CN104031889A

CN104031889A - 表达传染性法氏囊病毒vp2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗及应用

Info

Publication number: CN104031889A
Application number: CN201410171477.6A
Authority: CN
Inventors: 陈化兰; 陈普成; 柳金雄; 姜永萍; 王笑梅
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2014-09-10

Abstract

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗及应用。本发明以连续覆盖火鸡疱疹病毒(HVT)全基因组的Fosmid文库为基础，利用Red ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术，将携带Pec复合启动子的VP2基因***到火鸡疱疹病毒复制非必需区HVT053与HVT054位点处，获得了表达VP2蛋白的重组HVT(rHVT-VP2)，其能够提供针对传染性法氏囊病毒的完全保护力，可用于传染性法氏囊病毒的预防。

Description

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种重组有传染性法氏囊病毒VP2蛋白的火鸡疱疹病毒疫苗及其在预防传染性法氏囊病中的用途。

背景技术

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursaldisease virus,IBDV)引起的禽类急性、高度接触性免疫抑制性传染病，可以通过导致法氏囊损伤、免疫抑制和引起雏鸡高死亡率对家禽养殖造成巨大的经济损失[1]。目前商品化的传染性法氏囊病活毒疫苗分为弱毒、中毒和强毒三类。弱毒活疫苗对SPF鸡安全，但对有母源抗体鸡群的免疫保护力效果不理想。中等毒力和强毒疫苗的免疫保护力虽然要高很多，但由于具有一定的致病力而损伤法氏囊。同时，由于母源抗体的干扰以及IBDV的特点，在实际应用中传统疫苗可形成不可避免的免疫空白期。因此，安全有效的法氏囊基因工程疫苗是近些年的研究热点之一。VP2蛋白是IBDV的构象保护性抗原，VP2中和抗体可以引发机体对于法氏囊强毒攻击的保护[2]，构建表达IBDV VP2基因的重组活载体疫苗具有潜在的应用价值。

HVT Fc-126株作为原型马立克疫苗自1970年以来一直使用，该疫苗无致瘤性，保护效果良好，可以冻干，使用方便，已成为世界各国普遍使用的疫苗[3-5]。火鸡疱疹病毒(HVT)作为病毒载体携带外源保护性抗原基因方面，与其它病毒载体相比具有许多优势：其对鸡及其它动物均无致病性，使用安全；接种鸡体后病毒在鸡体内形成长达数周的病毒血症，可刺激机体产生较高的抗体水平并维持终身，接种一次即可获得终生免疫；HVT疫苗不仅生产成本低，而且可以冻干，易于贮存和运输。同时，近些年来以HVT为载体的基因工程疫苗一直是国内外学者研究的热点。新城疫病毒(NDV)、血清1型MDV、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)以及艾美尔球虫病(Eimeria)的保护性抗原都已在HVT载体中获得表达，而且能抵抗致死剂量病原的感染[6-8,16-19]。因而以HVT为载体的基因工程疫苗的研究具有广阔的应用前景。

发明内容

本研究以实验室构建的连续覆盖火鸡疱疹病毒(HVT)全基因组的Fosmid文库为基础，利用Red ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术，将携带Pec复合启动子的VP2基因***到火鸡疱疹病毒复制非必需区HVT053与HVT054位点处，获得了表达VP2蛋白的重组HVT(rHVT-VP2)。动物实验结果表明rHVT-5354VP2能够提供针对传染性法氏囊病毒的完全保护力，具有潜在的推广应用价值。

具体的，本发明提供以下各项：

1.一种表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(HVT)，其特征在于，所述VP2蛋白的编码基因***HVT基因组的复制非必需区。

2.如1所述重组火鸡疱疹病毒，其中，所述复制非必需区为HVT基因组HVT053与HVT054之间。

3.如1或2所述重组火鸡疱疹病毒，其中，所述VP2蛋白的编码基因处于强启动子下游。

4.如3所述重组火鸡疱疹病毒，其中，所述启动子可以是复合启动子，优选Pec启动子，所述Pec启动子包括一个CMV增强子和一个β-actin启动子。

5.一种表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(Meleagrid herpesvirus1)rHVT-5354VP2，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201327。

