CN106589066B

CN106589066B - 人卵巢癌细胞特异性结合的多肽及其应用

Info

Publication number: CN106589066B
Application number: CN201610966698.1A
Authority: CN
Inventors: 侯颖春; 何慧敏; 肖丽; 马妮; 程思楠; 黎金媚; 杨倩
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2036-11-03
Also published as: CN106589066A

Abstract

本发明涉及人卵巢癌细胞SKOV3特异性结合的多肽及其应用，所涉及多肽的氨基酸序列为：ASPLAPWSSVGP。所涉及的应用为本发明的人卵巢癌细胞SKOV3特异性结合的多肽特异结合人卵巢癌的应用。本发明筛选和初步鉴定获得的卵巢癌靶向多肽具有明显的卵巢癌细胞结合特异性，可用于研发卵巢癌早期靶向诊断试剂、高效低毒靶向药物递送。

Description

人卵巢癌细胞特异性结合的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，以改良的肽库消减筛选法筛选对人卵巢癌细胞(SKOV3细胞)特异性结合的多肽(序列)，对人卵巢癌细胞具有良好的结合特异性和敏感性。

背景技术

卵巢癌(Ovarian cancer)是常见的妇科肿瘤之一，其发病率仅次于子***和子宫体癌，居于第三位。卵巢癌在妇科恶性肿瘤中最为致命，特点是隐性发病、迅速发展、病人临床治愈率低。目前，卵巢癌的治疗方法包括手术疗法、化学疗法、放射疗法以及免疫疗法等，但因其发病隐匿，早期卵巢癌无明显症状和体征，易造成漏诊或误诊，待发现时已到中晚期，故而丧失最佳手术时机，多采用保守疗法。然而，放疗、化疗毒性极大，易产生剂量依赖性和药物抗药性等，效果不理想，病人的五年生存率仍然很低。因此，寻找一种敏感性高且特异性强的早期筛查诊断方法，从而降低卵巢癌的死亡率也是目前面临的关键问题之一。

近年来，迅速发展的分子影像学与靶向治疗为卵巢癌的诊断、治疗带来了新的希望，其中，筛选出卵巢癌细胞表面特异性强、敏感度高的靶向分子成为当务之急。

噬菌体肽库技术为卵巢癌细胞靶向分子筛选、卵巢癌的早期诊断和靶向治疗提供了新的途径，其中的关键是对癌细胞、癌组织具有特异靶向结合活性的多肽片段的获得。

发明内容

本发明的目的在于，由噬菌体12肽库筛选得到对卵巢癌细胞特异性结合的多肽序列，提供鉴定该序列与卵巢癌细胞及组织结合的特异性和敏感性的实验结果，以证明该多肽在卵巢癌的早期分子影像学诊断、与其它药物偶联进行卵巢癌靶向治疗等方面的应用价值。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

卵巢癌SKOV3细胞特异性结合的多肽，其氨基酸序列为：ASPLAPWSSVGP。该多肽能够特异性结合卵巢癌细胞，而不识别正常细胞/组织及其他肿瘤细胞/组织。

以卵巢癌SKOV3细胞为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞系为非特异性吸附细胞，以改良的肽库消减法对噬菌体随机12肽库进行5轮筛选，随机挑取60个噬菌体克隆，以ELISA鉴定阳性克隆。对阳性克隆进行测序，获得拥有共有序列(Consensus sequence)的阳性克隆组9个，各组取一个克隆为代表，对它们以细胞免疫荧光法鉴定其特异性和敏感性，确定最佳共有序列。再以此最佳共有序列合成FITC标记的肽探针，进行该探针对卵巢癌细胞/组织、正常细胞/组织、其它癌细胞/组织检测，确定其特异性和敏感性。

各实验结果均提示序列ASPLAPWSSVGP对卵巢癌细胞/组织具有良好的特异性、敏感性。由于多肽分子量小、免疫原性低、亲和力高、组织穿透性强、易修饰及合成等特点，有望使其与适当的荧光标记物、纳米颗粒、脂质体或抗肿瘤药物等偶联，从而用于肿瘤的早期影像诊断、靶向治疗，对于解决目前卵巢癌诊治面临瓶颈问题具有重要的价值。

