CN102532272A - HepG2细胞表面特异性结合的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HepG2细胞表面特异性结合的多肽，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到4条多肽片段，其氨基酸序列分别为：LLADTTHHRPWT，LLADTPHHRPWT，FGWVTPHHELRS和SLSDLTHMGPWP。本发明利用噬菌体多肽展示技术筛选肝癌HepG2细胞结合的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体克隆与肝癌细胞的亲和力，获得8个噬菌体克隆，测序获得4条多肽序列，其共有氨基酸序列(基序)为***D(V)TT(P)HH*P(L)W(R)*，同源性分析表明多肽基序可能为肿瘤细胞表面受体结合的配体蛋白上的氨基酸决定簇，细胞免疫荧光进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合HepG2细胞，筛选获得的肝癌HepG2细胞特异性多肽为肝癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向短肽药物的研发提供实验依据。

Description

HepG2细胞表面特异性结合的多肽

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及筛选肿瘤组织特异性结合肽，特别是一种HepG2细胞表面特异性结合的多肽。

背景技术

肝癌(Hepatocarcinoma)是消化道常见恶性肿瘤之一。在中国，肝癌是发病率高、死亡率高、治疗费用高的疾病。根据世界卫生组织的数据显示，我国每年至少有肝癌死亡人数55万。80％以上肝癌患者是由肝炎病毒携带者或慢性肝炎患者转化而来。我国是世界上肝癌高发区之一，其肝癌发病率约为欧美地区的10倍，主要分布在东南沿海。发展中国家此类肿瘤的新发病例数约占全球发病总数的77％，而中国就占了全球发病总数的43％。就死亡率而言，肝癌在我国恶性肿瘤死亡率位居第二，仅次于肺癌，每年约50万人死于肝癌，而且发病率和死亡率一直处于上升趋势。因为肝癌在早中期可能不会有症状，所以多数癌症病人就诊时已是晚期，错过了肝癌治疗的最佳时间。晚期肝癌的有效治疗方案很少，病人多数前景不好。所以，要提高肝癌术后生存率和降低死亡率的关键就在于早期发现、早期诊断和早期治疗。但是，目前对肝癌由于仍然缺乏特异的、廉价的、方便的早期诊断方法，所以对肝癌的早期检出率仍很低，病人死亡率仍很高。

噬菌体展示技术(Phage Display Technology)是一项特异性多肽或蛋白的筛选技术，1985年由美国Missouri大学G.P.Smith等首创，此技术可将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(如抗体、酶和细胞表面受体等)的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。噬菌体展示技术已被广泛用于肿瘤诊断标志物和抗肿瘤先导化合物的筛选、肿瘤特异性抗体和肿瘤药物靶向运输等方面的研究。

噬菌体展示技术正逐步发展成熟，为获取对癌症诊断和治疗有价值的多肽或抗体提供了重要手段。目前已发现多种与肿瘤相关的基因和抗原，肿瘤相关配体和多肽的筛选已成为寻找抗肿瘤药物的新热点，针对肿瘤细胞不同表达分子的特异性结合多肽，为肿瘤治疗提供了新的靶点，也为放射标记的肿瘤检测、化疗药物的给药、药物敏感实验及肿瘤的免疫治疗提供了新的分子靶位，噬菌体多肽还具有抑制肿瘤相关基因转录、阻碍肿瘤新生血管生成和转移及诱导肿瘤细胞凋亡等作用，将多肽与脂质体或纳米药物偶联，既有助于在达到更好的靶向治疗效果，又减小了药物的毒副作用，还可用于肿瘤血管三维成像和分子影像技术的检测及肿瘤治疗疗效评价。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种HepG2细胞表面特异性结合的多肽，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到4条多肽片段，并鉴定它们与肝癌细胞的亲和力和特异性，分析氨基酸序列组成，寻找能够和肝癌细胞特异性结合的配体，分析这些蛋白与细胞结合的氨基酸表位，为研究噬菌体展示多肽在肿瘤早期诊断和靶向药物治疗等研究方面提供实验依据。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

HepG2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到4条多肽片段，其氨基酸序列分别为：LLADTTHHRPWT，LLADTPHHRPWT，FGWVTPHHELRS和SLSDLTHMGPWP。

4条多肽片段均为亲水性多肽，且4条多肽片段的氨基酸序列具有一定的同源性，其共有氨基酸序列(基序)为***D(V)TT(P)HH*P(L)W(R)*(“*”表示该位点氨基酸不确定)。

4条多肽片段能够特异性结合HepG2细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞。

上述HepG2细胞表面特异性结合的多肽的筛选方法，利用噬菌体随机十二肽库，以体外培养的肝癌HepG2细胞系为靶细胞，以人胚肾细胞HEK293细胞系为吸附细胞，进行4轮全细胞消减筛选，随机挑取30个噬菌体克隆扩增并滴定，利用酶联免疫吸附实验鉴定阳性克隆，比较阳性克隆与HepG2细胞的亲和力，排除假阳性克隆，提取阳性噬菌体克隆单链DNA测序，分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同源性比较，检索出现频率高的多肽基序，BLAST检索蛋白质数据库，检测多肽基序同源性较高的蛋白质，及可能结合的细胞表面受体和配体；细胞免疫荧光法检测噬菌体多肽克隆的靶向性，进一步鉴定阳性克隆的特异性。

本发明利用噬菌体多肽展示技术筛选肝癌HepG2细胞结合的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体克隆与肝癌细胞的亲和力，获得8个阳性噬菌体克隆，测序获得4条多肽序列，其共有氨基酸序列(基序)为***D(V)TT(P)HH*P(L)W(R)*，同源性分析表明多肽基序可能为肿瘤细胞表面受体结合的配体蛋白上的氨基酸决定簇，细胞免疫荧光进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合HepG2细胞，筛选获得的肝癌HepG2细胞特异性多肽为肝癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向短肽药物的研发提供了实验依据。

