CN104714036A - 抗凝血酶ⅲ活性测定试剂盒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种临床检测试剂制备方法，具体为抗凝血酶III活性测定试剂盒的制备方法，Tris-HCl溶解凝血酶冻干粉末和肝素钠制成S1试剂，将凝血酶发色底物S-2238或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用Tris-HCl溶解制成S2试剂，S1试剂和S2试剂冻干形成S1冻干品和S2冻干品；含Tris-HCl叠氮化钠溶液复溶S1冻干品配制成S1冻干复溶试剂；超纯水溶解S2冻干品制成S2冻干复溶试剂；多人份混合血浆进行冻干，制备得到ATIII校准品；对ATIII校准品进行定值，定值范围ATIII％为90％～110％；采用定值的ATIII校准品、S1冻干复溶试剂和S2冻干复溶试剂制作标准曲线，线性相关系数大于0.99；待测血浆样品中加入S1冻干复溶试剂和S2冻干复溶试剂后进行显色反应。该方法制备得到的试剂盒成本低，线性范围宽，稳定性好，操作简单。

Description

抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒的制备方法
技术领域
本发明涉及一种临床检测试剂制备方法，具体为抗凝血酶III活性测定试剂盒的制备方法。
背景技术
抗凝血酶III(antithrombin III，AT III)是凝血酶及因子XIIα、XIα、IXα、Xα等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂。它与凝血酶通过精氨酸-丝氨酸肽键相结合。形成ATIII凝血酶复合物而使酶灭活，肝素可加速这一反应达千倍以上。肝素与AT III所含的赖氨酸结合后引起AT III构象改变，使AT III所含的精氨酸残基更易与凝血酶的丝氨酸残基结合。一旦肝素-AT III凝血酶复合物形成，肝素就从复合物上解离，再次与另一分子AT III结合而被反复利用。AT III-凝血酶复合物则被网状内皮***所消除。大量相关文献已经证明，临床上血浆中AT-III的活性变化与多种疾病密切相关。AT-III的增多或减少是出血、血栓的关键，它在肝病、肾病、肺病、肿瘤、DIC、妊娠高血压综合征等疾病的诊断中具有重要意义，对脑梗、心梗等突发疾病的协助诊断方面尤显重要。因此，AT-III活性检测在临床上具有良好的应用前景。
ATIII发色底物法检测原理是在待测血浆中加入过量的凝血酶，凝血酶与血浆中ATIII形成1∶1复合物，剩余的凝血酶作用于发色底物，裂解出显色基团，显色程度与剩余凝血酶的量呈正相关，而与血浆中ATIII活性呈负相关。在临床研究中应用越来越广泛。目前进口的AT-III发色底物法活性的试剂盒已有供应，但价格昂贵。因此，研究开发价格合理、特异性和灵敏度较高的国内自主品牌的AT-III活性检测试剂盒对于提高AT-III临床诊断水平具有重要意义和价值。
专利CN102690862 A，公开了一种抗凝血酶III测定试剂盒(发色底物法)，由于采用了肝素衍生物和进口的凝血酶，因此成本比较高。并且该现有技术在全自动凝血仪上进行ATIII活性检测时需要更改参数，更改的参数为待测血浆5μl，加入120μl稀释液后再取50μl血浆和60μlR1试剂，再加入60μlR2试剂，最后进行显色。此外在后台参数的设计上，需要更改参数光量设置，机器自身在检测中设置的参数光量值为“200-400”，在检测的过程中需要将“200“改为“0”。该技术由于成本比较高，因此减少了试剂的用量，体积的缩小可能会引起最后在比色的过程中部分的数值不能显示。因此，将参数光量值设置调整为了“0”。该技术成本较高，并且操作不方便，结果也容易出现误差。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种制备ATIII活性检测试剂盒的方法。制备得到的产品成本低，稳定性好，可配套用于多种凝血仪使用，满足临床对于ATIII活性检测的要求。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案，