6.一种构建表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的方法，包括以下步骤：

1)从HVT基因组的Fosmid文库中筛选出可共转染拯救病毒的粘粒组；

2)在所述粘粒组的一个粘粒中引入VP2蛋白的编码基因；

3)拯救重组病毒。

7.如6所述的方法，其中，所述粘粒组的粘粒共同覆盖整个HVT基因组。

8.如6或7所述的方法，其中，所述引入VP2蛋白的编码基因为使用同源重组引入，优选使用Red ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术。

9.如6或7所述的方法，其中，引入VP2蛋白的编码基因的粘粒具有HVT基因组的复制非必需区。

10.1-5任一项所述的重组病毒和/或6-9任一项所述方法制备的重组病毒用于制备预防传染性法氏囊病疫苗的用途。

发明详述

以下对本发明的技术方案做进一步详细阐述。应当指出，本发明的各实施方案可以根据需要以任何方式组合。

本发明的第一个方面，提供一种表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(HVT)，具体是所述VP2蛋白的编码基因***HVT基因组的复制非必需区中。

在一个具体的实施方案中，所述复制非必需区可以但不限于是HVT基因组HVT053与HVT054，只要该区域在基因组的复制中不是必不可少，即可用来作为***区。

由于已有实验证明VP2在火鸡疱疹病毒(HVT)载体上的表达量与禽法氏囊病(IBD)的保护呈正相关[7]。因此，在本发明的一个具体的实施方式中，所述VP2蛋白的编码基因处于强启动子下游以强化对禽法氏囊病。所述强启动子可以但不限于是复合启动子，只要能够增强下游目的蛋白的合适的启动调控序列均包含在本发明的范围内。所述复合启动子优选Pec启动子，Pec启动子作为一种新型的启动子包含了一个CMV增强子和一个β—actin启动子，其在鸡胚成纤维细胞上的启动能力是CMV的三倍之多。

本发明的第二个方面，提供一种构建表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的方法，其中用到fosmid文库技术。

fosmid文库技术是分子生物学领域的一项新技术，广泛地用于基因组测序和筛选新基因等。

因此，在本发明的一个具体实施方案中，所述构建表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的方法包括以下步骤：

2)在所述粘粒组的一个粘粒中引入VP2蛋白的编码基因；

3)拯救重组病毒。

在一个进一步的实施方案中，所述可共转染拯救病毒的粘粒组为从Fosmid文库中大量的粘粒中筛选出的组合，这些粘粒组可以共同覆盖整个HVT基因组区域，从而能够在共转染细胞后出现HVT病毒典型病变，即病毒拯救。也即只要是能够拯救产生病毒的粘粒组均可以用于本发明的重组病毒的构建，而不限于以下实施例中具体的粘粒组合。

在另一个进一步的实施方案中，所述向一个粘粒中引入VP2蛋白的编码基因可以但不限于采用同源重组的方式进行，只要能使VP2蛋白表达于病毒表面，且不影响病毒拯救的任何引入方法均在本发明的范围内。

在优选的实施方案中，所述引入VP2蛋白的编码基因为使用同源重组引入，优选使用Red ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术，通过该方法，将VP2蛋白编码基因与重组载体上的元件同源取代。

在进一步的优选的实施方案中，所述VP2蛋白编码基因处于如前所述的强启动子控制下。

此外，本发明的第三个方面，提供如前所述的重组病毒和/或所述方法制备的重组病毒用于制备预防传染性法氏囊病疫苗的用途。

综上所述，本研究以HVT反向遗传操作***为基础，采用Gateway LR克隆技术,将IBDV保护性抗原基因VP2***到HVT基因组HVT053与HVT054基因之间的复制非必需区，成功构建了表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒。此种构建策略是对传统的构建重组活载体疫苗方法的简化和改良，省去了转移载体的构建和反复地对转染细胞进行加压筛选等冗长步骤，为重组活载体疫苗的构建提供了新思路和新方法。VP2作为IBDV的主要宿主保护性抗原已经在多种活病毒载体表达过(包括HVT)，但都存在着不能有效诱导中和抗体的产生或诱导保护率较低的问题，已有的研究包括包含SV40早期启动子表达VP2的重组MDV结果证明对鸡是安全的但是只能产生部分保护并且持续时间短[5,6]；包含CMV启动子的表达VP2的重组HVT(rHVT)进行一次免疫时只能产生部分保护，由此可见VP2表达***的选择对疫苗保护效力有着至关重要的影响。已有实验证明VP2在火鸡疱疹病毒(HVT)载体上的表达量与禽法氏囊病(IBD)的保护呈正相关[7]。由此我们选择了Pec启动子，Pec启动子作为一种新型的启动子包含了一个CMV增强子和一个β—actin启动子，其在鸡胚成纤维细胞上的启动能力是CMV的三倍之多。本实验的研究结果表明以5000PFU剂量的rHVT-VP2接种1日龄鸡能够提供针对传染性法氏囊病的完全保护力。

