CN105368791A

CN105368791A - 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105368791A
Application number: CN201510782440.1A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 田克恭; 谭菲菲
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2014-02-21
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2016-03-02
Also published as: CN103923884A; CN103923884B

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原。该疫苗组合物能有效诱发抗体产生，对猪产生有效的保护，并能作为标记疫苗以有效区分野毒株和疫苗株。

Description

一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用

本申请为专利申请201410059931.9的分案申请

技术领域

本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、及其制备的疫苗组合物，以及制备方法和应用，属于动物病毒学领域。

背景技术

伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suidherpesvirus1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经***可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。

研究表明亚单位疫苗能够给免疫动物提供相应的保护，亚单位疫苗是利用基因工程方法将病原保护性抗原基因克隆到原核或真核表达***中，使其高效表达而制成的疫苗。目前发现伪狂犬病毒糖蛋白中的gB、gC、gD均能使机体产生中和抗体，这些抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力。“伪狂犬病亚单位疫苗研究进展”(杨承槐，娄高明，谌南辉《江西畜牧兽医杂志》2004年第3期)公开了在伪狂犬病病毒目前已发现的11种糖蛋白中，gB、gC、gD均能诱导机体产生中和抗体。在没有补体的参与下，gB、gC、gD的单克隆抗体能中和PRV。猪和小鼠注射抗gB、gC、gD的单克隆抗体均能抵抗PRV强毒的攻击。因此，gB、gC、gD是研制PRV亚单位疫苗的首选蛋白。糖蛋白gD是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，能诱导较好的保护反应。US6858385和US6521231公开了利用猪伪狂犬病病毒gD蛋白可以制备疫苗用于猪伪狂犬病的预防。

用于根除计划的疫苗的一个重要的因素是血清学标记，目前所有的PRV血清学检测方法中，gE-ELISA是最有效的区分野毒株和疫苗株的方法。因此gE缺失疫苗有利于伪狂犬的根除计划。在美国和欧共体等发达国家已经明确规定仅能使用伪狂犬gE基因缺失疫苗。专利申请CN103305474A提供的猪伪狂犬的变异株灭活疫苗，由于其不能识别野毒株和疫苗株感染，因此在生产实践中存在相当的局限。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种猪伪狂犬病病毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒株具有编码序列表SEQIDNO.1所示的氨基酸序列gD糖蛋白的核苷酸序列，并且不含编码gE糖蛋白的核苷酸序列。

可选择地，所述猪伪狂犬病病毒具有SEQIDNO.1的氨基酸序列或与其共有98％以上同源性的氨基酸序列表示的gD糖蛋白，且不含gE糖蛋白。

可选择地，所述猪伪狂犬病病毒可包含具有SEQIDNO.2的氨基酸序列或其片段共有95％以上核苷酸同源性的gB蛋白。

可选择地，所述猪伪狂犬病病毒可包含具有SEQIDNO.3的氨基酸序列或其片段共有95％以上核苷酸同源性的gC蛋白。

本发明术语“gD糖蛋白”，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为gp50蛋白。

本发明术语“同源性”在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，AltschulS.F.etal，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；StephenF.etal，NucleicAcidsRes.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，HigginsD.G.etal，MethodsinEnzymology，266：383-402(1996)；LarkinM.A.etal，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，PoirotO.etal，NucleicAcidsRes.，31(13)：3503-6(2003)；NotredameC.etal，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。

本发明的另一目的是提供一种猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE基因缺失株，其中，所述HN1201株的gE基因缺失株不含编码gE糖蛋白的核苷酸序列。

优选地，所述猪伪狂犬病病毒株为通过基因工程手段去掉gE基因HN1201株(Pseudorabiesvirus，strainHN1201)或其培养物，所述的猪伪狂犬病毒HN1201株(PseudorabiesvirusstrainHN1201)保藏号为CCTCCNO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。

所述术语“培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异，优选地，所述培养物是5-35代以内的培养物。

优选地，所述HN1201株的gE基因缺失株染色体gE基因部位核苷酸序列为编码序列表SEQIDNO.10所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明的再一目的是提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原。