附图说明

图1是本发明的具体技术路线图；

图2是随机十二肽pIII融合蛋白的N末端序列；

图3是精简遗传密码表；

图4是8个噬菌体阳性克隆与HepG2细胞亲和力的ELISA鉴定；

图5A、图5B、图5C和图5D分别是四条噬菌体多肽的氨基酸疏水性图；

图6A～X分别是噬菌体阳性克隆靶向HepG2细胞的免疫荧光检测(×200)图，其中：

A，B，C，D：HepG2cells(A and B)and HEK293 cells(C and D)incubated with PC28positive clone that displays HCSP1 peptide under the light microscope and the fluorescentmicroscope；E，F，G，H：HepG2 cells(E and F)and HEK293 cells(G and H)incubatedwith PC26 positive clone that displays HCSP2 peptide under the light microscope and thefluorescent microscope；I，J，K，L：HepG2 cells(I and J)and HEK293 cells(K and L)incubated with PC24 positive clone that displays HCSP3 peptide under the light microscopeand the fluorescent microscope；M，N，O，P：HepG2 cells(M and N)and HEK293 cells(Oand P)incubated with PC16 positive clone that displays HCSP4 peptide under the lightmicroscope and the fluorescent microscope；Q，R，S，T：HepG2 cells(Q and R)and HEK293(S and T)cells incubated with irrelevent phage under the light microscope and the fluorescentmicroscope；U，V，W，X：HepG2 cells(U and V)and HEK293 cells(W and X)incubatedwith PBS under the light microscope and the fluorescent microscope。

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

一、技术路线

本发明采用噬菌体多肽展示技术，以人肝癌HepG2细胞系为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞进行4轮消减筛选，从噬菌体12肽库中筛选能特异性结合肝癌HepG2细胞的多肽基序，检索其可能识别的细胞表面受体，为肝癌早期诊断和靶向治疗的进一步研究提供良好的实验依据，具体技术路线如图1所示。

二、材料与方法

2.1主要实验材料

2.1.1细胞、噬菌体多肽库、宿主菌

(1)细胞株：人肝癌细胞株HepG2，人胚肾细胞株HEK293，购于美国ATCC(Rockville，美国)。

(2)噬菌体肽库：随机十二肽噬菌体展示文库(Ph.D.-12TM Phage Display PeptideLibrary Kit)购自New England Biolabs，USA，滴度1.5×1013pfu/ml，贮存于含50％甘油的TBS溶液中。复杂度～2.7×109个转化子，于M13噬菌体cPIII蛋白的Kpn-I和Eag-I位点之间***外源序列。-96gIII测序引物序列为5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAACG-3’。

(3)宿主菌：大肠杆菌E.coli ER2738：F’laclqΔ(lacZ)M15proA+B+zzf::Tn10(TetR)/fhuA2supEthiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5(rk-mk-McrBC-)。该菌株以含50％甘油的菌体培养物形式贮存于-80℃：非感受态细胞，购自New England Biolabs，USA。

2.1.2主要试剂及耗材

(1)RPMI 1640培养基：购自Gibco公司。

(2)DMEM培养基：购自Gibco公司。

(3)胎牛血清：购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。

(4)青霉素、链霉素、庆大霉素及胰蛋白酶：购自Amresco公司。

(5)DMSO、台盼蓝：购自Sigma公司。

(6)PEG8000：购自北京索莱宝科技有限公司。

(7)IPTG、BSA：购自西安沃尔森生物技术有限公司。

(8)Xgal、DMF、NaN3、四环素、Tween-20、Agar购自Amresco公司。

(9)D-Glucose：购自上海生工生物工程公司。

(10)Bacto-Tryptone、酵母提取物：购自OXOID，England。

(11)Agarose：购自美国Invitrogen公司。

(12)山羊抗M13多克隆抗体：购自Santa Cruz Biotechnology，Inc公司。

(13)辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗山羊IgG：购自北京博奥森生物技术有限公司。

(14)多聚甲醛：购自Sigma公司。

(15)TMB：购自Boston Biomedica，Inc.(BBI)公司。

(16)FITC标记兔抗山羊IgG：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

(17)常规生物化学试剂：购自西安沃尔森生物技术有限公司。

2.1.3主要试剂的配制

(1)四环素贮液：以20mg/ml的浓度溶于无水乙醇中，封装至1.5ml无菌离心管中，1ml/管，-40℃避光保存，用前混匀。

(2)5×M9盐溶液：称取Na2HPO4·12H2O 42.74g，KH2PO47.5g，NaCl 1.25g，NH4Cl2.5g，溶于400ml三蒸水中，磁力搅拌至完全溶解，三蒸水定容至500ml，高压蒸汽灭菌，室温保存。

(3)20％Glucose：称取20g Glucose，溶于100ml三蒸水，用0.22μm过滤器过滤除菌，4℃贮存。

(4)含四环素抗性的1×M9基本培养基：取5×M9盐溶液100ml，称取琼脂粉7.5g，调节pH至7.0，三蒸水定容至500ml，高压蒸汽灭菌，冷却至低于70℃时，加入无菌的20％Glucose 10ml，及四环素贮液625μl(终浓度50μg/ml)，混匀倒平板。平板4℃避光保存。

(5)含四环素抗性的LB medium(pH 7.4)：称取胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaCl 2.5g，溶解于400ml三蒸水中，磁力搅拌至完全溶解。用1M的NaOH调节pH值至7.0，三蒸水定容至500ml。高压蒸汽灭菌30min，冷却至低于50℃时，加入四环素贮液1.25ml(终浓度50μg/ml)，4℃避光保存。

(6)TBS：50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，高压灭菌，室温保存。

(7)PEG/NaCl：20％(w/v)PEG8000，2.5M NaCl，高压灭菌，室温保存。

(8)IPTG/Xgal：将1.25g IPTG和1g Xgal溶于25ml DMF中，充分混匀，锡箔纸包裹，-20℃保存。

(9)LB/IPTG/Xgal平板：1L LB medium，加入15g琼脂粉，高压灭菌30min，室温冷却至低于70℃时，加入1ml IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光保存。

(10)顶层琼脂糖(Top Agarose)：称取Bacto-Tryptone：1g，yeast extract：0.5g，NaCl：0.5g，MgCl·6H2O：0.1g，Agarose：0.7g，高压灭菌30min，封装至无菌50ml离心管中，室温保存，用时微波炉融化。

(11)PBS磷酸盐缓冲液：称取NaCl 8g，KCl：0.2g，Na2HPO4·12H2O：1.44g，KH2PO4：0.24g，溶于900ml三蒸水中，磁力搅拌充分溶解，用10N HCl调节pH值至7.4，三蒸水定容至1L。高压灭菌，室温保存。

