CN104946678A - 马立克氏病病毒感染性重组克隆***及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马立克氏病病毒感染性重组克隆***及其构建方法和应用，属于生物技术领域。所述马立克氏病病毒感染性重组克隆***包括多个粘粒，每个粘粒中克隆有马立克氏病病毒疫苗株基因片段，所述马立克氏病病毒疫苗株基因片段含有相互重叠区域并可拼接覆盖完整马立克氏病病毒疫苗株基因组，其中至少一个所述粘粒的复制非必需区中***有外源基因。该***可以快捷高效的将外源基因表达盒克隆入MDV基因组，进而实现MDV重组病毒的拯救。而且应用该重组克隆***可以十分方便的分别向相应的区域***不同的外源基因，进而构建MDV多联活载体疫苗。

Description

马立克氏病病毒感染性重组克隆***及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种病毒感染性重组克隆***，具体涉及一种马立克氏病病毒感染性重组克隆***及其构建方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的一种鸡的传染性肿瘤病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征。马立克氏病是鸡的主要疾病之一，也是国内外50年代以来最受重视的鸡病。MDV属于α-疱疹病毒亚科马立克氏病样病毒属，是一种细胞结合性疱疹病毒，其基因组为线状双股DNA，约为180kb，组成模式为TR_L-U_L-IR_L-IR_S-U_S-TR_S。MDV至少编码103个蛋白质，然而大多数蛋白仍未得到鉴定。MDV包括三种血清型，血清1型病毒具有致瘤性，可进一步分为几个病理型，包括温和型MDV(mMDV)、强毒型MDV(vMDV)、超强毒型MDV(vvMDV)及特超强毒型MDV(vv+MDV)病毒株。鸡的非致瘤病毒分离株和火鸡疱疹病毒分离株分别称作血清2型和3型MDV(Biggs,P.M.The history and biology of Marek’sdisease virus.In:Hirai,K.(Ed.),Marek’s Disease.Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg,New York,2001,pp.1-24；Calnek,B.W.,Witter,R.L.Marek’s disease.In:Calnek,B.W.(Ed.),Diseases of Poultry.Iowa State University Press,Ames,1997,pp.369-413.)。

重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体，然后把外源基因***其中使之表达的活疫苗。该类疫苗诱导机体产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和细胞免疫，甚至粘膜免疫；更为重要的，活载体疫苗可以同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，起到一针防多病的效果，是当今和未来疫苗研发的主要方向之一。研究表明，疱疹病毒基因组较大，可供外源基因***或替换的复制非必需基因多，是一种理想的构建重组活载体疫苗的病毒载体。疱疹病毒活载体主要包括伪狂犬病毒(PRV)、I型牛疱疹病毒(BHV-1)和马立克氏病病毒(MDV)等。目前，已有大量疱疹病毒活载体疫苗的研究报道，如郭万柱等以PRV闵A株为载体构建了PRV的TK/gE/gI三基因缺失株并获得国家新兽药证书。Tsukamoto K等(2002)构建了表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的重组火鸡疱疹病毒，免疫SPF鸡后足以抵抗IBDV强毒的攻击(Tsukamoto K.,Saito S.,Saeki S.,et al.Complete,Long-Lasting protection against lethal infectious bursal disease viruschallenge by a single vaccination with an avian herpesvirus vector expressing VP2antigens.J Virol.2002,76(11):5637-5645.)。作为疱疹病毒科的一员，MDV同样是一种良好的活疫苗载体，研究发现在MDV的US2区***IBDV的VP2基因、在US10区***新城疫病毒的F基因获得的重组MDV对MDV强毒的保护效果与对照MDV相当(Tsukamoto K.,Kojima C.,Komori Y.,et al.Protection of chickens against veryvirulent infectious bursal Disease virus(IBDV)and Marek's disease virus(MDV)with arecombinant MDV expressing IBDV VP2.Virology 1999,257:352-362；Sonoda K.,Sakaguchi M.,Okamura H.,et al.Development of an effective polyvalent vaccine againstboth Marek's and Newcastle diseases based on recombinant Marek's disease virus type 1in commercial chickens with maternal antibodies.J Virol.2000,74(7):3217-3226.)。

目前构建MDV重组活载体疫苗主要使用的是同源重组法和细菌人工染色体(BAC)法。其中同源重组法是将外源基因***到带有同源臂的入门质粒中转染病毒感染细胞或与病毒基因组共转染易感细胞，通过细胞中的同源重组过程获得重组病毒。该方法构建过程复杂费时而且效率较低，需要加入筛选标记基因并进行重组病毒的纯化。细菌人工染色体(BAC)法是将完整的MDV基因组***到BAC中并在细菌中对其进行改造。BAC法是建立在同源重组基础上的，同样具有构建过程复杂、周期长的缺点；而且BAC自身序列难以去除，使得后期获得的重组病毒带有不必要的外源基因序列，存在安全隐患(Zelnik,V.Marek's disease virus research in thepost-sequencing era:new tools for the study of gene functions and virus-host interactions.Avian Pathol.2003,32:323-333.)。建立一种快捷、高效、安全的MDV活载体疫苗构建平台在当前具有重要的理论意义和应用前景。另外，MDV的研究与其他疱疹病毒相比相对滞后，对其基因组中外源基因***位点的报道较少。鉴定并筛选MDV基因组中的外源基因***位点有助于提高外源基因的表达水平，进而提高MDV活载体疫苗的免疫效力。

