CN108265067A - 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法 - Google Patents
新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108265067A CN108265067A CN201810002793.9A CN201810002793A CN108265067A CN 108265067 A CN108265067 A CN 108265067A CN 201810002793 A CN201810002793 A CN 201810002793A CN 108265067 A CN108265067 A CN 108265067A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primers
- primer pairs
- primer
- duck reovirus
- novel duck
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12211—Orthoreovirus, e.g. mammalian orthoreovirus
- C12N2720/12222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法,包括步骤:1)以Trizol试剂提取新型鸭呼肠孤病毒尿囊液的总RNA;2)采用PrimeScriptTM One Step RT‑PCR Kit试剂盒对步骤1)提取的总RNA进行克隆,其中使用的特异性引物包括L1引物对、L2引物对和L3引物对中的任意一对,所述L1引物对包括L1‑F引物和L1‑R引物,所述L2引物对包括L2‑F引物和L2‑R引物,所述L3引物对包括L3‑F引物和L3‑R引物。本发明的有益效果是:建立一步法扩增NDRV的L组全长基因序列的RT‑PCR体系,避免了常规PCR扩增后还需对基因片段克隆、连接、多次测序等增加繁杂工作。全长的扩增,亦为NDRV L组编码的蛋白研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域,特别涉及一种新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法。
背景技术
“新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)”是自2005年在福建、浙江等省突发的新的重大疫病,发病率5%~32.5%,病死率差异较大,为4%~20%,鸭日龄愈小,发病率、病死率愈高,该病主要引起肝脏不同程度点/斑块状出血和坏死、脾脏肿大坏死、心脏和法氏囊出血等。
NDRV为分节段的ds RNA正呼肠孤病毒,该病毒含有10个RNA节段,编码14种蛋白;总基因组包括3个大基因片段(L1,L2,L3),3个中基因片段(M1,M2,M3)和4个小基因片段(S1,S2,S3,S4)。目前关于S组基因的研究较多,关于L组基因序列研究较少。研究表明NDRVL组基因序列片段长分别为3959bp,3830bp,3907bp,分别编码λA蛋白(1294氨基酸),λB蛋白(1260氨基酸),λC蛋白(1286氨基酸);λA是内衣壳的主要结构之一,λB蛋白是内衣壳的次要成分,而λC蛋白是五聚体蛋白,能贯穿病毒的核心与外衣壳,具有多种功能。
常规PCR反应只适合扩增3kb以内的基因片段,不适用于长片段的扩增,对于长片段基因序列,一般选择分段设计引物以扩增目的序列,为后续目的基因片段克隆、连接、多次测序等增加繁杂工作。
发明内容
本发明旨在提供3对扩增NDRV的L组基因全长特异性引物的序列,有效减少了后续目的基因片段克隆、连接、多次测序等繁杂工作。
本发明所采取的技术方案是:
一种新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法,包括步骤:
1)提取新型鸭呼肠孤病毒尿囊液的总RNA;
2)采用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit试剂盒对步骤1)提取的总RNA进行克隆,其中使用的特异性引物包括L1引物对、L2引物对和L3引物对中的任意一对,所述L1引物对包括L1-F引物和L1-R引物,所述L2引物对包括L2-F引物和L2-R引物,所述L3引物对包括L3-F引物和L3-R引物,各引物的序列分别如表1所示。
表1 NDRV的L组基因特异性扩增引物
上述试剂盒反应体系包括:
运行程序为:50℃30min;94℃变性3min;98℃10s,68℃4min做35个循环;72℃再延伸10min。
本发明的有益效果是:建立一步法扩增NDRV的L组全长基因序列的RT-PCR体系,避免了常规PCR扩增后还需对基因片段克隆、连接、多次测序等增加繁杂工作。全长的扩增,亦为NDRV L组编码的蛋白研究奠定基础。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法
1)以Trizol试剂提取新型鸭呼肠孤病毒尿囊液的总RNA;
2)采用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit试剂盒对步骤1)提取的总RNA进行克隆,其中使用的特异性引物包括L1引物对、L2引物对和L3引物对中的任意一对,所述L1引物对包括L1-F引物和L1-R引物,所述L2引物对包括L2-F引物和L2-R引物,所述L3引物对包括L3-F引物和L3-R引物。
试剂盒反应体系25μl,包括:
运行程序为:50℃30min;94℃变性3min;98℃10s,68℃4min做35个循环;72℃再延伸10min。
实施例2:新型鸭呼肠孤病毒L组基因的鉴定
(1)将实施例1的反应体系扩大到50μl,通过胶回收试剂盒得到纯化的目的基因片段。
使用pMD18-T载体连接试剂盒的反应体系10μl:纯化产物4.5μl,2×LigaseBuffer(Ligation Solution)5μl,pMD18-T载体0.5μl。在冰盒上操作,将以上各种反应试剂加入一个灭菌的PCR管,混匀后,16℃作用4h,继续4℃静置过夜。
(2)将上述液体转入100μl DH5α感受态细胞,轻轻混匀,冰浴30min,42℃水浴热激90s,再迅速放回冰上10min,加入500μl新鲜LB液体培养基,37℃230r/min振荡培养60min后,枪头至EP管底部吸取50μl菌液在自制的蓝白斑LB琼脂平板上涂布均匀,将平皿在37℃倒置培养14h。
(3)挑取可疑白色单菌落,接种于含氨苄的LB肉汤中,37℃振荡培养10h,振荡培养的第5~10h期间均可用Premix Ex TaqTM热启动酶的PCR反应体系进行菌液PCR鉴定。
