CN105695423B - 表达传染性法氏囊病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用，属于医学或兽医学技术领域。本发明利用重组克隆技术，将包含传染性法氏囊病毒VP2基因和CAG启动子序列的基因片段CAG‑VP2***到鸡马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的US2基因内部，构建获得在US2基因内部***CAG‑VP2表达框的重组粘粒，由其拯救获得表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株。研究表明，本发明获得的疫苗株具有与亲本毒814疫苗株同等的体外复制能力以及良好的遗传稳定性，并且能够同时抵抗MDV超强毒株以及IBDV超强毒株的攻击。由此可见，本发明获得的表达IBDV VP2基因的重组MDV疫苗株可以用于制备预防或治疗传染性法氏囊病和鸡马立克氏病的药物。

Description

表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫 苗株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用，特别涉及一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用，本发明属于医学或兽医学技术领域。
背景技术
我国是一个养禽大国。鸡传染性法氏囊病和马立克氏病是危害我国养禽业健康发展的两种最为重要的免疫抑制性传染病，其广泛流行给我国养禽业带来了巨大的经济损失。
鸡传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种主要危害3-6周龄雏鸡的急性、高度接触性传染病。本病于1957年首发于美国Gumboro地区，被称为“甘布罗病”；由Cosgrove于1962年首先报道，由于死于该病的鸡的肾脏严重肿大，因此也称为“禽肾病”。60年来，该病一直威胁着养禽业的发展。抗原变异、免疫抑制，特别是超强毒株(vvIBDV)的出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽医局(OIE)认为IBD已经成为影响社会经济的重要疾病。IBDV基因组由两个双股RNA节段组成，分别为A节段和B节段。A节段编码的VP2蛋白构成病毒的外衣壳，是IBDV的主要结构蛋白。VP2可以诱导机体产生中和抗体，是IBDV主要的宿主保护性抗原(Heine H G,Boyle,D B.Infectious bursal diseasevirus structural protein VP2expressed by a fowlpox virus recombinant confersprotection against disease in chickens.Arch Virol,1993,131:277-292.)。疫苗免疫是防控vvIBDV的主要手段，但vvIBDV致病性强且不适应细胞培养，疫苗株的获得只能通过将野生vvIBDV在鸡胚或CEF细胞上传代致弱。这种传统的驯化方法费时费力，且结果带有随机性(Gao L,Qi X,Li K,Gao H,Gao Y,Qin L,Wang Y,Wang X.Development of atailored vaccine against challenge with very virulent infectious bursaldisease virus of chickens using reverse genetics.Vaccine 2011,29:5550-5557.)。对于高致病力的、易变异的vvIBDV的防控，特别是突发疫情的防控，开展新型疫苗的快速构建研究迫在眉睫。
马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的一种鸡的传染性肿瘤病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征。马立克氏病是鸡的主要疾病之一，也是国内外50年代以来最受重视的鸡病。MDV属于α-疱疹病毒亚科马立克氏病样病毒属，是一种细胞结合性疱疹病毒，其基因组为线状双股DNA，约为180kb。MDV至少编码103个蛋白质，然而大多数蛋白仍未得到鉴定。MDV包括三种血清型，血清1型病毒具有致瘤性，可进一步分为几个病理型，包括温和型MDV(mMDV)、强毒型MDV(vMDV)、超强毒型MDV(vvMDV)及特超强毒型MDV(vv+MDV)病毒株。鸡的非致瘤病毒分离株和火鸡疱疹病毒分离株分别称作血清2型和3型MDV。目前用于预防MD的疫苗主要是血清1型弱毒疫苗，常用的疫苗株有荷兰的CVI988株和我国的814疫苗株。其中，814疫苗株性状稳定，是一株自然弱毒株，该疫苗株自从上世纪80年代研制成功以来，已安全使用30余年，没有任何不良反应。814疫苗株具有良好的免疫原性，保护效果与CVI988/Rispens株相当。814疫苗株还是我国自主研制的，唯一有效应用的、具有自主产权的MD疫苗。
IBDV和MDV的感染不仅可以造成感染鸡的发病死亡，还可以引起显著的免疫抑制，造成继发感染和其他多种疫苗的免疫失败。两种病毒的混合感染造成的危害更加严重，也增加了防控的难度。疫苗是控制MD和IBD的主要手段，在种鸡群、蛋鸡群中MD疫苗是必须使用的疫苗，肉鸡群中使用该疫苗可以较大幅度地提高养殖效率。目前用于预防IBD的疫苗主要是传统活疫苗和灭活疫苗，但传统疫苗不仅易于受到母源抗体的干扰，而且具有毒力返强和灭活不彻底的安全隐患。同时，现地IBD弱毒疫苗和中等毒力疫苗的广泛使用不仅造成了鸡群的免疫抑制，还加剧了病毒的变异，因此迫切需要研制更加安全有效的新型IBD疫苗。活载体疫苗诱导机体产生的免疫比较广泛，可以同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，是当今和未来疫苗研发的主要方向之一。而且，重组活载体疫苗由于不含有完整的目的病毒，因此相对传统疫苗具有更好的安全性。
重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体，然后把外源基因***其中使之表达的活疫苗。该类疫苗诱导机体产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和细胞免疫，甚至粘膜免疫；更为重要的，活载体疫苗可以同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，起到“一针防多病”的效果，是当今和未来疫苗研发的主要方向之一。研究表明，疱疹病毒基因组较大，可供外源基因***或替换的复制非必需基因多，是一种理想的构建重组活载体疫苗的病毒载体。目前已有大量疱疹病毒活载体疫苗的研究报道，如郭万柱等以PRV闵A株为载体构建了PRV的TK/gE/gI三基因缺失株并获得国家新兽药证书。作为疱疹病毒科的一员，MDV同样是一种良好的活疫苗载体(Tsukamoto K.,Kojima C.,Komori Y.,etal.Protection of chickens against very virulent infectious bursal Diseasevirus(IBDV)and Marek's disease virus(MDV)with a recombinant MDV expressingIBDV VP2.Virology 1999,257:352-362.)。