优选地，本发明的疫苗组合物包含所述猪伪狂犬病病毒或其抗原作为活性成分。用于疫苗的组合物的猪伪狂犬病病毒具有SEQIDNO.1的氨基酸序列或与其共有98％以上同源性的氨基酸序列表示的gD糖蛋白，且不含gE糖蛋白。

用于本发明的抗原是指病毒组分的抗原部分，它引起免疫应答，并可包含具有与SEQIDNO.1的氨基酸序列。

可选择地，抗原可包含具有SEQIDNO.2的氨基酸序列或其片段共有95％以上核苷酸同源性的gB蛋白。

可选择地，抗原可包含具有SEQIDNO.3的氨基酸序列或其片段共有95％以上核苷酸同源性的gC蛋白。

优选地，所述疫苗组合物包括≥10^6.0TCID₅₀/ml的所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原。

所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。

优选地，本发明的疫苗组合物可包含每头份10^6.0TCID₅₀量的猪伪狂犬病病毒。当猪伪狂犬病病毒以少于10^6.0TCID₅₀的量使用时，疫苗不能有效刺激抗体产生。另一方面，超过的量可能是不经济的。

优选地，所述疫苗组合物包括≥25μg/ml的所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的gD蛋白抗原。

此外，本发明的猪伪狂犬疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括猪伪狂犬病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。本发明所用的术语“联合疫苗”用于指从本发明的猪伪狂犬病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指的是从病毒和细菌制备的疫苗。

优选地，所述疫苗组合物还包括介质、佐剂、赋形剂。

本发明的疫苗组合物还可包含介质、佐剂和/或赋形剂。生理盐水或蒸馏水可用作介质。用于疫苗组合物的佐剂的例子包括弗氏的不完全佐剂或完全佐剂、氢氧化铝凝胶、植物油或矿物油等。赋形剂的例子包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾，但不限于此。在实践中，本领域技术人员已知的用于疫苗制备的所有物质均可适用于本发明的疫苗组合物。

本发明的又一目的是提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：(1)培养增殖所述猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物；(2)收获所述增殖的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物，灭活；(3)加入佐剂，混匀。

具体地，所述方法为：(1)将猪伪狂犬病病毒疫苗株接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞；收获细胞培养物；

(2)用甲醛溶液、BPL(β-丙内酯)或BEI(二乙烯亚胺)处理来自步骤(1)的病毒；

所述易感细胞可以是传代细胞系，也可以是原代细胞。适合于猪伪狂犬病病毒的易感细胞包括但不限于，ST细胞系(ATCC编号：CRL-1746)、PK-15细胞系(ATCC编号：CCL-33)、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系(ATCC编号：CRL-12219)、牛肾细胞MDBK细胞系(ATCC编号：CCL-22)、牛睾丸传代细胞BT细胞系(ATCC编号：CRL-1390)、Vero细胞系(ATCC编号：CCL-81)、BHK-21细胞系(ATCC编号：CCL-10)、猪肾传代细胞系(如：IBRS-2，见例如，DECASTRO，M.P.1964.Behavioroffootandmouthdiseasevirusincellculture：susceptibilityoftheIB-RS-2swinecellline.ArquivosInstitutoBiologica31：63-78)、兔肾传代细胞系(RK，如：ATCC编号：CCL-106)等传代细胞系，或者鸡胚成纤维细胞和猪肾细胞等原代细胞。原代细胞可以通过本领域公知的方法，用动物体内的组织进行分离和制备。

可将根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。

本发明的还一目的在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：(1)表达所述猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的gD蛋白抗原；(2)收获所述表达的gD蛋白抗原；(3)加入佐剂，混匀。

本发明的还提供了所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病的药物中的应用。

本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”用于指由猪伪狂犬毒感染引起的疾病。它的例子包括发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀、体温升高，一旦发病，怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎或繁殖障碍，但不限于此。

本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。

附图说明

图1猪伪狂犬病病毒HN1201株重组转移载体构建示意图；

图2猪伪狂犬病病毒HN1201株gE基因删除及重组位置；

图3通过PCR方法确认猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株，其中，从左至右：第一泳道为gE缺失的第一代病毒vPRV-gE^—P1基因组用引物进行PCR扩增后的电泳结果；第二泳道为gE缺失的第二代传代病毒vPRV-gE^—P2基因组用引物进行PCR扩增后的电泳结果；第三泳道为gE缺失的第三代传代病毒vPRV-gE^—P3基因组用引物进行PCR扩增后的电泳结果；第四泳道为猪伪狂犬病病毒HN1201株病毒基因组用引物进行PCR扩增后的电泳结果；最右的泳道为Marker。