Fosmid粘粒是一种可以容纳30-45kb大小外源DNA的克隆载体，常用于基因文库的构建(Vinayak,S.,Brooks,C.F.,Naumov,A.,et al.Genetic manipulation of theToxoplasma gondii genome by fosmid recombineering.MBio.2014,5(6):e02021.)。本研究将目前现地广泛使用的MDV弱毒疫苗814株基因组DNA分段***Fosmid粘粒中，构建了该疫苗株基因组的Fosmid文库，并在此基础上建立了MDV多片段Fosmid拯救***。进一步，本研究将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因***到MDV疫苗株基因组的UL41、UL45/46、UL55/LORF10、US2和US10五个位点，拯救出5株表达eGFP的重组MDV疫苗株，从而在MDV疫苗株基因组中鉴定出5个可供外源基因***的复制非必需区。

发明内容

作为一种疱疹病毒，MDV较大的基因组使其便于外源基因的***，因此研究者们多年来一直致力于MDV活载体疫苗的研究。目前MDV重组病毒的构建大多采用同源重组法。这种方法构建重组病毒比较费时耗力，后期需要对重组病毒进行克隆纯化并去除抗性标记基因等，过程较为复杂。建立一种快捷高效的MDV重组病毒构建***对于MDV活载体疫苗的研究十分必要。本发明在之前构建的MDV疫苗株多片段粘粒拯救***的基础上，对重组粘粒进行了改造，建立了MDV疫苗株感染性重组克隆***，并应用该***拯救了表达eGFP的重组MDV疫苗株病毒，对MDV基因组中的复制非必需区进行了研究。

本发明的目的在于提供一种马立克氏病病毒感染性重组克隆***，该***可以快捷高效的将外源基因表达盒克隆入MDV基因组，进而实现MDV重组病毒的拯救。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种马立克氏病病毒感染性重组克隆***，其特征在于，所述***包括多个粘粒，每个粘粒中克隆有马立克氏病病毒疫苗株基因片段，所述马立克氏病病毒疫苗株基因片段含有相互重叠区域并可拼接覆盖完整马立克氏病病毒疫苗株基因组，其中至少一个所述粘粒的复制非必需区中***有外源基因。

在本发明中，优选的，所述粘粒为pCC1Fos。

在本发明中，优选的，所述马立克氏病病毒为马立克氏病病毒弱毒疫苗814株。

在本发明中，优选的，所述粘粒为5个粘粒，5个粘粒分别为p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5，其中克隆的马立克氏病病毒疫苗株基因片段的序列分别为马立克氏病病毒814株的1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位。

在本发明中，优选的，所述复制非必需区位于p814-3中的UL41基因内，p814-3中的UL45和UL46基因之间，p814-4中的UL55和LORF10基因之间，p814-5中的US10基因内以及p814-5中的US2基因内。

进一步的，本发明提供了构建所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆***的方法，包括以下步骤：

(1)切断所述马立克氏病病毒的DNA，并将切断后的马立克氏病病毒的DNA片段连接到粘粒上；

(2)选择多个粘粒组成所述马立克氏病病毒感染性重组克隆***，其中每个粘粒中克隆有马立克氏病病毒疫苗株基因片段，所述马立克氏病病毒疫苗株基因片段含有相互重叠区域并可拼接覆盖完整马立克氏病病毒疫苗株基因组；

(3)将外源基因***至少一个所述粘粒中的复制非必需区。

在本发明中，优选的，步骤(3)中将外源基因***所述粘粒中的复制非必需区的具体步骤为：

1)将Kan-ccdB抗性基因表达框架***到所述粘粒中的复制非必需区，构建带有Kan-ccdB抗性基因表达框架的重组突变粘粒；其中，所述Kan-ccdB抗性基因表达框架的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2)构建多克隆位点两端带有attL1和attL2位点特异重组序列的入门载体pENTR1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

3)将外源基因表达盒***到构建的入门载体pENTR1，获得含有外源基因表达盒的入门表达质粒，通过LR反应，用外源基因表达盒替换重组突变粘粒中的Kan-ccdB抗性基因表达框架，得到在复制非必需区***外源基因的重组表达粘粒。

在本发明中，优选的，所述Kan-ccdB抗性基因表达框架两侧带有attR1和attR2位点特异性重组序列；所述多克隆位点依次含有BglII-SalI-XbaI-NotI-EcoRI-KpnI-SmaI-SacI-HindIII-BamHI限制性内切酶位点。

更进一步的，本发明还提供了所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆***用于构建重组马立克氏病病毒中的应用。以及

所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆***在马立克氏病病毒活载体疫苗中的应用。

在本发明的一个具体实施例中，本发明成功拯救获得5株表达eGFP的重组病毒，从而在MDV疫苗株基因组中鉴定出5个复制非必须区，即外源基因***位点，具体实施方式如下：

1.本发明构建了5个依次含有马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列的重组粘粒，依次命名为p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5，其中所述的马立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因组序列的GeneBank登录号为JF742597。应用这5个重组粘粒转染鸡胚成纤维细胞，可以拯救出与原MDV疫苗株生物学性状一致的病毒。

