CN109239061A - 一种液体型抗凝血酶ⅲ活性测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,属于医学体外诊断领域。该试剂盒,包括试剂R1、试剂R2、质控品和校准品;所述的试剂R1包括凝血酶、肝素或其盐、第一缓冲液和保护剂;所述试剂R2包括凝血酶的发色底物、第二缓冲液、稳定剂和第二防腐剂。本发明的抗凝血酶Ⅲ检测试剂盒中R1和试剂R2均为液体型,开瓶即用,无需复溶,使用方便,储存有效期长达一年,不受血浆样本中HCII的干扰,检测线性范围宽,最高检测限能达到155%。
Description
技术领域
本发明属于医学体外诊断领域,具体涉及一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒。
背景技术
抗凝血酶Ⅲ是血浆中一种丝氨酸蛋白酶抑制物(serine protease inhibitor)。因子Ⅱa、Ⅶ、Ⅸa、Ⅹa、Ⅻa的活性中心均含有丝氨酸残基,都属于丝氨酸蛋白酶(serineprotease)。抗凝血酶Ⅲ分子上的精氨酸残基,可以与这些酶活性中心的丝氨酸残基结合而使之失活。在血液中,每一分子抗凝血酶Ⅲ,可以与一分子凝血酶结合形成复合物,从而使凝血酶失活。发色底物法目前广泛用于实验室研究和体外诊断。其原理是首先人工合成可以被待测凝血活酶催化裂解的化合物,且化合物连接上产色物质,在检测过程中产色物质可被解离下来,使被检样品中出现颜色变化,根据颜色变化可推算出被检凝血活酶的活性。
掌握抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)的活性作为对于弥散性血管内凝血(DIC)、肝疾患、肾病综合症等疾病的监测、病态分析、预后判定以及肝素治疗或使用AT-Ⅲ浓缩制剂投药时的指标具有重要意义。AT-Ⅲ是作为血液中活性凝血因子的最重要的阻碍因子,它控制着血液的凝固和纤维蛋白的溶解。其血液中AT-Ⅲ的水平根据各种疾病、症状而变化。血液中的AT-Ⅲ水平降低可能会导致肝素治疗效果无法呈现。AT-Ⅲ病理性增高:表明血液抗凝活性增强,主要见于口服抗凝药、急性出血期等。AT-Ⅲ病理性降低:常见的有先天性AT-Ⅲ缺乏症;血栓前状态和血栓性疾病时,血液抗凝作用减弱,如DIC高凝期、心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、妊娠症、深静脉血栓形成、肾病综合征等;合成减少,如严重肝病等;
目前公开的对抗凝血酶的检测主要有三类方法,分别是凝固法、免疫法和发色底物法。凝固法是通过血浆凝固时间直接或间接地测定样本中AT-Ⅲ活性,凝固法即可以直接使用待测血浆也可以将待测血浆加热脱纤维蛋白然后使用,但是直接使用待测血浆时有多种蛋白酶参与反应,测定结果易受影响。待测血浆加热脱纤维蛋白处理,操作繁杂,而且会导致AT-Ⅲ水平的降低,不利于准确测算。免疫学分析方法包括单向放射免疫扩散法、免疫比浊法以及酶联免疫吸附法测定样本中AT-Ⅲ的浓度。这种方法特异性好、灵敏度高,但是操作繁琐、耗时,非活性的AT-Ⅲ也参与了免疫学反应,检测的AT-Ⅲ浓度并不能完全反映AT-Ⅲ活性水平。这对于由于AT-Ⅲ活性降低而导致的AT-Ⅲ缺乏的病人来说,检测结果不准确。底物发色法是试剂中的凝血酶在肝素的存在下与待测血浆中的抗凝血酶形成凝血酶和抗凝血酶的复合物,使凝血酶的活性受到抑制。剩余的没有和抗凝血酶Ⅲ形成复合物的凝血酶作用于凝血酶特异发色底物,将底物裂解产生4-硝基苯胺(4-nitroaniline,pNA)显色基团,这种反应可引起在405纳米处吸光度的变化,而产生的4-硝基苯胺的量是和样品中抗凝血酶的活性成反比的。因此,利用测量405nm处吸光度的变化,可计算出血浆中抗凝血酶Ⅲ的活性水平由于该方法灵敏度高、准确性好、检测时间短,能够适用于多种自动化分析仪器,且在国产化检测试剂的发展下,大幅降低了临床检测费用,在临床中应用也越加广泛。实际上,虽然此法已在临床应用中广泛使用,但在其测定过程中大多还是有检测结果受血浆中多种干扰物质影响的情况发生。例如肝素辅助因子Ⅱ,对凝血酶具有抑制作用。大约70%的凝血酶抑制活性是由抗凝血酶Ⅲ引起。因此凝血酶的底物发色法不能准确地反映血浆中抗凝血酶Ⅲ的真实水平。
为了降低肝素辅因子II的影响,美国专利US5985582和中国专利CN102690862A中,公开了一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒(发色底物法),试剂盒包含肝素衍生物、凝血酶和发色底物试剂;所述试剂在把肝素加入样本前将其进行酶解得到肝素衍生物。这就增加了试剂制作的成本,工艺变得比较繁琐。由于该技术成本高,并且该现有技术在全自动凝血仪上进行AT-Ⅲ活性检测时需要更改很多参数,操作不方便,结果也容易出现误差。
