CN105445469B - 一种缺血修饰白蛋白的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种缺血修饰白蛋白的检测试剂盒。具体而言，本发明的试剂盒包括钴离子和二硫苏糖醇。本发明的试剂盒一方面通过添加稳定剂，增加了试剂盒的储存稳定性，另一方面通过添加增溶剂，去除试剂对比色装置的污染。

Description

一种缺血修饰白蛋白的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及临床检验领域，具体地，涉及一种改进的缺血修饰白蛋白检测试剂盒。

背景技术

缺血修饰白蛋白(Ischemia-modified albumin,IMA)是指在组织缺血和再灌注发生时，N末端氨基酸被修饰(结合位点被铜离子占据或被乙酰化或缺失)的白蛋白，其特点是与过渡金属(镍、铜、钴)的结合能力下降。

IMA在心肌缺血后5-10分钟内即迅速升高，6-12h内回到基线，是心肌缺血发生后细胞坏死前的一个早期指标。与其它反映心肌梗塞的指标如CK-MB、Myo、cTn相比较，其动力学曲线表明，其产生的时间区更加靠前，判断心肌缺血灵敏度更高。

临床上，IMA主要应用于急性心肌缺血的早期诊断，以及急性冠状动脉综合征(ACS)早期诊断和危险分层。Sinha研究表明相对心电图(ECG)和肌钙蛋白T，IMA作为心肌缺血指标灵敏度最高。与ECG或者肌钙蛋白T结合诊断ACS，可以明显提高检测灵敏度。同时也有研究表明IMA不仅是判断心肌缺血的良好指标，而且其升高的水平还与心肌缺血的严重程度相关。也有报道指出，IMA的特异性较低，急性感染、终末期肾病、***疾病和肝硬化等疾病会引起IMA升高。

目前，IMA作为评价心肌缺血的指标，已经被美国FDA批准通过，同时也是唯一一项判定心肌缺血的指标。因此，该项目具有广阔的应用前景。

目前IMA的主要检测方法是白蛋白钴结合实验(albumin-cobalt binding assay，ACB)。其主要测定原理是：

第一步：

过量Co²⁺+白蛋白→Co-白蛋白+剩余Co²⁺

过量Co²⁺+IMA→不结合；

第二步：

剩余Co²⁺+显色剂→有色产物。

缺血修饰白蛋白对Co²⁺结合能力低于正常白蛋白，血清中白蛋白与过量Co²⁺结合后，剩余的游离Co²⁺与有机显色物(二硫苏糖醇及其类似物或偶氮显色剂等)反应生成有色(红色或蓝色)产物，在一定的波长下进行比色，其吸光度与Co²⁺浓度、IMA含量成正比，与标准品进行比较，即可计算出样本中IMA的浓度。

在ACB实验中，钴离子与显色剂结合后，形成的复合物水溶性很差。特别是当样本中含有的IMA浓度比较高或者检测空白样本时，反应生成的复合物浓度高，会直接在反应过程中析出而吸附在仪器的比色装置中。这对仪器造成污染，进而影响整个仪器的分析性能。

另外还有使用ELISA、HPLC/MS等测定方法，但由于操作不方便，使用很少。

发明内容

根据本发明的一些实施方式，提供了一种改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，其包括步骤：1)提供待测样本、2)使待测样本与第一试剂接触、3)之后使待测样本与第二试剂接触。应当理解，任何本领域中已知的白蛋白钴结合实验(ACB实验)均适用于本发明改善污染的方法，例如但不限于《Cardiovascular Biomarkers:Pathophysiology andDisease Management》Springer出版社2010年；《Biomarkers in Heart Disease》James deLemos.John Wiley&Sons,2009年中所描述的那些。

在一些具体的实施方式中，第一试剂包含：缓冲液和Co2+；第二试剂包含：缓冲液和显色剂。和现有技术中的白蛋白钴结合实验相比，本发明的方法不同之处之一在于反应体系中还包括增溶剂。在一些具体的实施方式中，在第一试剂中、和/或在第二试剂中、甚至和/或在第三试剂中、或者在每一个试剂中含有增溶剂；增溶剂选自如下的一种或多种：白蛋白、甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、异戊醇和二甲基亚砜。在一个优选的实施方式中，增溶剂是白蛋白(例如BSA)或丙三醇。在一些具体的实施方式中，当增溶剂是白蛋白时，白蛋白的含量为0.01-20％，例如是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、15、16、18、20％或者上述任意两个端值之间的范围，优选0.05-2％，更优选0.1-1％，最优选0.2％；在一些优选的实施方式中，白蛋白在第1试剂中的含量为0.2％。当增溶剂是白蛋白以外的增溶剂时，其含量为0.1-20％，例如0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、15、16、18、20％或者上述任意两个端值之间的范围，优选0.2-10％，更优选0.5-5％；在一个优选的实施方式中，丙三醇在第2试剂中的含量为2％。