目前构建MDV重组活载体疫苗主要使用的是同源重组法和细菌人工染色体(BAC)法。其中同源重组法是将外源基因***到带有同源臂的入门质粒中转染病毒感染细胞或与病毒基因组共转染易感细胞，通过细胞中的同源重组过程获得重组病毒。该方法构建过程复杂费时而且效率较低，需要加入筛选标记基因并进行重组病毒的纯化。细菌人工染色体(BAC)法是将完整的MDV基因组***到BAC中并在细菌中对其进行改造。BAC法是建立在同源重组基础上的，同样具有构建过程复杂、周期长的缺点；而且BAC自身序列难以去除，使得后期获得的重组病毒带有不必要的外源基因序列，存在安全隐患。建立一种快捷、高效、安全的MDV活载体疫苗构建平台在当前具有重要的理论意义和应用前景。
本发明发明人在之前的研究中，建立了MDV弱毒疫苗814株多片段粘粒感染性克隆拯救***(公开号为CN104830883A)。在此基础上，本发明发明人在MDV基因组中鉴定出可供外源基因***的复制非必需区，并将IBDV VP2基因***MDV基因组的内部，构建了表达IBDVVP2基因的重组MDV疫苗株，用于免疫无特定病原鸡(SPF鸡)能使SPF鸡产生良好的对抗IBDV的抗体，同时还不影响MDV的免疫效果。
本发明通过利用鸡马立克氏病疫苗814株感染性克隆拯救平台，成功获得表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组MDV 814疫苗株，在国内外尚属首创。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法，本发明构建得到的疫苗株能使动物体产生良好的对抗IBDV的抗体，同时还不影响MDV的免疫效果。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发明人在前期建立的MDV弱毒疫苗株多片段拯救***的基础上，建立了MDV弱毒疫苗814株感染性重组克隆***，以利于外源基因向MDV基因组的***。然后，将IBDVVP2基因表达框架***MDV US2基因中(US2基因是MDV的复制非必需基因，缺失后不影响MDV的复制和致病性)，构建了表达VP2基因的重组MDV疫苗株，研究表明，该疫苗株具有与亲本毒814疫苗株同等的体外复制能力，可以在体外良好的表达VP2基因，并具有良好的遗传稳定性。用该重组病毒对鸡一次免疫后不但能提供与原疫苗株相当的对MDV超强毒株的保护效果，还可以对IBDV超强毒株提供完全的攻毒保护。重组病毒免疫鸡攻毒IBDV超强毒后，能够完全存活，没有任何临床症状，试验鸡法氏囊无萎缩和病变发生。由此可见，本发明获得的表达IBDV VP2基因的重组MDV疫苗株rMDV-VP2可以用于制备预防传染性法氏囊病和鸡马立克氏病的药物。
具体的，本发明的一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，是将包含传染性法氏囊病毒VP2基因和CAG启动子序列的表达框架CAG-VP2***到鸡马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的US2基因内部，获得在US2基因内部***CAG-VP2表达框架的重组粘粒，由其拯救获得表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，其中，US2基因缺失了其中第15至630位的核苷酸，代之以***CAG-VP2表达框架，所述的CAG-VP2表达框架的结构为CMV增强子-鸡β-actin启动子-VP2基因-sv40PolyA。
在本发明中，优选的，所述的CAG-VP2表达框架的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步的，本发明还提出了一种构建所述表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株的方法，包括以下步骤：
(1)构建马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作***
所述***包含5个分别依次含有马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列的重组粘粒，其中所述的马立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因组序列的GeneBank登录号为JF742597，所述***中的5个重组粘粒是通过将马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列与pCC1Fos载体连接后得到的，分别命名为p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5，其中p814-5包含马立克氏病病毒的US2基因，US2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
(2)含有CAG-VP2表达框架的重组突变粘粒p814-5US2VP2的构建
在步骤(1)构建得到的重组粘粒p814-5中的US2基因内部***CAG-VP2表达框架并替换US2基因的第15至630位核苷酸得到含有CAG-VP2表达框架的重组突变粘粒p814-5US2VP2，CAG-VP2表达框架的结构为CMV增强子-鸡β-actin启动子-VP2基因-sv40 PolyA；
(3)表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株的拯救
对得到的重组粘粒p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5US2VP2五个粘粒进行线性化处理，通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染次代CEF，置于37℃培养箱中培养，转染4 h后，弃掉细胞上清，用DMEM将细胞洗一遍；加入2 ml甘油休克液，室温孵育2 min；用DMEM洗涤3次后，加入含10％FBS的DMEM完全培养液培养，休克12 h后，将细胞培养液换为含3％FBS、1％双抗的DMEM继续培养，转染4-5天后盲传2代可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒即为表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，命名为rMDV-VP2。
在本发明中，优选的，含有CAG-VP2表达框架的重组突变粘粒p814-5US2VP2的构建，包括以下步骤：
(1)pKS KanccdB质粒的构建
