CN102533769B - 假单胞菌低温启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种假单胞菌低温启动子及其应用，具体涉及一种分离自云南梅里雪山明永冰川的耐低温假单胞菌Pseudomonassp.MY1402的低温启动子的序列及应用，本发明采用构建启动子探针质粒和建基因组文库的方法筛选，含有该启动子片段的重组质粒可以在原核细胞中、在低温下启动目标基因的表达；该启动子在不同原核生物中具有通用性，可用于构建在低温下多个原核生物之间能够通用的表达载体，以省却在不同原核生物中表达外源基因需要更换载体的麻烦，提高分子生物学实验效率；该启动子还能够用于在低温下启动低温蛋白和低温酶基因的表达，提高低温蛋白和低温酶的生产效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一个来源于低温假单胞菌启动子及其原核表达载体和应用。
背景技术
启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导RNA聚合酶同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。在微生物的异源蛋白表达中，启动子是影响异源表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。
当前，由于尚缺乏低温蛋白的高效表达***，使得低温蛋白尤其是低温酶的生产远远不能满足科学研究及工业应用的需要。目前常用的蛋白表达***多以大肠杆菌和酵母菌等中温菌作为宿主细胞，但由于大部分的低温酶热稳定性差，即使在中温宿主细胞中大量表达，也常会因热变性而失活。因此以嗜冷菌为宿主菌、以嗜冷菌启动子为启动子构建表达载体的方法越来越引起人们的重视。
低温启动子的研究属于刚刚起步阶段，目前仅有Duilio等人从分离自南极的海洋低温假交替单胞菌属菌株Pseudoalteromonashaloplanktis TAC125中，通过构建文库的方式，利用启动子探针质粒(Pseudoalteromonashaloplanktis TAC125为宿主细胞)，筛选到了能在4℃启动转录的低温启动子。对这些启动子的结构和功能的解析，为我们认识低温启动子在低温下启动的机制提供了生动的材料。
但是由于低温启动子的发展才刚刚起步，文献及资料相对较少，在当前还未形成完整的体系和理论。低温启动子在结构上不能与常温启动子明显区分开。一些具有低温启动活性的低温启动子的各功能调控区与常温启动子相同或相似。而还有一些具有低温启动活性的低温启动子则没有明显的保守结构序列，无法以常温启动子的保守序列为标准去确定其?10 区、?35区等低温启动子特定的各功能区及保守结构序列。因此大量分离低温启动子并分析其序列已成为当务之急。
此外，以低温菌为宿主细胞、利用来源于低温菌的启动子构建低温蛋白表达***最近已有部分报道，研究表明在常温蛋白表达***所难以表达的蛋白，包括来源于常温菌的甲苯、二甲苯单加氧酶，来源于人类的神经生长因子在这些表达***中均获得了有效表达。尤其值得关注的是在低温蛋白表达***表达的神经生长因子不但没有形成包涵体，而且准确定位于细胞的周质空间，充分体现了低温蛋白表达***的优越性，为异源低温蛋白和常温蛋白的高效表达提供了新的有效方法，通过构建以低温菌为宿主的低温蛋白表达***是解决高效、大量生产热不稳定蛋白质的一条可行之路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA分子，其来源于低温假单胞菌Pseudomonas sp. MY1402，并具有下列核苷酸序列之一：
a、具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
b、可与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
c、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加、修饰的核苷酸序列；
d、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。
本发明中所述DNA分子具有启动子活性，能够使目的基因在大肠杆菌和假单胞菌等原核细胞中表达，特别是在低温下能够高效表达。
本发明另一目的是提供一种原核表达载体，该载体含有前文所述的DNA分子。
本发明另一目的是提供一种原核宿主细胞，该细胞含有前文所述的DNA分子或原核表达载体。
本发明另一目的是将DNA分子应用于原核异源表达***中。
本发明中所述原核异源表达***为常温表达***或低温表达***。
在本发明中，将SEQ ID NO.1所示的启动子序列称为p1。
在本发明中，无启动子探针质粒称为pUE，将含有SEQ ID NO.1所示的启动子序列的探针质粒称为pUE1。
菌株Pseudomonas sp. MY1402由本实验室从梅里雪山明永冰川地区土样中分离得到。
