JP2006349559A - 反応容器及びこれを用いた物質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】基板に、ウェル状反応検出部を有する反応容器において、ウェル状反応検出部の底面と基板の裏面の間の基板の波長400〜650nmにおける平均光線透過率が80%以上であり、かつヘイズが10以下の範囲内であることを特徴とする反応容器とする。
【選択図】 図1
Description
図1に、本発明における一実施形態を示す図を示す。図1は、略長方形の板状の基板に、試料及び試薬を反応させるためのウェル状反応検出部が複数形成されている。
このようなものとして、例えば、PC(ポリカーボネート)、PP(ポリプロピレン)、シクロオレフィン系ポリマー、フッ素ポリマー、シリコン樹脂などを用いることができる。
中でも透明性、耐熱性、耐薬品性や反応系に対する影響などの点からシクロオレフィン系樹脂(ゼオノア(日本ゼオン株式会社製))やメチルペンテン系樹脂(TPX(三井化学株式会社製))を用いることが好ましい。
なお、基板の素材としてガラスを用いてもよい。
ウェル状反応検出部は、基材がプラスチック、合成樹脂系であれば切削加工、成型加工により形成することができる。ガラスであれば切削加工により形成することができる。
また、ウェル状反応検出部は複数有することができる。
また、ウェルの大きさは、特に限定はしないが、ライフサイエンス分野では極微量での反応、検出が行われることが多く、開口部の直径及び深さが5mm以下、特に0.01mm〜5mmの範囲内であればよい。
又、ウェル状反応検出部の内表面は、平滑であることが好ましい。底部においてはヘイズ、光線透過率などの光学特性が向上し、側面においては液の充填が容易になるためである。
なお、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定し、反応液の充填には、分注器、注射器、シリンジ等を用いて充填する。又、親水化処理は大気圧プラズマ処理に限られず、コロナ処理や、コーティング処理で行っても良い。
PCR反応部を設けることにより、同一チップ上で検体の調整、DNAの検出を行うことができる。
PCR反応部としては、ウェル状の反応部を設けても良いし、流路を設け流路内で反応を行っても良い。
また、その他の反応部を設けても良い。
本発明でいう検出物質とは、検出をしようとする対象物質のことで、認識物質とは、検出物質を特定するために用いる物質のことを言う。
抗原抗体反応による抗原検出の場合、例えば、予め各ウェル状反応検出部内に認識物質として抗原を含む試料を入れておき、後から検出物質として抗体を含む試薬を添加し、認識物質または、検出物質のいずれかに標識物質を付けておくことで、反応の有無を検出できる。標識物質としては、蛍光などの発光物質が一般的に用いられる。なおこの場合、基板上に試薬収容部を設けて置き、検出物質を収容しておいてもよい。
例えば、インベーダー・アッセイ法(サードウェイブテクノロジーズ,Inc(米国ウィスコンシン州マディソン市)を用いても良い。これによりSNP解析の具現化を図ることが可能となる。
また、認識物質はウェル状反応検出部内に固定してもよいし、固定させずに保持させておくだけでもよい。
図5に一例を示す。図5において、反応容器1の下部方向に励起源10、蛍光検出部9を有しており、励起源9より蛍光物質を励起することのできる波長の光を照射し、励起光により励起され、発した蛍光を蛍光検出部9により検出する。
<実施例>
(チップ作成(成形))
図1のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、日本ポリプロ株式会社ノバティックPP MA04Aを用いて成形品を作成した。成形温度は210℃、型締め力は50tonF、金型温度は20℃、計量値24mmで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップM3で成形を行い、スクリュー系はφ35mmである。検出部底厚は0.3mmで成形を行った。
透過率測定装置(オリンパス OSP−SP200)を用いて、ウェル内の透過率測定を行ったところ、470nmでは透過率84.3%、520nmでは85.2%であった。また、570nmでは透過率は86.4%、620nmでは87.4%であった。
ウェル内のヘイズの値は測定が困難であった為、0.3mm板を射出成形にて作成して、板のヘイズの値を、ヘイズメーター(NIPPON DENSHOKU HAZE Meter NDH 2000)を用い測定した。測定値は、異なる3点を測定した平均値は5.06(5.14, 5.08, 4.98)であった。
また、ウェル底部の中心線平均粗さをOLYMPUS 走査型レーザー顕微鏡 OLS1100により測定した。なお、3箇所で測定した平均の値を用いた。得られた値は0.508μmであった。
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット(ThirdWaveTechonogy社製に順ずる)。
ウェル状反応検出部にインベーダープローブ0.15μlを加えて、乾燥させた。
検出物質としてPCR反応により調整済みのPCR産物1μlに対して、インベーダー試薬3.644μl、蛍光物質としてFAMが結合しているFRET 0.75μl、Clevase 0.75μlを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応検出部に2μlずつ加える。ミネラルオイルを4μl加えて、61℃、40分間インベーダー反応を行う。反応が完了したら、蛍光検出を行った。なお、ここでいうインベーダープローブ、インベーダー試薬、FRET、Clevaseは認識物質である。