本发明以卵巢癌SKOV3细胞为靶细胞，对噬菌体12肽库以我们改良的消减筛选法进行了5轮消减筛选，最后获得9条共同多肽序列，分别为AWPASFLTQKAL、ASPLAPWSSVGP、QPTTDNRDIRSK、KLHDWADSFSLI、YDHHGQSVMPRA、KSGNIWCPCPNF、WSNALTVTSTYG、ELIPSGSQTYLS、NIAFTTTQHGNR。通过一系列鉴定分析实验发现其中的ASPLAPWSSVGP对于卵巢癌的靶向性最强，提示了其用于卵巢癌诊断、靶向治疗方面的价值。

在卵巢癌检测方面，利用同位素或者荧光标记的多肽可以特异性结合卵巢癌细胞/组织，适用于肿瘤成像和分子影像诊断，对于卵巢癌早期检测、癌病灶定位和疗效评价都具有重要意义；在卵巢癌靶向治疗方面，有望利用其特异性高、分子量小、穿透力强、亲和力高的特性来与化疗药物偶联，达到靶向递送给药的目的，可大大减小化疗药物的非特异性和毒副作用。

附图说明

图1为本发明多肽的制备路线图；

图2为随机十二肽pIII融合蛋白的N末端序列；

图3为专用密码子表；

图4为噬菌体克隆与卵巢癌细胞SKOV3亲和力的ELISA鉴定结果；

图5为9条共有序列的代表性阳性噬菌体克隆与细胞亲和力的免疫荧光鉴定，其中A：R5+SKOV3；B：R6+SKOV3；C：R10+SKOV3；D：R12+SKOV3；E：R18+SKOV3；F：R20+SKOV3；G：R33+SKOV3；H：R46+SKOV3；I：R47+SKOV3；J：URP+SKOV3；K：R5+HEK293；L：R6+HEK293；M：R10+HEK293；N：R12+HEK293；O:R18+HEK293；P:R20+HEK293；Q:R33+HEK293；R:R46+HEK293；S:R47+HEK293；T：URP+HEK293.DAPI染细胞核；噬菌体克隆与卵巢癌细胞SKOV3亲和力的ELISA鉴定结果；

图6为克隆S7(ASPLAPWSSVGP)与靶细胞亲和力鉴定，其中A：SKOV3+S7；B：Hek293+S7；C：SKOV3+URP；D：Hek293+URP；E：SKOV3+PBS；F：Hek293+PBS；DAPI染细胞核；

图7为合成多肽(ASPLAPWSSVGP)与靶细胞的结合特异性鉴定，其中A：SKOV3+阳性多肽；B：SKOV3+阴性多肽；C：Hek293+阳性多肽；D：Hek293+阴性多肽；DAPI染细胞核；

图8为合成多肽(ASPLAPWSSVGP)与卵巢癌不同组织的结合特异性鉴定，其中，人卵巢癌组织芯片的组织排列如图8-A所示；合成多肽探针与卵巢癌不同组织的结合特异性如图8-B所示；对照多肽探针与卵巢癌不同组织的结合特异性如图8-C所示。

以下结合附图对本发明作进一步说明。

具体实施方式

本发明利用改良的肽库消减筛选法筛选可以特异敏感的结合于人卵巢癌细胞/组织的多肽序列，并以相关实验证明了该序列对人卵巢癌细胞/组织结合的高度特异性和敏感性。

本发明以人卵巢癌SKOV3细胞为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞为非特异性吸附细胞，对噬菌体随机12肽库进行5轮消减筛选，寻找与卵巢癌细胞/组织具有特异性结合力的噬菌体肽序，为进一步研发卵巢癌早期靶向诊断试剂和高效低毒靶向治疗药物奠定基础，具体技术路线如图1所示。

一、材料与方法

1.1主要实验材料

1.1.1细胞株人卵巢癌细胞株SKOV3，购于美国ATCC(Maryland，USA)。人胚肾细胞株HEK293，为本实验室保存。

1.1.2噬菌体随机十二肽库1.5×10¹³pfu/ml。购于美国NEB(Boston，USA)；库试剂盒包含宿主菌E.coli ER2738。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

用RPMI 1640完全培养基、37℃、饱和湿度、5％CO₂孵箱。

1.2.2宿主菌E.coli ER2738的准备

E.coli ER2738专用菌株，用LB-Tet培养基。

1.2.3噬菌体随机十二肽库消减筛选

以人胚肾细胞HEK293作为阴性吸附细胞预吸附以排除正常细胞靶向克隆，再以人卵巢癌细胞SKOV3作为靶细胞以改良的消减筛选法进行淘筛，重复5轮。该消减筛选法大大简化了实验难度和提高了筛选效率。