附图说明

图1.pEntr-VP2的构建过程。

用引物VP2CU和VP2CD扩增VP2，利用EcoR I和Bgl II将扩增获得的VP2基因与PCAGGS质粒连接形成PCAGG-VP2，其次，利用Sal I和Hind III将VP2表达框架Pec-VP2-POLYA切下并与pEntrMCS(Invitrogen)相连接形成pEntr-VP2。

图2.pFosC DEST质粒图谱

图3.pFosCVP2质粒图谱

图4.重组病毒rHVT-5354VP2的拯救示意图。

图5.重组病毒rHVT-5354VP2的PCR鉴定结果。

M:Marker

1:rHVT5354VP2

2:HVT

图6.重组病毒rHVT5354VP2的免疫印迹鉴定鉴定结果。

M:Marker

1:rHVT5354VP2

2:HVT

3:CEF

图7.重组病毒rHVT5354VP2的间接免疫荧光鉴定结果。

A:rHVT5354VP2

B:HVT

具体实施方式

材料方法

材料

HVT为FC126株购自中国兽医药品监察所，IBDV HLJ-0504株，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室提供。9～10日龄SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。pCAGGs[20]、pENTR(购自invitrogen公司)质粒由本实验室保存。反转录试剂盒、LR Clonase II enzyme、One Shot ccdBSurvival2T1R competent cells均购自invitrogen公司，phusion高保真酶购自NEB公司，EcoRI、BglII、HindIII、SalI核酸内切酶购自NEB公司，CounterSelectionBAC modification kit购自Gene Bridge公司，EPI300-T1cells及其fosmid高拷贝诱导剂均购自Epicentre公司。

方法

1HVT基因组DNA的提取

用9-10日龄SPF鸡胚，按照常规方法进行原代及次代鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备和培养。24h细胞长成单层后，按1×10^-4PFU/细胞接种HVT，接种72h后，在细胞出现80％病变时，收取细胞。如Morgan等所述的方法制备病毒DNA[16]。

2HVT基因组Fosmid文库构建

用物理方法将上述方法制备的病毒DNA随机剪切成约30-45Kb大小的片段。胶回收30-45Kb的DNA片段，回收产物进行末端修饰。末端修饰反应体系(所有试剂均购自Takara公司)：10×End-Repair Buffer8ul，2.5mM dNTP Mix8ul，10mM ATP8ul，End-Repairenzyme Mix4ul，浓度为0.5ug/ul的剪切DNA20ug，最后无菌水补足80ul。室温孵育45分钟，70℃孵育10分钟灭活End-Repair enzyme(Takara)。精制修饰好末端的DNA，加上Sbf I接头。将回收后的DNA片段连接到pCC1FOS(Epicentre)载体上，4℃过夜。连接液进行包装反应，包装好的混和液进行10倍梯度稀释，分别取10^-2,10^-4,10^-5,10^-6四个稀释度的稀释液10μl感染100μl EPI300菌株，将此菌涂于含12.5μg/ml氯霉素的LB平板，37℃过夜培养，统计菌落数量，并计算其滴度，结果为4.2x104cfu/lib。即成功构建HVT的fosmid文库。

3拯救rHVT病毒粘粒的筛选

文库构建成功后，挑取288个克隆提取粘粒，用碱裂解法提取粘粒，送大连宝生物公司对***pCC1Fos中的HVT DNA片段末端进行测序，测序引物序列如下：

FP：5’-GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG-3’(SEQ ID NO：1)

RP：5’-CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3’(SEQ ID NO：2)

经过末端测序的分析，共得到***片段两端都连接有完整Fse I-Sbf I接头的克隆246个。从这246个克隆中选取多组用于拯救HVT的5粘粒组合。其中每组中克隆的HVT DNA片段两端都含有Fse I-Sbf I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全HVT基因组。