2.本发明对[1]中所述的重组粘粒p814-3、p814-4和p814-5进行了改造，分别在p814-3的UL41基因中(替换814株基因组序列的96441-96620位核苷酸序列)、UL45/UL46基因间(***814株基因组序列的103416位和103417位核苷酸序列之间)，p814-4的UL55/LORF10基因间(***814株基因组序列的120336位和120337位核苷酸序列之间)，p814-5的US10基因中(替换814株基因组序列的152042-152583位核苷酸序列)以及US2基因中(替换814株基因组序列的154040-154655位核苷酸序列)***抗性基因Kan-ccdB表达框架(两侧带有attR1和attR2位点特异性重组序列)，所述Kan-ccdB抗性基因表达框架的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，构建了5个带有kan-ccdB双抗性基因的重组突变粘粒。

3.本发明构建了多克隆位点两端带有attL1和attL2位点特异重组序列的入门载体pENTR1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，该多克隆位点依次含有BglII-SalI-XbaI-NotI-EcoRI-KpnI-SmaI-SacI-HindIII-BamHI限制性内切酶位点。

4.构建了eGFP表达质粒，将eGFP表达盒***上述[3]构建的入门载体pENTR1，获得了eGFP入门表达质粒。通过LR反应，用eGFP表达盒分别替换***到MDV疫苗株基因组UL41、UL45/UL46、UL55/LORF10、US10和US2各位点(如[2]所述)的Kan-ccdB抗性基因表达框架，构建了5个分别在上述位置***eGFP表达框架的重组表达粘粒。

5.应用上述[4]构建的***eGFP表达框架的重组表达粘粒与上述[1]构建的5粘粒感染性克隆***中的另外4个粘粒共转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得分别在MDV疫苗株基因组UL41、UL45/UL46、UL55/LORF10、US10和US2各位点成功表达eGFP基因的5株重组马立克氏病病毒，从而在MDV疫苗株基因组中鉴定出5个可供外源基因***和稳定表达的复制非必需区。研究表明，5株表达eGFP的重组病毒在细胞上的复制特性与原MDV疫苗株没有明显差异；eGFP基因在上述位点的表达水平由高到低依次为UL41、UL45/UL46、UL55/LORF10、US2和US10。

本发明构建的MDV感染性重组克隆***包括5个分别在MDV基因组UL41基因中、UL45/UL46基因间、UL55/LORF10基因间、US10基因中以及US2基因中***抗性基因Kan-ccdB表达盒的重组突变粘粒，以及一个通用型入门载体pENTR1。在5个重组突变粘粒中Kan-ccdB表达盒的两端分别连有attR1和attR2序列；在入门载体pENTR1中多克隆位点的两端分别连有attL1和attL2序列。应用本***可以方便的将外源基因表达盒***MDV基因组中的上述5个位置，进而进行重组病毒的拯救：首先，构建目的基因表达盒，并将该表达盒与入门载体pENTR1连接获得入门表达质粒；其次，将入门表达质粒与相应的kan-ccdB重组突变粘粒进行LR反应，即可实现将目的基因表达盒克隆入MDV基因组的目的；最后，将构建的包含目的基因表达框架的重组突变粘粒与MDV感染性克隆***中的另外4个重组粘粒共转染CEF细胞，即可实现MDV重组病毒的拯救。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)在MDV重组病毒构建方面，本发明建立的MDV感染性重组克隆***具有诸多优点。首先，该过程仅需两步重组质粒的构建和一步LR反应即可将外源目的基因克隆入MDV基因组，与传统的同源重组法相比，更加快捷高效。其次，该过程不会残留其他不必要的基因序列，使构建的重组病毒具有良好的安全性。更为重要的是，本发明筛选获得的MDV基因组复制非必需区位于不同的重组粘粒上，因此应用该重组克隆***可以十分方便的分别向相应的区域***不同的外源基因，进而构建MDV多联活载体疫苗。

(2)MDV基因组中的复制非必需区是构建MDV重组病毒时外源基因的***位点。研究发现，***位点对于外源基因的表达水平以及MDV活载体疫苗的免疫效果有很大影响。因此，对MDV基因组中的复制非必需区进行鉴定和筛选有助于提高MDV活载体疫苗的免疫效果。本发明构建了在US2和US10基因中***外源基因的重组突变粘粒，发现US2基因中外源基因的表达水平高于US10。进一步的，本发明在MDV疫苗株基因组的UL区鉴定出三个新的复制非必需区，即UL41基因中、UL45/UL46基因间和UL55/LORF10基因间，研究发现，外源基因组在这三个区域的表达水平显著高于US2和US10区域。以上发现为MDV活载体疫苗的研究提供了新的设计思路。

附图说明

图1为MDV基因组DNA片段脉冲场电泳图；其中，M，低范围PFG Marker；1，MDV基因组DNA；2，基因组DNA剪切后片段；3，回收后35-48kb DNA；

图2为pCC1Fos载体图谱；

图3为拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒基因组DNA的HindIII酶切图谱；其中，M1：低范围PFG Marker；M2：15kb DNA分子量标记；rMDV：MDV疫苗株拯救毒；MDV：原MDV疫苗株病毒；

图4为pKS KanccdB质粒的构建示意图；其中A，pMOD-6；B，pDEST22；C，pKS KanccdB；

图5为入门表达质粒的构建示意图；其中，A，pENTR1；B，pCAGGS-eGFP；C，pENTR1-eGFP；

图6为MDV疫苗株感染性克隆及改造粘粒示意图；

图7为重组病毒和MDV亲本病毒在CEF细胞上产生的细胞病变图；其中，rMDV，MDV疫苗株拯救毒；MDV，原MDV疫苗株病毒；Mock，正常未接毒细胞；

图8为重组病毒和MDV亲本病毒在CEF细胞中形成的未成熟病毒粒子图；其中，rMDV，MDV疫苗株拯救毒；MDV，原MDV疫苗株病毒；Mock，正常未接毒细胞；

图9为eGFP基因在重组病毒中的表达情况图；其中，A，重组病毒荧光图片；B，蛋白质印迹(western blot)检测结果；C，eGFP基因在重组病毒中表达量的比较。rMDV，MDV疫苗株拯救毒；Mock，正常未接毒细胞；