所选噬菌体克隆扩增后以ELISA法鉴定与靶细胞SKOV3的亲和力。

1.2.4阳性噬菌体克隆多肽序列的测定

对噬菌体阳性克隆、无关克隆进行测序，根据遗传密码子表格(参见图2、图3)，将多肽序列翻译成氨基酸序列并获得Consensus序列。

1.2.5Consensus序列的结合特异性鉴定

以Consensus序列的代表性克隆通过常规细胞免疫荧光法进行结合特异性和敏感性的鉴定。

1.2.6统计学分析

利用SPSS 16.0数据处理软件进行数据分析，数据结果用

表示，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著，P>0.05说明差异不显著，无统计学意义，组间多重比较采用Duncan检验处理。

二、实验结果

2.1阳性克隆的ELISA鉴定和测序

获得阳性噬菌体克隆38个，其中克隆R20与SKOV3细胞结合特异性最高，结果如图4所示。阳性噬菌体克隆有9个共有序列，分别命名为OSP1-OSP9：

(1)OSP1，肽序为AWPASFLTQKAL，包含的克隆有R1，R10，R17，R26，R27，R32，R40，R57；(2)OSP2，肽序为ASPLAPWSSVGP，包含的克隆有R3，R13，R20，R25，R45；(3)OSP3，肽序为QPTTDNRDIRSK，包含的克隆有R4，R6，R12，R15，R37；(4)OSP4，肽序为KLHDWADSFSLI，包含的克隆有R5；(5)OSP5，肽序为YDHHGQSVMPRA，包含的克隆有R8，R16，R18，R36，R39，R48；(6)OSP6，肽序为KSGNIWCPCPNF，包含的克隆有R12；(7)OSP7，肽序为WSNALTVTSTYG，包含的克隆有R28，R30，R31，R33，R49，R60；(8)OSP8，肽序为ELIPSGSQTYLS，包含的克隆有R34，R35，R44，R47；(9)OSP9，肽序为NIAFTTTQHGNR，包含的克隆有R46，R58。两个阴性克隆的肽序为：HMNTYTQTRSPP和NWHNSSAQVYQG。无关克隆的肽序为：LTSDYMASSSRS。

2.2阳性噬菌体克隆的结合特异性

结果如图5-图6所示，阳性噬菌体克隆均结合SKOV3细胞而不与HEK293细胞结合，以克隆R20(ASPLAPWSSVGP)为最佳，说明该阳性多肽有很好的靶向性。

2.3合成FITC标记多肽ASPLAPWSSVGP的特异性和敏感性鉴定

结果如图7-图8所示。多肽ASPLAPWSSVGP特异结合于SKOV3细胞表面而不与HEK293结合。

核苷酸序列表电子文件

<110>陕西师范大学

<120>人卵巢癌细胞特异性结合的多肽及其应用

<141>

<160>

<210>1

<211>12

<212>氨基酸

<213>OSP1序列

<220>

<223>

<400>1

AWPASFLTQKAL

<210>2

<211>12

<212>氨基酸序列

<213>OSP2序列

<220>

<223>

<400>2

ASPLAPWSSVGP

<210>3

<211>12

<212>氨基酸序列

<213>OSP3序列

<220>

<223>

<400>3

QPTTDNRDIRSK

<210>4

<211>12

<212>氨基酸序列

<213>OSP4序列

<220>

<223>

<400>4

KLHDWADSFSLI

<210>5

<211>12

<212>氨基酸序列

<213>OSP5序列

<220>

<223>

<400>5

YDHHGQSVMPRA

<210>6

<211>12

<212>氨基酸序列

<213>OSP6序列

<220>

<223>

<400>6

KSGNIWCPCPNF

<210>7

<211>12

<212>氨基酸序列

<213>OSP7序列

<220>

<223>

<400>7

WSNALTVTSTYG

<210>8

<211>12

<212>氨基酸序列

<213>OSP8序列

<220>

<223>

<400>8

ELIPSGSQTYLS

<210>9

<211>12

<212>氨基酸序列

<213>OSP9序列

<220>

<223>

<400>9

NIAFTTTQHGNR

Claims

1.人卵巢癌细胞特异性结合的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为：ASPLAPWSSVGP。

2.权利要求1所述多肽用于制备特异结合人卵巢癌细胞制剂的应用。