Demers等人(Thrombosis and Hemostasia,69(3),pp.231-235(1993))报道采用FXa替代凝血酶,不会受到HCII的抑制,中国专利CN107153043A和CN106153612A公开了一种型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂,也是用FXa替代凝血酶,但是用FX分析成本更高,而且FXa不稳定,操作繁杂,不适合自动分析仪。
目前市场上的抗凝血酶Ⅲ的检测试剂多使用冻干粉制剂,然而冻干粉试剂需要冰冻干燥工序,工艺比较复杂,而且在使用时需要复溶,复溶过程中,加样量的不同,都会导致冻干粉制剂瓶间差,批间差很大。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒稳定性差、灵敏度低的问题,而提供一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒。
本发明提供一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,包括试剂R1、试剂R2、质控品和校准品;
所述的试剂R1包括凝血酶、肝素或其盐、第一缓冲液和保护剂;
所述试剂R2包括凝血酶的发色底物、第二缓冲液、稳定剂和第二防腐剂。
优选的是,所述凝血酶选自人、牛、猪凝血酶中的任意一种,所述的凝血酶的浓度为8-20U/mL。
优选的是,所述的肝素或其盐优选为肝素或肝素钠,浓度优选为12U/ml。
优选的是,所述保护剂包括氨基酸、多元醇、表面活性剂、金属离子螯合剂、无机盐和第一防腐剂;
所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸中的一种或几种,质量体积百分比为1%-20%;
所述多元醇选自木糖醇、甘露醇、山梨醇中的一种或几种,质量体积百分比为0.1%-10%;
所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、TritonX-100中的一种或几种,质量体积百分比为0.01%-0.5%;
所述金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、酒石酸钾钠、柠檬酸铵,质量体积百分比为5%-20%;
所述无机盐选自氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸钾,质量体积百分比为0.5%-10%。
优选的是,所述的发色底物选自Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(ChromozymTH)、Boc-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl或H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl中的一种或几种。
优选的是,所述的稳定剂为酪蛋白,质量体积百分比1-10%。
优选的是,所述的第一缓冲液和第二缓冲液分别选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或几种。
优选的是,所述的第一防腐剂和第二防腐剂分别选自叠氮钠、Proclin300、庆大霉素、硫柳汞。
优选的是,所述质控品由动物血浆,添加缓冲液、冻干保护剂和防腐剂冻干制成。
优选的是,所述校准品是将正常健康人血浆收集之后混合,然后进行AT-Ⅲ活性检测,检测值应在80%-120%,添加缓冲液、冻干保护剂和防腐剂,分装后冻干,然后用WHO抗凝血酶国际标准品血浆对该校准品进行溯源性定值。
本发明的有益效果
本发明提供一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,包括试剂R1、试剂R2、质控品和校准品;该试剂盒将稳定剂酪蛋白用于制备凝血酶发色底物液,能够使得凝血酶发色底物稳定地溶解在水溶液中。本发明的抗凝血酶Ⅲ检测试剂盒中R1和试剂R2均为液体型,开瓶即用,无需复溶,使用方便,储存有效期长达一年,能够有效解决试剂的稳定性问题,稳定性好、灵敏度高、特异性好、不受血浆样本中HCII的干扰,检测线性范围宽,最高检测限能达到155%。
附图说明
图1为抗凝血酶Ⅲ的校准曲线。