用Qiagen公司的中量提取试剂盒提取所选择的粘粒的DNA。用Fse I、Sbf I内切酶(均购自New England Biolabs)对所选择的粘粒进行线性化处理，反应条件如下：Sbf I内切酶20U，粘粒5μg，37℃作用2小时，酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀制备转染用HVT DNA。参照Reddy SM(2002)的磷酸钙方法将5段HVT DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(CEF)，经多次重复，其中有1组5粘粒组合(分别命名为pFosA,pFosB,pFosC,pFosD,pFosE，其长度及在基因组中的位置如表1所示)转染6-8天后出现HVT病毒典型病变，收获此组5粘粒共转染拯救的病毒，命名为rHVT。

表1

粘粒名称	碱基数量	基因组中位置
			pFosA	41319bp	10162-51480
pFosB	32726bp	39389-74114
			pFosC	44754bp	67199-111952
pFosD	39360bp	108578-147937

pFosE

37970bp

143007-21816

注：参考序列为：Meleagrid herpesvirus1,complete genome(159160bp)，NCBI数据库编号为：NC_002641

4表达传染性法氏囊病毒VP2基因重组火鸡疱疹病毒的构建

为了构建表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组病毒，首先PCR扩增了VP2基因(序列如SEQ ID NO：3所示，相应的VP2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)，扩增引物如下：

VP2CU:ATG GAA TTC GCC GCC ACC ATG ACA AAC CTG CAA GAT CAA ACC(SEQ ID NO：5)

VP2CD:GCG AGA TCT TTA CAG CTA TCC TCC TTA AGG CCC GA(SEQ ID NO：6)

利用EcoR I和Bgl II将扩增获得的VP2基因与PCAGGS质粒连接形成PCAGG-VP2，其次，利用Sal I和Hind III将VP2表达框架Pec-VP2-POLYA切下并与pEntr MCS(Invitrogen)相连接形成pEntr-VP2(构建过程见图1)。

5pFosC DEST的构建

选取包含HVT第53和54号基因的FosC粘粒作为***对象，将attR1-Kan-ccdB-attR2元件利用同源重组的方法***到其所包含的HVT第53和54号基因之间(HVT95318-95319)形成pFosCDEST，所用引物如下：

ET5354F:5’-cgcgattattatgaagtctacgcctctgtcctctctaatgcgatgagtaaCAGCTCT GGGGATCATAAAAC-3’(SEQ ID NO：7)

ET5354R:5’-tggtgtgattggataaataaaacacagtaaccgttagaggtgcgtttttatCGTACC AATTGTTGAGGTTCC-3’(SEQ ID NO：8)

相应质粒图谱见图2。

6pFosCVP2的构建

将pEntr-VP2与pFosC DEST混合在，在Invitrogen公司LR重组酶的作用下使VP2表达框架Pec-VP2-POLYA***到pFosC粘粒所包含的HVT第53和54号基因之间(具***置为HVT基因组95318-95319碱基之间)形成pFosCVP2(参见图3)。

7重组病毒rHVT-5354VP2的拯救

用Qiagen公司的中提试剂盒提取pFosA,pFosB,pFosD,pFosE和五个粘粒DNA。用Sbf I内切酶(购自New England Biolabs公司)将所用粘粒线性化处理，其反应条件如下：Sbf I内切酶60U，粘粒10μg，37℃作用2小时，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，制备转染用HVT DNA。参照Reddy SM(2002)的方法分别将五个粘粒共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF救获重组病毒(拯救示意图见图4)，获得的疱疹病毒科α疱疹病毒属火鸡疱疹病毒rHVT-5354VP2Meleagrid herpesvirus1已于2013年7月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国湖北省武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：V201327。

8重组病毒rHVT-5354VP2的免疫印迹鉴定

常规方法制备CEF细胞，以0.1MOI接种重组病毒rHVT-5354VP2，待80％细胞出现病变时去除上清，收获细胞进行SDS-PAGE电泳，先用甲醇润湿PVDF膜(购自密理博公司)后，用转膜液浸泡膜和滤纸10分钟，用半干法进行转印，转膜条件为电压15V，15分钟。用PBS洗膜3次，每次5分钟。将膜放置于平皿中，加5％脱脂乳封闭液，于37℃摇荡1小时后，加入用封闭液按1：200的比例稀释的鸡抗IBDV血清(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室制备并保存)(作为一抗)，室温摇荡1小时，用PBST洗膜3次，每次5分钟；加入用封闭液按1：5000的比例稀释的红外荧光标记的抗鸡IgG抗体(购自Sigma公司)(作为二抗)，室温摇荡1小时，用PBST洗膜3次，每次5分钟；最后加入少许PBS，在奥德赛扫描仪中拍照。

