CN105466920A - 基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶iii快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶iii快速检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药体外诊断领域，具体涉及一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂、终止液和显色测定卡，所述R2试剂包含发色底物试剂，所述显色测定卡上有比色参考带和反应池，比色参考带上分为由深至浅的6个黄色区域，分别对应抗凝血酶III的活性20％、40％、60％、80％、100％和＞100％。本发明通过改进发色底物配方，提高显色反应的裸眼可辨识度，将抗凝血酶III活性与裸眼可辨识的颜色关联起来获得人眼可分辨的比色参考带，本发明不需要使用配套仪器，只需要肉眼判断就可以快速半定量的检测获得抗凝血酶III活性。

Description

基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物医药体外诊断试剂领域，具体涉及一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
发色底物法检测的原理为：人工合成一种可以被待测凝血活酶催化裂解的化合物，此化合物连接上一种显色基质，在检测过程中产色物质可被解离下来，使被检样品中出现颜色变化，根据颜色变化可推算出被检凝血活酶的活性。产色物质一般选用连接对硝基苯胺(pNA)。
目前该方法常用于生化分析仪和分光光度计等设备上，游离的pNA呈黄色，其测定波长一般选用405nm。在这一波长下，其它物质对光的吸收小于pNA对光吸收的1％。具体检测方法既可采用动态法、也可采用终点法。动态法即是连续记录样品的吸光度变化，算出单位时间吸光度的变化量，并以每分钟吸光度的变化来报告结果。终点法即是指在活性酶同产色物质作用一段时间后，加入乙酸终止反应，检测此段时间内吸光度的变化，进而推算出待检酶的活性。
使用产色物质在检测血栓/止血指标时大致可分成三种模式。
(1)酶的检测：即在含酶的样品中直接加入产色物质，因为酶可裂解产色物质释放pNA，监测由于pNA释放而导致被检样品在405nm处光吸收的变化，就可推算样品中酶的活性。如对凝血酶、纤溶酶等的检测。
(2)对酶原的检测：要对某种酶原进行测定，必须先用激活剂将其激活，使其活化位点暴露，才可将产色物质上的pNA裂解下来。加入的激活剂必须过量，因为只有这样才能使酶原被全部激活，酶原的量才会同样品中酶的活性成一定的数量关系。样品中酶的活性可通过pNA释放，即样品吸光度的变化反应出来，由此则可推算出样品中酶原的含量。
(3)酶抑制物的检测：首先往待检样品中加入过量对应的酶中和该抑制物，剩余的酶可裂解产色物质释放pNA，监测由于pNA释放而导致光吸收的变化，就可测出酶的活性，进而可推算出样品中抑制物的含量。如对抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)等。
现在的诊断技术正在向大型集成化和简单快速化两个方向发展，显色底物法在体外诊断行业，尤其是血栓与止血领域应用十分广泛，且检测结果的准确性良好，但是现有的显色底物法的测试必须使用配套的仪器才能实现检测。然而在很多时候，如条件不允许的情况下(没有仪器或仪器没有这项功能的时候)就不能开展该方面的检测项目。当只需要简单快速的判断大致含量或者只需定性判断阴阳性的时候，现有的显色底物法的检测方法就比较欠缺。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测试剂盒及其检测方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂、终止液和显色测定卡，所述R1试剂包含肝素、凝血酶，所述R2试剂包含发色底物试剂，所述显色测定卡上有比色参考带和反应池，所述比色参考带上分为由深至浅的6个黄色区域，从深至浅分别对应抗凝血酶III的活性20％、40％、60％、80％、100％、＞100％。
上述方案中，所述发色底物试剂各组分的配比为：发色底物Su60.25mg/ml、Tris-HCl50mM、pH8.4、吐温-201wt％、PEG80001wt％、海藻糖3.5wt％和叠氮钠0.01wt％。
上述方案中，所述比色参考带通过如下方法获得：将抗凝血酶III标准品用生理盐水稀释成一系列已知浓度的样本，分别采用所述检测试剂盒进行检测，检测结果为各反应池内显示的不同颜色的反应液，将检测结果使用数码相机拍照成图并用图像处理软件分析，标识出图片在RGB模式下的R值、G值和B值，将所述R值、G值和B值用绘图软件整合并绘制得到反应液颜色与抗凝血酶III的活性相对应的比色参考带。
