CN105628834B

CN105628834B - 蒙药漏芦花指纹图谱建立方法以及质量评价方法

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Publication number: CN105628834B
Application number: CN201610067803.8A
Authority: CN
Inventors: 王晓琴; 杜月; 李彩峰; 特布沁; 黄慧; 韩国庆
Original assignee: Inner Mongolia Medical University
Current assignee: Inner Mongolia Medical University
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2017-06-16
Anticipated expiration: 2036-01-29
Also published as: CN105628834A

Abstract

本发明涉及一种蒙药漏芦花指纹图谱的建立方法，包括：1)供试品溶液的制备：取药材粉末，置100mL具塞锥形瓶中，加70％甲醇，超声提取，放置到室温后，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，滤过，取滤液以0.45μm微孔滤膜滤过；2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，获得指纹图谱，采用的色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：乙腈(A)‑0.2％磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脱85％B(0min)～78％B(12min)～74％B(13min)～60％B(60min)；检测条件：DAD检测器，检测波长230～400nm；柱温：20～40℃；进样量：5～30μL。本发明还提供一种利用指纹图谱评价蒙药漏芦花质量的方法，该方法灵敏度高，重现性好；所获得的标准指纹图谱能较全面的反映漏芦花蒙药材中所含的化学成分种类与数量。

Description

蒙药漏芦花指纹图谱建立方法以及质量评价方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及中药材指纹图谱建立方法和药材质量评价方法。

背景技术

随着蒙药产业的快速发展，资源不合理利用和环境变迁等原因带来的野生资源日益减少的问题凸显，严重制约了蒙药产业的健康发展。蒙药材的自采自用也很普遍，目前市场上有一些蒙医专用的道地产药材并没有商品流通，有的有市场流通的商品药材，但品种混乱，临床使用情况不清，这就给合理有效的使用蒙药材造成很大困扰。漏芦花就是其中一种，其同名异物现象非常普遍，多被误用同科其他植物头状花序入药。所以选择一种能快速、高效、全面的反映蒙药材质量信息的手段是非常必要和重要的，而指纹图谱技术就是符合这些特点的技术手段，且化学成分指纹图谱亦可鉴别饮片的品质，也可辅助对品种鉴定，能基本反映中药全貌，实现对中药内在质量的控制。

蒙药漏芦花为菊科漏芦属植物祁州漏芦Rhaponticum uniflorum(L.)DC.的干燥花。蒙药名：洪古尔-珠尔,分布于我国内蒙古、东北、河北、陕西、甘肃、青海、山西、河南、四川、山东等地。入蒙药可杀“粘”、止刺痛、清热、解毒、解表等，主治感冒、心热痢疾、血热及传染性热症等。漏芦花为蒙医临床常用药，收载于《中华人民共和国***药品标准》(蒙药分册)，但无鉴别、检查、含量测定项，《中国药典》2015版中只有关于中药漏芦(祁州漏芦的根)的质量控制方法，但并不适用于漏芦花。这不仅制约了漏芦花资源的有效利用，也无法保证用药的安全性和有效性。

本发明首次建立了蒙药漏芦花指纹图谱，标识了13个共有峰中的8个峰。研究所用的HPLC法操作简单，分离度高，重现性好。建立的标准指纹图谱典型、全面、有代表性，能真实、客观地反映漏芦花所含化学成分的类型、数量和相对含量。

发明内容

本发明提出一种漏芦花指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取药材粉末，置100mL具塞锥形瓶中，加70％甲醇，超声提取，放置到室温后，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，滤过，取滤液以0.45μm微孔滤膜滤过，备用；

2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，获得指纹图谱，采用的色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脱85％B(0min)～78％B(12min)～74％B(13min)～60％B(60min)；检测条件：DAD检测器，检测波长230～400nm；柱温：20～40℃；进样量：5～30μL。