以R1F和R1R为引物，从pDEST22中扩增得到attR1序列；以P6KanF和p6KanR为引物，从pMOD6中扩增得到卡那霉素抗性基因(Kan)；以ccdBR2F和ccdBR2R为引物，从pDEST22中扩增得到ccdB-attR2基因；分别纯化上述得到的3个DNA片段，并以此3个片段为模板，以R1F和ccdBR2R为引物，扩增得到attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架，将得到的attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架利用XbaI和HindIII酶切位点克隆入pBluescript II KS(+)载体，获得pKSKanccdB；
R1F：GCGTCTAGAGATGATGAAGATACCCCACCA(XbaI)
R1R：GTGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAA
P6KanF：TTGGCAGCATCACCCGACGCACACATCTCAACCATCATCG
P6KanR：ATCTGGCTTTTAGTAAGCCGGATCCACCGAGCTCGAATTCGATGAA
ccdBR2F：GGATCCGGCTTACTAAAAGCCAGAT
ccdBR2R：GCGAAGCTTCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG(HindIII)
(2)带有Kan/ccdB抗性基因的重组突变粘粒p814-5US2KanccdB的构建
以US2hmL和US2hmR为引物从pKS KanccdB中扩增带有同源重组臂的attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架：
US2hmL：5’-ATCTAATTGGTAGCAAGTAGGTCTGTCGAATAACAGCTAATGACTACCGGGGGTGGGTCGAATCAAACAAGTTTGT-3’，
US2hmR：5’-TGGGTGTGCCCATAATCGCCAGAGCTGCAGACCTATTCCGTTTTGCCAAAGCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG-3’；
用Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒将所扩增的片段克隆入p814-5中的US2基因中，替换814株基因组US2基因序列的第15-630位核苷酸序列，代之以attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架，获得重组突变粘粒p814-5US2KanccdB；
(3)pENTR1入门载体的构建
将pENTR-gus质粒中的gus基因删除，替换为BglII-SalI-XbaI-NotI-EcoRI-KpnI-SmaI-SacI-HindIII-BamHI十个酶切位点，获得入门载体，命名为pENTR1；
(4)pCAGGS-VP2表达质粒的构建
用引物VP2F以及VP2R，以质粒pUC57-VP2为模板，扩增获得VP2基因，将纯化后的PCR产物用EcoRI和ClaI酶切，克隆入pCAGGS载体多克隆位点，成功构建得到pCAGGS-VP2，其中VP2基因位于CAG启动子下游，SV40PolyA上游，在pCAGGS载体的1719-1736位核苷酸之间，其中质粒pUC57-VP2是通过将按照鸡密码子优化后的VP2基因克隆入pUC57载体中得到的；
VP2F：5’-TTTGAATTCGCCGCCACCATGACCAACCTGCAGGACCAGAC-3’
VP2R：5’-TTTATCGATTCAGCGGCGCAGGGCGCGGATGATGTCC-3’
(5)VP2入门表达质粒pENTR1-VP2的构建
将步骤(4)构建的VP2表达质粒pCAGGS-VP2用SalI和HindIII进行双酶切，酶切产物回收后获得VP2表达框架CAG-VP2，将获得的VP2表达框架CAG-VP2通过SalI和HindIII酶切位点克隆入pENTR1入门载体，获得VP2入门表达质粒pENTR1-VP2；
(6)含有VP2表达框架的重组突变粘粒p814VP2的构建
将上述VP2入门表达质粒pENTR1-VP2与重组突变粘粒p814-5US2KanccdB利用ClonaseTM II Enzyme Mix进行LR反应，使上述重组突变粘粒中的Kan-ccdB表达框架替换为pENTR1-VP2质粒中的VP2表达框架，从而获得在马立克氏病病毒的US2基因中***VP2表达框架的重组粘粒p814-5US2VP2。
在本发明中，优选的，所述的CAG-VP2表达框架的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
再进一步的，本发明还提出了所述的表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株在制备预防和治疗鸡马立克氏病和鸡传染性法氏囊病药物中的用途。
本发明以MDV血清1型弱毒疫苗814株为载体，构建了表达IBDV VP2基因的重组病毒。与其他病毒载体相比，814疫苗株载体具有无可比拟的优势：1)814疫苗株是目前应用最广泛的血清1型MDV疫苗株之一，与CVI988/Rispens株免疫效果相当，能对目前流行的MDV特超强毒(vv+MDV)提供良好的保护，免疫效果显著强于HVT疫苗；2)814疫苗株是一株自然弱毒株，性状稳定，自上世纪80年代研制成功以来，安全适应30余年，无任何不良反应；3)作为疱疹病毒科成员，MDV具有持续性感染的特性，有利于在体内长期表达外源抗原，激发机体产生较强的免疫应答反应；4)IBDV感染后果的严重程度与鸡的年龄有很大关系，3-6周龄的雏鸡对感染的易感性最高，而MDV疫苗必须在1日龄进行免疫接种，因此有助于尽早帮助鸡体建立针对IBDV的早期主动免疫应答反应；5)MDV为专一的细胞结合型病毒，通过细胞与细胞之间的直接接触进行传播，因此受母源抗体干扰较小。
综上，本发明构建的重组疫苗克服了现有IBD弱毒疫苗的不足，安全有效，生产成本低，可以同时有效预防IBD和MD两种重要的禽类传染病。该重组疫苗符合IBD流行规律和市场需求，可望在全国推广，并出口创汇，能够产生巨大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为MDV基因组DNA片段脉冲场电泳图；
其中，M，低范围PFG Marker；1，MDV基因组DNA；2，基因组DNA剪切后片段；3，回收后35-48kb DNA；
图2为pCC1Fos载体图谱；
图3为拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒在CEF细胞上产生的细胞病变；
其中，rMDV：MDV疫苗株拯救毒；MDV：原MDV疫苗株病毒；Mock：正常未接毒细胞；
图4为拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒基因组DNA的HindIII酶切图谱；
其中，M1：低范围PFG Marker；M2：15kb DNA分子量标记；rMDV：MDV疫苗株拯救毒；MDV：原MDV疫苗株病毒；