图10为重组病毒在CEF细胞上的生长曲线图；其中，rMDV，MDV疫苗株拯救毒；MDV，原MDV疫苗株病毒；Mock，正常未接毒细胞；

图11为PCR检测eGFP表达盒在重组病毒中的稳定情况图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 MDV疫苗814株基因组Fosmid文库的构建

1.1 毒株

马立克氏病病毒弱毒疫苗814株(Zhang,F.,Liu,C.J.,Zhang,Y.P.,et al.Comparative full-length sequence analysis of Marek's disease virus vaccine strain 814.Arch Virol.2012,157(1):177-183.)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存，提供。所述的马立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因组序列的GeneBank登录号为JF742597。

1.2 MDV培养及病毒基因组的提取

将马立克氏病病毒弱毒疫苗814株接种原代鸡胚成纤维(CEF)细胞，待病毒生长至90％左右的细胞产生病变时，将细胞反复冻融三次，收集细胞和上清。将细胞和上清于32000rpm离心45min，弃上清；将沉淀用10mL细胞透化液(320mM蔗糖，5mM MgCl₂，10mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100)重悬，冰浴10min；32000rpm离心45min，弃上清；将沉淀再次用细胞透化液重悬，冰浴10min；32000rpm离心45min，弃上清；将沉淀用5mL细胞核缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，2mM MgCl₂·6H₂O，10％蔗糖)重悬，加入500μL 10×核酸酶缓冲液(NEB公司)、50μL 100×BSA(NEB公司)、600U微球菌核酸酶(NEB公司)和1μL RNase A(100mg/ml，Qiagen)，混匀，37℃作用1h；加入55μL 0.5M EDTA，37℃作用5min；加入22mL裂解缓冲液(100mM NaCl，10mM Tris–HCl pH 8.0，25mM EDTA pH 8.0，0.5％SDS)和135μL蛋白酶K(20mg/mL，Invitrogen)，50℃作用16h；将裂解产物用等体积酚-氯仿-异戊醇抽提两次，氯仿抽提一次，每次8000g离心5min，取上层清液；加入1/10体积3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀2h；15000g离心15min，弃上清；向沉淀加入1mL 70％乙醇，15000g离心10min，弃上清；将沉淀风干后用100μL Tris-HCl(pH 7.5)溶解，用分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。

结果获得浓度为1200ng/μL的基因组DNA，脉冲场电泳(BioRad公司CHEFXA Pulsed Field Electrophoresis System***，条件为：电泳缓冲液0.5×TBE，胶浓度1％，程序5-220kb)显示所提取的基因组DNA长度约为170kb(图1)，与MDV疫苗814株的基因组长度相一致，表明获得完整MDV基因组。

1.3 MDV疫苗株基因组Fosmid文库的构建

按照Epicentre公司CopyControlTM Fosmid Library Production Kit试剂盒说明进行MDV基因组Fosmid文库的构建，方法如下：

1)MDV基因组DNA的剪切和末端修饰

将提取的MDV基因组用200μL移液器吸头反复抽吸50-100次，通过脉冲场电泳分析，至其片段长度在30-50kb之间(图1)。将剪切后的DNA用End-RepairEnzyme Mix(Epicentre公司)进行平末端化和5’磷酸化修饰：冰上混合5μL 10XEnd-Repair Buffer，5μL 2.5mM dNTP Mix，5μL 10mM ATP，2μL End-RepairEnzyme Mix，5μg剪切后DNA，灭菌水补足50μL；室温作用45min，70℃作用10min。

取末端修饰后的DNA进行脉冲场电泳，条件如上所述。切下包含大小为35-48kb基因组DNA片段的胶块。将10×琼脂糖酶缓冲液加入到胶块中，70℃作用15min使胶块完全融化；加入β-琼脂糖酶I(1U/100mg胶块，NEB公司)，42℃水浴作用2h；70℃作用15min灭活β-琼脂糖酶I；加入1/10体积3M醋酸钠，冰浴15min，12000g离心15min，取上清；加入2倍体积无水乙醇，-20℃孵育2h后15000g离心15min，弃上清；沉淀用70％乙醇洗1遍后用20μL灭菌水溶解。结果成功回收获得35-48kb之间的DNA片段(图1)。

2)连接和包装

取回收后DNA与pCC1Fos载体(图2)连接，反应体系为：1μl 10X Fast-LinkLigation Buffer，0.5μl 10mM ATP，1μl CopyControl pCC1FOS(0.5μg/μl)，6.5μl回收后DNA(40ng/μl)，1μl Fast-Link DNA Ligase。室温连接16-18h，70℃作用15min灭活连接酶。