反応容器の下2mm厚の場所に測定の設定を行い、リアルタイムPCR(ABI PRISM 7000)を用いて検出した。
なお、反応及び蛍光検出は3つのウェルで行った。結果を図6に示す。
(チップ作成(成形))
図1のウェル形状の検出チップを、成形により作成する。成形に用いた樹脂は、日本ポリプロ株式会社ノバティックPP MA04Aを用いて成形品を作成した。成形温度は210℃、型締め力は50tonF、金型温度は20℃、計量値24mmで行った。成形機は住友重機械工業サイキャップM3で成形を行い、スクリュー系はφ35mmである。検出部底厚の厚さは、形状は図と同じだが、検出部厚は1.0mmにして成形を行った。
実施例と同様の方法でウェル内の透過率測定を行ったところ、470nmでは透過率72.1%、520nmでは75.7%であった。また、570nmでは透過率は78.8%、620nmでは80.9%であった。
ウェル内のヘイズの値は測定が困難であった為、1.0mm板を射出成形にて作成して、板のヘイズの値を、ヘイズメーター(NIPPON DENSHOKU HAZE Meter NDH 2000)を用い測定した。測定値は、異なる3点を測定した平均値は11.89(11.94, 12.83, 10.91)であった。
また、ウェル底部の中心線平均粗さをOLYMPUS 走査型レーザー顕微鏡 OLS1100により測定した。なお、3箇所で測定した平均の値を用いた。得られた値は0.579μmであった。
インベーダー反応はインベーダーアッセイキット(ThirdWaveTechonogy社製に順ずる)。
ウェル状反応検出部にインベーダープローブ0.15μlを加えて、乾燥させた。
検出物質としてPCR反応により調整済みのPCR産物1μlに対して、インベーダー試薬3.644μl、蛍光物質としてFAMが結合しているFRET 0.75μl、Clevase 0.75μlを乾燥させたインベーダープローブが底に乾燥しているウェル状反応検出部に2μlずつ加える。ミネラルオイルを4μl加えて、61℃、40分間インベーダー反応を行う。反応が完了したら、蛍光検出を行った。なお、ここでいうインベーダープローブ、インベーダー試薬、FRET、Clevaseは認識物質である。
反応容器の下2mm厚の場所に測定の設定を行い、リアルタイムPCR(ABI PRISM 7000)を用いて検出した。
なお、反応及び蛍光検出は3つのウェルで行った。結果を図7に示す。
図6、7より実施例のサンプルはいずれも18分ぐらいから強度が一定になり、また強度も高いものとなった。それに対し比較例のサンプルは、20分過ぎても強度が一定にならず、判定が困難であり、また最終的に一定になった強度も低いものとなった。さらに実施例のサンプルは3つともばらつきのないデータが得られたが、比較例のサンプルでは多少のばらつきがみられた。
また、強度が一定になるまでの時間、グラフの傾きを用いて分析する場合、実施例に比べ比較例は判定が困難なものとなる。
2 基板
3 ウェル状反応検出部
4 ウェル状反応検出部底部と基板裏面間の距離
5 試薬収納部
6 PCR反応部(流路タイプ)
7 流路
8 反応溶液
9 蛍光検出部
10 励起源
Claims (9)
- 基板に、ウェル状反応検出部を有する反応容器において、ウェル状反応検出部の底面と基板の裏面の間の基板の波長400〜650nmにおける平均光線透過率が80%以上であり、かつヘイズが10以下の範囲内であることを特徴とする反応容器。
- 前記ウェル状反応検出部の底面と基板の裏面の間の距離が0.3以上1mm未満であることを特徴とする請求項1記載の反応容器。
- 前記ウェル状反応検出部の底面が平坦であることを特徴とする請求項1又は2に記載の反応容器。
- 前記ウェル状反応検出部が複数であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の反応容器。
- 前記基材がシクロオレフィン系樹脂又はメチルペンテン系樹脂であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の反応容器。
- さらにウェル状の試薬収容部を有することを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の反応容器。
- さらにPCR反応部を有することを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の反応容器。
- 基板にウェル状反応検出部を有し、かつウェル状反応部の底面と基板の裏面の間の基板の波長400〜650nmにおける平均光線透過率が80%以上であり、かつヘイズが10以下であるウェル状反応検出部内に認識物質を注入する工程と、ウェル状反応検出部に検出物質を注入する工程とを有し、前記認識物質又は前記検出物質のいずれかが蛍光標識されており、前記認識物質と前記検出物質との反応の有無を前記ウェル状反応検出部の底部側から蛍光検出する工程を有することを特徴とする物質の検出方法。
- 前記検出物質が核酸であることを特徴とする請求項7記載の物質の検出方法。
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