图5为pKS KanccdB质粒图谱；
图6为重组突变粘粒p814-5US2KanccdB结构示意图；
图7为入门载体pENTR1图谱；
图8为目的基因表达质粒pCAGGS-VP2图谱；
图9为入门表达质粒pENTR1-VP2图谱；
图10为在MDV疫苗株814基因组US2基因内部***VP2表达框架的重组突变粘粒p814-5US2VP2(p814VP2)图谱；
图11为重组病毒和原MDV疫苗株病毒在CEF细胞上产生的细胞病变；
其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组MDV；MDV：原MDV疫苗株病毒；Mock：正常未接毒细胞；
图12为重组病毒和原MDV疫苗株病毒在CEF细胞上形成的病毒粒子；
其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组MDV；MDV：原MDV疫苗株病毒；Mock：正常未接毒细胞；
图13为重组病毒和原MDV疫苗株病毒基因组DNA PCR鉴定；
其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组MDV；MDV：原MDV疫苗株病毒；DL2000：2000分子量Marker；DL15000:15000bp分子量Marker；
图14为间接免疫荧光试验检测目的基因的VP2的表达情况；
其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组MDV；MDV：原MDV疫苗株病毒；Mock：正常未接毒细胞；
图15为Western blot检测目的基因VP2的表达情况；
其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组MDV；MDV：原MDV疫苗株病毒；CEF：正常未接毒CEF细胞；
图16为PCR法检测外源基因VP2在重组病毒传代中的遗传稳定情况；
其中，rMDV-VP2_P5，P10，P20分别为第5、10、20代重组病毒；MDV：原MDV疫苗株病毒；DL15000:15000bp分子量Marker；
图17为间接免疫荧光试验检测外源基因VP2在重组病毒传代中的稳定表达情况；
其中，rMDV-VP2_P5，P10，P20分别为第5、10、20代重组病毒；Mock：正常未接毒细胞；
图18为重组病毒rMDV-VP2和亲本毒MDV在CEF上的复制曲线；其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组病毒；MDV：亲本MDV病毒；
图19为重组病毒rMDV-VP2和亲本毒MDV在免疫后7天羽髓中的病毒载量；
其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组病毒；MDV：亲本MDV病毒；Mock：未免疫空白对照；
图20为重组病毒rMDV-VP2和亲本毒MDV免疫后ELISA抗体和中和抗体检测；
其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组病毒；MDV：亲本MDV病毒；Mock：正常对照鸡；
图21为重组病毒rMDV-VP2和亲本毒MDV免疫鸡攻毒IBDV后存活率和临床症状分值；
其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组病毒；MDV：亲本MDV病毒；Mock：正常对照鸡；
图22为重组病毒rMDV-VP2和亲本毒MDV免疫鸡攻毒IBDV后法氏囊体重比(F/Bratios)和法氏囊指数(BBIX)；
其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组病毒；MDV：亲本MDV病毒；Mock：正常对照鸡；
图23为重组病毒rMDV-VP2和亲本毒MDV免疫鸡攻毒IBDV后法氏囊病理变化情况及病理变化分值(HBLS)。
其中，rMDV-VP2：表达VP2基因的重组病毒；MDV：亲本MDV病毒；Mock：正常对照鸡。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 MDV疫苗814株基因组Fosmid文库的构建
马立克氏病病毒弱毒疫苗814株(Zhang,F.,Liu,C.J.,Zhang,Y.P.,etal.Comparative full-length sequence analysis of Marek's disease virus vaccinestrain 814.Arch Virol.2012,157(1):177-183.)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存，提供。所述的马立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因组序列的GenBank登录号为JF742597。
按照Epicentre公司CopyControlTM Fosmid Library Production Kit试剂盒说明进行MDV基因组Fosmid文库的构建。方法如下：
将MDV疫苗814株病毒基因组DNA用物理方法即用200μL移液器吸头反复抽吸50-100次，通过脉冲场电泳(BioRad公司CHEFXA Pulsed Field ElectrophoresisSystem***，条件为：电泳缓冲液0.5×TBE，胶浓度1％，程序5-220kb)分析，至其片段长度在30-50kb之间(图1)。将剪切后的DNA用End-Repair Enzyme Mix(Epicentre公司)进行平末端化和5’磷酸化修饰。取末端修饰后的DNA进行脉冲场电泳，条件如上所述。回收大小为35-48kb之间的基因组DNA片段(图1)。取回收后DNA与pCC1Fos载体(图2)连接。将连接产物用包装试剂MaxPlax Lambda Packaging Extracts(购自Epicentre公司)包装，转染大肠杆菌EPI300-T1R(购自Epicentre公司)。将菌液涂布于含12.5μg/ml氯霉素的LB平板上培养过夜，统计菌落数量，计算粘粒文库的滴度(cfu/ml)，结果为1.8×106cfu/ml。
从培养平板上挑取300个克隆，碱裂解法提取粘粒，用引物pCC1F：5’-GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG-3’和pCC1R：5’-CTCGTATGTTGT GTGGAATTGTGAGC-3’对重组粘粒进行基因组测序。结果共获得273个克隆有MDV基因片段的重组粘粒，***片段长度在32-46kb之间。以每个***片段30kb计算，该273个克隆对MDV 814疫苗株基因组的覆盖率为47.6(273×30kb/172kb)，表明其足以覆盖MDV全基因组。即成功构建MDV疫苗814株基因组Fosmid文库。
实施例2病毒拯救