将连接产物与25μL包装试剂(MaxPlax Lambda Packaging Extracts，Epicentre公司)混合，30℃孵育2h；向反应体系中再次加入25μL包装试剂，30℃孵育2h后用噬菌体稀释缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.3，100mM NaCl，100mM NaCl)补足1ml；加入25μL氯仿，轻轻混匀，4℃保存。将包装好的混合液10倍梯度稀释后，分别取10μL与100μL大肠杆菌EPI300-T1R混合，37℃孵育1h。将菌液涂布于含12.5μg/ml氯霉素的LB平板上培养过夜，统计菌落数量，计算粘粒文库的滴度(cfu/ml)，结果为1.8×10⁶cfu/ml。

3)重组粘粒的鉴定和测序

从培养平板上挑取300个克隆，碱裂解法提取粘粒，用引物pCC1F：5’-GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG-3’和pCC1R：5’-CTCGTATGTTGTGTGGAATTG TGAGC-3’对重组粘粒进行基因组测序。结果共获得273个克隆有MDV基因片段的重组粘粒，***片段长度在32-46kb之间。以每个***片段30kb计算，该273个克隆对MDV 814疫苗株基因组的覆盖率为47.6(273×30kb/172kb)，表明其足以覆盖MDV全基因组。以上结果显示，MDV疫苗株基因组Fosmid文库构建成功。

实施例2 病毒拯救

2.1 病毒拯救

1)用于拯救病毒的粘粒的选择：根据粘粒末端测序分析，从中选取6组5粘粒组合。每个组合中的5个粘粒均克隆有MDV疫苗814株基因组DNA片段，含有相互重叠区域并可拼接覆盖完整MDV基因组。

2)重组粘粒的提取和线性化：用QIAGEN公司中提试剂盒提取所选择的粘粒DNA。用NotI(NEB公司)对提取的粘粒进行线性化处理：NotI内切酶100U，粘粒10μg，37℃作用2h。酶切产物用等体积酚-氯仿-异戊醇抽提两次，氯仿抽提一次，每次8000rpm离心5min，取上层清液；加入1/10体积3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀2h；15000g离心15min，弃上清；向沉淀加入1mL 70％乙醇，15000g离心10min，弃上清；将沉淀风干后用40μL TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)溶解。

3)CEF细胞的制备：采用磷酸钙转染方法将5段MDV基因组DNA片段共转染次代CEF细胞。CEF细胞的制备方法如下：取9-10日龄SPF鸡胚，无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎；用Hank’s液洗涤两次，加入0.25％的胰酶(4mL/胚)，37℃孵育10min；弃尽胰酶，加入含5％FBS、1％双抗的DMEM培养液(购自HyClone)，反复吹打使细胞分散。用6层纱布过滤后制成8×10⁵细胞/mL的细胞悬液，分装于细胞培养瓶中于37℃温箱中培养。

4)磷酸钙转染：①制备次代CEF细胞：将培养16-18h的原代CEF细胞用胰酶消化下来。将细胞用含10％FBS、无双抗的DMEM洗涤两次，每次500g室温离心5min。将细胞重悬于1.5倍体积的DMEM完全培养液，用6层纱布过滤后分装到60mm培养皿中(4×10⁶细胞/皿)。②制备磷酸钙-DNA沉淀：在制备次代CEF细胞的同时进行磷酸钙-DNA沉淀的制备。在1.5ml EP管中混合388μl灭菌水、50μl DNA(包含5个浓度均为200ng/μl的MDV基因组DNA片段，每个片段10μl即2μg)、62μl 2M CaCl₂；在另一个1.5ml EP管中加入500μl 2×HBS缓冲液(1.5mMNa₂HPO₄，10mM KC1，280mM NaCl，12mM蔗糖，50mM HEPES pH 7.0)；将CaCl₂-DNA混合液逐滴缓慢加入到2×HBS缓冲液中，然后在管底吹5-6个泡使其混匀；室温孵育30min。③将制备的磷酸钙-DNA沉淀逐滴加入到制备的次代CEF细胞上，轻微混匀后置于37℃培养箱中培养。④休克：转染4h后，弃掉细胞上清，用DMEM将细胞洗一遍；加入2ml甘油休克液(15％甘油，1×HBS)，室温孵育2min；用DMEM洗涤3次后，加入含10％FBS的DMEM完全培养液培养。⑤换液：休克12h后，将细胞培养液换为含3％FBS、1％双抗的DMEM继续培养。

转染4-6天后，观察细胞病变的产生情况。结果表明，所选取的6组粘粒组合转染CEF细胞后均可出现MDV典型细胞病变。选取重复性最好的一组粘粒组合，进行后续的试验。该粘粒组合中的5个重组粘粒所***的DNA片段分别为MDV疫苗814株基因组的(GenBank JF742597)的1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位(图6A-B)，5个重组粘粒分别命名为p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5。将此粘粒组合拯救获得的病毒命名为rMDV。

2.2 拯救病毒的鉴定

从细胞病变、电镜观察、酶切图谱和测序四个方面对拯救毒进行鉴定。

1)细胞病变：将rMDV与原MDV疫苗株病毒分别接种CEF细胞，培养4-6天后观察比较病毒在感染细胞上产生的蚀斑情况。发现rMDV在CEF细胞上产生的蚀斑形态和大小与原MDV疫苗株病毒无明显差异(图7)。

2)电镜观察：用透射电镜观察拯救毒rMDV感染细胞中是否存在典型的MDV病毒粒子。结果发现，在rMDV感染细胞中可见大量典型的MDV病毒粒子(多数为裸露的未成熟病毒)，与原MDV疫苗株病毒形成的病毒粒子无明显差异(图8)。