序列表中：

序列1为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gD氨基酸序列；

序列2为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gB氨基酸序列；

序列3为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gC氨基酸序列；

序列4为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gD核苷酸序列；

序列5为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gB核苷酸序列；

序列6为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株gC核苷酸序列；

序列7为猪伪狂犬病病毒HN1201株gE缺失毒株未缺失gE前gE核苷酸序列；

序列8为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE氨基酸序列；

序列9为猪伪狂犬病病毒HN1201株部分gE缺失后剩余的gE核苷酸序列；

序列10为猪伪狂犬病病毒HN1201株部分gE缺失后剩余的gE氨基酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。

本发明中所述的“TCID₅₀”(50％tissuecultureinfectivedose)是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。

MEM液体培养基(液)用购自美国LifeTechnologies公司的MEM干粉培养基按照其说明书配制。

本发明的DMEM培养基参照GB/T18641-2002附录A配制方法配制。

本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSaline)的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。

实施例1、病毒的采集分离

从来自河南的疑似猪伪狂犬感染的样本中分离样本无菌采集猪脑组织，以1∶10(体积比)加入MEM培养液，研磨，制备组织悬液，经反复3次冻融后，2000r/min离心15min，收集上清液，再经0.2μm滤膜滤器过滤，在PK-15细胞上传代37℃培养1h，换加含2％犊牛血清的MEM培养液，37℃培养5日。收获含毒培养液，经2次冻融后，收毒，换加含2％犊牛血清的MEM培养液。采用猪伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)检测猪伪狂犬病病毒，结果为阳性；对分离的病毒利用利用PCR试剂盒进行外源病毒的检测(猪蓝耳病病毒RT-PCR检测试剂盒、猪细小病毒PCR检测试剂盒猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公产品)，PCR检测结果均为阴性，表明毒种纯净。

将分离到的伪狂犬病毒提交保藏，所述猪伪狂犬病毒株为HN1201株(Pseudorabiesvirus，strainHN1201)，保藏号为CCTCCNO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。

实施例2、分离病毒的遗传特性

通过基因分析来确定实施例1中分离的病毒的遗传特性。利用在PK15细胞上分离的猪伪狂犬病病毒基因组DNA做模板，使用表1所示的引物进行PCR。分别使用PrimerPremier5.0来设计用于扩增gB、gC、gD基因的引物序列。

以提取的基因组DNA为模板，制备PCR扩增体系如下：模板DNA100μg，PrimerSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl，2×PrimerSTARGCBuffer25μl，上下游引物各1μl(10pmol/μl)，dNTPMix(2.5mMeach)4μl，并用蒸馏水将体积补足50μl。进行两步PCR反应：在98℃变性10sec，然后在68℃退火和延伸(按照1kb/min计算所需时间)，共30个循环。在4℃终止PCR反应。通过在含有溴化乙锭的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析所得的PCR产物。PCR产物进行序列测定。用Lasergene软件分析所得到的序列数据。

表1PCR引物序列

实施例3、病毒的致病性试验

3.1不同日龄仔猪的致病性

将34～35日龄猪伪狂犬病抗体阴性仔猪6头随机分成2组，4头/组(试验组)和2头/组(对照组)，滴鼻接种猪伪狂犬病病毒HN1201株(攻毒剂量为2×10^8.0TCID₅₀/头)，对照组接种DMEM培养基；同时将4头49日龄仔猪接种保藏后培养3代的强毒HN1201株(攻毒剂量为2×10^8.0TCID₅₀/头)，仍以35日龄仔猪作为对照。病毒接种后，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表2。

表2猪伪狂犬强毒HN1201株对不同日龄仔猪的致病性

结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201株接种不同日龄的仔猪均可导致仔猪发病，且可导致3/4以上的仔猪死亡。