尽管不受任何理论限制，可以这样理解，本发明的方法通过引入增溶剂，增加复合物在溶剂中的溶解性，进而去除反应产物对仪器比色装置的污染。

适用于现有技术中白蛋白钴结合实验的任何待测样本均可用于本申请的方法，选自全血、血清、血浆和尿液。

在一些具体的实施方式中，稳定剂所在的试剂(例如第二试剂)还包含稳定剂。稳定剂优选是三(2-羧乙基)膦-盐酸盐。稳定剂的含量为0.05-100 mM，例如0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、6.0、8.0、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100mM或者上述任意两个端值之间的范围，优选0.2-20mM，最优选1mM。尽管不受任何理论限制，可以这样理解，由于显色剂(如二硫苏糖醇)为还原性物质，在作为液体试剂盒使用时，长期放置容易被空气中的氧气氧化，进而导致失去显色能力。因此，本发明的方法可通过添加稳定性组分，增加显色剂在液体基质的稳定性，增加试剂的储存稳定性。

在一些具体的实施方式中，缓冲液选自如下一种或多种：Good's缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液和乙酸缓冲液，缓冲液浓度为10-500mM、10-50mM、50-100mM、100-200mM、200-300mM、300-500mM。

在一些具体的实施方式中，Co²⁺选自：氯化钴、硫酸钴、硝酸钴、硼酸钴；所述Co²⁺的含量为0.01-10mM，优选0.05-2mM，更优选0.1–0.5mM，最优选0.3mM。

在一些具体的实施方式中，显色剂是二硫苏糖醇，所述显色剂的含量为0.1-100mM，优选1-10mM，更优选2-5mM，最优选3mM。

根据本发明的另一些实施方式，提供了一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其包含：

其中增溶剂选自如下的一种或多种：白蛋白、甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、异戊醇和二甲基亚砜。

在一些具体的实施方式中，试剂盒还包含稳定剂。稳定剂优选是三(2-羧乙基)膦-盐酸盐。稳定剂的含量为0.05-100mM，优选0.2-20mM，更优选0.5-5mM，最优选1mM。

和现有技术中的IMA检测试剂盒相比，本发明的试剂盒不同之处之一在于试剂盒中还包括增溶剂。在一些具体的实施方式中，在第一试剂中、和/或在第二试剂中、甚至和/或在第三试剂中、或者在每一个试剂中含有增溶剂。增溶剂选自如下的一种或多种：白蛋白、甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、异戊醇和二甲基亚砜。在一个优选的实施方式中，增溶剂是白蛋白或丙三醇。在一些具体的实施方式中，当增溶剂是白蛋白时，白蛋白的含量为0.01-20％，优选0.05-2％，更优选0.1-1％，最优选0.2％；在一个优选的实施方式中，白蛋白在第1试剂中的含量为0.2％。当增溶剂是白蛋白以外的增溶剂时，其含量为0.1-20％，优选0.2-10％，更优选0.5-5％，最优选2％；在一个优选的实施方式中，丙三醇在第2试剂中的含量为2％。

在一些实施方式中，试剂盒中的缓冲液选自如下一种或多种：Good's缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液和乙酸缓冲液。第一试剂和第二试剂中的缓冲液可以相同也可以不同，优选相同。在一些实施方式中，Co²⁺选自氯化钴、硫酸钴、硝酸钴、硼酸钴；所述Co²⁺的含量为0.05-2mM，更优选0.1–0.5mM，最优选0.3mM。在一些实施方式中，显色剂是二硫苏糖醇，所述显色剂的含量为1-10mM，更优选2-5mM，最优选3mM。

技术人员可以理解，所述试剂盒可以制备成任何适当的形式，三试剂或双试剂的形式，通常制备成双试剂的形式。试剂盒可以是干粉试剂，即使用前加水溶解；也可以是液体试剂，直接使用。技术人员还可以理解，为了避免提前发生显色，Co²⁺与显色剂位于不同的试剂中。例如在一些实施方式中，Co²⁺位于第一试剂中，而显色剂位于第二试剂中。在一些实施方式中，显色剂和稳定剂位于同一试剂中。