(12)Blocking buffer：3％BSA溶于PBS(pH7.4)，0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存。

(13)TBST：50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，不同浓度(v/v)的Tween-20(0.1％、0.2％、0.3％、0.5％)，高压灭菌，室温保存。

(14)RPMI 1640完全培养基：取RPMI 1640培养基干粉3包，溶于2L超纯三蒸水，并用三蒸水清洗包装袋2～3次(洗液一并加入培养基中)，加入NaHCO3：6g，FBS：300ml，抗生素各30ml(青霉素/链霉素终浓度为100U/ml，庆大霉素终浓度为100μg/ml)，磁力搅拌至完全溶解，10N HCl调节pH值至7.2左右(过滤后pH值会升高0.2～0.3)，超纯三蒸水定容至3L。0.22μm过滤器过滤除菌，分装于500ml灭菌试剂瓶，4℃保存。

(15)DMEM完全培养基：取DMEM培养基干粉3包，溶于2L超纯三蒸水，并用三蒸水清洗包装袋2～3次(洗液一并加入培养基中)，加入NaHCO3 7.2g，FBS 300ml，抗生素各30ml(青霉素/链霉素终浓度为100U/ml，庆大霉素终浓度为100μg/ml)，磁力搅拌至完全溶解，10N HCl调节pH值至7.2左右，超纯三蒸水定容至3L。0.22μm过滤器过滤除菌，分装于500ml灭菌试剂瓶，4℃保存。

(16)0.25％Trypsin-0.02％EDTA：称取0.25g胰蛋白酶Trypsin粉剂，溶于100ml0.1M PBS中，加入1M EDTA 54μl，磁棒慢速搅拌5～6小时，0.22μm过滤器过滤除菌，4℃保存。

(17)4％台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加入少量三蒸水研磨，加三蒸水定容至100ml，用滤纸过滤，4℃保存，使用时用PBS稀释母液至0.4％使用液。

(18)4％多聚甲醛固定液：称取4g多聚甲醛粉末，溶于100ml PBS(pH7.2)，磁力搅拌溶解，稍许加热至60℃，加入几滴1M NaOH助溶完全，0.22μm滤器过滤，4℃保存。

(19)TMB底物贮液：称取10mg TMB粉末，溶于5ml DMSO中，锡箔纸包裹，4℃保存。

(20)TMB底物缓冲液(pH5.5)：溶液A：柠檬酸(C6H8O7·H2O)0.1mol/L；溶液B：磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)0.2mol/L；将溶液A、溶液B和三蒸水按体积比24.3∶25.7∶50的比例混合，高压灭菌，4℃保存。

(21)TMB工作液：依次取TMB底物缓冲液9.5ml，0.75％H2O2 42μl，TMB底物贮液0.5ml，于10ml灭菌离心管中充分混匀，避光操作，现用现配。

(22)显色终止液：2M H2SO4。

(23)碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，4M NaI。室温避光保存。

2.2实验方法

2.2.1细胞培养

2.2.1.1细胞复苏

用酒精棉球擦拭超净工作台台面，紫外线照射30min以上，37℃水浴预热RPMI1640培养基和DMEM培养基，从液氮罐中取出冻存的HepG2细胞冻存管，迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并不断的摇动，使管中的液体迅速融化。约1～2min后冻存管内液体完全溶解，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，移入超净台内，无菌条件下将细胞悬液转入10ml离心管中，加入5ml RPMI1640培养基，用托架天平平衡后800rpm低速离心3min，弃上清。加入RPMI1640培养基重悬细胞，转入10cm2培养瓶中。将培养瓶移至37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱内培养。重复同样操作复苏HEK293细胞。

2.2.1.2细胞传代培养

次日更换培养液一次，待细胞长至90％融合时，小心吸弃去旧培养基，用预热的PBS轻轻洗涤细胞，加入适量胰蛋白酶消化液37℃消化3～5min，倒置显微镜下观察，待细胞胞质回缩变圆、细胞不再粘连成片时，吸弃消化液，加入RPMI 1640完全培养基，用滴管轻柔吹打已消化细胞成细胞悬液，将细胞悬液转移至10ml离心管，平衡后将离心管放入台式离心机，800rpm，离心5min，小心吸弃上清，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞悬液，封装于2～3个培养瓶，补足培养基后旋紧瓶盖。倒置显微镜下观察细胞数量，传代细胞密度不应少于1×105cells/ml，置于37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱，拧松瓶盖培养。2～3日待细胞铺满瓶底继续传代。

2.2.1.3细胞冻存

冻存前24h进行细胞换液，取培养2～3天对数生长期的细胞，按细胞传代方法收集细胞并计数，以1～5×106cells/ml细胞浓度悬浮于含10％DMSO的RPMI 1640完全培养基中，轻轻反复吹打均匀，1ml/管分装于冻存管中，置于冻存杯中室温放置2h，于-80℃超低温冰箱中过夜，次日置于液氮罐中长期保存并做好冻存记录。

2.2.2宿主菌E.coli ER2738的活化

(1)复苏：取250μl LB-Tet液体培养基于1.5ml无菌离心管中，以无菌技术从E.coliER2738的甘油冻存物中取出2～3μl菌液与之充分混匀，滴加至M9-Tet平板，用灭菌玻璃珠涂布2～3min，倒出玻璃珠，平板室温放置5min，标记后置于37℃细菌培养箱倒置培养过夜。次日长出克隆后封口膜封口，4℃避光保存备用。

(2)培养：取3ml LB-Tet液体培养基置于10ml灭菌离心管中，用无菌枪头以无菌技术挑取单克隆置于其中，标记后置于恒温摇床37℃，300rpm振荡培养过夜。细菌扩增液于4℃保存备用，取一管细菌与灭菌甘油1∶1混合，分装于1.5ml无菌离心管，每管1ml，-80℃超低温冰箱保存。

2.2.3噬菌体展示十二肽库的消减筛选

以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞，肝癌HepG2细胞为靶细胞，参照随机十二肽噬菌体展示文库(Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit)使用说明书，优化改良筛选方法，进行4轮消减筛选，保持每一轮筛选投入噬菌体量不少于1.5×1010PFU。第一轮筛选程序如下：