Premix Ex TaqTM热启动酶的PCR反应体系:酶12.5μl;F引物和R引物各1μl;RNaseFree Water 8.5μl。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法
<130> 2018
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctttttctc cgaacgccga aatgag 26
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatgaataac ctccaacgag agtcgacg 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctttttcct caccatgcga gtcaac 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatgaataat tcctcgagcc atgctgg 27
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcttttacac ccatggctca gattagag 28
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gatgagtaac acccttctac tggaggc 27
Claims (1)
1.一种新型鸭呼肠孤病毒L组基因的克隆方法,其特征在于,包括步骤:
1)提取新型鸭呼肠孤病毒尿囊液的总RNA;
2)采用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit试剂盒对步骤1)提取的总RNA进行克隆,其中使用的特异性引物包括L1引物对、L2引物对和L3引物对中的任意一对,所述L1引物对包括L1-F引物和L1-R引物,所述L2引物对包括L2-F引物和L2-R引物,所述L3引物对包括L3-F引物和L3-R引物,各引物的序列分别如SEQ ID №1~6所示。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810002793.9A CN108265067A (zh) | 2018-01-02 | 2018-01-02 | 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810002793.9A CN108265067A (zh) | 2018-01-02 | 2018-01-02 | 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108265067A true CN108265067A (zh) | 2018-07-10 |
Family
ID=62773257
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810002793.9A Pending CN108265067A (zh) | 2018-01-02 | 2018-01-02 | 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108265067A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113355460A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-07 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1566334A (zh) * | 2003-07-08 | 2005-01-19 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 新的呼肠病毒、其抗体、疫苗及它们的用途 |
CN1565628A (zh) * | 2003-07-08 | 2005-01-19 | 中国人民解放军军事医学科学院仪器测试分析中心 | 呼肠病毒基因组及其编码蛋白质在sars相关的研究中的用途 |
CN102675469A (zh) * | 2012-03-08 | 2012-09-19 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 新型鸭呼肠孤病毒重组σB(SigmaB)蛋白抗原、制备方法及应用 |
CN103451157A (zh) * | 2013-07-12 | 2013-12-18 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法 |
CN103642758A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-03-19 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 表达新型鸭呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建方法 |
CN103773899A (zh) * | 2014-01-26 | 2014-05-07 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒 |
CN103966359A (zh) * | 2014-04-29 | 2014-08-06 | 浙江省农业科学院 | 番鸭呼肠孤病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法 |
CN105695629A (zh) * | 2016-03-10 | 2016-06-22 | 浙江省农业科学院 | 鉴别基因i型与ii型鸭呼肠孤病毒的引物及方法 |
CN106676200A (zh) * | 2017-01-17 | 2017-05-17 | 佛山科学技术学院 | 一种rt‑lamp核酸试纸条试剂盒及应用 |
-
2018
- 2018-01-02 CN CN201810002793.9A patent/CN108265067A/zh active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1566334A (zh) * | 2003-07-08 | 2005-01-19 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 新的呼肠病毒、其抗体、疫苗及它们的用途 |
CN1565628A (zh) * | 2003-07-08 | 2005-01-19 | 中国人民解放军军事医学科学院仪器测试分析中心 | 呼肠病毒基因组及其编码蛋白质在sars相关的研究中的用途 |