3)酶切图谱：提取拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒基因组DNA，用HindIII(购自NEB公司)进行酶切后，用脉冲场电泳分析其酶切图谱。结果表明，拯救毒rMDV基因组的物理图谱与原病毒MDV完全一致(图3)。

4)测序：对此组5个重组粘粒进行基因组测序，并与原MDV疫苗株病毒基因组序列相比较。发现拯救病毒rMDV的基因序列与原病毒完全一致。

2.3 拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒生长曲线的测定

将拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒以100PFU剂量接种培养于6孔板中的CEF细胞，每隔24h取样检测病毒滴度，直到感染后144h，绘制病毒生长曲线。结果表明，拯救毒rMDV与原MDV的生长曲线没有明显差异(图10)，说明用上述感染性克隆***拯救出的病毒与原MDV病毒在CEF上具有相同的复制特性。以上结果表明，MDV疫苗814株多片段感染性克隆拯救***建立成功。

实施例3 重组粘粒的突变

基于上述已建立的5粘粒感染性克隆平台，分别在p814-3中MDV基因组的UL41基因内部、UL45和UL46基因间，p814-4中MDV基因组的UL55和LORF10基因间，p814-5中MDV基因组的US10基因内部、US2基因内部***eGFP表达框架，构建5个重组突变粘粒p814-3UL41eGFP、p814-3UL45/46eGFP、p814-4UL55/10eGFP、p814-5US10eGFP、p814-5US2eGFP(其构建模式可参加图6H-L)。过程简述如下：

3.1 pKS KanccdB的构建

用表1所示的3对引物分别对pDEST22质粒(Invitrogen公司)、pMOD6质粒(Epicentre公司)进行多重PCR扩增。

表1用于克隆Kan-ccdB表达框架的PCR引物

引物名称	序列(5’-3’)
		R1F	GCGTCTAGAGATGATGAAGATACCCCACCA(XbaI)
R1R	GTGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAA
		P6KanF	TTGGCAGCATCACCCGACGCACACATCTCAACCATCATCG
P6KanR	ATCTGGCTTTTAGTAAGCCGGATCCACCGAGCTCGAATTCGATGAA
		ccdBR2F	GGATCCGGCTTACTAAAAGCCAGAT
ccdBR2R	GCGAAGCTTCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG(HindIII)

其构建过程简述如下：1)以R1F和R1R为引物，从pDEST22中扩增得到attR1序列，反应条件为：95℃5min，35×(94℃30s，65℃30s，72℃30s)，72℃10min。2)以P6KanF和p6KanR为引物，从pMOD6中扩增得到卡那霉素抗性基因(Kan)，反应条件为：95℃5min，35×(94℃30s，66℃30s，72℃1min)，72℃10min。3)以ccdBR2F和ccdBR2R为引物，从pDEST22中扩增得到ccdB-attR2基因，反应条件为：95℃5min，35×(94℃30s，64℃30s，72℃1min)，72℃10min。4)分别纯化上述得到的3个DNA片段，并以此3个片段为模板，以R1F和ccdBR2R为引物，扩增得到Kan-ccdB表达框架，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反应条件为：95℃5min，35×(94℃30s，66℃30s，72℃2min)，72℃10min。

将得到的Kan-ccdB表达框架利用XbaI和HindIII酶切位点克隆入pBluescript IIKS(+)载体，获得pKS KanccdB，如图4所示。

3.2 带有Kan-ccdB抗性基因表达框架的重组突变粘粒的构建

用表2所示的带有相应同源臂的引物从上述构建的质粒pKS KanccdB中扩增带有同源重组臂的Kan-ccdB表达框架，其PCR反应条件为：95℃5min，35×(94℃30s，66℃30s，72℃2min)，72℃10min。用Gene Bridges公司的Counter-SelectionBAC Modification Kit试剂盒将所扩增的片段克隆入相应粘粒的相应位置。具体的，将Kan-ccdB表达框架分别***p814-3所包含的UL41基因中(替换814株基因组序列的96441-96620位核苷酸序列)以及UL45和UL46基因间(***814株基因组序列的103416位和103417位核苷酸序列之间)，p814-4中的UL55和LORF10基因间(***814株基因组序列的120336位和120337位核苷酸序列之间)，p814-5中的US10基因中(替换814株基因组序列的152042-152583位核苷酸序列)以及US2基因中(替换814株基因组序列的154040-154655位核苷酸序列)，获得重组突变粘粒p814-3UL41KanccdB、p814-3UL45/46KanccdB、p814-4UL55/10KanccdB、p814-5US10 KanccdB、p814-5US2 KanccdB，如图6C-G所示。

表2扩增带有重组臂的Kan-ccdB表达框架的PCR引物(下划线部分为同源重组臂)

3.3 pENTR1入门载体的构建

为便于向MDV基因组中***外源基因表达框架，本研究将pENTR-gus质粒(Invitrogen公司)中的gus基因删除，替换为BglII-SalI-XbaI-NotI-EcoRI-KpnI-SmaI-SacI-HindIII-BamHI十个酶切位点，过程如下：以ENTR1F和ENTR1R为引物(表3)，以pENTR-gus为模板，进行PCR扩增，反应条件为：95℃5min，35×(94℃30s，65℃30s，72℃2min15s)，72℃10min。将纯化后的PCR产物用EcoR1(NEB公司)酶切。酶切产物纯化后，用T4DNA连接酶(Thermo)进行自身连接，转化大肠杆菌，获得入门载体pENTR1(如图5A所示)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