根据重组粘粒末端测序分析，从中选取6组5粘粒组合。每个组合中的5个粘粒均克隆有MDV疫苗814株基因组DNA片段，含有相互重叠区域并可拼接覆盖完整MDV基因组。用QIAGEN公司中提试剂盒提取所选择的粘粒DNA。用NotI(NEB公司)对提取的粘粒进行线性化处理：NotI内切酶100U，粘粒10μg，37℃作用2h。酶切产物用酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀制备转染用MDV基因组DNA。
采用磷酸钙转染方法将5段MDV基因组DNA片段共转染次代CEF细胞。CEF细胞的制备方法如下：取9-10日龄SPF鸡胚，无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎；用Hank’s液洗涤两次，加入0.25％的胰酶(4mL/胚)，37℃孵育10min；弃尽胰酶，加入含5％FBS、1％双抗的DMEM培养液(购自HyClone)，反复吹打使细胞分散。用6层纱布过滤后制成8×105细胞/mL的细胞悬液，分装于细胞培养瓶中于37℃温箱中培养。
磷酸钙转染过程如下：将培养16-18h的原代CEF细胞用胰酶消化下来，用含10％FBS、无双抗的DMEM洗涤两次，用6层纱布过滤后分装到60mm培养皿中(4×106细胞/皿)。在1.5ml EP管中混合388μl灭菌水、50μl DNA(包含5个浓度均为200ng/μl的MDV基因组DNA片段，每个片段10μl即2μg)、62μl 2M CaCl2；在另一个1.5ml EP管中加入500μl 2×HBS缓冲液；将CaCl2-DNA混合液逐滴缓慢加入到2×HBS缓冲液中，混匀；室温孵育30min。将制备的磷酸钙-DNA沉淀逐滴加入到制备的次代CEF细胞上，轻微混匀后置于37℃培养箱中培养。转染4h后，用2ml甘油休克液(15％甘油，1×HBS)休克2min，加入含10％FBS的DMEM完全培养液培养。休克12h后，将细胞培养液换为含3％FBS、1％双抗的DMEM继续培养。
转染4-6天后，观察细胞病变的产生情况。结果表明，所选取的6组粘粒组合转染CEF细胞后均可出现MDV典型细胞病变。选取重复性较好的一组粘粒组合，进行后续的试验。收获此组5粘粒共转染拯救的病毒，命名为rMDV。将rMDV与原MDV疫苗株病毒分别接种CEF细胞，培养4-6天后观察，发现rMDV在CEF细胞上产生的蚀斑形态和大小与原MDV疫苗株病毒无明显差异(图3)。提取拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒基因组DNA，用HindIII(购自NEB公司)进行酶切后，用脉冲场电泳分析其酶切图谱，表明拯救毒rMDV基因组物理图谱与原病毒MDV完全一致(图4)。说明所选择的5粘粒组合成功拯救MDV。
本发明人将所选择的5粘粒组成员分别命名为p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5，其所***的DNA片段分别为MDV疫苗814株基因组的第1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位。这5个重组粘粒所含有的DNA片段能相互重叠且能覆盖全MDV基因组，其中p814-5包含MDV的US2基因(US2基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)。
实施例3在MDV基因组US2基因内部***VP2基因表达框架(SEQ ID No.1)的重组突变粘粒的构建
基于上述已建立的MDV多片段粘粒拯救***，在所选择的5粘粒组成员p814-5中MDV基因组的US2基因内部，具体地，US2基因共813bp，本研究中，US2基因缺失了其中第15至630位核苷酸，代之以***CAG-VP2表达框架(CAG-VP2表达框架的核苷酸序列为SEQ IDNO.1，其结构为CMV增强子-鸡β-actin启动子-VP2基因-sv40PolyA)，构建1个重组突变粘粒p814-5US2VP2(简称p814VP2)。
重组突变粘粒p814-5US2VP2的构建过程简述如下：
3.1 pKS KanccdB质粒的构建
用表1所示的3对引物分别对pDEST22质粒和pMOD6质粒进行多重PCR扩增。
其构建过程简述如下：以R1F和R1R为引物，从pDEST22中扩增得到attR1序列；以P6KanF和p6KanR为引物，从pMOD6中扩增得到卡那霉素抗性基因(Kan)；以ccdBR2F和ccdBR2R为引物，从pDEST22中扩增得到ccdB-attR2基因；分别纯化上述得到的3个DNA片段，并以此3个片段为模板，以R1F和ccdBR2R为引物，扩增得到attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架。将得到的attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架利用XbaI和HindIII酶切位点克隆入pBluescript II KS(+)载体，获得pKS KanccdB，如图5所示。
表1用于克隆Kan-ccdB表达框架的PCR引物
引物名称 序列(5’-3’)
R1F GCGTCTAGAGATGATGAAGATACCCCACCA(XbaI)
R1R GTGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAA
P6KanF TTGGCAGCATCACCCGACGCACACATCTCAACCATCATCG
P6KanR ATCTGGCTTTTAGTAAGCCGGATCCACCGAGCTCGAATTCGATGAA
ccdBR2F GGATCCGGCTTACTAAAAGCCAGAT
ccdBR2R GCGAAGCTTCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG(HindIII)
3.2带有Kan/ccdB抗性基因的重组突变粘粒p814-5US2KanccdB的构建
用以下引物从pKS KanccdB中扩增带有同源重组臂的attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架，US2hmL：5’-ATCTAATTGGTAGCAAGTAGGTCTGTCGAATAACAGCTAATGACTACCGGGGGTGGGTCGAATCAAACAAGTTTGT-3’，US2hmR：5’-TGGGTGTGCCCATAATCGCCAGAGCTGCAGACCTATTCCGT TTTGCCAAAGCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG-3’。用Counter-Selection BAC ModificationKit试剂盒将所扩增的片段克隆入p814-5中的US2基因中，替换814株基因组US2基因序列的第15-630位核苷酸序列，代之以attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架，获得重组突变粘粒p814-5US2KanccdB，其构建模式如图6所示。
3.3 pENTR1入门载体的构建