作为优选，色谱柱采用规格为250mm×4.6mm,5μm的YMC-Pack ODS-A色谱柱或者岛津Inertsil ODS-SP HPLC色谱柱。

进一步的优选是，步骤1)中，取药材粉末约0.2g，精密称定，加入70％甲醇25mL，超声提取40min，放置到室温后，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，滤过，取滤液以0.45μm微孔滤膜滤过。

更优选地，流速为1.2ml/min；采用DAD检测器，检测波长254nm；柱温25℃；进样量10μL。

本发明还提供一种利用指纹图谱评价黄花列当药材质量的方法，包括以下步骤：步骤一：建立标准指纹图谱，包括：a)供试品溶液的制备：分别制备11个不同批次的漏芦花样品供试品溶液，取样品粉末，置100mL具塞锥形瓶中，加70％甲醇，超声提取，放置到室温后，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，滤过，取滤液以0.45μm微孔滤膜滤过，备用；b)对照品溶液的制备：称取1)蜕皮甾酮、2)槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、3)芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、4)山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、5)泥胡木脂素B苷、6)木犀草素、7)芹菜素、8)5,7,4’-三羟基-3’-甲氧基黄酮共8种对照品，用甲醇溶解定容，制成一定浓度的单一对照溶液，微孔滤膜0.45μm滤过，备用；c)先后将各供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中，分别获得指纹图谱，色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脱85％B(0min)～78％B(12min)～74％B(13min)～60％B(60min)；检测条件：DAD检测器，检测波长230～400nm；柱温：20～40℃；进样量：5～30μL；d)用相似度评价软件计算11个样品的相似度，从中确定一个相似度最高的作为标准指纹图谱。步骤二：用上述相同的方式获得一个待评价样品的指纹图谱；步骤三：用前述相似度评价软件评价所述待评价样品指纹图谱和所述标准指纹图谱的相似度，相似度大于0.9则判定所述待评价样品质量符合要求。

进一步地，所述标准指纹图谱包含以下13个共有峰，各峰的相对保留时间分别为：5.40，11.24，16.47，17.46，18.53，18.91，20.92，22.62，23.01，25.43，27.66，33.59，35.22。

更进一步地，其中，所述13个共有峰的相对峰面积分别为0.164，1.280，0.378，0.115，0.061，0.617，0.056，0.251，0.446，0.491，0.268，0.038。

更进一步地，用所述共有峰中标识出的8个对照品对应峰的峰面积，与待测样品对应的峰面积进行比较，后者峰面积越大，说明样品质量越好。

根据本发明的供试品溶液制作方法操作溶液，具有较高的精密度、稳定性、和重现性，***适用性强，可适用于该属药材的制作。所建立的漏芦花指纹图谱分析方法灵敏度高，重现性好；所获得的标准指纹图谱具有典型性、代表性，能较全面的反映漏芦花药材中所含的化学成分种类与数量，进而对药材的整体评价和描述提供一个更为全面的依据。本发明建立的漏芦花药材高效液相指纹图谱技术，弥补了现今尚属空白的漏芦花药材质量控制的方法，使漏芦花药材的质量控制技术更加科学全面。

附图说明

图1是根据本发明的方法获得的标准指纹图谱；

图2和图3显示8个单一对照品与标准指纹图谱的对照图谱；

图4是11批漏芦花药材HPLC指纹图谱叠加图。

具体实施方式

供试品溶液的制备

该环节中，取干燥的漏芦花粉碎，取药材粉末，精密加入计算量的甲醇溶液，超声处理，放置至室温，溶剂补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

本发明中，使用甲醇水溶液作为供试品溶剂，甲醇溶液的浓度范围可以在50～100％之间，优选在60～80％之间，最优选70％的甲醇溶液。

优选将漏芦粉碎，使用时过65目筛，提取方法可以是回流或者超声处理，优选通过超声提取，提取时间可以是30～60min，优选提取40min。

本发明中，取样的量可以在0.1～0.4g的范围，在采用上述最优选方式的情况下，优选取样0.2g，加70％甲醇25ml，称定重量，超声处理40min，放置到室温后，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液以0.45μm微孔滤膜滤过，得到供试品溶液。