9重组病毒rHVT-5354VP2的间接免疫荧光鉴定

常规方法制备CEF细胞，以0.1MOI接种重组病毒rHVT-5354VP2，待出现细胞病变时去除上清，用PBS洗2次，用4％多聚甲醛于室温条件下固定细胞20分钟，PBS洗3次，加入用1％BSA封闭液按1：200的比例稀释的鸡抗IBDV血清(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室制备并保存)，37℃作用1小时。用PBST洗5次，每次3分钟。用绿色荧光(FITC)标记的羊抗鸡IgG抗体(购自密理博公司)在37℃作用1小时。用PBS洗5次，在荧光显微镜下观察并拍照。

10动物实验

将80只1日龄SPF鸡(由哈尔滨兽医研究所动物房提供)随机分为4组，每组20只。Ⅰ组和Ⅱ组，分别以5000PFU剂量免疫rHVT-5354VP2；Ⅲ组免疫HVT；Ⅳ组作为对照。免疫后每周采血并分离血清。免疫后第三周及第五周用传染性法氏囊超强毒株HLJ0504通过滴鼻和点眼方式进行攻击，攻毒后观察死亡情况，攻毒后第5天剖杀观察法氏囊的损害情况。

实施例1

重组病毒rHVT-5354VP2的PCR鉴定

将重组病毒连续传20代后提取总DNA，用特异性引物扩增VP2基因，结果如图5所示。重组病毒样品泳道出现特异性的大小约为1.4kb的条带，亲本毒株HVT则无此条带，由此说明VP2基因能够在HVT基因组中稳定存在。

实施例2

重组病毒rHVT-5354VP2的免疫印迹鉴定

将重组病毒连续传20代后提取细胞总蛋白，进行westernblot，用特异性抗体检测VP2基因的表达情况，结果如图6所示。重组病毒样品泳道出现特异性的大小约为48ku目的条带，亲本毒株HVT及CEF泳道则无此条带。由此说明VP2基因能够在HVT基因组中稳定存在且表达VP2抗原。实施例3

重组病毒rHVT-5354VP2的间接免疫荧光鉴定

将重组病毒连续传20代后进行免疫荧光检测，用特异性抗体检测VP2基因的表达情况，结果如图7所示。重组病毒感染细胞出现特异性的荧光信号，而亲本毒株HVT则无此信号，由此说明VP2基因可在重组病毒的复制过程中充分表达。

实施例4

重组病毒rHVT-5354VP2诱导产生的免疫保护

用rHVT-VP2以5000PFU剂量免疫1日龄SPF鸡(由哈尔滨兽医研究所动物房提供)。免疫后第三周及第五周用传染性法氏囊超强毒株 HLJ-0504进行攻击，攻毒后观察死亡情况，攻毒后第5天剖杀观察法氏囊的损害情况。结果表明rHVT-VP2免疫组鸡只攻毒后100％存活且没有出现法氏囊损伤，而HVT免疫组及对照组鸡只全部死亡且出现不同程度的法氏囊萎缩(见表2)。

表2攻毒保护实验结果

1.MüLLER H,ISLAM M R,RAUE R.Research on infectious bursal disease—the past,the present and the futureComparative studies on structural and antigenic properties of two serotypes of infectious bursal disease virus.[J].Veterinary Microbiology,2003,97(1-2):153–165.

2.YEH H-Y,RAUTENSCHLEIN S,SHARMA J M.Protective immunity against infectious bursal disease virus in chickens in the absence of virus-specific antibodies[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2002,89(3-4):149–158.

3.Jackson,et al.,无致病性马立克氏病病毒和致弱马立克氏病病毒疫苗的传染性和免疫性.江苏农学院学报,1980(01):p.44.

4.Purchase,H.G.and W.Okazaki,Effect of vaccination with herpesvirus of turkeys(HVT)on horizontal spread of Marek's disease herpesvirus.Avian Dis,1971.15(2):p.391-7.

5.Purchase,H.G.,W.Okazaki,and B.R.Burmester,Field trials with the herpes virus of turkeys(HVT)strain FC126as a vaccine against Marek's disease.PoultSci,1971.50(3):p.775-83.