为便于向MDV基因组中***外源基因表达框架，本发明将pENTR-gus质粒中的gus基因删除，替换为BglII-SalI-XbaI-NotI-EcoRI-KpnI-SmaI-SacI-HindIII-BamHI十个酶切位点，过程如下：以ENTR1F(5’-GAATTCTCGCGGCCGCTCTAGAATC TGTCGACAGATCTGGTTTCTACAGGACGGACCATG-3’)和ENTR1R(5’-GAATTCGGTACCCGGGAGCTCAAGCTTGGATCCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGG-3’)为引物，以pENTR-gus为模板，进行PCR扩增，。将纯化后的PCR产物用EcoR1酶切。酶切产物纯化后，用T4DNA连接酶进行自身连接，转化大肠杆菌，获得入门载体pENTR1(如图7所示)。
3.4 pCAGGS-VP2表达质粒的构建
用引物VP2F：5’-TTTGAATTCGCCGCCACCATGACCAACCTGCAGGACCAG AC-3’和VP2R：5’-TTTATCGATTCAGCGGCGCAGGGCGCGGATGATGTCC-3’以质粒pUC57-VP2为模板扩增获得VP2基因，全长1359bp，其中质粒pUC57-VP2是通过将按照鸡密码子优化后的VP2基因克隆入pUC57载体中得到的。将纯化后的PCR产物用EcoRI和ClaI酶切，克隆入pCAGGS载体多克隆位点，成功构建pCAGGS-VP2，VP2基因位于CAG启动子下游，SV40PolyA上游，在pCAGGS载体的1719-1736为核苷酸之间，如图8所示。
3.5 VP2入门表达质粒pENTR1-VP2的构建
将上述构建的VP2表达质粒pCAGGS-VP2用SalI和HindIII进行双酶切，酶切产物回收后获得VP2表达框架。将获得的VP2表达框架通过SalI和HindIII酶切位点克隆入pENTR1入门载体，获得VP2入门表达质粒pENTR1-VP2(如图9所示)。
3.6含有VP2表达框架的重组突变粘粒p814VP2的构建
将上述VP2入门表达质粒pENTR1-VP2与重组突变粘粒p814-5US2KanccdB利用ClonaseTM II Enzyme Mix进行LR反应，使上述重组突变粘粒中的Kan-ccdB表达框架替换为pENTR1-VP2质粒中的VP2表达框架，从而获得在MDV基因组的US2基因中***VP2表达框架的重组粘粒p814VP2(该重组突变粘粒的图谱如图10所示)。具体地，用所述CAG-VP2表达框架(SEQ ID No.1)替换所述MDV疫苗814株US2基因(SEQ ID No.2)的第15到630位核苷酸片段。
实施例4表达IBDV VP2基因的重组MDV的拯救、鉴定及生物学特性分析
4.1重组病毒的拯救
用QIAGEN公司的中提试剂盒提取p814-1、p814-2、p814-3、p814-4(由实施例1-2构建和筛选)、p814VP2五个粘粒DNA。用NotI(NEB公司)对提取的粘粒进行线性化处理：NotI内切酶100U，粘粒10μg，37℃作用2h。酶切产物用酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀制备转染用DNA。
通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染次代CEF，病毒拯救过程阐述如下：取9-10日龄SPF鸡胚，无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎；用Hank’s液洗涤两次，加入0.25％的胰酶(4mL/胚)，37℃孵育10min；弃尽胰酶，加入含5％FBS、1％双抗的DMEM培养液(购自HyClone)，反复吹打使细胞分散。用6层纱布过滤后制成8×105细胞/mL的细胞悬液，分装于细胞培养瓶中于37℃温箱中培养。
将培养16-18h的原代CEF细胞用胰酶消化下来，制备为次代CEF细胞。在制备次代CEF细胞的同时进行磷酸钙-DNA沉淀的制备。在1.5ml EP管中混合388μl灭菌水、50μl DNA(包含5个浓度均为200ng/μl的MDV基因组DNA片段，每个片段10μl即2μg)、62μl 2M CaCl2；在另一个1.5ml EP管中加入500μl 2×HBS缓冲液；将CaCl2-DNA混合液逐滴缓慢加入到2×HBS缓冲液中，然后在管底吹5-6个泡使其混匀；室温孵育30min。将制备的磷酸钙-DNA沉淀逐滴加入到制备的次代CEF细胞上，轻微混匀后置于37℃培养箱中培养。转染4h后，弃掉细胞上清，用DMEM将细胞洗一遍；加入2ml甘油休克液(15％甘油，1×HBS)，室温孵育2min；用DMEM洗涤3次后，加入含10％FBS的DMEM完全培养液培养。休克12h后，将细胞培养液换为含3％FBS、1％双抗的DMEM继续培养。转染4-5天后盲传2代可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒命名为rMDV-VP2。
4.2重组病毒的鉴定
从细胞病变、电镜观察和测序三个方面对拯救毒进行鉴定。将rMDV-VP2与原MDV疫苗株病毒分别接种次代CEF细胞，培养4-6天后观察比较病毒在感染细胞上产生的蚀斑情况。用透射电镜观察拯救毒rMDV-VP2感染细胞中是否存在典型的MDV病毒粒子。用引物VP2F：5′-ATGACCAACCTGCAGGACCAGAC-3′和US2R：5′-TGGGTGTGCCCATAATCGCCAGAG-3′对重组病毒进行PCR鉴定并测序。
4.3重组病毒目的基因VP2表达情况
将上述拯救获得的重组病毒rMDV-VP2与原MDV疫苗株病毒以100PFU接种培养于六孔板中的CEF细胞，培养120h后收集细胞，用VP2单克隆抗体和FITC标记的抗鼠二抗进行间接免疫荧光试验(IFA)。过程如下：将接毒细胞用无水乙醇室温固定20min。用PBST将固定好的培养板洗一遍。加入1:100稀释的VP2单抗，37℃湿盒中孵育1h。用PBST洗5遍。加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃湿盒中孵育1h。用PBST洗5遍，于荧光显微镜下观察结果。
同时进行蛋白质印迹(Western blot)检测：每孔加入500μL细胞裂解液(购自碧云天公司)，4℃裂解30min释放细胞中的VP2。将细胞裂解所得上清用10％SDS-PAGE分离胶电泳。将蛋白胶用半干转膜仪(Bio-Rad公司)将蛋白转至NC膜。转膜完成后，将膜用VP2单克隆抗体和DyLight-800标记的抗鼠二抗(KPL公司)进行Western blot试验：转膜完成后，将膜置于5％脱脂乳中于4℃封闭过夜。将膜用PBST洗三次，5min/次。将膜用VP2单抗室温孵育1.5h，同样方法洗3-5次。将膜置于红外标记的抗鼠二抗中室温孵育1h，洗涤3-5次。用蛋白质印迹扫描***观察结果。
4.4重组病毒的遗传稳定性
将重组病毒rMDV-VP2在CEF中连续传20代，提取病毒基因组DNA，用引物VP2F和US2R进行PCR和测序鉴定。将病毒接种培养于CEF细胞，进行间接免疫荧光试验，检测目的基因VP2的表达情况。
4.5重组病毒的体外复制曲线
将重组病毒rMDV-VP2和原MDV疫苗株病毒以100PFU剂量接种培养于6孔板中的次代CEF细胞，感染后每隔24h收集病毒(每个时间点每种病毒均做3个重复孔)，直到感染后144h。测定各个时间点所收集病毒的滴度，绘制生长曲线，检测重组病毒rMDV-VP2在CEF上的复制曲线是否与亲本毒一致。