3.2不同剂量对仔猪的致病性

将49日龄猪伪狂犬抗体阴性仔猪8头随机分成2组，每组4头，另取2头仔猪作为对照。实验组分别滴鼻接种2×10^7.0TCID₅₀/头和2×10^8.0TCID₅₀/头猪伪狂犬病病毒HN1201株，对照组接种DMEM培养基。病毒接种后，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体结果见表3。

表3不同剂量猪伪狂犬病病毒HN1201株对仔猪的致病性

结果显示，猪伪狂犬病病毒临床分离HN1201以不同剂量接种49日龄的仔猪，均可导致仔猪发病，且4/4的仔猪死亡。

实施例4、PRVHN1201株gE缺失毒株的制备

4.1PRVHN1201GFP重组病毒转移载体的构建

根据要缺失的gE基因(序列表SEQIDNO.7)的序列，在其两端设计同源臂，分别为gEA和gEB。将gEA和gEB克隆到pUC19载体上，命名为pUCgEAB。然后将GFP基因克隆至pUCgEAB上，获得重组病毒转移载体，命名pUCgEA-GFP-B。转移载体中同源臂为gE两侧序列，所以重组后得到的重组病毒即为gE基因缺失的。重组转移载体构建示意图见图1，图2为gEA和gEB同源臂在基因组上所在位置。

4.1.1、同源重组臂的扩增及克隆

4.1.1.1引物设计和模板制备

根据HN1201病毒的基因序列设计两对引物，用于扩增gE基因两侧的同源臂：

左侧同源臂gEA的上下游引物分别为：

gEAF:CCGGAATTCAAAAGCGCAGCCCGGTCCGTAG(下划线为EcoRI酶切位点)

gEAR:CTAGTCTAGAataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatCAGAAAGGGCCGCATGGTCTCAAC(下划线为XbaI酶切位点，小写字母为loxp位点)

右侧同源臂gEB的上下游引物分别为：

gEBF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatCCCGCCCCGCTTAAATACCG(下划线为SphI酶切位点，小写字母为loxp位点)

gEBR:CCCAAGCTTCCAGGAGCACCTGGTCGCAGA(下划线为HindIII酶切位点)

取PRVHN1201感染vero细胞，待细胞80％以上发生病变后，取部分上清，采用GeneaidViralNucleicAcidExtraction试剂盒提取病毒基因组DNA，作为同源臂扩增的模板。

4.1.1.2同源臂gEA、gEB的扩增及克隆

利用TAKARA的PrimeSTAR进行PCR扩增gEA、gEB，体系及条件如下：

PRV HN1201 DNA	1μL
		primSTAR	0.5μL
2*primSTAR GC buffer	25μL
		dNTP(25mM)	4μL
上游引物	0.5μL
		下游引物	0.5μL
水	补足50μL

PCR扩增出的gEA和gEB片段通过琼脂糖凝胶电泳分离后，用天根胶回收试剂盒回收目的片段。将gEA片段和pUC19载体分别用EcoRI和XbaI双酶切后，回收目的片段，T4DNAligase连接后转化DH5α，涂布氨苄板37℃培养过夜。挑取单克隆酶切鉴定正确后，鉴定正确的质粒命名为pUCgEA。将pUCgEA和gEB分别用SphI和HindIII双酶切后回收目的片段，T4DNAligase连接后，转化DH5α，涂布氨苄板37℃培养过夜。挑取单克隆提取质粒，经酶切和测序鉴定正确的质粒命名为pUCgEAB。

4.1.2标记基因GFP的扩增

4.1.2.1GFP载体pAcGFP-C1多克隆位点的去除

将pAcGFP-C1质粒(购自Clontech，货号632470)用BglII和SmaI双酶切后，回收线性化的载体，经DNAPolymeraseILarge(Klenow)Fragment补平，T4DNALigase连接后，转化感受态细胞DH5α获得删除MCS的GFP质粒，命名为：pAcGFPΔMCS。

4.1.2.2GFP基因的扩增

根据pAcGFP-C1载体序列设计扩增GFP的引物：

上游引物

CMVU:ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(下划线为SalI酶切位点)

下游引物

SV40R:ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC(下划线为SphI酶切位点)