表3用于构建pENTR1的PCR引物

3.4 pCAGGS-eGFP表达质粒的构建

用表4所示的引物eGFPF和eGFPR从pEGFP-C1载体(Clontech公司)扩增获得eGFP基因，全长726bp，反应条件为95℃5min，35×(94℃30s，60℃30s，72℃1min)，72℃10min。将纯化后的PCR产物用EcoR1和Cla1(NEB公司)酶切，连入pCAGGS载体，成功构建pCAGGS-eGFP，如图5B所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

表4用于构建pCAGGS-eGFP的PCR引物

引物名称	序列(5’-3’)
		eGFPF	TTTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGC(EcoRI)
eGFPR	TTTATCGATTTACTTGTACAGCTCGTCCATG(ClaI)

3.5 eGFP入门表达质粒pENTR1-eGFP的构建

将上述构建的eGFP表达质粒用SalI和HindIII(NEB公司)进行双酶切，酶切产物回收后获得eGFP表达框架，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。将获得的eGFP表达框架通过SalI和HindIII酶切位点克隆入pENTR1入门载体，获得eGFP入门表达质粒pENTR1-eGFP(如图5C所示)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

3.6 含有eGFP表达框架的重组突变粘粒的构建

取上述3.5构建的eGFP入门表达质粒pENTR1-eGFP，分别与上述3.2构建的含有Kan-ccdB抗性基因表达框架的重组突变粘粒p814-3UL41KanccdB、p814-3UL45/46KanccdB、p814-4UL55/10KanccdB、p814-5US10KanccdB、p814-5US2KanccdB进行LR反应，使上述重组突变粘粒中的Kan-ccdB表达框架替换为pENTR1-eGFP质粒中的eGFP表达框架，从而分别获得在MDV基因组的UL41基因中、UL45/UL46基因之间、UL55/LORF10基因之间、US10基因中以及US2基因中***eGFP表达框架的重组突变粘粒p814-3UL41eGFP、p814-3UL45/46eGFP、p814-4UL55/10eGFP、p814-5US10eGFP、p814-5US2eGFP(其构建模式如图6C-G所示)。

具体过程为：将100ng的入门表达质粒pENTR1-eGFP分别与150ng的Kan-ccdB重组突变粘粒混合，之后加水至8μL，加入2μL的LR Clonase^TMII Enzyme Mix，混合后25℃作用1h，加入1μL蛋白酶K于37℃作用10min终止反应。之后取1μL转化大肠杆菌EPI300，PCR并测序鉴定阳性克隆。

实施例4 重组病毒的拯救和分析

4.1 重组病毒的拯救

用QIAGEN公司中提试剂盒提取上述获得的重组突变粘粒DNA。用NotI(购自NEB公司)将所用粘粒线性化处理，经酚氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀后制备转染用DNA。参照实施例2所述方法进行CEF细胞制备，分别用p814-3UL41eGFP、p814-3UL45/46eGFP、p814-4UL55/10eGFP、p814-5US10eGFP、p814-5US2eGFP五个重组突变粘粒之一与上述构建的MDV感染性克隆***中的另外4个粘粒共转染次代CEF细胞，磷酸钙转染方法如实施例2所述。转然后4-7天可见CEF细胞出现MDV典型细胞病变并可观察到eGFP的表达(如图9A所示)。分别拯救出五株表达eGFP的重组MDV疫苗株，依次命名为：r814UL41eGFP、r814UL45/46eGFP、r814UL55/10eGFP、r814US10eGFP、r814US2eGFP。

4.2 重组病毒的鉴定

将上述五株重组病毒与原MDV疫苗株病毒分别接种CEF细胞，培养4-6天后观察比较病毒在感染细胞上产生的蚀斑情况。发现重组病毒在CEF细胞上产生的蚀斑形态和大小与原MDV疫苗株病毒无明显差异(图7)。

用透射电镜观察上述五株重组病毒感染细胞中是否存在典型的MDV病毒粒子。结果发现，在五株重组病毒感染细胞中均可见大量典型的MDV病毒粒子(多数为裸露的未成熟病毒)，与原MDV疫苗株病毒形成的病毒粒子无明显差异(图8)。

提取上述五株重组病毒基因组DNA，以pCAGGS载体上游测序引物1596U为上游引物，以表5中相应的同源臂引物为下游引物，分别对重组病毒进行PCR和测序鉴定，未见有突变发生。

表5用于重组病毒鉴定的PCR引物

引物名称	序列(5’-3’)
		1596U	TTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGC
UL41L	TCACATCCCATTAATATCAAATCTGTGTCCGAAGACAATACATATGCGAC
		UL4546R	GATTATTAAAGAAATAAAGAACCGCTTTAAGAATAGTGTTTATTTTTGTG
UL5510L	CTTACTCGATAACAGTTACGTATTATATGTCAATTTTATGATAACAATCTG
		US10R	TTATAAGTAGGATTCCCCGTCTCCTGTTGGCGATTCCCGAAGATTTGTCA
US2R	TGGGTGTGCCCATAATCGCCAGAGCTGCAGACCTATTCCGTTTTGCCAA

