CN102747133B - 一种腺苷脱氨酶检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种检测人腺苷脱氨酶（ADA）的检测试剂盒。试剂盒盒体内包括：甘氨酸缓冲液、3-甲基-N，N-二丙磺酸钠苯胺配制的显色剂、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、腺嘌呤核苷、4-氨基安替比林溶液。通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列反应，再将反应物置于半/全自动生化分析仪下，检测主波长550nm处吸光度变化的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的浓度大小。本试剂盒具有准确、稳定、方便的优点。

Description

一种腺苷脱氨酶检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人腺苷脱氨酶的检测试剂盒。

背景技术

腺苷脱氨酶（ADA）是嘌呤核苷分解代谢过程中关键作用的酶，它能催化腺嘌呤核苷降解为次黄嘌呤核苷，而后经核苷磷酸化酶催化成次黄嘌呤，最终氧化成代谢产物尿酸。腺苷脱氨酶有三种同工酶，分别是腺苷脱氨酶1、腺苷脱氨酶1+cp及腺苷脱氨酶2。

腺苷脱氨酶在动物体内的分布以盲肠、小肠粘膜和脾中含量最高，在纤维细胞、羊水细胞、肝、肾、肺、骨骼肌等处也有发现，血液中ADA主要存在于血细胞中，如红细胞、淋巴细胞和粒细胞，其活性约为血清中的40～70倍，组织中的腺苷脱氨酶活性在冰冻条件下可保持一周，在组织匀浆中可低温保存数月之久。

腺苷脱氨酶活性是反映肝损伤的敏感指标。慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌患者血清腺苷脱氨酶活性显著升高。其阳性率达85%～90%，故腺苷脱氨酶活性测定可作为慢性肝病的筛选指标。失代偿期肝硬化腺苷脱氨酶活性明显高于代偿期肝硬化，因而可判断慢性肝病的程度。另外，慢性活动性肝炎腺苷脱氨酶活性明显高于慢性迁延性肝炎，故可用于二者的鉴别诊断。

ADA检测方法经过多次改进，形成了目前市场上ADA检测试剂盒的两种主要检测方法，包括连续检测法和酶偶联法。

最早的ADA检测原理是ADA将腺苷脱氨产生次黄苷和氨。低的底物浓度达不到底物饱和要求，造成ADA活性检测失真。因此，该法不适用于临床应用。随后发展的第二代ADA检测原理为腺苷脱氨酶催化腺嘌呤核苷水解，产生次黄嘌呤核苷和氨。此方法所需试剂易配制，仪器简单，但灵敏度低，易受外源性NH3影响，空白过高，不能直接测定红细胞ADA活性。

同样原因，ADA偶联谷氨酸脱氢酶反应: 通过测量340nm处NADPH吸光度下降的速度来测算ADA活性。该法也因血清含氨干扰，以及测试***中过高NADPH造成非特异性氧化而无成算。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测人腺苷脱氨酶（ADA）的检测试剂盒。该试剂盒结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广。

本发明的另一目的是提供上述检测试剂盒的生产制备及使用方法。

为实现上述目的，本发明提供的试剂盒组成为：

1.甘氨酸缓冲液、2.显色剂、3.嘌呤核苷磷酸化酶、4.黄嘌呤氧化酶、5.过氧化物酶、6.腺嘌呤核苷、7.4-氨基安替比林溶液。。

本发明提供的上述试剂盒的制备方法及操做步骤如下：

（a）按下列比例配制好试剂：

甘氨酸缓冲液                80mmol/L

显色剂                      10mmol/L

嘌呤核苷磷酸化酶           0.5-1KU/L

黄嘌呤氧化酶               0.8-1KU/L

过氧化物酶                  0.6-1KU/L

腺嘌呤核苷                  30mmol/L

4-氨基安替比林溶液         10mmol/L

（b）将试剂与待测样本按一定比例混合，使其完全反应；

（c）用半/全自动生化分析仪测定吸光度变化值；

（d）根据吸光度变化值计算出样本中腺苷脱氨酶的浓度。

本发明试剂盒的独特性在于，显色剂为含有3-甲基-N，N-二丙磺酸钠苯胺的磷酸盐缓冲液，4-氨基安替比林溶液为含有4-氨基安替比林的氯仿溶液。经过一系列反应后，可形成醌类化合物，具有显色效果好、反应迅速、稳定的有点。