以质粒pAcGFPΔMCS为模板扩增GFP基因，体系及条件如下：

pAcGFPΔMCS	1μL
		primSTAR	0.5μL
2*primSTAR GC buffer	25μL
		dNTP(25mM)	4μL
上游引物CMVU	0.5μL
		下游引物SV40R	0.5μL
水	补足50μL

电泳回收目的条带进行下一步的连接。

4.1.3GFP标记基因与pUCgEAB的连接

将GFP用SalI和SphI双酶切后，回收目的片段，和经过同样双酶切的pUCgEAB质粒连接，转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆提取质粒，酶切和测序鉴定正确的质粒命名为pUCgEA-GFP-B。

4.2含有GFP的重组病毒的获得

4.2.1转移载体和HN1201DNA共转染Vero细胞获得重组病毒

以脂质体法共转染Vero细胞，将3ugPRV-HN1201病毒基因组DNA和5ug转移载体pUCgEA-GFP-B，按照Lipofectamine2000(Invitrogen，货号11668030)说明书上的步骤进行转染。在37℃含5％CO2的培养箱中培养。转染后36-48h，待出现细胞病变，且病变处有荧光后，收获细胞上清，即为P0代重组病毒，命名为rPRV-GFP-gE^-(在图3中)。

4.2.2重组病毒的噬斑纯化

将获得的P0代重组病毒rPRV-GFP-gE^-感染Vero细胞后，铺上2％的低熔点琼脂糖，48h后待细胞出现明显的病变和荧光后，挑取带有绿色荧光的噬斑于-70℃冻融3次后，10倍倍比稀释接种到预先铺好的Vero细胞六孔板中，继续挑取绿色荧光噬斑进行纯化，经过8轮的噬斑纯化，得到纯化的不含野生型病毒HN1201的gE缺失的重组病毒rPRV-GFP-gE^-。

4.3gE缺失重组病毒中GFP标记基因的删除

将表达Cre酶的pBS185质粒(购买自addgene，Cre酶识别同源臂gEA下游和gEB上游的loxP位点，将两个loxp位点中间的序列即GFP基因序列删除)和重组病毒rPRV-GFP-gE^-基因组DNA共转染vero细胞，结果转染后24h出现比较明显的病变，而且单个荧光比较多。收获的P0代病毒倍比稀释后接种进行空斑筛选，挑取没有荧光的噬斑进行下一轮纯化。经过2轮筛选纯化，得到没有荧光的病毒，命名为vPRV-gE^-。提取纯化病毒基因组DNA，PCR鉴定表明gE基因缺失，且GFP标记基因也已经删除。说明不含GFP标记基因的gE缺失病毒纯化成功。

4.5PRVHN1201株gE缺失毒株确认

提取gE缺失病毒和野生型病毒的病毒基因组，进行PCR鉴定，引物如下：

gEDCF：acgaagaggaggaggacgaggaggg

gEDCR：tcgtgcgtctcggtggtgatgtagaa

野生型病毒扩增的PCR产物大小为3109bp,gE缺失病毒扩增的PCR片段大小为1398bp，PCR鉴定结果图3。

实施例5猪伪狂犬gD蛋白的制备

1.PRVgD基因的扩增

在生长良好的PK15细胞上接种PRVHN1201病毒gE缺失株或其不同代次的培养物，该不同代次的培养物为5-35代以内的培养物，收获病毒后用TAKARA公司MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.3.0试剂盒提取PRV基因组DNA。取1μl基因组DNA作为模板，利用gD特异性引物：

gDSF:5′ATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGC3′和

gDSR:5′CTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG3′

进行PCR扩增，利用TAKARA的高保真酶HSDNAPolymerasewithGCBuffer，扩增条件为：94℃3min；94℃30s，68℃90s，30cycles；72℃5min。PCR产物命名为gD。其核苷酸序列见SEQNO.2，推导其氨基酸序列为SEQNO.1