本发明通过构建启动子探针质粒筛选到高活性的低温启动子核苷酸片段，利用已分离出的具有高活性的原核生物启动子序列构建重组表达载体，并在低温下异源表达目的基因，该启动子和目的蛋白的结构基因连接，且该基因受启动子调控，结果目的基因在启动子的调控下高效表达，并且该启动子在15℃的低温下也具有较高的启动活性；该启动子在不同原核生物中具有通用性，可用于构建在低温下多个原核生物之间能够通用的表达载体，以省却在不同原核生物中表达外源基因需要更换载体的麻烦，提高分子生物学实验效率；该启动子还能够用于在低温下启动低温蛋白和低温酶基因的表达，提高低温蛋白和低温酶的生产效率。
本发明能够为发展和完善低温启动子的基础研究提供一些材料和借鉴，并且能够为蛋白（酶）特别是低温蛋白（酶）的工业生产提供新异源表达载体及启动子序列，本发明可以应用于分子生物学实验和低温蛋白（酶）的生产。
附图说明
图1为本发明重组探针质粒构建示意图。
图2为本发明中菌株MY1402基因组DNA的电泳示意图，其中M为DL2,000 marker，1是菌株MY1402基因组DNA。
图3为本发明中Sau3A I酶切MY1402基因组的回收结果示意图，其中M为DL2,000 marker，1是用限制性内切酶BamH I和细菌用碱性磷酸酶（BAP）处理探针质粒pUE后的回收结果示意图，2是用限制性内切酶Sau3A I处理Pseudomonas sp.MY1402基因组DNA 后的回收结果示意图。
图4为本发明中BamH I酶切pUE的回收结果示意图，其中M是DL2,000 marker，1是小量酶切电泳图，2是用限制性内切酶BamH I处理探针质粒pUE的回收结果示意图。
图5为本发明中pUE***片段菌落PCR结果示意图，其中M是DL5,000 marker，1是pUE，2是DH5α/pUE1。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：启动子的筛选
1、可能的启动子片段的制备：提取假单胞菌属Pseudomonas sp. MY1402菌株的基因组DNA，用酶Sau3A I部分酶切，同时回收大小为100~2,000 个碱基的不同片段。
提取菌株MY1402的基因组，最终提取结果见图2，经测定，所提取的MY1402基因组的OD260=0.0478，OD280=0.0267，则MY1402基因组的浓度为50×OD600=50×0.0478×100=239μg/ml=239ng/μl，OD260/ OD280=1.79，纯度满足使用的要求；
酶Sau3A I部分酶切Pseudomonas sp.MY1402基因组的具体方法：
把酶Sau3A I直接稀释至0.125 u/μl，通过限制酶切时间来获得所需要的片段，这样实施例的可控性增强，具体的反应体系和时间如下：
| MY1402 基因组 DNA | 80 μl（19.12 μg） |
| 酶Sau3AⅠ | 8 μl（0.5 U） |
| 10×H 缓冲液 | 10 μl |
| dd H2O | 添加至 100 μl |
混匀后，10 μl/PCR管分装成10管，在37℃反应3 小时，然后同时回收片段大小在100~2,000 个碱基大小的不同片段，Sau3A I酶切MY1402基因组的回收结果见图3。
2、探针质粒pUE大片段的制备：用限制性内切酶BamH I完全酶切探针质粒pUE，回收后用细菌用碱性磷酸酶（BAP）处理，酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，最终制备结果见图4。
3、用T4 DNA 连接酶连接载体大片段和可能的启动子片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α。
连接体系如下：
| pUE/BamH I/BAP | 1 μl（0.2 μg） |
| MY1402 基因组 DNA/Sau3A I | 10 μl（0.1 μg） |
| T4 DNA连接酶 | 1 μl（350U） |
| 10×T4 DNA 连接酶缓冲液 | 2 μl |
| dd H2O | 添加至20 μl |
4、筛选：采用直接筛选法，即在连接产物转化大肠杆菌DH5α后吸取100 μl培养物涂布LB/Kan固体培养基，置于37℃培养7天。
5、对筛选到的重组子进行菌落PCR鉴定，对具有***片段的菌株进行扩培并抽提质粒，用所提质粒重新转化大肠杆菌DH5α，确认其确实有启动子活性后进行测序。
5.1 菌落PCR鉴定：此处设计一对专用引物f3、r3专门用于对***片段进行鉴定和测序；引物序列为：上游引物f3 5’-CTTTGACGTATGCGGTGTGAAAT-3’，下游引物r3
5’-AGATGGTCAGACTAAACTGGCTG-3’；通过鉴定发现有***片段，直接筛选法筛选到的1个有***片段的单菌落，在此将直接筛选法从载体：片段为1:10的文库中筛选到的单菌落中的重组质粒命名为pUE1，***片段命名为p1。含有p1***片段的pUE1菌落PCR结果见图5。