抗凝血酶III活性测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用PH8.4的10～50mmol/L Tris-HCl溶液将凝血酶冻干粉末和肝素钠溶解，配制成S1试剂，S1试剂的凝血酶浓度为5～20IU/mL，肝素浓度为0.2～10IU/mL；
(2)将发色底物S-2238或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PH7.0的10～50mmol/LTris-HCl溶解，配制成底物浓度为2～5μmol/mL的溶液，为S2试剂；
(3)分别在S1试剂和S2试剂中加入助剂进行冻干，形成S1冻干品和S2冻干品；
S1试剂加入的助剂在S1试剂中的含量为：BSA为0.5～5％，KCl浓度为15～250mmol/L、EDTA2K浓度为1～10mmol/L、抑肽酶0.1～5IU/mL、聚乙二醇6000浓度为1～5mg/ml；
S2试剂加入的助剂在S2试剂中的质量比例为：BSA为0.5～5％、甘露醇为1～5％；
(4)使用含有PH8.4的10～50mmol/L Tris-HCl、0.1～0.5mg/ml叠氮化钠的S1试剂复溶液复溶S1冻干品，配制成S1冻干复溶试剂；使用超纯水溶解S2冻干品，配制成S2冻干复溶试剂；
(5)采取新鲜多人份混合血浆，加入稳定剂、防腐剂物质进行冻干，制备得到ATIII校准品；
采用WHO/BS/10.2146标准品，在全自动凝血仪CA-1500上对ATIII校准品进行定值，定值范围ATIII％为90％～110％；
(6)在全自动凝血仪CA-1500上，采用定值的ATIII校准品、S1冻干复溶试剂和S2冻干复溶试剂制作标准曲线，线性相关系数大于0.99；
(7)使用待测血浆样品在全自动凝血仪CA-1500上进行检测，检测得到待测血浆样本的OD值，机器自动计算出待测血浆样本中ATIII的活性值，检测程序如下：16μl待测血浆样品中加入175μl S1冻干复溶试剂和33μl S2冻干复溶试剂后进行显色反应，整个过程不调整仪器自身的任何参数。
本发明提供抗凝血酶III活性测定试剂盒的制备方法，制备得到的试剂盒成本低，线性范围宽达到200％～3.1％，稳定性好，在全自动凝血仪器上检测不需要更改任何参数，操作简单，可配套用于多种凝血仪使用，满足临床对于ATIII活性检测的要求。
具体实施方式
结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例以制备ATIII活性检测试剂以及具体在全自动凝血仪CA-1500上检测为例。
(1)使用10～50mmol/L Tris-HCl PH8.4溶液将凝血酶冻干粉末和肝素钠溶解，将不同浓度的凝血酶和肝素钠溶液进行混合，配制成S1试剂，凝血酶浓度为5～20IU/mL，肝素浓度为0.2～10IU/mL。
(2)将发色底物S-2238或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PH7.0的10～50mmol/LTris-HCl溶解，配制成底物浓度为2～5μmol/mL的溶液，为S2试剂。
(3)分别在S1试剂和S2试剂中加入稳定剂和赋形剂进行冻干，即可制备成S1冻干品和S2冻干品。S1试剂加入的助剂在S1试剂中的含量为：0.5％～5％BSA，20～50mmol/L Tris-HCl，15～250mmol/L KCl、1～10mmol/L EDTA2K/L、0.1～5IU/mL抑肽酶、1～5mg/ml聚乙二醇6000；。S2试剂加入的助剂在S2试剂中的质量比例为：BSA为0.5～5％、甘露醇为1～5％。
(4)使用含有PH8.4的10～50mmol/L Tris-HCl、0.1～0.5mg/ml叠氮化钠的S1试剂复溶液复溶S1冻干品，配制成S1冻干复溶试剂；使用超纯水溶解S2冻干品，配制成S2冻干复溶试剂。
(5)在CA-1500上，使用定值好的ATIII校准品制作标准曲线，制作的标准曲线线性相关系数大于0.99。
(6)使用待测血浆样品在全自动凝血仪CA-1500上进行检测，检测得到样本的OD值，机器自动计算出待测样本中ATIII的活性值，检测程序如下：16μl血浆中加入175μl S1冻干复溶试剂和33μlS2冻干复溶试剂后进行显色反应，整个过程不调整仪器自身的任何参数。
产品性能检验测试：
(1)在全自动凝血仪器上的检测结果