上述方案中，所述R值和G值均为255，所述B值与抗凝血酶III的活性呈现良好的线性关系，线性关系用函数定义为：Y＝-0.318X+99.93，R2＝0.999。
上述方案中，所述反应池采用梯形结构设计。
上述方案中，所述显色测定卡采用PVC、PP、PE、LDPE或ABS材质制备得到，其中，更为优选地，采用白色的PVC材质制备得到。
上述方案中，所述终止液的配方为：醋酸50wt％，叠氮钠0.01wt％。
上述方案中，所述R1试剂的配方为：凝血酶5000IU/L、肝素3000IU/L、Tris-甘氨酸50mM，pH8.4、氯化钠175mM、甘露醇5wt％、Na2EDTA0.2wt％、BSA2wt％和叠氮钠0.1wt％。
一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)含抗凝剂的样本血浆或样本血清加入到反应池中；
(2)向反应池中加入R1试剂，混匀，使过量的凝血酶与抗凝血酶III充分反应；
(3)再加入R2试剂，混匀，使剩余的凝血酶与发色底物试剂充分反应；
(4)最后加入终止液，终止反应；将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比，根据反应液颜色与比色参考带上6个区域颜色的接近程度，判断抗凝血酶III的活性。
上述方案中，所述样本血浆或样本血清：R1试剂：R2试剂：终止液的体积比为1：3：1：0.5，步骤(2)所述过量的凝血酶与抗凝血酶III充分反应的反应时间为1分钟；步骤(3)所述剩余的凝血酶与发色底物试剂充分反应的反应时间为3分钟。
本发明的有益效果如下：(1)本发明克服了现有技术中显色底物法检测抗凝血酶III活性必须使用配套的仪器、在仪器条件不允许的情况下无法展开该项目的检测的不足，提供了一种可以快速半定量检测抗凝血酶III活性的试剂盒及其检测方法；(2)本发明通过改进发色底物配方，提高显色反应的裸眼可辨识度，成功地将抗凝血酶III的活性与裸眼可辨识的颜色有效地关联起来，制备得到了人眼可分辨的比色参考带，解决了现有技术中检测结果的读取必须依靠仪器设备，无法肉眼判断的技术问题；(3)本发明检测方法操作简单，不需要使用配套仪器，只需要肉眼判断就可以半定量的检测获得抗凝血酶III活性。
附图说明
图1为本发明显色测定卡的结构示意图，其中1为比色参考带，2为反应池。
图2为本发明反应池的俯视图和主视图，其中3为俯视图，4为主视图。
图3为本发明检测结果的B值与抗凝血酶III的浓度的线性关系图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1检测试剂盒及其检测方法
一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂、终止液和显色测定卡。
所述R1试剂为：凝血酶5000IU/L、肝素3000IU/L、Tris-甘氨酸50mM，pH8.4、氯化钠175mM、甘露醇5wt％(质量浓度)、Na2EDTA0.2wt％、BSA2wt％和叠氮钠.0.1wt％。分装冻干，使用前用等体积纯化水复溶。
所述R2试剂为：显色底物Su60.25mg/ml、Tris-HCl50mM，pH8.4、吐温-201wt％、PEG80001wt％、海藻糖3.5wt％、叠氮钠0.01wt％。
所述终止液为：醋酸50wt％，叠氮钠0.01wt％。
所述显色测定卡(具体的结构如图1)由白色PVC塑料制备而成，显色测定卡的体积：长7cm，宽2cm，厚0.5cm；显色测定卡上有比色参考带和反应池，比色带的面积为1cm×0.5cm，反应池采用梯形结构设计(俯视图和主视图见图2)，容积为600μL。所述比色参考带上分为由深至浅的6个黄色区域，从深至浅分别对应抗凝血酶III的浓度为20％、40％、60％、80％、100％、＞100％。
所述比色参考带通过如下方法获得：将抗凝血酶III标准品用生理盐水稀释成一系列已知浓度的样本，分别采用所述检测试剂盒进行检测，检测结果为各反应池内显示的不同颜色的反应液，将检测结果使用数码相机拍照成图并用图像处理软件分析，标识出图片在RGB模式下的R值、G值和B值，将所述R值、G值和B值用绘图软件整合并绘制得到反应液颜色与抗凝血酶III的活性相对应的比色参考带。
所述R值和G值均为255，所述B值与抗凝血酶III的活性呈现良好的线性关系，线性关系用函数定义为：Y＝-0.318X+99.93，R2＝0.999。
采用上述基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测试剂盒检测抗凝血酶III活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将100μL含抗凝剂的样本血浆或样本血清加入到反应池中；