CN102675469A (zh) * | 2012-03-08 | 2012-09-19 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 新型鸭呼肠孤病毒重组σB(SigmaB)蛋白抗原、制备方法及应用 |
CN103451157A (zh) * | 2013-07-12 | 2013-12-18 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法 |
CN103642758A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-03-19 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 表达新型鸭呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建方法 |
CN103773899A (zh) * | 2014-01-26 | 2014-05-07 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒 |
CN103966359A (zh) * | 2014-04-29 | 2014-08-06 | 浙江省农业科学院 | 番鸭呼肠孤病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法 |
CN105695629A (zh) * | 2016-03-10 | 2016-06-22 | 浙江省农业科学院 | 鉴别基因i型与ii型鸭呼肠孤病毒的引物及方法 |
CN106676200A (zh) * | 2017-01-17 | 2017-05-17 | 佛山科学技术学院 | 一种rt‑lamp核酸试纸条试剂盒及应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
CHEN,S.Y.ET AL.: "ACCESSION NO:KC312700-KC312702,Duck reovirus NP03/CHN/2009 segment L1(L2/L3), complete sequence", 《GENBANK》 * |
党娟: "禽呼肠孤病毒L2基因的克隆与序列分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
李君文 等: "《当代生物医学研究进展》", 31 January 2000 * |
许丰 等: "番鸭呼肠孤病毒L2基因的序列分析", 《中国兽医杂志》 * |
郝瑞峰: "禽呼肠孤病毒L1和L3基因的克隆与序列分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113355460A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-07 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用 |
CN113355460B (zh) * | 2021-06-18 | 2022-11-15 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106544351A (zh) | CRISPR‑Cas9体外敲除耐药基因mcr‑1的方法及其专用细胞穿透肽 | |
RU2008125815A (ru) | Теломеразная обратная транскриптаза птиц | |
CN105647943B (zh) | 天山雪莲细胞鲨烯合酶基因SiSQS及其编码的产物和应用 | |
CN103589743A (zh) | Gibson组装载体及其制备方法和应用 | |
CN106399356A (zh) | 一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用 | |
WO2014205882A1 (zh) | 一种高保真dna聚合酶及其制备和应用 | |
CN105602972B (zh) | 基于CRISPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法 | |
CN108265067A (zh) | 新型鸭呼肠孤病毒l组基因的克隆方法 | |
CN116855529B (zh) | OsbHLH186基因在改良水稻粒型中的应用 | |
EP4165177A1 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
CN114457071B (zh) | 一种古菌和细菌中通用的rna型毒素及其相关生物材料 | |
WO2023076952A1 (en) | Enzymes with hepn domains | |
WO2023028348A1 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
Nüesch et al. | Proteins specifically binding to the 3′ untranslated region of hepatitis A virus RNA in persistently infected cells | |
CN112501199B (zh) | 甜瓜蚜传黄化病毒侵染性克隆重组载体 | |
CN105294845B (zh) | 大麦抗叶锈病蛋白及其编码基因与应用 | |
CN102676572A (zh) | 植物抗病相关蛋白xa5PG1及其编码基因和应用 | |
Glazunova et al. | Promoter islands in the genome of E. coli: comparative analysis against AT-rich sequences | |
CN105695472B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法 | |
WO2017214940A1 (zh) | 特异促进Cplx2基因高表达的慢病毒表达载体及其应用 | |
CN114540351B (zh) | 靶向肺炎克雷伯菌MdtABC外排泵的sRNA及在制备四环素类抗生素耐药株中的应用 | |
KR102129584B1 (ko) | 목적 유전자를 선형 벡터에 삽입하는 방법 | |
WO2020135549A1 (zh) | 诱导质粒拷贝数增加的培养基及其应用 | |
CN107384950B (zh) | 一种产生三基因片段dna融合方法及应用 | |
CN108048457B (zh) | 一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180710 |