(1)细胞准备：将生长状态良好的人肝癌细胞HepG2和人胚肾HEK293细胞，分别传代，接种于10cm2细胞培养瓶，置于37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱培养24h后换液，培养至细胞贴壁，生长状态良好，待融合度为90％以上，汇合成单层细胞时进行筛选。

(2)细菌活化：将过夜振荡培养的ER2738以1∶100稀释于20ml LB-Tet液体培养基中，37℃，225rpm，缓慢振摇2～3h至对数前期，于紫外分光光度计上测OD600～0.5。

(3)封闭：取融合度为90％以上的HEK293细胞，吸弃培养基，用PBS轻轻洗涤两次，加无血清培养基，37℃、5％CO2培养1h，吸去培养液，加入Blocking buffer(3％BSA+PBS)，37℃封闭2h；重复同样操作，封闭肝癌细胞HepG2细胞。

(4)洗涤：吸弃封闭液，用0.1％TBST轻柔地洗涤6次，操作要避免细胞脱落。

(5)阴性细胞吸附：将10μl噬菌体库(第2轮至第4轮筛选取扩增库1.5×1010PFU)与1ml TBS混合，与HEK293细胞孵育，37℃，孵育1h，孵育期间每隔15min放脱色摇床上微摇。

(6)取上清：用吸管缓慢吸取上清，转移至2ml灭菌离心管，1000rpm，离心5min，转移上清至新离心管，再离心一次以去除上清中可能含有的细胞。

(7)结合：迅速将上清与已封闭、洗涤好的肝癌HepG2细胞孵育，37℃，孵育2h。

(8)洗涤：小心吸弃上清，消化收集细胞于离心管，1000rpm，离心5min，吸弃上清，用0.1％TBST反复吹打洗涤HepG2细胞20次，1000rpm，离心5min，重复洗涤4次，弃尽上清获得细胞沉淀，用无菌滤纸条吸尽剩余液滴。

(9)扩增：将细胞沉淀加入已摇至对数前期的ER2738菌液中，置于恒温摇床，37℃，225rpm，振荡培养4.5h。

(10)噬菌体纯化：

①将噬菌体扩增菌液分装于灭菌的1.5ml离心管，每管1ml，13000rpm，离心10min，上清转入新离心管中，再离心，取上清上部80％转入新离心管中。

②加入1/6体积的PEG/NaCl(167μl/tube)，反复vertex混匀，4℃沉淀噬菌体过夜。

③次日，4℃，13000rpm，离心过夜沉淀物15min。

④倒掉上清，再次短暂离心，用微量移液器吸尽残留上清液。

⑤每管加入1ml TBS重悬沉淀，反复vertex混匀，悬液转移至灭菌1.5ml离心管中，4℃，13000rpm，离心5min，以去除残余细胞。

⑥上清转入另一无菌微量离心管中，用1/6PEG/NaCl(170μl/tube)，反复vertex混匀，再次沉淀，冰上孵育60min，4℃，13000rpm，离心10min。

⑦弃上清，再次短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。

⑧每管加入200μl TBS/0.02％NaN3，反复vertex混匀，短暂离心1min，沉淀任何残余不溶物，上清转入新1.5ml离心管中，此即为扩增后的一级库，标记，以1∶1加入灭菌甘油，-20℃保存。

(11)噬菌体滴定：

①取2～3μl E.coli ER2738宿主菌，涂布M9-Tet平板，置于恒温培养箱37℃倒置培养过夜。

②菌操作挑取分离良好的单克隆于3ml LB-Tet液体培养基中，置于恒温摇床37℃，300rpm，振荡培养16～18小时。

③将过夜ER2738培养物1∶100稀释于3ml LB-Tet培养基中，225rpm，振荡培养1.5h～2h，至OD600～0.5。

④准备5个LB/IPTG/Xgal平板于37℃恒温培养箱预热(每个噬菌体稀释度对应一个平板)。

⑤预先准备45℃水浴，微波炉中融化Top Agarose，分装于10ml离心管中，3ml/tube，置于水浴中备用。

⑥将ER2738(OD600～0.5)分装于1.5ml灭菌离心管中(每个噬菌体稀释度对应一管)，200μl/tube，4℃保存备用。

⑦在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体扩增库，稀释范围为102～1011。

⑧取107～1011不同噬菌体稀释度，每管10μl，分别与200μl宿主菌混合，快速振荡混匀，室温温育5min。

⑨将感染的细菌快速加入45℃预温的Top Agarose中，每次一管，快速vortex混匀，立即倾注于37℃预热的LB/IPTG/Xgal平板上，快速旋转倾斜平版使之均匀铺展开来。室温冷却5min，置于恒温培养箱中，37℃倒置培养过夜。

⑩次日，待平板长出蓝斑，选择密度合适(～100个蓝斑)的平板计数，计算扩增噬菌体库的滴度。计算方法如下：扩增噬菌体库的滴度＝(蓝斑数目×对应噬菌体稀释倍数)/10μl(pfu/μl)。

(12)下一轮筛选：将滴定后的次级库再次与HEK293细胞和肝癌HepG2细胞孵育，筛选过程如上述，分别用上一轮结合、扩增、滴定的噬菌体次级库，进行3轮筛选，每轮筛选投入的噬菌体量均为1.5×1010PFU，逐轮增加筛选强度：与阴性细胞HEK293细胞孵育时间增加至1.25h、1.5h、2h；与靶细胞HepG2细胞孵育时间每轮筛选减少为1.5h、1.25h、1h；TBST洗涤次数相应增加为6次、8次、10次；洗涤液中Tween-20浓度依次增加为0.2％、0.3％、0.5％。