(2)向反应池中加入300μLR1试剂，混匀，使过量的凝血酶与抗凝血酶III充分反应1分钟；
(3)再加入R2100μL试剂，混匀，使剩余的凝血酶与发色底物试剂充分反应3分钟；
(4)最后加入50μL终止液，终止反应；将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比，根据反应液颜色与比色参考带上6个区域颜色的接近程度，判断抗凝血酶III的活性。
实施例2试剂盒检测准确度
将参比血浆用生理盐水稀释成一系列浓度(100％，75％，50％，25％，0％)，然后采用本发明所述试剂盒检测抗凝血酶III活性，同时使用现有某凝血分析仪检测，对比检测结果如下表1：
表1参比血浆按比例稀释后用不同方法检测AT-III活性：
采集病人血浆作为检测样本，采用本发明试剂盒基检测方法检测，同时用现有某凝血分析仪检测，对比检测结果如下表2：
表2病人血浆用不同检测方法检测AT-III活性：
表1和表2的检测结果表明：采用本发明试剂盒可以快速半定量的检测抗凝血酶III活性，以采用凝血分析仪定量检测抗凝血酶III活性为准，本发明通过肉眼辨识颜色判断的检测结果准确可靠，适用于在仪器条件不允许，且只需要简单快速的判断抗凝血酶III的大致活性或者只需定性判断阴阳性的情况。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂、终止液和显色测定卡，所述R1试剂包含肝素、凝血酶，所述R2试剂包含发色底物试剂，所述显色测定卡上有比色参考带和反应池，所述比色参考带上分为由深至浅的6个黄色区域，从深至浅分别对应抗凝血酶III的活性20%、40%、60%、80%、100%和＞100%。
2.根据权利要求1所述的抗凝血酶III快速检测试剂盒，其特征在于，所述发色底物试剂的各组分配比为：发色底物Su60.25mg/ml、Tris-HCl50mM、pH84、吐温-201wt%、PEG80001wt%、海藻糖3.5wt%和叠氮钠0.01wt%。
3.根据权利要求1所述的抗凝血酶III快速检测试剂盒，其特征在于，所述比色参考带通过如下方法获得：将抗凝血酶III标准品用生理盐水稀释成一系列已知浓度的样本，分别采用所述检测试剂盒进行检测，检测结果为各反应池内显示的不同颜色的反应液，将不同颜色的反应液使用数码相机拍照成图并用图像处理软件分析，标识出图片在RGB模式下的R值、G值和B值，将所述R值、G值和B值用绘图软件整合并绘制得到反应液颜色与抗凝血酶III的活性相对应的比色参考带。
4.根据权利要求3所述的抗凝血酶III快速检测试剂盒，其特征在于，所述R值和G值均为255，所述B值与抗凝血酶III活性呈现良好的线性关系，线性关系用函数定义为：Y=
-0.318X+99.93，R2=0.999。
5.根据权利要求1所述的抗凝血酶III快速检测试剂盒，其特征在于，所述反应池采用梯形结构设计。
6.根据权利要求1所述的抗凝血酶III快速检测试剂盒，其特征在于，所述显色测定卡采用PVC、PP、PE、LDPE或ABS材质制备得到。
7.根据权利要求1所述的抗凝血酶III快速检测试剂盒，其特征在于，所述终止液的配方为：醋酸50wt%，叠氮钠0.01wt%。
8.根据权利要求1所述的抗凝血酶III快速检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的配方
为：凝血酶5000IU/L、肝素3000IU/L、Tris-甘氨酸50mM，pH8.4、氯化钠175mM、甘露醇5wt%、Na2EDTA0.2wt%、BSA2wt%和叠氮钠0.1wt%。
9.权利要求1~8任一所述基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）含抗凝剂的样本血浆或样本血清加入到反应池中；
（2）向反应池中加入R1试剂，混匀，使过量的凝血酶与抗凝血酶III充分反应；
（3）再加入R2试剂，混匀，使剩余的凝血酶与发色底物试剂充分反应；
（4）最后加入终止液，终止反应；将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对比，根据反应液颜色与比色参考带上6个区域颜色的接近程度，判断抗凝血酶III的活性。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述样本血浆或样本血清：R1试剂：R2试剂：终止液的体积比为1：3：1：0.5，步骤（2）所述过量的凝血酶与抗凝血酶III充分反应的反应时间为1分钟；步骤（3）所述剩余的凝血酶与发色底物试剂充分反应的反应时间为3分钟。
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