用Sysmex CA-1500全自动血凝仪及配套抗凝血酶III检测试剂(SIEMENS)和本实施例制的的ATIII检测试剂制作标准曲线，结果见表1。
表1 ATIII标准曲线制作结果
ATIII(％) 实施例试剂 SIEMENS试剂
150 0.407 0.407
100 0.713 0.750
50 1.154 1.154
25 1.360 1.272
12.5 1.452 1.390
R2 -0.998 -0.998
由上表可知，本实施例所得产品制作的标准曲线线性良好R2＞0.99，检测结果与进口SIEMENS公司产品一致。
(2)产品复溶稳定性检测
将实施例制备的ATIII复溶后分成3份，分别置于37℃、2℃-8℃和室温(20℃-25℃)保存，每隔一定时间取样进行标准曲线制备，结果如表2和表3：
表2 SIEMENS公司试剂复溶后37℃稳定性考察结果
ATIII(％) 放置前 2小时 4小时 6小时 8小时 24小时
150 0.483 0.507 0.450 0.462 0.442 0.053
100 0.804 0.789 0.759 0.739 0.752 0.321
50 1.098 1.117 1.059 1.067 1.081 0.629
25 1.270 1.232 1.266 1.241 1.251 0.806
12.5 1.322 1.304 1.456 1.305 1.279 0.898
R2 -1.000 -0.999 -0.999 -0.998 -0.997 -0.998
表3 实施例制得的试剂复溶后37℃稳定性考察结果
ATIII(％) 放置前 2小时 4小时 6小时 8小时 24小时
150 0.396 0.405 0.386 0.375 0.412 0.341
100 0.730 0.703 0.742 0.744 0.703 0.594
50 1.165 1.150 1.162 1.154 1.110 0.930
25 1.357 1.362 1.366 1.359 1.311 1.136
12.5 1.458 1.454 1.456 1.439 1.391 1.246
R2 -0.999 -0.998 -0.999 -1.000 -0.995 -0.995
由表2和表3的数据可知，自制试剂在37℃保温的8小时内检测结果的波动范围均＜10％，线性相关系数≥0.99。37℃保温24小时以后，自制试剂和SIEMENS试剂的数值均有缩减，但是相比进口SIEMENS试剂而言，SIEMENS试剂置于37℃后的数值缩减比较明显，因此自制试剂在37℃保温24小时的稳定性好于进口SIEMENS试剂。
表4实施例制得的试剂复溶后2℃-8℃稳定性考察结果
ATIII(％) 放置前 2小时 4小时 8小时 48小时 96小时
150 0.540 0.537 0.502 0.516 0.486 0.503
100 0.782 0.733 0.723 0.787 0.752 0.788
50 1.084 1.165 1.038 1.077 1.024 1.091
25 1.241 1.304 1.219 1.145 1.184 1.242
12.5 1.288 1.350 1.286 1.230 1.265 1.333
R2 -0.999 -0.998 -0.996 -0.998 -0.998 -1.000
表4证明实施例复溶后在2℃～8℃放置前后各检测数值波动范围＜10％，线性相关系数≥0.99，可以认为本发明制备的自制试剂复溶后2℃～8℃稳定性良好。
表5 实施例制得的试剂复溶后室温稳定性考察结果
ATIII(％) 放置前 2小时 4小时 8小时 48小时 96小时
150 0.540 0.563 0.537 0.528 0.532 0.562
100 0.782 0.784 0.774 0.788 0.753 0.797
50 1.084 1.085 1.089 1.092 1.038 1.092
25 1.241 1.250 1.253 1.248 1.219 1.234
12.5 1.288 1.306 1.312 1.303 1.286 1.296
R2 -0.997 -0.998 -0.996 -0.998 -0.996 -0.999