2.2.4细胞ELISA初步鉴定噬菌体阳性克隆

2.2.4.1噬菌体单克隆的制备

(1)经过第4轮筛选获得的噬菌体不经过扩增，直接感染宿主菌E.coli ER2738，滴定铺制LB/IPTG/Xgal平板，37℃倒置培养过夜。

(2)将过夜培养的宿主菌按1∶100比例稀释于LB-Tet液体培养基，分装于30个10ml离心管，每管3ml。

(3)无菌操作，从长出蓝斑数目～100的平板上，随机挑取30个噬菌体克隆，接种到分装好的离心管中，于37℃恒温摇床，225rpm，缓慢振摇4.5h。

(4)将每个噬菌体单克隆扩增液分装于灭菌1.5ml离心管中，按照上述“噬菌体纯化”方法纯化每个单克隆。

(5)滴定每一个噬菌体单克隆。

(6)以同样方法滴定原始噬菌体肽库，从滴定平板上随机提取一个克隆扩增、滴定，以作为阴性噬菌体克隆对照。

2.2.4.2ELISA法鉴定噬菌体单克隆与肝癌细胞结合的特异性

以人胚肾细胞系HEK293细胞为阴性对照细胞，人源肝癌细胞系HepG2细胞为靶细胞，用全细胞酶联免疫吸附实验(ELISA)鉴定随机挑取的30个噬菌体克隆结合特异性和亲和力，以排除假阳性和非特异性克隆，同时设立PBS对照及原始噬菌体肽库单克隆对照(无关克隆对照)。具体操作方法如下：

(1)取生长状态良好的肝癌细胞HepG2和HEK293细胞，传代消化，细胞计数，接种96孔细胞培养板，密度4×105cells/ml，每孔200μl，每组设两个复孔，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育24～36h，待细胞贴壁长满单层进行下步实验。

(2)吸弃培养基，用预热的PBS洗涤2次，每孔加入200μl无血清培养基，置细胞培养箱孵育1h。

(3)吸弃培养基，PBS洗涤2次，加入4％多聚甲醛，100μl/孔，室温固定30min。

(4)吸弃固定液，在吸水纸上轻轻拍干，PBS洗涤5min×3次。

(5)在吸水纸上轻轻拍干，滴加3％H₂O₂，100μl/孔，室温孵育20min，以阻断内源性过氧化物酶活性。

(6)弃H₂O₂，在吸水纸上轻轻拍干，PBS洗涤5min×3次。

(7)加入Blocking buffer(3％BSA in 0.5％TBST)，250μl/孔，室温封闭2h。

(8)吸去封闭液，0.1％TBST洗涤5次，分别加入噬菌体单克隆，1×1010PFU，100μl/孔(稀释于0.2％TBST)，设PBS对照和原始噬菌体肽库单克隆对照，37℃孵育1.5h，间隔20min置脱色摇床缓慢振摇。

(9)吸去噬菌体克隆，在吸水纸上轻轻拍干，PBS振荡洗涤5min×5次。

(10)加入山羊抗M13多克隆抗体(1∶2000稀释于Blocking buffer)，100μl/孔，37℃孵育1h，并间隔15min放脱色摇床上缓慢振摇。

(11)吸弃一抗，在吸水纸上轻轻拍干，PBS振荡洗涤5min×5次。

(12)加入HRP标记兔抗山羊IgG(1∶8000稀释于Blocking buffer)，100μl/孔，37℃孵育1h，并间隔15min放脱色摇床上缓慢振摇。

(13)吸弃二抗，在吸水纸上轻轻拍干，PBS振荡洗涤5min×5次。

(14)在吸水纸上轻轻拍干，加入现配TMB显色工作液，100μl/孔，37℃孵育10～30min，肉眼观察(白色背景)，阳性孔应为蓝色或深蓝色，阴性孔和对照孔应无色或淡蓝色。

(15)加入显色终止液(2M H2SO4)终止反应，50μl/孔，立即用酶标仪于450nm波长下测OD值，记录数据。

(16)判定结果，分析酶标测定仪取λ＝450nm，P/n≥2.1时阳性，P/n≤1.5阴性，1.5＜P/n＜2.1可疑阳性。重复上述步骤3次，3次ELISA检测P/n＞2.1的克隆为阳性克隆。P/n＝肝癌HepG2细胞孔O.D值/人胚肾HEK293细胞孔O.D值(用空白孔校T＝100％)。

(17)接种肝癌HepG2细胞于96孔细胞培养板，重复以上ELISA实验步骤，进一步鉴定阳性克隆与肝癌HepG2细胞的结合活性，排除假阳性克隆，比较阳性克隆与HepG2细胞亲和力，每个克隆设8个复孔，同时设PBS对照和无关克隆对照。

2.2.5阳性噬菌体克隆单链DNA快速纯化

(1)按上述噬菌体扩增方法，扩增阳性克隆，在第一步离心后，将500μl含噬菌体上清转入新无菌1.5ml离心管中。

(2)加入200μl PEG/NaCl，反复颠倒混匀，室温放置10min。

(3)4℃，12000rpm，离心15min，去上清，再次短暂离心，小心吸去残余上清。

(4)沉淀物彻底重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl无水乙醇。室温温育10min。短时间的室温温育使ssDNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。

(5)4℃，10000rpm，离心10min，弃上清。用70％乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。

(6)沉淀重悬于30μl TE(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)中。

2.2.6噬菌体单链DNA测序

取5μl噬菌体阳性克隆、噬菌体原库无关克隆对照和阴性克隆单链DNA作为模板，稀释-96gIII测序引物：5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’，送南京金丝瑞生物工程公司全自动测序。根据噬菌体展示试剂盒说明书读序图，利用DNAStar软件找到Egal I酶切位点CGGCCG和Kpn I酶切位点GGTACC，十二肽序列即***这两个酶切位点之间，找出编码Gly-Gly-Gly的碱基序列(GGT GGA GGT或CCA CCT CCA)其上游36个碱基为编码十二肽的密码子，按照十二肽库的设计原则，每个密码子的第三位均为G或T，验证找到的碱基序列是否正确，利用软件得出模板链的碱基序列，按照试剂盒说明书提供的三联密码子图翻译成多肽序列(参见图2)。

融合蛋白表达时N端有一段信号肽前导序列，蛋白分泌后前导序列被切除，使随机肽直接位于成熟蛋白的N末端，下箭头指示前导序列的切割位点。-28和-96引物的互补位置也在图中标出。

参见图3，文库的随机序列区域仅用32个密码子编码所有20种氨基酸。这使单密码子氨基酸的出现频率相对较高，同时排除了三个终止密码子中的两个。在构建该文库的菌株中，琥珀终止子TAG^*可被Gln抑制。

2.2.7阳性克隆氨基酸序列的同源性和特征分析

将翻译的氨基酸序列通过NCBI/BLAST软件同数据库中蛋白质的氨基酸序列进行同源性分析，将出现频率较高的序列用ExPASY提供的软件ProtParam tools来分析12肽片段的组成及特点，利用FASTA工具来分析多肽序列的疏水性。