4.3 重组病毒的eGFP表达情况

将上述拯救获得的五株重组病毒与原MDV疫苗株病毒以100PFU接种培养于六孔板中的CEF细胞，每隔24h收集3个感染孔中的细胞，直到感染后120h。每孔加入500μL细胞裂解液(购自碧云天公司)，4℃裂解30min释放细胞中的eGFP，用Microplate Fluorescence Reader(激发光485nm，吸收光528nm)检测每孔eGFP的相对表达水平。结果如图9A所示，r814UL41eGFP感染细胞中eGFP的表达量最高；其次为r814UL45/46eGFP和r814UL55/10eGFP，二者无显著差异；上述三株重组病毒eGFP的表达量均显著高于r814US2eGFP；r814US10eGFP感染细胞中eGFP的表达量最低(图9C)。

收获感染后120h的细胞裂解上清，进行蛋白质印迹(Western blot)检测。过程简述如下：将细胞裂解所得上清用5×SDS-PAGE上样缓冲液(碧云天公司)处理，用10％SDS-PAGE分离胶电泳，条件为80V 30min，120V 1.5h。将蛋白胶用转膜液浸泡30min，用半干转膜仪(Bio-Rad公司)将蛋白转至NC膜，条件为15V 1h。转膜完成后，将膜置于5％脱脂乳中于室温封闭过夜。将膜用PBST洗三次后，用eGFP单抗室温孵育1.5h，同样方法洗三次。将膜置于DyLight-800标记的抗鼠二抗(KPL公司)中室温孵育1h，PBST洗涤5次，用Licor公司近红外荧光扫描成像***(Licor ODYSSEY)观察。结果显示，五株重组病毒均可成功表达eGFP，目的蛋白大小约为27kDa，与预期相符(如图9B)。eGFP表达量与荧光值检测结果相符。

4.4 重组病毒的生长曲线滴定

将上述五株重组病毒和原MDV疫苗株病毒以100PFU剂量接种培养于6孔板中的CEF细胞，每隔24h取样检测病毒滴度，直到感染后144h，绘制病毒生长曲线。结果表明，五株重组病毒与原MDV的生长曲线没有明显差异(图10)，均在感染后120h达到最高滴度。在最高滴度时，MDV、r814UL41eGFP、r81445/46eGFP、r814UL55/10eGFP、r814US10eGFP和r814US2eGFP的生长滴度(log10PFU/ml)分别为4.95、4.94、4.92、4.97、4.93和4.96。

4.5 重组病毒的遗传稳定性检测

将上述五株重组病毒在CEF中连续传20代，提取病毒基因组DNA，用表5所示引物进行PCR和测序鉴定，未见有突变或缺失发生(图11)。五株重组病毒均可表达eGFP，感染细胞可见绿色荧光，说明重组病毒具有良好的遗传稳定性。

Claims (10)

1.一种马立克氏病病毒感染性重组克隆***，其特征在于，所述***包括多个粘粒，每个粘粒中克隆有马立克氏病病毒疫苗株基因片段，所述马立克氏病病毒疫苗株基因片段含有相互重叠区域并可拼接覆盖完整马立克氏病病毒疫苗株基因组，其中至少一个所述粘粒的复制非必需区中***有外源基因。

2.根据权利要求1所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆***，其特征在于，所述粘粒为pCC1Fos。

3.根据权利要求1所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆***，其特征在于，所述马立克氏病病毒为马立克氏病病毒弱毒疫苗814株。

4.根据权利要求1所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆***，其特征在于，所述粘粒为5个粘粒，5个粘粒分别为p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5，其中克隆的马立克氏病病毒疫苗株基因片段的序列分别为马立克氏病病毒814株的1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位。

5.根据权利要求1所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆***，其特征在于，所述复制非必需区位于p814-3中的UL41基因内，p814-3中的UL45和UL46基因之间，p814-4中的UL55和LORF10基因之间，p814-5中的US10基因内以及p814-5中的US2基因内。

6.构建权利要求1-5任一项所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆***的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)切断所述马立克氏病病毒的DNA，并将切断后的马立克氏病病毒的DNA片段连接到粘粒上；

(2)选择多个粘粒组成所述马立克氏病病毒感染性重组克隆***，其中每个粘粒中克隆有马立克氏病病毒疫苗株基因片段，所述马立克氏病病毒疫苗株基因片段含有相互重叠区域并可拼接覆盖完整马立克氏病病毒疫苗株基因组；

(3)将外源基因***至少一个所述粘粒中的复制非必需区。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中将外源基因***所述粘粒中的复制非必需区的具体步骤为：

1)将Kan-ccdB抗性基因表达框架***到所述粘粒中的复制非必需区，构建带有Kan-ccdB抗性基因表达框架的重组突变粘粒；其中，所述Kan-ccdB抗性基因表达框架的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2)构建多克隆位点两端带有attL1和attL2位点特异重组序列的入门载体pENTR1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

3)将外源基因表达盒***到构建的入门载体pENTR1，获得含有外源基因表达盒的入门表达质粒，通过LR反应，用外源基因表达盒替换重组突变粘粒中的Kan-ccdB抗性基因表达框架，得到在复制非必需区***外源基因的重组表达粘粒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述Kan-ccdB抗性基因表达框架两侧带有attR1和attR2位点特异性重组序列；所述多克隆位点依次含有BglII-SalI-XbaI-NotI-EcoRI-KpnI-SmaI-SacI-HindIII-BamHI限制性内切酶位点。

9.权利要求1-5任一项所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆***用于构建重组马立克氏病病毒中的应用。

10.权利要求1-5任一项所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆***在马立克氏病病毒活载体疫苗中的应用。