图2为抗凝血酶Ⅲ的线性曲线。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,该实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明提供一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,包括试剂R1、试剂R2、质控品和校准品;
所述的试剂R1包括凝血酶、肝素或其盐、第一缓冲液和保护剂;
所述试剂R2包括凝血酶的发色底物、第二缓冲液、稳定剂和第二防腐剂。
本发明所述凝血酶选自人、牛、猪凝血酶中的任意一种,优选牛凝血酶,所述的凝血酶的浓度为8-20U/mL。
本发明所述的肝素或其盐优选为肝素或肝素钠,浓度优选为12U/ml;
本发明所述的第一缓冲液优选为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或几种,更优选磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,缓冲液的工作浓度优选为0.01-0.5mol/L。
本发明所述保护剂优选包括氨基酸、多元醇、表面活性剂、金属离子螯合剂、无机盐和第一防腐剂;
所述氨基酸优选选自甘氨酸、赖氨酸或组氨酸中的一种或几种,更优选赖氨酸,工作浓度质量体积百分比1%-20%;
所述多元醇优选选自木糖醇、甘露醇、山梨醇中的一种或几种,更优选木糖醇,工作浓度质量体积百分比0.1%-10%;
所述表面活性剂优选选自吐温-20、吐温-80、Triton X-100中的一种或几种,更优选Triton X-100,工作浓度质量体积百分比0.01%-0.5%;
所述金属离子螯合剂优选选自乙二胺四乙酸二钠、酒石酸钾钠、柠檬酸铵,更优选乙二胺四乙酸二钠,工作浓度质量体积百分比5%-20%;
所述无机盐优选选自氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸钾,优选氯化钙,工作浓度质量体积百分比0.5%-10%,此浓度范围的氯化钙能保证缓冲液的离子强度的同时也能提高凝血酶的稳定性;
本发明所述的第一防腐剂优选为叠氮钠、Proclin300、庆大霉素、硫柳汞,更优选Proclin300,工作浓度质量体积百分比为0.01-1%。
本发明所述发色底物优选选自Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(ChromozymTH)、Boc-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl或H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl中的一种或几种。更优选Boc-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl。优选工作浓度为0.1mmol/L-4mmol/L,所述的凝血酶发色底物均是市售可得的。由此,可以有效地提高抗凝血酶Ⅲ活性测定的效率。
本发明所述的稳定剂优选为酪蛋白,优选工作浓度为质量体积百分比1-10%。该浓度范围内的酪蛋白能够使凝血酶发色底物稳定地溶解在水溶液中,由于不需要冻干过程,因此生产工艺得到简化,降低了生产成本。
本发明所述第二缓冲液可以和第一缓冲液相同,也可以不同,优选选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或几种,更优选磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,缓冲液的工作浓度为0.01-0.5mol/L。
本发明所述第二防腐剂可以和第一防腐剂相同,也可以不同,优选选自叠氮钠、Proclin300、庆大霉素、硫柳汞,更优选Proclin300,工作浓度质量体积百分比为0.01-1%。
本发明所述质控品由市售动物血浆,添加缓冲液、冻干保护剂、防腐剂冻干制成。
所述动物血浆来自猪、牛、马、羊、狗中的一种或几种。所述的缓冲液优选为5-40mM的Tris-HCl缓冲液;冻干保护剂优选为选自甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、山梨醇、木糖醇、甘露醇、中的一种或几种组合,更优选1%-10%的甘氨酸和0.1%-5%的山梨醇;防腐剂优选为工作浓度质量体积百分比为0.01-1%的Proclin300;所述的冻干温度优选为-60℃,冻干时间优选为12小时。