2.2.8细胞免疫荧光法鉴定阳性噬菌体克隆的靶向性

(1)细胞爬片的准备：

①将24mm×24mm盖玻片浸泡，洗洁精清洗，自来水冲洗，稀盐酸浸泡8h，流水冲洗，铬酸浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水、三蒸水冲洗三次，置于玻璃培养皿中高压灭菌，烘干备用；

②在6孔细胞培养板中滴加少量细胞培养基，用无菌操作，夹取盖玻片，放入培养板孔中，使其贴附到孔底；

③取生长状态良好的肝癌HepG2细胞和人胚肾HEK293细胞，PBS冲洗一遍，胰蛋白酶消化收集细胞，细胞计数，接种至6孔细胞培养板孔中的盖玻片上，4×105cells/ml，1ml/well，置于37℃，5％CO2细胞培养箱，培养24h。

(2)免疫荧光检测阳性噬菌体克隆的靶向性：

①待HepG2细胞和HEK293细胞培养至长满单层，吸弃培养基，PBS冲洗3次，吸尽残留液体，4％多聚甲醛室温固定细胞，30min；

②用PBS洗涤5min×3次；

③滴加3％BSA室温封闭2h；

④弃封闭液，分别将展示CCSP1～4多肽的噬菌体阳性克隆滴加至细胞表面(1×1010PFU)，37℃孵育2h；

⑤PBS洗涤5min×5次；

⑥滴加抗M13多克隆抗体(工作浓度1∶500)，37℃孵育2h；

⑦PBS洗涤5min×5次；

⑧滴加FITC标记兔抗山羊IgG(工作浓度1∶100)，37℃孵育1h；

⑨PBS洗涤5min×3次，90％缓冲甘油封片，尼康Ti-S倒置显微镜镜检并拍照记录。

2.2.9统计学方法

采用SPSS 16.0-GLM中的Univariate分析数据，数据均以±SD表示，组间多重比较采用Duncan检验处理。P＜0.01为差异极显著，P＜0.05为差异显著，P＞0.05为无统计学意义。

三、实验结果

3.1噬菌体十二肽库4轮消减筛选

本发明是从噬菌体随机十二肽库中筛选出与人肝癌细胞亲和力较高的噬菌体多肽，以人源肝癌HepG2细胞为靶细胞，以人胚肾细胞HEK293细胞为阴性吸附细胞，完成对噬菌体十二肽库4轮消减筛选，回收与肝癌HepG2细胞结合的噬菌体，重复对阴性细胞的消减筛选以排除非特异克隆。在筛选过程中，严格控制每轮筛选中加入噬菌体的数量，以保证筛选结果的稳定性。噬菌体原库的效价为1.5×1013pfu/ml，第一轮筛选投入噬菌体为1.5×10¹¹pfu，回收噬菌体滴定后每轮尽量保证投入噬菌体量在1.5×10¹⁰pfu以上(如表3-1和图4所示)，通过4轮消减筛选，特异性克隆得到大量富集和扩增，为进一步挑取阳性克隆奠定良好的实验基础，提高了获得具有高亲和力噬菌体十二肽的可能性。

表3-1四轮消减筛选中投入噬菌体量和回收噬菌体滴度

Round of biopanning	Input phages(pfu)	Output phages(pfu/ml)
			1	1.5×1011	1.75×1013
2	1.5×1011	1.60×1013
			3	1.5×1011	1.59×1013
4	1.5×1011	1.57×1013

3.2细胞ELISA初步鉴定噬菌体阳性克隆

第4轮消减筛选后不进行扩增，直接滴定，从约有100个蓝斑的LB/IPTG/Xgal平板上随机挑取30个噬菌体单克隆，感染宿主菌扩增、纯化并滴定，经细胞酶联免疫分析(ELISA)初步鉴定，依据噬菌体克隆与肝癌HepG2细胞结合情况，排除非特异性结合的克隆，以PBS为空白克隆对照，同时以原库单克隆为无关克隆对照(URPs)，三次实验结果显示(表3-1，表3-2)：OD450值阳性细胞组(HepG2细胞)与阴性细胞组(HEK293细胞)之比均大于2.1倍的克隆共有8个，分别是6、11、16、18、24、26、27、28，它们能与肝癌HepG2细胞较好结合，与人胚肾HEK293细胞亲和力较弱或不结合，无关克隆对照和PBS空白克隆对照组蓝色较弱或无色，初步确定此8个克隆为阳性克隆。利用ELISA法，对8个噬菌体阳性克隆在HepG2细胞上的结合特异性进行反复鉴定(图4)，对ELISA数据结果进行统计学分析，显示8个阳性克隆与HepG2细胞的亲和力均显著高于无关克隆对照组和PBS对照组(P＜0.01)，其中28号克隆与HepG2细胞结合的OD450值最高。

表3-2ELISA鉴定噬菌体单克隆与HepG2细胞的结合力

表3-3ELISA鉴定阳性克隆与HepG2细胞的亲和力

^**：P＜0.01与PBS对照组和噬菌体无关克隆(URPs)对照组比较。

#：P＞0.05与PBS对照组比较。

3.3噬菌体阳性克隆的测序结果及分析

3.3.1测序结果

对于细胞ELISA鉴定获得的噬菌体阳性克隆、噬菌体原库无关克隆对照和亲和力较弱的噬菌体克隆进行DNA测序，按照噬菌体展示试剂盒说明书提供的ssDNA提取方法，提取的噬菌体单链DNA测序后得到的是其互补碱基序列，利用DNAStar软件按照碱基互补配对原则转化为反向互补序列，按照噬菌体肽库使用说明书测序分析方法，噬菌体***片段位于Kpn I酶切位点GGTACC和Eag I酶切位点CGGCCG之间，即5’-(Kpn I)G GTA CCT TTC TAT TCT CAC TCT NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNKNNK NNK NNK GGT GGA GGT TCG GCC G(Eag I)-3’，其中第三位碱基K为G或T，其后面是一段间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，找到***序列并按照说明书中的遗传密码表推导出相应的氨基酸序列，测序结果如下：