因此，本发明最优选的漏芦花供试品溶液的制备方法为：取药材粉末约0.2g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，超声提取40min，放置到室温后，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，滤过，取滤液以0.45μm微孔滤膜滤过，即得。采用该最优选的制备方法，在色谱图的峰数、峰高、峰面积和分离度方面表现最佳。

对照品溶液的制备

精密称取各对照品约0.5mg，分别置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液，进样前用0.45μm微孔滤膜滤过。对照品均为漏芦花化学成分研究中得到并经光谱解析鉴定结构。如下8种：

1)蜕皮甾酮

2)槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷

3)芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

4)山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷

5)泥胡木脂素B苷

6)木犀草素

7)芹菜素

8)5,7,4’-三羟基-3’-甲氧基黄酮

色谱条件

本发明中使用的色谱条件优选为：色谱柱是十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相是乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脱85％B(0min)～78％B(12min)～74％B(13min)～60％B(60min)；采用DAD检测器，检测波长230～400nm；柱温20～40℃；进样量5～30μL。

在本发明的最佳实施例中，确定漏芦花HPLC指纹图谱分析的最优色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)或者岛津Inertsil ODS-SP HPLC色谱柱；流动相:乙腈-0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱:85％B(0min)～78％B(12min)～74％B(13min)～60％B(60min)；流速：1.2mL/min；检测波长254nm；柱温25℃；进样量20μL。采用该最佳流动相***和洗脱比例，色谱图中峰信息全面，峰形好，基线平稳。采用254nm的检测波长可以获得最佳的各色谱图中的峰数、峰高、峰面积和分离度。流速为1.2mL/min时色谱图分离度较好，且在不影响分离度和峰数的情况下洗脱时间更短。

共有峰的标定

取不同产地采集的11批漏芦花药材样品，按照上述已经建立的操作方法分别进样分析，得到各批次药材的HPLC指纹图谱。在11个样品指纹图谱中，可确定13个共有峰，形成共有模式。其中2号峰(S)为参照峰，其相对保留时间和相对峰面积为1.00，其他峰与其相比较计算相对保留时间和相对峰面积，见表1：

表1漏芦花标准指纹图谱中共有峰相对保留时间及峰面积

标准指纹图谱的建立

将上述获得11份样品指纹图谱，导入相似度评价软件中，以平均数法计算相似度。从计算结果中选择一个相似度最大的指纹图谱——S7号药材指纹图谱作为标准指纹图谱(图1)。对照品指认图谱(由前述对照品获得)与S7号药材图谱的比较如图2与图3，其中图1中指认出2、4、6、12、13号峰，图2中指认出3、7、10号峰。

采用前述最优选的各项参数和色谱条件，该标准指纹图谱包含的13个共有峰，其保留时间和相对峰面积分别为：5.40，0.164；11.24，1.0000；16.47，1.280；17.46，0.3782；18.53，0.115；18.91，0.061；20.92，0.617；22.62，0.056；23.01，0.251；25.43，0.446；27.66，0.491；33.59，0.268；35.22，0.038。同时将制备好的对照品溶液进样，可指认13个共有峰中的8个，这8个峰与标准指纹图谱中峰号对应如下：

2号：蜕皮甾酮

3号：槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷

4号：芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

6号：山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷

7号：泥胡木脂素B苷

10号：木犀草素

12号：芹菜素

13号：5,7,4’-三羟基-3’-甲氧基黄酮

在本次发明中如下来源的11批漏芦花信息

表2.11批漏芦花药材

漏芦花药材质量评价

根据本发明，可以利用上述指纹图谱建立的条件获得待评价样品的指纹图谱，然后将其与前述标准指纹图谱进行比较，利用相似度评价软件进行评价，考察其相似性，相似度大于0.90则判定样品符合要求。本发明的典型实施例中采用的评价软件是国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价***(2004A版)。还可以进一步将标准指纹图谱中所述8个对照品对应的峰的峰面积，与待测样品对应的峰面积进行比较，后者峰面积越大，说明样品质量越好。在另一种优选实施方式中，可以进一步比较这8个峰的相似度，相似度越高，则药品质量越好。

