CN104327161B

CN104327161B - Cd44靶向性多肽及其在制备用于筛选早期胃癌的亲和探针中的应用

Info

Publication number: CN104327161B
Application number: CN201410497787.7A
Authority: CN
Inventors: 禄韶英; 贾环; 王燕; 张丹; 李伟明; 关昊
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Setes (Hainan) biomedical Co.,Ltd.
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2034-09-25
Also published as: CN104327161A

Abstract

本发明提供一种CD44靶向性多肽及其在制备用于筛选早期胃癌的亲和探针中的应用，该多肽包括WHPWSY的氨基酸序列，本发明所述多肽能够与胃癌生物标记分子CD44特异性结合，可以作为亲和探针并联合普通光学内窥镜或共聚焦荧光显微内镜实现对胃癌的高效筛查，克服了目前常规光学内窥镜对于面积较大的胃粘膜可疑病变，只能采取随机多点活检的方法的不足，能在胃镜检查中实现胃癌的早期、实时和定位诊断，临床应用价值较高。

Description

CD44靶向性多肽及其在制备用于筛选早期胃癌的亲和探针中的应用

技术领域

本发明涉及在内窥镜下实现分子影像学胃癌早期诊断用多肽试剂，具体涉及CD44靶向性多肽及其在制备用于筛选早期胃癌的亲和探针中的应用。

背景技术

(1)胃癌早期诊断的困境

我国胃癌病人接受治疗时普遍病期偏晚，5年生存率仅有30％左右，而早期胃癌(Early gastric cancer，EGC)患者的总生存率高达90％，而10年复发率则只有2-3％，因此早期发现、早期治疗是提高胃癌疗效的关键。但除了日本和韩国由于全国性的胃癌内镜筛查发现了较大比例的早期胃癌，其他国家早期胃癌的检出率都比较低，即使欧美发达国家也只有15-20％。造成这种情况的原因主要有以下两方面因素：

1)早期胃癌发生发展的生物学特性

胃癌的发生是一个多因素参与、多途径引起、多步骤发生的复杂过程，是环境因素和遗传因素共同作用于机体产生的结果。目前较为认可的胃癌的发生模式是1988年Correa提出的：正常胃黏膜-浅表性胃炎-萎缩性胃炎-小肠型肠上皮化生-轻度不典型增生(Lowgrade dysplasia,LGD)-重度不典型增生(high grade dysplasia,HGD)-胃癌(肠型)。这是一个连续的、漫长的病理学过程。

2008年，荷兰的一项包括超过90000名研究对象的全国性队列研究发现，在5年的随访中，萎缩性胃炎、轻中度不典型增生、重度不典型增生患者的胃癌发病率分别以3.5％、0.6％、6％的速度呈阶梯式的增加，其中重度不典型增生患者有40.14％的患病风险率。可见，对于重度不典型增生患者的胃镜筛查是发现早期胃癌的关键。

2)常规胃镜诊疗技术的缺陷

目前，胃镜检查仍是胃癌最直接、准确、可靠的诊断方法，但是常规的胃镜+活检组织病理学的诊断模式存在以下缺点：①早期胃癌诊断率低，漏检率、误诊率高。首先，胃癌的癌前病变往往涉及胃粘膜广泛区域，常规的内镜活检采取分段、随机多点取样方法，漏检局灶癌变组织的可能性很大，特别是经验缺乏的内镜医生则更容易出现“视癌不见”；其次，在显微镜下对于不典型性增生和早期胃癌的判定需要大量的病例积累、训练，在不同的病理医生间或者同一病理医生多次诊断同一组胃镜活检标本，都存在着一定的差异；②内镜技术的物理学进展并没有和肿瘤分子生物学研究进展融合。目前内镜检查方法进展很多，如放大内镜、染色内镜、超声内镜、荧光内镜、近红外线电子内镜、窄谱成像技术、共聚焦激光显微内镜等都有在临床应用，然而这些技术一些是提高成像精度、范围，另一些虽能对病灶进行突出显像，但对于癌组织并无针对性，因此对病变性质的判断依旧依靠操作医师的经验。另一方面肿瘤发生，往往伴随一些分子的变化，并且这些分子变化经常发生在瘤形成的早期，但如何去检测这些分子变化也是摆在人们面前的一个重要问题。另外，这些方法在临床的应用都不久，大都缺乏循证医学证据，没有被广泛认可的操作规范和诊断标准可依，所以大都应用于临床研究用，很难普及。③内镜下胃粘膜切除技术的发展也存在瓶颈。日本早期胃癌治愈率的提高还得益于其内镜下粘膜切除手术的广泛开展(Endoscopic MucosalResection，EMR)，配合染色内镜和窄谱成像技术该手术能安全地切除直径3cm以内的胃粘膜病变。由于比常规活检能获取更多的组织，EMR不但能提高早期胃癌的确诊率，还可以选择性的治疗小胃癌及微小胃癌。但是对于直径超过5cm的癌前病变，应用该技术后出血及胃穿孔的并发症明显高发，应用受限。如果能在EMR术中实时定位，确认癌变灶，进行选择性的病变粘膜切除，缩小粘膜切除的范围，则有助于该技术的广泛开展。