在一些实施方式中，试剂盒还可以包含表面活性剂、和/或防腐剂等辅助成分，浓度分别在0.01到2％之间，这可以由技术人员自行确定。

根据一个具体的实施方式，本发明的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，包含或由如下组成：

试剂1：

Good’s缓冲液 50mM，

氯化钴 0.3mM，

Triton X-405 0.1％；

试剂2：

根据另一个具体的实施方式，本发明的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，包含或由如下组成：

试剂1：

试剂2成分及浓度：

Good’s缓冲液 100mM，

二硫苏糖醇 5mM，

三(2-羧乙基)膦-盐酸盐 5mM。

根据本发明的另一些实施方式，提供了一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒的制备方法，按照本领域公知的常规方法配制本发明的试剂盒，其特征在于包括向试剂中加入增溶剂的步骤。增溶剂选自如下的一种或多种：白蛋白、甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、异戊醇和二甲基亚砜。在一个优选的实施方式中，增溶剂是白蛋白或丙三醇。在一些具体的实施方式中，当增溶剂是白蛋白时，白蛋白的含量为0.01-20％，优选0.05-2％，更优选0.1-1％，最优选0.2％；在一个优选的实施方式中，白蛋白在第1试剂中的含量为0.2％。当增溶剂是白蛋白以外的增溶剂时，其含量为0.1-20％，优选0.2-10％，更优选0.5-5％，最优选2％；在一个优选的实施方式中，丙三醇在第2试剂中的含量为2％。

检测IMA时产生的剩余钴离子可以使用本领域内公知的方法，可以通过电化学、化学放光等方法，也可以用包括离子分析仪在内的仪器检测反应。

本发明提供的检测缺血修饰白蛋白的试剂盒，可以在全自动生化分析仪及半自动生化分析仪上使用，不需要其它的仪器，测定结果准确，速度快，重复性好，稳定性好，抗干扰能力强，便于推广使用。

附图说明

图1显示本发明试剂盒2测量样本时的样本浓度线性范围。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下述实验方法如无特别说明，所使用的实验材料均可容易地从商业公司获取。

实施例1：本发明试剂盒的制备方法

按照如下成分，将试剂盒配制成液体双试剂的形式。

试剂盒1.本发明试剂盒的第一个组成为双试剂试剂盒，其成分如下：

试剂1成分及浓度：

Good’s缓冲液： 50mM，pH 8.0

氯化钴： 0.3mM，

Triton X-405: 0.1％；

试剂2成分及浓度：

试剂盒2.本发明试剂盒的第2个组成为双试剂试剂盒，其成分如下：

试剂1成分及浓度：

试剂2成分及浓度：

Good’s缓冲液： 100mM，

二硫苏糖醇: 5mM，

三(2-羧乙基)膦-盐酸盐: 5mM。

实施例2.试剂盒的使用方法

本检测方法为速率法。

1)提供血清样本，

2)将150μL试剂1与20μL血清样本混合后，37℃孵育5min，检测505nm下吸光度A1，

3)加入50μL试剂2，再孵育5min，检测5min时505nm下吸光度A2。从而计算出样本中IMA的浓度。其它本领域公知的适当检测方式和操作步骤也可以使用。

测试例1.稳定性考察

将本试剂盒1放入2-8℃10个月，考察试剂稳定性。主要依据空白吸光度的变化来考察。实验结果见表1。可以看出，本试剂盒的稳定性良好。

表1：本发明试剂盒1的稳定性结果

测试例2：重复性、线性范围及抗污染性能

(1)使用本发明的试剂盒2同时平行测量同一例血清样本20次，检测试剂盒测量样本时的重复性，结果见表2。

表2：本发明试剂盒2测定血清样本时的重复性结果

(2)使用血清高值和低值样本，用本发明的试剂盒2进行检测，验证本发明试剂盒测量样本时的样本浓度线性范围，结果见图1。可见，本发明的试剂盒测量重复性高，测量线性范围广。

(3)将试剂盒1或2分别在Beckman AU系列机型上测定R1的空白吸光度，保证各批次检测使用同一比色杯，考察检测前后比色杯的吸光度变化。

表3：本发明试剂盒2对试剂污染性能的影响(增溶剂在R1)

表4：本发明实施例试剂盒1对试剂污染性能的影响(增溶剂在R2)

可以明显看出，本发明的试剂盒，在做过一次测定之后，对比色杯没有影响，而对比试剂盒则对比色杯产生明显的吸附污染，进而影响整个检测仪器的分析性能。

Claims (29)