(1)阳性克隆PC6和PC26：

两标志性酶切位点之间序列：

AACCTCCACCAGTCCACGGCCTATGATGCGTCGTATCCGCAAGCAGAGAGTGAGAATAGAAA

反向互补序列：

TTTCTATTCTCACTCTCTGCTTGCGGATACGACGCATCATAGGCCGTGGACTGGTGGAGGTT

12肽碱基序列：CTGCTTGCGGATACGACGCATCATAGGCCGTGGACT

12肽序列：LLADLTHMRPWT

(2)阳性克隆PC11和PC24：

两标志性酶切位点之间序列：

AACCTCCACCAGTCCACGGCCTATGATGCGGCGTATCCGCAAGCAGAGAGTGAGAATAGAAA

反向互补序列：

TTTCTATTCTCACTCTCTGCTTGCGGATACGCCGCATCATAGGCCGTGGACTGGTGGAGGTT

12肽碱基序列：CTGCTTGCGGATACGCCGCATCATAGGCCGTGGACT

12肽序列：LLADLPHMRPWT

(3)阳性克隆PC16：

两标志性酶切位点之间序列：

AACCTCCACCACTCCGAAGCTCATGATGCGGCGTAACCCATCCGAAGAGTGAGAATAGAA

反向互补序列：

TTTCTATTCTCACTCTTCGGATGGGTTACGCCGCATCATGAGCTTCGGAGTGGTGGAGTT

12肽碱基序列：TTCGGATGGGTTACGCCGCATCATGAGCTTCGGAGT

12肽序列：FGWVLPHMELRS

(4)阳性克隆PC18，PC27，PC28：

两标志性酶切位点之间序列：

AACCTCCACCCGGCCAAGGCCCATGATGAGTCGTATCCGAAAGCGAAGAGTGAGAATAGAA

反向互补序列：

TTTCTATTCTCACTCTCGCTTTCGGATACGACTCATCATGGGCCTTGGCCGGGTGGAGGTT

12肽碱基序列：TCGCTTTCGGATACGACTCATCATGGGCCTTGGCCG

12肽序列：SLSDLTHMGPWP

(5)噬菌体无关克隆对照：

两标志性酶切位点之间序列：

AACCTCCACCATGCGCCAGCCGCTGAAGCATACTATAAAACGGATCAGAGTGAGAATAGAAA

反向互补序列：

TTTCTATTCTCACTCGATCCGTTTTATAGTATGCTTCAGCGGCTGGCGCATGGTGGAGGTT

12肽碱基序列：GATCCGTTTTATAGTATGCTTCAGCGGCTGGCGCAT

12肽序列：DPFYSMLQRLAH

(6)阴性噬菌体克隆：PC1

两标志性酶切位点之间序列：

AACCTCCACCCACCGTAGCCTGATGCGGAGGAAAATTATGCGTCTTAGAGTGAGAATAGAA

反向互补序列：

TTCTATTCTCACTCAAGACGCATAATTTTCCTCCGCATCAGGCTACGGTGGGTGGAGGTT

12肽碱基序列：AAGACGCATAATTTTCCTCCGCATCAGGCTACGGTG

12肽序列：KTHNFPPHQATV

表3-4：噬菌体阳性克隆测序

Phage clones	DNA sequence	Peptide sequence
			PC6，PC26	CTGCTTGCGGATACGACGCATCATAGGCCGTGGACT	LLADTTHHRPWT
PC11，PC24	CTGCTTGCGGATACGCCGCATCATAGGCCGTGGACT	LLADTPHHRPWT
			PC16	TTCGGATGGGTTACGCCGCATCATGAGCTTCGGAGT	FGWVTPHHELRS
PC18，PC27，PC28	TCGCTTTCGGATACGACTCATCATGGGCCTTGGCCG	SLSDLTHMGPWP
			IRP	GATCCGTTTTATAGTATGCTTCAGCGGCTGGCGCAT	DPFYSMLQRLAH
PC1	AAGACGCATAATTTTCCTCCGCATCAGGCTACGGTG	KTHNFPPHQATV
			PC14	GCTGAGCCTTTTTATACGTATATGGCTAATCGTCTG	AEPFYTYMANRL

测序结果如表3-4显示，11个噬菌体克隆测序正确、含有外源***的随机序列，并在随机区域内含有编码十二肽的36个碱基，且每一密码子第三位碱基为G或T，符合噬菌体随机肽库的构建原则，结果显示与肝癌细胞结合的阳性噬菌体克隆含有4个公有序列：LLADTTHHRPWT，LLADTPHHRPWT，FGWVTPHHELRS和SLSDLTHMGPWP。噬菌体原库无关克隆对照序列为DPFYSMLQRLAH；两个亲和力较低的克隆序列为KTHNFPPHQATV、AEPFYTYMANRL。

3.3.2氨基酸序列同源性分析

3.3.2.1四种氨基酸序列之间的同源性分析

将4条肝癌HepG2细胞特异性多肽共有序列分别命名为HCSP1、HCSP2、HCSP3、HCSP4。序列之间有不同程度的重复序列，登录EMBL EBI网站(http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align)，比较四种多肽片段之间的同源性(表4-5)。将四条多肽序列编辑为FASTA格式，采用Clustal X1.83软件分析，Load序列，选择DoComplete Alignment菜单，寻找保守氨基酸位点。通过BioEdit软件分析四条多肽序列的共有基序(Motif Sequence)，输出序列比对结果如下：

表3-5：四种***片段的氨基酸序列对比结果

注：Len表示多肽长度；Score表示同源性程度。

表3-6：Clustal X多序列比对

Peptide Name	Consenusus Sequence
		HCSP1	LLADTTHHRPWT
HCSP2	LLADTPHHRPWT
		HCSP3	FGWVTPHHELRS
HCSP4	SLSDTTHHGPWP
		Motif Sequence	***D(V)TT(P)HH*P(L)W(R)*

“*”：The random amino site

4.3.2.2与数据库已知蛋白质氨基酸序列的同源性分析

登陆NCBI/BLAST网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，选择Bacic BLAST菜单下的protein blast，输入多肽序列，选择Non-redundant protein sequences(nr)数据库，限定为人源性(Homo sapiens)，Program Selection选择blastp(protein-protein BLAST)，将这4个十二肽序列分别与数据库中已知蛋白质氨基酸序列进行同源性分析。在噬菌体展示多肽库与肝癌细胞孵育过程中，对多肽与癌细胞表面受体或配体的结合起决定作用的可能是多肽全部氨基酸或者若干个关键性的氨基酸基序如丝氨酸、脯氨酸和精氨酸等。因此将上述四条多肽序列与蛋白质数据库中已知蛋白相比较，结果发现它们与一些已知的蛋白质或多肽具有同源性如表列如下：