6.Reddy,S.K.,etal.,Protective efficacy of a recombinant herpesvirus of turkeys as an in ovo vaccine against Newcastle and Marek's diseases in specific-pathogen-free chickens.Vaccine,1996.14(6):p.469-77.

7.Cronenberg,A.M.,etal.,Vaccination of broilers with HVT expressing an Eimeriaacervulina antigen improves performance after challenge with Eimeria.ActaVirol,1999.43(2-3):p.192-7.

8.Tsukamoto,K.,et al.,Complete,long-lasting protection against lethal infectious bursal disease virus challenge by a single vaccination with an avian herpesvirus vector expressing VP2antigens.J Virol,2002.76(11):p.5637-45.

9.Gao,H.,et al.,Expression of HA of HPAI H5N1virus at US2gene insertion site of turkey herpesvirus induced better protection than that at US10gene insertion site.PLoS ONE,2011.6(7):p.e22549.

10.Li,Y.,et al.,Recombinant herpesvirus of turkeys as a vector-based vaccine against highly pathogenic H7N1avian influenza and Marek's disease.Vaccine,2011.29(46):p.8257-66.

11.Tian,G.,et al.,Protective efficacy in chickens,geese and ducks of an H5N1-inactivated vaccine developed by reverse genetics.Virology,2005.341(1):p.153-62.

12.Chen,H.and Z.Bu,Development and application of avian influenza vaccines in China.Curr Top MicrobiolImmunol,2009.333:p.153-62.

13.Sakaguchi,M.,et al.,Protection of chickens with or without maternal antibodies against both Marek's and Newcastle diseases by one-time vaccination with recombinant vaccine of Marek's disease virus type1.Vaccine, 1998.16(5):p.472-9.

14.Witter,R.L.,et al.,Isolation from turkeys of a cell-associated herpesvirusantigenically related to Marek's disease virus.Am J Vet Res,1970.31(3):p.525-38.

15.Davison,F.and V.Nair,Use of Marek's disease vaccines:could they be driving the virus to increasing virulence？Expert Rev Vaccines,2005.4(1):p.77-88.

16.Morgan,R.W.,et al.,Efficacy in chickens of a herpesvirus of turkeys recombinant vaccine containing the fusion gene of Newcastle disease virus:onset of protection and effect of maternal antibodies.Avian Dis,1993.37(4):p.1032-40.

17.Ross,L.J.,et al.,Construction and properties of a turkey herpesvirus recombinant expressing the Marek's disease virus homologue of glycoprotein B of herpes simplex virus.J Gen Virol,1993.74(Pt3):p.371-7.

18.Sondermeijer,P.J.,et al.,Avian herpesvirus as a live viral vector for the expression of heterologous antigens.Vaccine,1993.11(3):p.349-58.

19.Tarpey,I.,et al.,A recombinant turkey herpesvirus expressing chicken interleukin-2increases the protection provided by in ovo vaccination with infectious bursal disease and infectious bronchitis virus.Vaccine,2007.25(51):p.8529-35.

20.Niwa,H.,K.Yamamura,and J.Miyazaki,Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.Gene,1991.108(2):p.193-9。

Claims

1.一种表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(HVT)，其特征在于，所述VP2蛋白的编码基因***HVT基因组的复制非必需区，所述VP2蛋白的编码基因如SEQ ID NO.3所示，相应的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

2.如权利要求1所述重组火鸡疱疹病毒，其中，所述复制非必需区为HVT基因组HVT053与HVT054之间。

3.如权利要求1或2所述重组火鸡疱疹病毒，其中，所述VP2蛋白的编码基因处于强启动子下游。

4.如权利要求3所述重组火鸡疱疹病毒，其中，所述启动子可以是复合启动子，优选Pec启动子，所述Pec启动子包括一个CMV增强子和一个β-actin启动子。

2)在所述粘粒组的一个粘粒中引入VP2蛋白的编码基因；

3)拯救重组病毒。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述粘粒组的粘粒共同覆盖整个HVT基因组。

8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述引入VP2蛋白的编码基因为使用同源重组引入，优选使用Red ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术。

9.如权利要求6或7所述的方法，其中，引入VP2蛋白的编码基因的粘粒具有HVT基因组的复制非必需区。

10.权利要求1-5任一项所述的重组病毒和/或权利要求6-9任一项所述方法制备的重组病毒用于制备预防传染性法氏囊病疫苗的用途。