新型鸭呼肠孤病毒重组σB(SigmaB)蛋白抗原、制备方法及应用
CN103451157A (zh) * 2013-07-12 2013-12-18 广东温氏食品集团股份有限公司 一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法
CN103642758A (zh) * 2013-11-06 2014-03-19 中国农业科学院上海兽医研究所 表达新型鸭呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建方法
CN103773899A (zh) * 2014-01-26 2014-05-07 广西壮族自治区兽医研究所 鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒
CN103966359A (zh) * 2014-04-29 2014-08-06 浙江省农业科学院 番鸭呼肠孤病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法
CN105695629A (zh) * 2016-03-10 2016-06-22 浙江省农业科学院 鉴别基因i型与ii型鸭呼肠孤病毒的引物及方法
CN106676200A (zh) * 2017-01-17 2017-05-17 佛山科学技术学院 一种rt‑lamp核酸试纸条试剂盒及应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1566334A (zh) * 2003-07-08 2005-01-19 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 新的呼肠病毒、其抗体、疫苗及它们的用途
CN1565628A (zh) * 2003-07-08 2005-01-19 中国人民解放军军事医学科学院仪器测试分析中心 呼肠病毒基因组及其编码蛋白质在sars相关的研究中的用途
CN102675469A (zh) * 2012-03-08 2012-09-19 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 新型鸭呼肠孤病毒重组σB(SigmaB)蛋白抗原、制备方法及应用
CN103451157A (zh) * 2013-07-12 2013-12-18 广东温氏食品集团股份有限公司 一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法
CN103642758A (zh) * 2013-11-06 2014-03-19 中国农业科学院上海兽医研究所 表达新型鸭呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建方法
CN103773899A (zh) * 2014-01-26 2014-05-07 广西壮族自治区兽医研究所 鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒
CN103966359A (zh) * 2014-04-29 2014-08-06 浙江省农业科学院 番鸭呼肠孤病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法
CN105695629A (zh) * 2016-03-10 2016-06-22 浙江省农业科学院 鉴别基因i型与ii型鸭呼肠孤病毒的引物及方法
CN106676200A (zh) * 2017-01-17 2017-05-17 佛山科学技术学院 一种rt‑lamp核酸试纸条试剂盒及应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN,S.Y.ET AL.: "ACCESSION NO:KC312700-KC312702,Duck reovirus NP03/CHN/2009 segment L1(L2/L3), complete sequence", 《GENBANK》 *
党娟: "禽呼肠孤病毒L2基因的克隆与序列分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
李君文 等: "《当代生物医学研究进展》", 31 January 2000 *
许丰 等: "番鸭呼肠孤病毒L2基因的序列分析", 《中国兽医杂志》 *
郝瑞峰: "禽呼肠孤病毒L1和L3基因的克隆与序列分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113355460A (zh) * 2021-06-18 2021-09-07 广东省农业科学院动物卫生研究所 用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用
CN113355460B (zh) * 2021-06-18 2022-11-15 广东省农业科学院动物卫生研究所 用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106544351A (zh) CRISPR‑Cas9体外敲除耐药基因mcr‑1的方法及其专用细胞穿透肽
RU2008125815A (ru) Теломеразная обратная транскриптаза птиц
CN105647943B (zh) 天山雪莲细胞鲨烯合酶基因SiSQS及其编码的产物和应用
CN103589743A (zh) Gibson组装载体及其制备方法和应用
CN106399356A (zh) 一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用
WO2014205882A1 (zh) 一种高保真dna聚合酶及其制备和应用
CN105602972B (zh) 基于CRISPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法
CN108265067A (zh) 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法
CN116855529B (zh) OsbHLH186基因在改良水稻粒型中的应用
EP4165177A1 (en) Enzymes with ruvc domains
CN114457071B (zh) 一种古菌和细菌中通用的rna型毒素及其相关生物材料
WO2023076952A1 (en) Enzymes with hepn domains
WO2023028348A1 (en) Enzymes with ruvc domains
Nüesch et al. Proteins specifically binding to the 3′ untranslated region of hepatitis A virus RNA in persistently infected cells
CN112501199B (zh) 甜瓜蚜传黄化病毒侵染性克隆重组载体
CN105294845B (zh) 大麦抗叶锈病蛋白及其编码基因与应用
CN102676572A (zh) 植物抗病相关蛋白xa5PG1及其编码基因和应用
Glazunova et al. Promoter islands in the genome of E. coli: comparative analysis against AT-rich sequences
CN105695472B (zh) 一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法
WO2017214940A1 (zh) 特异促进Cplx2基因高表达的慢病毒表达载体及其应用
CN114540351B (zh) 靶向肺炎克雷伯菌MdtABC外排泵的sRNA及在制备四环素类抗生素耐药株中的应用
KR102129584B1 (ko) 목적 유전자를 선형 벡터에 삽입하는 방법
WO2020135549A1 (zh) 诱导质粒拷贝数增加的培养基及其应用
CN107384950B (zh) 一种产生三基因片段dna融合方法及应用
CN108048457B (zh) 一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180710