结果：
4.6重组病毒rMDV-VP2的拯救、鉴定及生物学特性分析
4.6.1重组病毒rMDV-VP2的鉴定
将重组病毒rMDV-VP2与原MDV疫苗株病毒分别接种CEF细胞，培养4-6天后观察比较病毒在感染细胞上产生的蚀斑情况。发现重组病毒rMDV-VP2在CEF细胞上产生的蚀斑形态和大小与原MDV疫苗株病毒无明显差异(图11)。用透射电镜观察发现，在rMDV-VP2感染细胞中可见大量典型的MDV病毒粒子(多数为裸露的未成熟病毒)，与原MDV疫苗株病毒形成的病毒粒子无明显差异(图12)。提取rMDV-VP2感染细胞基因组DNA，对重组病毒进行PCR鉴定。结果表明，亲本MDV疫苗株病毒因不含有VP2基因，扩增结果为阴性；重组MDV疫苗株的PCR产物长度为2477bp，包含VP2基因全长和VP2表达盒下游的US2基因部分序列(图13)。将PCR产物进行测序，PCR产物的1-1359bp核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的VP2基因序列完全一致。
4.6.2目的基因VP2表达情况
将重组病毒rMDV-VP2与原MDV疫苗株病毒分别接种CEF细胞后72h收集细胞，用IFA和Western blot试验检测目的基因VP2的表达情况。IFA结果表明，rMDV-VP2感染的细胞经VP2单抗检测可见绿色荧光信号，MDV亲本病毒与未接毒细胞未见荧光(图14)。WesternBlot结果显示，VP2基因表达产物约50kDa，大小与预期相符(图15)。由上可见，重组病毒rMDV-VP2可以成功表达目的基因VP2。
4.6.3重组病毒的遗传稳定性
将重组病毒rMDV-VP2在CEF中连续传20代。提取第5、10、20代重组病毒基因组DNA，用目的基因上游引物VP2F和下游同源臂引物US2R进行PCR鉴定。结果显示，以上代次病毒均可扩增获得大小为2477bp的目的片段，与预期相符(图16)。测序结果表明，以上代次的重组病毒中***的VP2基因与SEQ ID No.1所示的VP2基因序列完全一致，未见有突变或缺失发生。将第5、10、20代病毒接种CEF细胞，用间接免疫荧光试验检测重组蛋白的表达。结果表明，以上代次的病毒均可以稳定的表达VP2目的蛋白(图17)。综上说明，重组病毒rMDV-VP2具有良好的遗传稳定性。
4.6.4重组病毒的体外复制特性
将重组病毒rMDV-VP2和原MDV疫苗株亲本病毒以100PFU接种CEF，每24小时收集细胞，滴定病毒的复制曲线。如图18所示，从生长曲线来看，各时间点rMDV-VP2的滴度与MDV无明显差异(P＞0.05)。重组病毒与亲本毒均在感染后120h复制滴度达到最高峰，分别为9.46×104PFU/ml和9.52×104PFU/ml。说明rMDV/IBDV-VP2在CEF中的复制特性与MDV一致。
实施例5重组MDV疫苗株rMDV-VP2的免疫效力试验
5.1重组病毒对IBDV的免疫保护效力试验
取45只1日龄SPF莱航鸡随机分为3组，每组15只。组1以2000PFU/只剂量颈部皮下接种重组疫苗株rMDV-VP2；组2接种MDV亲本病毒作为阴性对照；组3不免疫作为空白对照。免疫后每周采血，用IDEXX试剂盒检测IBDV特异性ELISA抗体。采集免疫后4周血清进行中和试验，检测IBDV中和抗体。中和抗体测定方法为：将无菌分离血清放入56℃水浴锅30min灭活；用不含血清的DMEM以2倍梯度稀释后，加入100TCID50的vvIBDV细胞适应株病毒rHLJ0504ACC(由发明人所在的国家兽医生物技术重点实验室制备并保存)，于37℃作用1h；取96孔板CEF，甩去培养液，用D-HANK’S液清洗细胞一次，加入血清与病毒混合物，作用1小时加入含2％血清的DMEM继续培养72h，观察计数，以能完全抑制病毒生长的最大血清稀释度为其中和滴度。
免疫后4周，组1和组2试验鸡分别以500ELD50剂量攻毒IBDV超强毒(HLJ0504株)。攻毒后连续观察10天，统计各组试验鸡存活情况和临床症状，统计症状分值。参照OIE IBD参考实验室建立的IBD症状分值统计方法进行评价[7]，简述如下：0，试验鸡没有任何临床症状，与对照组鸡无差异；1，试验鸡羽毛蓬松，但活动正常，活动时羽毛症状消失；2，试验鸡羽毛蓬松，精神萎靡，活动能力减弱或丧失，活动后扔有羽毛蓬松症状；3，试验鸡精神极度萎靡，卧地，衰竭，频临死亡或已经死亡。
攻毒后10天剖杀，采集法氏囊，统计囊重比(F/B)和囊指数(BBIX)，F/B＝(法氏囊重/体重)×1000；BBIX＝试验组鸡囊重比/空白对照组鸡囊肿比；当BBIX<0.7时，判为法氏囊萎缩；BBIX>0.7时，判为法氏囊正常。将采集的法氏囊组织制作病理切片，进行组织病理学观察，统计病变分值(HBLS)。HBLS的统计方法[8]如下：0，没有任何病变；1，轻微病变；2，散在的或部分滤泡病变；3，小于或等于50％的滤泡发生病变；4，50％-75％的滤泡发生病变；5，75％-100％的滤泡发生病变。当HBLS≤1时，判为保护；HBLS>1时，判为未保护。
5.2重组病毒对MDV的免疫保护效力试验
取60只SPF莱航鸡平均分为3组，每组20只，其中2组分别通过颈部皮下接种2000PFU重组病毒rMDV-VP2或亲本病毒814疫苗，第三组接种灭菌PBS作为非免疫攻毒对照。另外设置10只同日龄鸡作为健康对照。免疫后7天，采集各组试验鸡羽髓，用荧光定量PCR方法检测MDV在体内的复制滴度。同时在免疫后7天，所有试验鸡通过腹腔注射的方式按1000PFU/只的剂量用MDV超强毒株(Md5株)进行攻毒。攻毒之后连续观察试验鸡的发病和死亡情况至攻毒后12周。所有攻毒后死亡的试验鸡以及实验结束时扑杀试验鸡均进行剖检观察大体病变，同时采集肝脏、肾脏、脾脏、坐骨祌经和皮肤组织用10％中性缓冲***固定之后，按文献方法进行病理学检查。保护指数按照以下公式进行计算：PI(％)＝(％对照组MD阳性率-％免疫组MD阳性率)/％对照组MD阳性率。
结果：
5.3.重组病毒rMDV-VP2对IBDV的攻毒保护效果
5.3.1重组病毒的体内复制特性
试验鸡免疫重组病毒rMDV-VP2后7天，采集羽髓，检测重组病毒在鸡体内的复制滴度，并与亲本病毒相比较。结果表明，免疫后7天，重组病毒rMDV-VP2在羽髓中的平均病毒载量为4.2×103拷贝/106细胞，亲本病毒MDV在羽髓中的平均病毒载量为4.5×103拷贝/106细胞，二者没有显著性差异(P>0.05)(如图19所示)。
5.3.2 IBDV抗体滴度的检测
将rMDV-VP2以2000PFU/只剂量接种1日龄SPF鸡，免疫后每周采血，检测IBDV特异性ELISA抗体，结果如图20所示。免疫后前两周，所有免疫鸡均检测不到抗体。免疫后三周免疫鸡血清抗体开始转阳；免疫后4周，抗体滴度继续升高，ELISA抗体阳性率达到80％，平均抗体滴度为680(图20)。中和抗体的检测结果表明，免疫后4周，所有免疫鸡均产生IBDV中和抗体阳性率100％，平均中和抗体滴度为28.2(图20)。
5.3.3 IBDV攻毒后试验鸡存活率和临床症状