表5实验结果证明本发明制备的ATIII活性检测试剂稳定性较好，检测结果的波动范围均＜10％，线性相关系数≥0.99，可以认为本产品复溶后室温存放96小时内可保持稳定。
(3)冻干产品稳定性检测
将实施例制备的ATIII冻干试剂，分别置于37℃，和室温(20℃-25℃)保存，每隔一定时间取样进行标准曲线测定制备，以考察试剂稳定性，结果如下：
表6 冻干产品37℃稳定性考察结果
ATIII(％) 放置前 1天 2天 3天 4天 7天
150 0.477 0.435 0.423 0.489 0.410 0.452
100 0.742 0.713 0.702 0.728 0.712 0.707
50 1.037 0.994 0.956 0.993 0.937 0.967
25 1.175 1.135 1.109 1.139 1.091 1.115
12.5 1.248 1.219 1.168 1.219 1.150 1.204
R2 -1.000 -0.999 -0.999 -0.999 -0.996 -0.999
表6结果显示自制试剂冻干品在37℃保温7天后检测结果的波动范围均＜10％，且线性保持良好＞0.99，表明自制冻干产品在37℃保温7天后稳定性良好。
表7 冻干产品室温稳定性考察结果
ATIII(％) 放置前 1天 2天 3天 4天 7天
150 0.477 0.505 0.486 0.462 0.477 0.484
100 0.742 0.783 0.742 0.745 0.740 0.722
50 1.037 1.051 1.022 1.015 1.001 1.012
25 1.175 1.215 1.149 1.170 1.153 1.162
12.5 1.248 1.265 1.233 1.243 1.213 1.232
R2 -1.000 -0.999 -1.000 -0.999 -1.000 -0.999
表7结果显示自制试剂冻干品在室温保温7天后检测结果的波动范围均＜10％，线性相关系数≥0.99，表明自制冻干产品在室温保温7天后稳定性良好。

Claims (1)

1.抗凝血酶III活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用PH8.4的10～50mmol/L Tris-HCl溶液将凝血酶冻干粉末和肝素钠溶解，配制成S1试剂，S1试剂的凝血酶浓度为5～20IU/mL，肝素浓度为0.2～10IU/mL；
(2)将发色底物S-2238或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PH7.0的10～50mmol/LTris-HCl溶解，配制成底物浓度为2～5μmol/mL的溶液，为S2试剂；
(3)分别在S1试剂和S2试剂中加入助剂进行冻干，形成S1冻干品和S2冻干品；
S1试剂加入的助剂在S1试剂中的含量为：BSA为0.5～5％，KCl浓度为15～250mmol/L、EDTA2K浓度为1～10mmol/L、抑肽酶0.1～5IU/mL、聚乙二醇6000浓度为1～5mg/ml；S2试剂加入的助剂在S2试剂中的质量比例为：BSA为0.5～5％、甘露醇为1～5％；
(4)使用含有PH8.4的10～50mmol/L Tris-HCl、0.1～0.5mg/ml叠氮化钠的S1试剂复溶液复溶S1冻干品，配制成S1冻干复溶试剂；使用超纯水溶解S2冻干品，配制成S2冻干复溶试剂；
(5)采取新鲜多人份混合血浆，加入稳定剂、防腐剂物质进行冻干，制备得到ATIII校准品；
采用WHO/BS/10.2146标准品，在全自动凝血仪CA-1500上对ATIII校准品进行定值，定值范围ATIII％为90％～110％；
(6)在全自动凝血仪CA-1500上，采用定值的ATIII校准品、S1冻干复溶试剂和S2冻干复溶试剂制作标准曲线，线性相关系数大于0.99；
(7)使用待测血浆样品在全自动凝血仪CA-1500上进行检测，检测得到待测血浆样本的OD值，机器自动计算出待测血浆样本中ATIII的活性值，检测程序如下：16μl待测血浆样品中加入175μl S1冻干复溶试剂和33μl S2冻干复溶试剂后进行显色反应，整个过程不调整仪器自身的任何参数。
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