(2)噬菌体肽库筛选肿瘤标志分子的靶向性多肽结合分子影像学可以诊断早期肿瘤

分子影像学(Molecular Imaging)的概念出现于21世纪初期，可以被广泛定义为对活体的生物学过程在细胞和分子水平进行的描述和测量，其起源于分子生物学原理与活体成像两学科的交叉。与传统的影像诊断不同，分子影像学展示了机体分子水平的异常而不是去展示这种分子异常所带来的最终结果，因此，分子影像学手段能在最早期发现疾病。国外曾有研究者使用针对组织蛋白酶(其在肺癌高表达)的光学探针在小鼠模型中检测出直径1mm的肿瘤。

噬菌体肽库技术(Phage Display)是一种非常成熟的多肽分子筛选技术，肽库包含超过109不同的多肽序列。大量的研究表明，以肿瘤抗原、细胞、离体及活体组织为靶点进行筛选，能从肽库获得与靶分子特异性结合的抗体、配体以及组织、细胞特异性多肽，利用这些特异性多肽联合分子影像学技术，能实现肿瘤特异性的治疗和早期定位诊断。该策略在食管粘膜不典型增生、膀胱癌、结肠癌、***癌和胰腺癌等肿瘤的研究中都取得了很大进展，但是在上消化道恶性肿瘤的诊断、治疗领域报导不多。

要实现分子成像，需要以下几个要素：1)具有合理药物动力学的高亲和力探针；2)探针能够穿过生物屏障(如细胞膜、血管等)到达靶点；3)能够通过化学或者生物手段将信号放大；4)能够灵敏、快速、高分辨率的检测探针的影像学技术。随着各种影像学技术的发展，目前分子影像学的关键是选择合适的靶分子及获得针对靶分子的特异性亲和探针。

(3)CD44是胃癌细胞的重要生物标志物

CD44是一种细胞膜整合糖蛋白，在人类，由位于第11号染色体上的CD44基因编码。作为透明质酸(细胞外基质的组成部分)的主要细胞受体，CD44与细胞间、细胞与外基质的相互作用有关，参与淋巴细胞归巢、细胞外基质粘附、T淋巴细胞活化、肿瘤扩散等一系列过程。

研究发现CD44s在所有的正常胃组织中都有表达，然而在胃癌组织中CD44v的表达明显高于正常胃组织和胃癌前病变组织，并且，在转移的胃癌组织中可以发现尤其高的CD44v表达。Fan.X等研究人员发现HP阳性的胃上皮细胞CD44的表达阳性，并推测HP感染可能通过诱导CD44的表达而促进了胃癌的进展。Heider等曾对42例胃癌患者标本进行免疫组织化学染色分析，发现在肠型胃癌中表达的CD44有v5及v6编码的成分，而弥漫型则仅含有v5，通过RT-PCR检测组织中CD44 RNA的表达亦发现同样的模式。Takaishi等鉴定出三个CD44(+)胃癌细胞系，能够在无血清培养基中形成球形克隆并具有在裸鼠胃及皮肤中成瘤的能力，对CD44的敲低则明显抑制这种作用。这些细胞能够自我更新、分化及形成CD44(-)细胞的能力，并且对化疗药及放射引起的细胞死亡具有更大的抵抗力，这表明CD44(+)胃癌细胞具有肿瘤干细胞特性，而且CD44是胃癌细胞的重要生物标志物。

申请者在斯坦福大学做博士后研究期间，以人类食管癌细胞株(SEg-1)为靶细胞，从PHD7肽库筛选出了一个7肽，该多肽能特异性识别Seg-1细胞，并能发现人类Barrett食管标本中的癌变细胞(Shaoying Lu,Gastroenterology,2008；Lu S,Cancer Biomark.2008；Li M,Progress in biomedical optics.2009.)。该研究同时获得了斯坦福大学和密西根大学进行人体试验的许可，进一步的临床研究表明在荧光内镜观察下该多肽能够特异性识别Barrett食管病变中的早期癌变组织，指导荧光内窥镜下的靶向性粘膜活检。该多肽目前已经被斯坦福大学专利化(US61/128210)，并与奥林巴斯(Olympus)公司医学研究部门联合进行新一代内窥镜的研发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CD44靶向性多肽及其在制备用于筛选早期胃癌的亲和探针中的应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种CD44靶向性多肽，该多肽包括如SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸序列。

所述多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

上述CD44靶向性多肽在制备用于筛选早期胃癌的亲和探针中的应用。

本发明的有益效果体现在：

本发明所述多肽能够与胃癌生物标记分子CD44特异性结合，可以作为亲和探针并联合荧光内窥镜或激光共聚焦显微内镜实现对胃癌的高效筛查，克服了目前常规光学内窥镜对于面积较大的胃粘膜可疑病变，只能采取随机(盲目)多点活检的方法的不足，能在胃镜检查中实现胃癌的早期、实时和定位诊断，临床应用价值较高。