免疫后4周对各组试验鸡攻毒IBDV超强毒HLJ0504株，攻毒后连续观察10天。结果表明，攻毒后重组病毒rMDV-VP2免疫鸡完全存活，存活率达到100％(15/15)(图21)，且未见任何临床症状(图21)。亲本毒MDV免疫组攻毒后试验鸡存活率仅为13％(2/15)，可见到明显的IBD临床症状。
5.3.4 IBDV攻毒后试验鸡法氏囊萎缩情况
将试验鸡于攻毒后10天剖检，结果发现，重组疫苗株rMDV-VP2免疫组所有试验鸡攻毒后法氏囊均没有萎缩症状，囊肿比(F/B)与空白对照组试验鸡没有明显差异(P>0.05)；而亲本毒MDV免疫组试验鸡攻毒后法氏囊可见明显萎缩，囊肿比明显低于空白对照组(P<0.05)。法氏囊指数(BBIX)的统计结果表明，rMDV-VP2免疫组试验鸡攻毒后BBIX均大于0.7，进一步说明其法氏囊没有萎缩现象；然而，亲本毒MDV免疫鸡攻毒后存活的2只鸡的法氏囊指数均小于0.7，说明其法氏囊出现萎缩(图22)。
5.3.5 IBDV攻毒后试验鸡法氏囊病理变化情况
将试验鸡法氏囊样品制备病理切片，进行病理组织学检测，各个试验鸡法氏囊的病理组织学检测结果及病变分值，如图23所示。结果表明，rMDV-VP2免疫组试验鸡的HBLS分值均不大于1，其中8只鸡HBLS打分为0(即没有任何病理变化)，7只鸡HBLS打分为1(仅见固有层轻微水肿，无其他病理变化)(图23)，进一步证实重组病毒rMDV/IBDV-VP2免疫鸡可以达到完全保护。亲本毒MDV免疫组中的15只试验鸡13只死亡，剩余的2只试验鸡法氏囊病理组织学检测表明，其法氏囊淋巴滤泡萎缩，淋巴细胞显著减少(HBLS为5.0)，说明亲本毒MDV免疫鸡均不能获得保护。
5.4重组病毒rMDV-VP2对MDV的攻毒保护效果
为确定外源基因***后是否会影响重组病毒对MDV本身的免疫保护效力，分别用重组病毒rMDV-VP2和亲本病毒814疫苗免疫1日龄SPF鸡，免疫后7天用超强毒株Md5株进行攻毒，攻毒后连续观察实验组与对照组试验鸡发病和死亡情况至攻毒后12周。结果显示，非免疫对照组试验鸡攻击MDV超强毒后出现典型的MD临床症状，死亡率达80％(16/20)，发病后至实验结束仍存活的4只对照组试验鸡经病理学检查可以观察到特征性肿瘤病理变化(表2)。而rMDV-VP2重组病毒免疫组和814亲本病毒免疫组试验鸡攻毒后未出现任何临床症状和显微病变，保护指数均达到100％，说明重组病毒对MDV的免疫保护效力未受到影响。
表2重组病毒rMDV-VP2对MDV的免疫保护效力试验结果
综上所述，rMDV-VP2免疫鸡可以产生显著的IBDV特异性抗体和中和抗体。rMDV-VP2免疫鸡攻毒IBDV超强毒后，试验鸡完全存活且未见任何IBD临床症状；法氏囊未见萎缩，且无明显病理变化，能够对IBDV超强毒的攻击提供完全保护。同时，rMDV-VP2也能够提供良好的对MDV的免疫效果。

Claims (4)

1.表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，其特征在于是将包含传染性法氏囊病毒VP2基因和CAG启动子序列的表达框架CAG-VP2***到鸡马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的US2基因内部，获得在US2基因内部***CAG-VP2表达框架的重组粘粒，由其拯救获得表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，其中，US2基因缺失了其中第15至630位的核苷酸，代之以***CAG-VP2表达框架，所述的CAG-VP2表达框架的结构为CMV增强子-鸡β-actin启动子-VP2基因-sv40PolyA，所述的CAG-VP2表达框架的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，其特征在于，所述的表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，命名为rMDV-VP2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.12009。
3.一种构建权利要求1所述的表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作***
所述***包含5个分别依次含有马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列的重组粘粒，其中所述的马立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因组序列的GeneBank登录号为JF742597，所述***中的5个重组粘粒是通过将马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列与pCC1Fos载体连接后得到的，分别命名为p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5，其中p814-5包含马立克氏病病毒的US2基因，US2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
(2)含有CAG-VP2表达框架的重组突变粘粒p814-5US2VP2的构建
在步骤(1)构建得到的重组粘粒p814-5中的US2基因内部***CAG-VP2表达框架并替换US2基因的第15至630位核苷酸得到含有CAG-VP2表达框架的重组突变粘粒p814-5US2VP2，CAG-VP2表达框架的结构为CMV增强子-鸡β-actin启动子-VP2基因-sv40PolyA，所述的CAG-VP2表达框架的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；
(3)表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株的拯救
对得到的重组粘粒p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5US2VP2五个粘粒进行线性化处理，通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染次代CEF，置于37℃培养箱中培养，转染4h后，弃掉细胞上清，用DMEM将细胞洗一遍；加入2ml甘油休克液，室温孵育2min；用DMEM洗涤3次后，加入含10％FBS的DMEM完全培养液培养，休克12h后，将细胞培养液换为含3％FBS、1％双抗的DMEM继续培养，转染4-5天后盲传2代可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒即为表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株。
4.权利要求1或2所述的表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株在制备预防和治疗鸡马立克氏病和鸡传染性法氏囊病药物中的用途。
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