本发明所述校准品的制备是将正常健康人血浆收集之后混合,然后进行AT-Ⅲ活性检测,检测值应在80%-120%,添加缓冲液、冻干保护剂和防腐剂,分装后冻干,然后用WHO抗凝血酶国际标准品血浆对该校准品进行溯源性定值。
所述制备校准品的缓冲液优选为5-40mM的Tris-HCl缓冲液,冻干保护剂优选选自甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、山梨醇、木糖醇、甘露醇、中的一种或几种组合,更优选1%-10%的甘氨酸和0.1%-5%的山梨醇;所述防腐剂优选为工作浓度质量体积百分比为0.01-1%的Proclin300。所述的冻干温度优选为-60℃,冻干时间优选为12小时。
在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明:
实施例1试剂R1、试剂R2、质控品和校准品的制备
试剂R1保护剂的配制:使用pH 8.0的10mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加入2%赖氨酸、0.5%木糖醇、0.02%Triton X-100、5%EDTA、1%氯化钙、0.1%的Proclin300。
试剂R1的配制:牛凝血酶需提前配成高浓度,10mg/ml备用;肝素钠需提前配制成1mg/ml=180U/ml备用,配制10mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、加入配制好的保护剂、加入900ml纯净水,充分溶解,调pH至8.0,加入高比活牛凝血酶(购自沈阳拜英),至浓度为12U/ml,加入肝素钠至浓度为12U/ML。用纯净水定容终体积至1000ml。
试剂R2配制,将2.25g发色底物Boc-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl、20g酪蛋白、1gProclin300加入到10mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中,用盐酸调pH至5.0,用纯净水定容终体积至1000ml。
AT-Ⅲ校准品的配制:将健康正常人血浆混合后加入缓冲液中,缓冲液由20mMTris-HCl和4%的甘氨酸、0.1%的山梨醇、0.1%的Proclin300溶解,并调节pH值为7.5,以1ml/瓶分装冻干。用WHO抗凝血酶国际标准品血浆08/258对AT-Ⅲ校准品进行定值,定值为90%。
AT-Ⅲ质控品的配制:市售动物血浆混合后,添加20mM Tris-HCl缓冲液、4%的甘氨酸、0.1%的山梨醇、0.1%的Proclin300溶解,并调节pH值为7.0,以1ml/瓶分装冻干,用AT-III试剂测试质控品的值在正常范围内,定值为101%。
实施例2试剂R1、试剂R2、质控品和校准品的制备
试剂R1保护剂的配制:使用pH 7.5的10mM的Tris-HCl缓冲液加入1%半胱氨酸、1%海藻糖、0.01%吐温-20、0.5%氯化钾、0.1%蔗糖、0.1%的叠氮钠。
试剂R1的配制:牛凝血酶需提前配成高浓度,10mg/ml备用;肝素钠需提前配制成1mg/ml=180U/ml备用,配制10mM的Tris-HCl缓冲液、加入配制好的保护剂、加入900ml纯净水,充分溶解,调pH至7.5,加入高比活牛凝血酶(购自沈阳拜英),至浓度为9U/ml,加入肝素钠至浓度为9U/ML。用纯净水定容终体积至1000ml。
试剂R2的配制:将2.5g发色底物Tos-Gly-Pro-Arg-pNA、10g牛血清白蛋白、1gProclin300加入到20mM的甘氨酸-盐酸缓冲液中,调节pH至5.0,用纯净水定容终体积至1000ml。
AT-Ⅲ校准品的配制:将健康正常人血浆混合后加入缓冲液中,缓冲液由20mM PBS和2%的甘氨酸、0.1%的山梨醇、0.2%的Proclin300溶解,并调节pH值为7.5,以1ml/瓶分装冻干。用WHO抗凝血酶国际标准品血浆08/258对AT-Ⅲ校准品进行定值,定值为92%。
AT-Ⅲ质控品的配制:市售动物血浆混合后,添加20mM PBS缓冲液、2%的甘氨酸、0.1%的山梨醇、0.2%的Proclin300溶解,并调节pH值为7.5,以1ml/瓶分装冻干,用AT-III试剂测试质控品的值在正常范围内,定值为104%。
实施例3试剂R1、试剂R2、质控品和校准品的制备
试剂R1保护剂的配制:使用pH 7.5的10mM的HEPES缓冲液加入2%精氨酸、1%甘油、0.01%吐温-80、1%氯化钠、0.1%蔗糖、0.2%的庆大霉素。