附图说明

图1为ELISA实验验证展示序列WHPWSYLWTQQA的噬菌体对CD44蛋白亲和的结果；图1中：CD44/BSA表示序列对CD44亲和力和对牛血清蛋白亲和力的比值。

图2为细胞免疫荧光实验结果。

图3为基序WHPWSY与CD44透明质酸结合域的分子对接方式预测(3D模式)；图3中：C1～C3分别为结合位点Cavity1～Cavity3，共有序列在C1～C3中为球棍模型的较小分子。

图4为在荧光内窥镜下联合使用多肽探针实现胃食管连接处早期胃癌(贲门

癌)的定位诊断和靶向性活检结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。

(一)利用噬菌体展示肽库技术，以人源性CD44(该分子在胃癌组织表达明显高于胃正常组织及癌前病变)纯化蛋白为靶点筛选出CD44特异性12肽WHPWSYLWTQQA(Trp HisPro Trp Ser Tyr Leu Trp Thr Gln Gln Ala)。

该12肽在酶联免疫实验(参见图1)、细胞免疫荧光实验(参见图2)中均表现出对CD44良好的特异性和亲和力，由于在筛选出的针对CD44的另一条特异性多肽序列中也发现六肽基序WHPWSY，故猜测该12肽可能是通过六肽基序WHPWSY与CD44结合，因此，对两者利用软件(Molegro Virtual Docker、

LigPlus)进行了分子对接，结果显示两者在构型及能量上均有良好的结合特性(参见图3以及表1)。

由图1可以看出，展示多肽WHPWSYLWTQQA的噬菌体对CD44特异性结合，而对牛血清蛋白(BSA)无明显结合，未展示序列的空噬菌体(WT)并未表现对CD44的特异性结合。根据CD44/BSA可以得出该序列(WHPWSYLWTQQA)对CD44的亲和力是对无关蛋白亲和力的6倍多，具有较高的特异性。

由图2可以看出，***序列WHPWSYLWTQQA的噬菌体克隆对GV146-CD44质粒转染HEK293细胞特异性结合(参见图2A)；对转染GV146空质粒HEK293细胞则几乎不结合(参见图2C)；无关对照噬菌体克隆对GV146-CD44转染HEK293细胞(参见图2E)和GV146空质粒转染的HEK293细胞(参见图2G)均仅有微弱结合；图2B(与图2A对应)、图2D(与图2C对应)、图2F(与图2E对应)、图2H(与图2G对应)为DAPI染细胞核。

表1基序WHPWSY与CD44透明质酸结合域在3个可能结合位点的分子对接数据

(二)在荧光内窥镜(或共聚焦内镜)下联合使用基于该多肽(12肽，WHPWSYLWTQQA)探针(即亲和探针)实现胃癌的实时、定位诊断，并能指导靶向性活检。具体步骤如下：

1)本发明以纯化的人源CD44蛋白分子为靶点利用噬菌体展示肽库筛选并合成能和CD44特异性结合的多肽，在其C-端标记绿色荧光素制成探针；

2)由于胃癌组织高表达CD44分子，因此，在病人进行荧光内镜或共聚焦内窥镜检查中，于病人胃粘膜表面喷洒亲和探针，在探针的指引下实现靶向性胃粘膜活检。选择胃粘膜慢性炎症、溃疡、萎缩性胃炎病人为检查对象。

首先进行常规胃镜检查确认癌前病变的位置和范围，然后在确认的位置和范围给胃粘膜喷洒100μM上述亲和探针的溶液1～3mL(具体体积根据范围大小)，溶剂为中性缓冲液溶液，例如PBS缓冲液，对照探针的序列为随机12肽序列，对照探针可在喷洒亲和探针半小时后进行喷洒(亲和探针一般喷洒后15分钟开始衰减，半小时后亲和探针已不再存在于胃粘膜)，喷洒亲和探针5分钟后生理盐水冲洗未结合的探针(对照探针同样操作)，以荧光内窥镜观察胃粘膜病变处有无荧光，活检发出荧光的组织，做常规的病理学检查。检查结果参见图4，该例患者胃粘膜在荧光内窥镜下的图像(Fluorescent image)显示存在荧光较亮处(图4a)，取荧光较亮处活检，经病理学检验验证为胃癌组织(Histology Cancer，图4b)，从图4b的局部放大图可以看出，图4c中看到在组织学染色图片中癌组织侵犯鳞状上皮(Histology cancer invading squamous)，图4d显示在组织学染色图片中可见癌组织和腺体管状结构(Histology cancer complex tubule)。对照探针未见荧光染色。

Claims

1.一种CD44靶向性多肽，其特征在于：该多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.根据权利要求1所述一种CD44靶向性多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.一种如权利要求1或2所述CD44靶向性多肽在制备用于筛选早期胃癌的亲和探针中的应用。