具体实施方式

下述实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。

实施例1：

本发明的试剂盒举例可以是双试剂，其中：

试剂1：

甘氨酸缓冲液                80mmol/L

显色剂                       10mmol/L

嘌呤核苷磷酸化酶             0.5KU/L

黄嘌呤氧化酶                 0.8KU/L

过氧化物酶                   0.6KU/L

试剂2：

腺嘌呤核苷                   30mmol/L

4-氨基安替比林溶液           10mmol/L

其中：

（1）甘氨酸缓冲液为35mM甘氨酸，0.05%吐温-20, 10mM乙二胺四乙酸二钠，0.05%硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5-10；

（2）显色剂为含有20mM3-甲基-N，N-二丙磺酸钠苯胺的磷酸盐缓冲液；

（3）4-氨基安替比林溶液为含有25mM 4-氨基安替比林的氯仿溶液。

实施例2：试剂盒使用方法

1.试剂准备，试剂可为液体双试剂，开瓶即用，其中：

试剂1：

甘氨酸缓冲液                80mmol/L

显色剂                      10mmol/L

嘌呤核苷磷酸化酶             0.5KU/L

黄嘌呤氧化酶                 0.8KU/L

过氧化物酶                   0.6KU/L

试剂2：

腺嘌呤核苷                   30mmol/L

4-氨基安替比林溶液           10mmol/L

2.全自动生化仪参数设置

(a)检测温度：37℃

(b)检测波长：主波长为550nm；副波长为700 nm；

(c)反应时间：10分钟，其中，温育时间5分钟，反应时间3分钟，检测时间2分钟。

3.检测步骤（全部在全自动生化分析仪中完成）

(a)取180μL 试剂1和5μL血清样本混匀。

(b)将混匀后的溶液在37℃温育5分钟。

(c)添加60μL 试剂2，反应3分钟后，在550nm条件下检测2分钟的吸光度变化。

4.通过吸光度变化的计算出腺苷脱氨酶的浓度。

本发明具有的优点：

该试剂盒结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广。所需检测仪器（生化分析仪）在各大医院和检测中心普遍使用。

Claims (7)

1.一种腺苷脱氨酶检测试剂盒，其组成为：

甘氨酸缓冲液                80mmol/L；

显色剂                      10mmol/L；

嘌呤核苷磷酸化酶             0.5KU/L；

黄嘌呤氧化酶                 0.8KU/L；

过氧化物酶                   0.6KU/L；

腺嘌呤核苷                  30mmol/L；

4-氨基安替比林溶液          10mmol/L；

其中，甘氨酸缓冲液为35mM甘氨酸，0.05%吐温-20, 10mM乙二胺四乙酸二钠，0.05%硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5-10；显色剂为含有20mM3-甲基-N，N-二丙磺酸钠苯胺的磷酸盐缓冲液；4-氨基安替比林溶液为含有25mM 4-氨基安替比林的氯仿溶液。

2.一种根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于其操作方法：

（a）按权利要求1配制好试剂；

（b）将试剂与待测样本按一定比例混合，使其完全反应；

（c）用半/全自动生化分析仪测定吸光度变化值；

（d）根据吸光度变化值计算出样本中腺苷脱氨酶的浓度。

3.一种根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，被测样品与试剂比例应控制在1：45到1：60之间。

4.一种根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，反应温度为37±1℃。

5.一种根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，反应时间为10-15分钟。

6.一种根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，用半/全自动生化分析仪检测的主波长为550nm，副波长为700 nm。

7.一种根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂配置成单试剂、双试剂或三试剂。