表3-7：十二肽HCSP1序列与蛋白质数据库的对比结果

注：score是打分矩阵计算出来的值，值越大说明所检索的序列跟目标序列匹配程度越大；E value表示序列被随机搜索出来的概率；Identities是相似程度，表示输入序列和数据库中序列的匹配程度；Query coverage是序列覆盖度。

表3-8：十二肽HCSP2序列与蛋白质数据库的对比结果

表3-9：十二肽HCSP3序列与蛋白质数据库的对比结果

表3-10：十二肽HCSP4序列与蛋白质数据库的对比结果

3.3.2.3氨基酸序列组成及特点分析

将四条十二肽基序用ExPASy网站提供的软件ProtParam tool(http://cn.expasy.org/tools/protparam.html)分析其氨基酸组成及其特点如下：

表3-11：四条阳性共有序列的氨基酸组成及特点

3.3.2.4短肽的疏水性分析

噬菌体展示的十二肽可以保持相对的空间结构，通过模拟配基蛋白中的氨基酸决定簇与细胞表面受体结合，这往往需要满足一定的条件，如具有亲水基团、位于蛋白质的表面及一定的柔韧性等。由于蛋白质的N端和C端序列的氨基酸通常位于蛋白质表面，一般都带有亲水基团，如NH3+和COO-，通常具有一定的柔韧性，所以N端和C端通常被视为寻找氨基酸决定簇的理想位置，而噬菌体随机展示多肽也大多构建在衣壳蛋白的N端。疏水性氨基酸在蛋白质内部，由于其疏水的相互作用，在保持蛋白质的三级结构上起重要作用，在酶和基质、抗体和抗原间的相互作用等各种非共价键的分子结合方面也具有重要作用。利用ExPASy网站ProtParam tool工具分析四条多肽序列的疏水性，利用BioEdit软件中的Kyte & Doolittle Mean Hydrophobicity Profile工具分析多肽每个氨基酸的疏水性。氨基酸的疏水指数介于-4.5～4.5之间，数字越大表示疏水程度越高，数字越小表示亲水能力越强，中间表示中性。

表3-12：多肽基序的平均疏水性

注：

表示疏水或亲水性不确定位点，●表示亲水性位点，○表示疏水性位点。

3.4细胞免疫荧光法鉴定阳性噬菌体克隆的靶向性

采用细胞免疫荧光技术，以FITC标记的IgG为二抗，抗M13多克隆抗体为一抗，荧光显微镜放下显示绿色荧光。将展示四条HepG2细胞特异性多肽基序的噬菌体阳性克隆、无关克隆对照(URPs)和PBS对照分别与肝癌HepG2细胞和人胚肾HEK293细胞孵育，经过洗涤和一抗二抗孵育，倒置荧光显微镜下检查结果如图6所示，结果显示展示HCSP1～4多肽的噬菌体阳性克隆均不同程度地结合到HepG2细胞上，而阳性噬菌体克隆不与HEK293细胞结合，PBS对照组和无关克隆对照组亦无绿色荧光。

四、本发明获得的研究成果及其意义

本发明以肝癌HepG2细胞为靶细胞，以人胚肾HEK293为吸附细胞，采用全细胞筛选策略，经过4轮消减筛选，经过酶联免疫吸附试验鉴定，随机挑取的30个噬菌体克隆中有8个阳性克隆，进一步鉴定8个阳性克隆与HepG2细胞的亲和力发现28号克隆亲和力最高，阳性克隆的测序获得4条共同多肽序列，分别为LLADTTHHRPWT(HCSP1)，LLADTPHHRPWT(HCSP2)，FGWVTPHHELRS(HCSP3)和SLSDLTHMGPWP(HCSP4)。Motif sequence为***D(V)TT(P)HH*P(L)W(R)*，同源性分析表明HCSP1与HCSP2和HCSP4同源高达66％和50％。BLAST检索蛋白数据库发现4条多肽基序与某些细胞表面受体具有同源性，氨基酸疏水性分析显示4条多肽均为亲水性氨基酸。细胞免疫荧光进一步鉴定展示四条多肽的噬菌体克隆对于肝癌HepG2细胞的靶向性，噬菌体阳性克隆均可以特异性靶向HepG2细胞，而不识别HEK293细胞，提示本课题筛选的噬菌体多肽基序能特异性结合肝癌HepG2细胞。

本发明利用噬菌体多肽展示技术，筛选获得4条肝癌HepG2细胞特异性多肽，在肝癌早期检测和靶向治疗方面具有潜在的应用价值，在治疗方面，有望利用这些特异性高、分子量小、穿透力强、亲和力高的短肽来取代传统化疗药物，或与某些化疗药物如顺铂、阿霉素等偶联，达到靶向给药的目的，减小化疗药物的非特异性和毒副作用；在肝癌早期检测方面，利用荧光标记的多肽可以结合肝癌细胞而非正常组织，肝癌细胞特异性多肽经放射性同位素标记能够在肿瘤组织中特异性富集，适用于肿瘤成像和分子影像诊断，多肽对于肿瘤细胞分子标记物设计和造影剂的改造也具有重要意义，对于肝癌早期检测、癌细胞定位和疗效评价都具有重要意义。

LLADTTHHRPWT

LLADTPHHRPWT

FGWVTPHHELRS

SLSDTTHHGPWP

Claims (4)

1.HepG2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到4条多肽片段，其氨基酸序列分别为：

LLADTTHHRPWT；

LLADTPHHRPWT；

FGWVTPHHELRS；

SLSDLTHMGPWP。

2.如权利要求1所述的HepG2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的4条多肽片段的氨基酸序列具有一定的同源性，其共有氨基酸序列为***D(V)TT(P)HH*P(L)W(R)*。

3.如权利要求1所述的HepG2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的4条多肽片段均为亲水性多肽。

4.如权利要求1所述的HepG2细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的4条多肽片段能够特异性结合HepG2细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞。

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