2.重组Bacmid的获取及鉴定

将高保真酶扩增获得的PCR产物gD克隆至pFastBac/HBM-TOPO载体(购自Invitrogen公司，货号A11339)，克隆体系如下：PCR产物gD4μl，Saltsolution(盐溶液)1μl，TOPOvector1μl，共6μl。混合均匀，室温孵育5min，转化OneShotRMach1^TMT1R感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板，挑取单克隆鉴定gD基因的***方向，***方向正确的质粒送Invitrogen公司测序，鉴定gD序列的正确性。测序正确的质粒命名为pFastBac/HBM-TOPO-gD。

pFastBac/HBM-TOPO-gD质粒转化DH10Bac感受态细胞(来源)，pFastBac/HBM-TOPO-gD和感受态细胞中的穿梭质粒Bacmid进行转座，用Invitrogen的PureLinkHiPurePlasmidDNAMiniprepKit提取获得的重组质粒，并用pUCM13Forward/pUCM13Reverse引物鉴定gD的***，阳性Bacmid命名为Bacmid-gD。

3.转染获得重组杆状病毒

按照Invitrogen公司Bac-to-BacHBMTOPOSecretedExpressionSystem的说明书提供的方法进行。6孔板每孔铺8×10⁵个sf9细胞，待细胞贴壁后按照CellfectinⅡ转染试剂的说明书进行转染：分别稀释8μlCellfectinⅡ和1μgBacmid-gDDNA到100ulSF-900Ⅱ培养基中，Vortex混匀，混合稀释后的DNA与稀释后的CellfectinⅡ(总体积～210μl),混合均匀室温孵育15～30min，一滴滴加到细胞中。转染后72h待出现细胞病变后，收集细胞培养上清，记为P0代重组病毒vBac-gD。P0代重组病毒vBac-gD感染sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-gD用于重组蛋白表达。

4.重组杆状病毒感染High-five细胞获得重组蛋白

将P3代重组杆状病毒vBac-gD接种High-five细胞(购自Invitrogen，货号B85502)。在500ml三角瓶中悬浮培养High-five细胞，至细胞密度达到7.0×10⁵cell/ml后，按照1MOI的量接种病毒，感染后72h收取细胞培养上清。利用Millipore的切向流过滤***将体积浓缩为原来体积的1/10。用1％(体积比)的TritonX-100(购自sigma)灭活杆状病毒，SDS-PAGE光密度法测定蛋白含量为200μg/ml。

实施例6、猪伪狂犬病病毒病灭活苗的制备

将按照表4将所分离的毒株的不同代次的培养物接种于PK-15细胞培养物先形成种子批，然后按病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的PK细胞培养物中，置37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒，测定毒价。分别向不同代次病毒液中加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活后病毒液用PH7.4的PBS液稀释至表3所示的病毒含量然后与206佐剂(法国SEPPIC公司产品)按照体积比54:46混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。

表4各组别猪伪狂犬疫苗的制备

实施例7、猪伪狂犬病病毒病gE缺失株灭活苗的制备

将实施例4将制备的猪伪狂犬病病毒病gE缺失株接种于PK-15细胞培养物先形成种子批，然后按病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的PK细胞培养物中，置37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒，测定毒价。分别向不同代次病毒液中加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活后病毒液用PH7.4的PBS液稀释至表5所示的病毒含量然后与206佐剂(法国SEPPIC公司产品)按照体积比54:46混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。

表5各组别猪伪狂犬疫苗的制备

实施例8、灭活疫苗免疫原性实验

将21日龄PRV抗体阴性仔猪24头随机分成6组，4头/组，按照表6注射疫苗灭活苗组注射实施例6制备的疫苗免疫猪伪狂犬灭活疫苗2ml/头以及实施例7制备的疫苗免疫猪伪狂犬灭活疫苗，对照疫苗采用CN101186902方法制备的猪伪狂犬活疫苗SA215株，按照其专利说明书免疫原性测定方法的使用，对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为HN1201株猪伪狂犬病病毒2×10^8.0TCID₅₀/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况(结果见表6)攻毒前分别取试验组和对照组的猪血清用猪伪狂犬病毒gE抗体的3种ELISA试剂盒(IDEXX)依照其说明书进行gE抗体检测。

表6免疫原性试验动物分组

组别	注射疫苗	免疫剂量
			灭活苗A	实施例6制备的疫苗组别A	2ml/头
灭活苗B	实施例6制备的疫苗组别B	2ml/头
			灭活苗C	实施例7制备的疫苗组别A	2ml/头
灭活苗D	实施例7制备的疫苗组别B	2ml/头
			活疫苗SA215	猪伪狂犬病病毒活疫苗	10^6.0TCID₅₀/头
对照组	DMEM培养基	2ml/头