1.一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂，

其中，所述的第一试剂中包含：

缓冲液 10mM至500mM，

Co²⁺ 0.01mM至10mM；

所述的第二试剂中包含：

缓冲液 10mM至500mM，

显色剂 0.1mM至100mM；

在第一试剂和/或第二试剂中还含有白蛋白，白蛋白按质量/体积计的含量为0.05％至2％。

2.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，还包含稳定剂，所述稳定剂是三(2-羧乙基)膦-盐酸盐；

所述稳定剂的含量为0.2mM至20mM。

3.根据权利要求2所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，三(2-羧乙基)膦-盐酸盐的含量为0.5mM至5mM。

4.根据权利要求2所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，三(2-羧乙基)膦-盐酸盐的含量为1mM。

5.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其中：

白蛋白的含量按质量/体积计为0.1％至1.0％。

6.根据权利要求5所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其中：

白蛋白的含量按质量/体积计为0.2％。

7.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其中：

缓冲液选自如下一种或多种：Good's缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液和乙酸缓冲液；

Co²⁺选自：氯化钴、硫酸钴、硝酸钴、硼酸钴；

所述Co²⁺的含量为0.05mM至2mM；

显色剂是二硫苏糖醇，所述显色剂的含量为1mM至10mM。

8.根据权利要求7所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其中：

所述Co²⁺的含量为0.1mM至0.5mM。

9.根据权利要求8所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其中：

所述Co²⁺的含量为0.3mM。

10.根据权利要求7所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其中：

所述显色剂的含量为2mM至5mM。

11.根据权利要求10所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其中：

所述显色剂的含量为3mM。

12.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，所述试剂盒是三试剂或双试剂的形式；其中Co²⁺与显色剂位于不同的试剂。

13.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，还包含表面活性剂，按质量/体积计浓度为0.01％到2％。

14.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，还包含防腐剂，按质量/体积计浓度为0.01％到2％。

15.一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其包含：

第一试剂：

第二试剂：

Good’s缓冲液 100mM，

二硫苏糖醇 5mM，

三(2-羧乙基)膦-盐酸盐 5mM。

16.一种制备权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒的方法，其特征在于方法包括向试剂中加入白蛋白的步骤；

白蛋白按质量/体积计的含量为0.05％至2％。

17.根据权利要求16所述的方法，其中：

白蛋白的含量按质量/体积计为0.1％至1.0％。

18.根据权利要求17所述的方法，其中：

白蛋白的含量按质量/体积计为0.2％。

19.一种改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，其包括步骤：

1)提供待测样本、

2)使待测样本与第一试剂接触、

3)之后使待测样本与第二试剂接触；

其中

第一试剂包含缓冲液和Co²⁺；

第二试剂包含缓冲液和显色剂；

其中第一试剂和/或第二试剂中还含有增溶剂白蛋白，白蛋白按质量/体积计的含量为0.05％至2％；

待测样本选自：全血、血清、血浆和尿液。

20.根据权利要求19所述的改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，其中：

白蛋白的含量按质量/体积计为0.1％至1.0％。

21.根据权利要求20所述的改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，其中白蛋白的含量按质量/体积计为0.2％。

22.根据权利要求19所述的改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，所述第二试剂还包含稳定剂，

所述稳定剂是三(2-羧乙基)膦-盐酸盐，其含量为0.2mM至20mM。

23.根据权利要求22所述的改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，三(2-羧乙基)膦-盐酸盐的含量为0.5mM至5mM。

24.根据权利要求23所述的改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，三(2-羧乙基)膦-盐酸盐的含量为1mM。

25.根据权利要求19所述的改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，其中：

缓冲液选自如下一种或多种：Good's缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液和乙酸缓冲液，缓冲液浓度为10mM至500mM；

Co²⁺选自：氯化钴、硫酸钴、硝酸钴、硼酸钴；

所述Co²⁺的含量为0.05mM至2mM；

显色剂是二硫苏糖醇，所述显色剂的含量为1mM至10mM。

26.根据权利要求25所述的改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，其中所述Co²⁺的含量为0.1mM至0.5mM。

27.根据权利要求26所述的改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，其中所述Co²⁺的含量为0.3mM。

28.根据权利要求25所述的改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，其中所述显色剂的含量为2mM至5mM。

29.根据权利要求28所述的改善白蛋白钴结合实验中仪器污染的方法，其中所述显色剂的含量为3mM。