试剂R1的配制:牛凝血酶需提前配成高浓度,10mg/ml备用;肝素钠需提前配制成1mg/ml=180U/ml备用,配制10mM、pH 7.5的PBS缓冲液、加入配制好的保护剂,高比活牛凝血酶(购自沈阳拜英),至浓度为10U/ml,肝素钠至浓度为5U/ml。
试剂R2的配制:将2.75g发色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl、10g牛血清白蛋白、1.5g Proclin300加入到10mM、pH 7.5的PBS缓冲液中。
AT-Ⅲ校准品的配制:将健康正常人血浆混合后加入缓冲液中,缓冲液由10mMHEPES和1%的甘氨酸、0.5%的甘露醇、0.2%的庆大霉素溶解,并调节pH值为7.4,以1ml/瓶分装冻干。用WHO抗凝血酶国际标准品血浆08/258对AT-Ⅲ校准品进行定值,定值为95%。
AT-Ⅲ质控品的配制:市售动物血浆混合后,添加10mM HEPES缓冲液、1%的甘氨酸、0.5%的甘露醇、0.2%的庆大霉素溶解,并调节pH值为7.2,以1ml/瓶分装冻干,用AT-III试剂测试质控品的值在正常范围内,定值为99%。
将实施例1制备得到的液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒做校准曲线,并进行线性范围测试、重复性检测、质控品均一性检测、稳定性检测和对肝素辅助因子Ⅱ的抗干扰研究。
1、校准曲线制作
按实施例1的方法配制配制试剂R1和试剂R2。取浓度为90%的抗凝血酶Ⅲ校准品,用抗凝血酶Ⅲ校准品和缓冲液按照以下比例配制样本,7:4、1:1、1:2、1:4、1:8,用希森美康CA7000对样本进行检测,将OD405吸光度变化率和对应的抗凝血酶Ⅲ浓度采取对数线性方程做出校准曲线,如图1所示。
2线性范围检测
样本来自冻干人血浆值为155%,用缓冲液按照比例稀释成活性浓度分别为96.92%、67.88%、38.84%、9.8%,用希森美康血凝仪CA7000重复检测三次,取平均值,做线性回归曲线,线性范围10%~155%均有较好的线性关系,相关系数r>0.99,满足检测抗凝血酶Ⅲ活性的要求。线性结果如图2和表1所示。
表1
实施例4重复性考察
在重复性条件下,用正常质控血浆重复测试10次,计算CV值。结果如表2所示,显示重复性CV=1.2%。
表2
实施例5质控品均一性考察
取5瓶质控品,每瓶测试1次,计算各参数5个测量结果的平均值和标准差SD1;另用上述5瓶质控品中的1瓶连续测试5次,计算各参数5个测量结果的平均值和标准差SD2;计算出瓶间均一性。如表3所示:
表3
瓶间 | 瓶内 |
100.6 | 101.8 |
99.1 | 100.1 |
98.8 | 99.8 |
100.5 | 100.8 |
102.1 | 99.6 |
SD1 | 1.325519 |
SD2 | 0.895545 |
SD瓶间 | 0.977241 |
mean | 100.22 |
CV | 0.98% |
测试结果显示质控品瓶间均一性CV=0.98%,说明配制的质控品均一性非常好。
实施例6稳定性考察
本发明以及竞品试剂R1和试剂R2分别放置于2-8℃和37℃,每隔7天取样,分别对质控品(101%)进行测定。测试结果如表4所示。
表4
试验结果显示,本发明所述液体即用型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂相比现有技术的液体试剂,在4℃和37℃具有更高的稳定性。本发明试剂在37℃可稳定14天。说明稳定性很好。
实施例7对肝素辅助因子Ⅱ的抗干扰研究
将血浆样本分别与干扰物质80U/ml肝素辅助因子Ⅱ(HCⅡ)采购自(HYPHENBioMed)按如下表所示的比例混合(具体浓度及混合方法见下表5):
表5含有HCII干扰物质的血浆样品
HCII浓度(U/ml) | 干扰物质原液用量(ul) | 血浆用量(ul) | 生理盐水用量(ul) |
0 | 0 | 1140 | 60 |
1 | 15 | 1140 | 45 |
2 | 30 | 1140 | 30 |
3 | 45 | 1140 | 15 |
4 | 60 | 1140 | 0 |
对比试剂采用SIEMENS公司生产的冻干粉型抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)测定试剂盒(发色底物法),采用希森美康CA7000仪器,分别对表5中所列出的含有HCII干扰物质的血浆样品进行抗凝血酶活性检测,分别求出测定结果的均值作为实测值。
表6