方法学验证

精密度的考察

按照供试品溶液的制备方法制备一份样品，以确定的最优色谱条件重复进样6次，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别在0.06～0.14％和0.15～3.00％之间，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。见表3、4。

表3漏芦花药材指纹图谱精密度实验(相对保留时间)

表4漏芦花药材指纹图谱精密度实验(相对峰面积)

稳定性考察

按照确定的供试品溶液的制备方法制备S7号样品，以确定的最优色谱条件分别在0、2,、4、8、12、24h进样分析，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值在0.05～0.18％和0.49～2.93％之间，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。见表5、6。

表5漏芦花药材指纹图谱稳定性实验(相对保留时间)

表6漏芦花药材指纹图谱稳定性实验(相对峰面积)

重复性试验

按照确定的供试品溶液的制备方法平行制备S7号样品5份，以前述确定的最优色谱条件分别进样分析，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值在0.08～0.20％和0.89～2.90％之间，表明该方法重复性良好。见表7，8。

表7漏芦花药材指纹图谱重复性实验(相对保留时间)

表8漏芦花药材指纹图谱重复性性实验(相对峰面积)

11批漏芦花样品相似度评价

前述11批漏芦花药材中各取一份样品，用前述相同的方法得到各批药材的HPLC指纹图谱，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2004A版)”对各色谱图中的13个共有峰进行分析评价，以平均数法计算相似度，得出11批药材的相似度数据(表9)。各批次样品HPLC指纹图谱叠加图见图4。

表9 11批药材的相似度数据

Claims

1.一种利用指纹图谱评价漏芦花药材质量的方法，包括以下步骤：

建立标准指纹图谱，包括：a)供试品溶液的制备：分别制备11个不同批次的漏芦花样品供试品溶液，取样品粉末，置100mL具塞锥形瓶中，加70％甲醇，超声提取，放置到室温后，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，滤过，取滤液以0.45μm微孔滤膜滤过，备用；b)对照品溶液的制备：称取1)蜕皮甾酮、2)槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、3)芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、4)山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、5)泥胡木脂素B苷、6)木犀草素、7)芹菜素、8)5,7,4’-三羟基-3’-甲氧基黄酮共8种对照品，用甲醇溶解定容，制成一定浓度的单一对照溶液，微孔滤膜0.45μm滤过，备用；c)将各供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中，分别获得指纹图谱，色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：乙腈A-0.2％磷酸水溶液B，采用梯度洗脱：0min～12min～13min～60min、85％B～78％B～74％B～60％B；检测条件：DAD检测器，检测波长230～400nm；柱温：20～40℃；进样量：5～30μL；d)用相似度评价软件计算11个样品的相似度，从中确定一个相似度最高的作为标准指纹图谱；

用上述相同的方式获得一个待评价样品的指纹图谱；

用前述相似度评价软件评价所述待评价样品指纹图谱和所述标准指纹图谱的相似度，相似度大于0.9则判定所述待评价样品质量符合要求。

2.如权利要求1所述的方法，其中，色谱柱采用岛津Inertsil ODS-SP HPLC色谱柱或者规格为250mm×4.6mm,5μm的YMC-Pack ODS-A色谱柱。

3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤a)中，取药材粉末约0.2g，精密称定，加入70％甲醇25mL，超声提取40min，放置到室温后，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，滤过，取滤液以0.45μm微孔滤膜滤过。

4.如权利要求3所述的方法，其中，流速为1.2mL/min；检测波长254nm；柱温25℃；进样量10μL。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述标准指纹图谱包含以下13个共有峰，各峰的保留时间分别为：5.40，11.24，16.47，17.46，18.53，18.91，20.92，22.62，23.01，25.43，27.66，33.59，35.22。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述13个共有峰的相对峰面积分别为0.164，1.000，1.280，0.378，0.115，0.061，0.617，0.056，0.251，0.446，0.491，0.268，0.038。