5.2启动子活性的鉴定：抽提重组质粒，将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中，吸取100 μl培养物分别涂布于LB/Amp和LB/Kan固体培养基，37℃倒置培养12 小时。观察发现转化子可在LB/Kan固体培养基上生长。至此，可确认***片段p1确实具有启动子活性。
6、测序：测序用引物f3、r3，测序结果显示p1长为145 个碱基，序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2：p1启动子活性的验证
（1）将重组质粒pUE1电转化菌株MY1402，电击电压为1800v，电击完毕，立即往电击杯中加入500 μl预冷的LB液体培养基，将所有液体移至一个1.5 ml离心管中，15℃ 180 转/分振荡培养1 小时，吸取100 μl培养物于LB/Kan固体培养基中，用灭菌涂布棒涂干，用胶带将平板封好，28℃倒置培养72 小时。
（2）把长出的单菌落接种到LB/Kan液体培养基中，分别在15℃和28℃两个摇床中以180 转/分的转速振荡培养，在24 小时取样，测定在600纳米的吸光值。为了消除试管在培养过程中由于倾斜角度等的不同而造成的不均一性，在振荡培养时，把所有试管***到试管架中，试管架水平放置，以尽量使结果真实可靠。
（3）结果见下表：
表1 28℃180转/分培养24 小时后不同卡那霉素浓度培养菌液OD值
表2 ：15℃180转/分培养24 小时后不同卡那霉素浓度培养菌液OD值
由表1的数据可知，含有p1启动子片段的重组质粒转化入Pseudomonas sp. MY1402低温假单胞菌后，使原本没有卡那霉素抗性的宿主菌Pseudomonas sp. MY1402具有了卡那霉素抗性，并且能够在卡那霉素浓度0~250μg/ml的范围内生长，说明p1启动子片段在28℃的条件下具有启动子活性。
由表2的数据可知，含有具有p1启动子片段的重组质粒的Pseudomonas sp. MY1402在15℃的培养条件时，使原本没有卡那霉素抗性的宿主菌Pseudomonas sp. MY1402也具有了卡那霉素抗性。并且能够在卡那霉素浓度0~300μg/ml的范围内生长，说明p1启动子片段在低温15℃的条件下仍具有启动子活性。
由表1和表2的数据对比可知，当卡那霉素浓度在50μg/ml -150μg/ml 之间时宿主菌Pseudomonas sp. MY1402在28℃时要比15℃条件下的细菌存活数多，但是相差不大。说明p1启动子在卡那霉素浓度在50μg/ml -150μg/ml 之间时28℃与15℃条件下的启动活性相当，但是当卡那霉素浓在200μg/ml -300μg/ml的选择压力下，含有p1启动子片段的重组质粒的Pseudomonas sp. MY1402在15℃要比28℃条件下的细菌存活多，含有更多的细菌数，说明当卡那霉素浓在200μg/ml -300μg/ml时，p1启动子在15℃的低温下的启动活性与28℃条件下的活性更高，由此更说明p1启动子具有低温启动活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明理工大学
<120> 假单胞菌低温启动子及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 145
<212> DNA
<213> Pseudomonas sp.MY1402
<400> 1
aaagcaataa aaccactcaa ggctattttt agcgccatcg ctgtatccaa 50
cctgttaaaa gaaagttgcg gctagcatgc cgcagtatta cactcacaaa 100
aactgaataa tactcatcaa gttcatcacg aaaagagaag gctat 145
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctttgacgta tgcggtgtga aat 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agatggtcag actaaactgg ctg 23
Claims (4)
1.一种DNA分子，来源于低温假单胞菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA分子具有启动子活性。
2.一种含有权利要求1所述DNA分子的原核表达载体。
3.一种原核宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求1所述的DNA分子或权利要求2所述的表达载体。
4.权利要求1所述DNA分子在假单胞菌或大肠杆菌表达***中的应用。
Priority Applications (1)
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