疫苗免疫后，每周参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定灭活疫苗组的中和抗体效价，结果见表7。

表7猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后不同时间的抗体情况

表7的结果显示，猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后，能产生较高的中和抗体，且随免疫时间逐渐升高。

免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株猪伪狂犬病病毒2×10^8.0TCID₅₀/头，观察临床症状和死亡情况见表8，攻毒后每日测定仔猪体温见表9。

表8猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后的攻毒情况

表9猪伪狂犬疫苗免疫的仔猪攻毒后仔猪体温变化

表8和表9的结果显示，猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后，虽然不能阻断病毒感染(出现临床症状)，但能为仔猪提供100％(4/4)保护，而对照仔猪攻毒后4日后全部死亡，因此，猪伪狂犬灭活疫苗具有很好的保护力。另外相对于对照组活疫苗，灭活疫苗免疫组的仔猪体温升高时间更短，并且疫苗组C和组D没有上升到41度，食欲基本正常，并且基本没有临床症状，显示出很好的免疫保护。

猪伪狂犬gEElisa抗体检测：疫苗A组和疫苗B组检测到gE抗体，呈阳性；而疫苗C组和疫苗D组以及活疫苗组没有检测到gE抗体，呈阴性。

实施例9、猪伪狂犬给gD亚单位疫苗的制备

将实施例5制备的亚单位抗原，用PBS液(pH7.4)稀释至表10的体积与206佐剂(法国SEPPIC公司产品)按照体积比54:46混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。

表10各组别猪伪狂亚单位疫苗的制备

组别	蛋白含量	疫苗配比(灭活病毒液：206佐剂)
			A	25μg/ml	54:46
B	100μg/ml	54:46

实施例10、亚单位疫苗对猪的免疫原性实验

将21日龄PRV抗体阴性仔猪12头随机分成3组，4头/组，按照表2注射实施例9制备的疫苗，免疫猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗2ml/头。对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×10^8.0TCID₅₀/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况(结果见表12)。

表11免疫原性试验动物分组

组别	注射疫苗	免疫剂量
			亚单位疫苗A	实施例9制备的疫苗组别A	2ml/头
亚单位疫苗B	实施例9制备的疫苗组别B	2ml/头
			对照组	DMEM培养基	2ml/头

免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×10^8.0TCID₅₀/头，观察临床症状和死亡情况见表12，攻毒后每日测定仔猪体温见表13。

表12猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫仔猪后的攻毒情况

表13猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫的仔猪攻毒后仔猪体温变化

表12和表13的结果显示，猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗免疫仔猪后，虽然不能阻断病毒感染(出现临床症状)，但能为仔猪提供100％(4/4)保护，而对照仔猪攻毒后4日后全部死亡，显示出很好的免疫保护。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪伪狂犬病病毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒株具有编码序列表SEQIDNO.1所示的氨基酸序列gD糖蛋白的核苷酸序列，并且不含编码gE糖蛋白的核苷酸序列。

2.一种猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE基因缺失株，其中，所述HN1201株的gE基因缺失株不含编码gE糖蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE基因缺失株，其中，所述HN1201株的gE基因缺失株染色体gE基因部位核苷酸序列为编码序列表SEQIDNO.10所示氨基酸序列的核苷酸序列。

4.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1～3任一项所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原、亚单位抗原。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括≥10^6.0TCID₅₀/ml的权利要求1～3任一项所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原。

6.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括≥25μg/ml的权利要求1～3任一项所述的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的gD蛋白抗原。

7.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括介质、佐剂、赋形剂。

8.一种制备权利要求4所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：

(1)培养增殖所述猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物；

(2)收获所述增殖的猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物，灭活；

(3)加入佐剂，混匀。

9.一种制备权利要求4所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：

(1)表达所述猪伪狂犬病病毒株gE基因缺失株或其培养物的gD蛋白抗原；

(2)收获所述表达的gD蛋白抗原；

(3)加入佐剂，混匀。

10.根据权利要求4～7所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病的药物中的应用。