HCII浓度(U/ml) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
对比试剂实测值 | 102.2 | 103.9 | 104.6 | 109.1 | 118.3 |
相对偏差 | 0.0% | 1.7% | 2.3% | 6.8% | 15.8% |
本发明实测值 | 102.6 | 101.1 | 103.8 | 104.2 | 108.5 |
相对偏差 | 0.0% | -1.50% | 1.20% | 1.60% | 5.80% |
总结:抗干扰测试结果表明,组合在HCII浓度在4U/ml以下时,本试剂具有很好的抗干扰效果,明显优于竞品公司生产的液体型抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)测定试剂盒(发色底物法)。
Claims (10)
1.一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,其特征在于,包括试剂R1、试剂R2、质控品和校准品;
所述的试剂R1包括凝血酶、肝素或其盐、第一缓冲液和保护剂;
所述试剂R2包括凝血酶的发色底物、第二缓冲液、稳定剂和第二防腐剂。
2.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,其特征在于,所述凝血酶选自人、牛、猪凝血酶中的任意一种,所述的凝血酶的浓度为8-20U/mL。
3.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,其特征在于,所述的肝素或其盐为肝素或肝素钠,浓度为12U/ml。
4.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,其特征在于,所述保护剂包括氨基酸、多元醇、表面活性剂、金属离子螯合剂、无机盐和第一防腐剂;
所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸中的一种或几种,质量体积百分比为1%-20%;
所述多元醇选自木糖醇、甘露醇、山梨醇中的一种或几种,质量体积百分比为0.1%-10%;
所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、TritonX-100中的一种或几种,质量体积百分比为0.01%-0.5%;
所述金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、酒石酸钾钠、柠檬酸铵,质量体积百分比为5%-20%;
所述无机盐选自氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸钾,质量体积百分比为0.5%-10%。
5.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,其特征在于,所述的发色底物选自Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(ChromozymTH)、Boc-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl或H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,其特征在于,所述的稳定剂为酪蛋白,质量体积百分比1-10%。
7.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,其特征在于,所述的第一缓冲液和第二缓冲液分别选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,其特征在于,所述的第一防腐剂和第二防腐剂分别选自叠氮钠、Proclin300、庆大霉素、硫柳汞。
9.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,其特征在于,所述质控品由动物血浆,添加缓冲液、冻干保护剂和防腐剂冻干制成。
10.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒,其特征在于,所述校准品是将正常健康人血浆收集之后混合,然后进行AT-Ⅲ活性检测,检测值应在80%-120%,添加缓冲液、冻干保护剂和防腐剂,分装后冻干,然后用WHO抗凝血酶国际标准品血浆对该校准品进行溯源性定值。
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