CN102095696A - 一种同型半胱氨酸测定方法及其试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同型半胱氨酸浓度的测定方法：将待测样本在酶循环反应***中，进行如式1～3所示的反应，测定酶循环反应生成的氨的生成速率并计算，即得待测样本中同型半胱氨酸含量；所述的酶循环反应***包括蛋氨酸合成酶、蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、以及5-甲基四氢叶酸或其盐和O-乙酰-L-高丝氨酸。本发明还公开了与该方法相应的测定试剂。本发明建立了一种新型的同型半胱氨酸的酶学测定方法及测定试剂。本发明方法无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉，可实现临床快速、大流量的样本检测，使同型半胱氨酸成为临床上常规检测项目成为可能，具有极高的科学和经济价值。
Description
技术领域
本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种同型半胱氨酸测定试剂。
背景技术
同型半胱氨酸(Homocysteine)是含硫氨基酸，在细胞内由蛋氨酸脱甲基生成。近期的研究表明，同型半胱氨酸通过产生超氧化物及过氧化物损伤血管内皮细胞，改变凝血因子功能，增加血栓形成倾向，促进动脉粥样硬化及血栓形成，使心血管疾病发病率及死亡率增加，因此测定血中同型半胱氨酸的浓度在临床上意义十分重要。当同型半胱氨酸在细胞内积聚，并进入血液循环后，大部分以氧化型存在，并与蛋白结合，还原形同型半胱氨酸在血中仅占1％。测定血中总同型半胱氨酸的含量，一般需采用还原剂将氧化型同型半胱氨酸还原为还原型同型半胱氨酸，常用的还原剂为三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)。
同型半胱氨酸在临床应用中的测定方法主要包括：高效液相色谱法、酶免疫分析法、荧光偏振法等。上述方法的共同特点是需要特别的测定仪器、操作复杂，试验耗时较长，不能应用于临床大流量的自动化分析，并且价格昂贵。
由于同型半胱氨酸在样本中的含量较低，常规临床酶学的测定方法无法达到所需的测定灵敏度，限制了常规方法的采用。在酶学方法测定同型半胱氨酸的技术方面，Naoto Matsuyama等(参见美国专利#6686172)发明了一种利用同型半胱氨酸转甲基酶和腺苷同型半胱氨酸酶的非循环酶学测定技术，提高测定灵敏度的方法，但该方法操作繁琐，试剂复杂，测定前需加入巯基化合物，测定时必须同时进行多项空白测定，增加了测定方法的不准确性。
本发明公开了一种新的测定体液样本中同型半胱氨酸的酶循环方法，该方法不受体液样本中干扰物质的干扰，具有优良的反应灵敏度。并进过巧妙设计，首次在测定同型半胱氨酸的酶学方法采用产物二次循环方法，不但为酶学测定试剂创建了一种新的循环增量测定方法，而且进一步提高了反应的灵敏度和抗干扰性能。本发明同时还首次公开了基于二次酶循环法制备的同型半胱氨酸测定试剂，该试剂可以应用于目前广泛使用的临床自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题一方面是为了克服现有的同型半胱氨酸测定方法需特殊仪器、操作复杂、耗时长、不能进行大流量的自动化分析的缺陷；另一方面是为了进一步提高现有全自动分析试剂的灵敏度，从而改善测定质量，而提供的一种同型半胱氨酸测定试剂。同时还提供了一种全新的同型半胱氨酸酶循环测定试剂。
本发明人巧妙地利用酶循环反应，首次公开了一种同型半胱氨酸二次酶循环法的测定试剂。该方法无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉，可实现临床快速、大流量的样本测试，并大大提高了同型半胱氨酸在临床常规检测项目中的质量，具有极高的科学和经济价值。具体的，本发明通过下述技术方案解决上述技术问题：
本发明涉及一种同型半胱氨酸的测定方法，其包括如下步骤：将待测样本在酶循环反应***中，进行如式1～3所示的反应，测定酶循环反应生成的氨的生成速率并计算，即得待测样本中同型半胱氨酸含量；所述的酶循环反应***包括蛋氨酸合成酶(Methionine synthetaseEC 2.1.1.13，)、蛋氨酸γ-裂解酶(Methionine gamma-lyase EC 4.4.1.11)、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶(O-Acetylhomoserine aminocarboxypropyltransferase EC 2.5.1.49)、5-甲基四氢叶酸或其盐和O-乙酰-L-高丝氨酸。
本发明的方法采用循环增量的构思，通过将待测样本中的同型半胱氨酸经式1所示的反应生成L-蛋氨酸，之后再经式2和3所示反应的反复循环，不断生成氨，极大的提高了检测灵敏度。由于氨的生成速率与同型半胱氨酸含量成正比，通过测定氨的生成速率，经计算即得同型半胱氨酸含量。
本发明的方法中，所述的待测样本可为各种形式的需检测其所含同型半胱氨酸含量的样本，如体液样品或组织样本，更具体的如血清样本或血浆样本。所述的待测样本与酶循环反应***的用量比没有特殊要求，只要能满足进行式1～3所示的反应即可，但同一测定批次内应一致。
本发明的方法中，如式1～3所示，所述的蛋氨酸合成酶、蛋氨酸γ-裂解酶和O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶均为反应催化剂，用量均为催化有效量以上，一般可为0.1～500kU/L，较佳的为1～100kU/L(U为国际单位)。显然的，增加上述酶的用量并不影响本发明方法的应用，但会增加成本。所述的5-甲基四氢叶酸或其盐(如5-甲基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸钠)的用量以过量可促进循环反应向理想方向进行为宜，一般可为0.01～50mmol/L，较佳的为0.1～30mmol/L，更佳的为1～5mmol/L。所述的O-乙酰-L-高丝氨酸可以是商品化的成品，也可以通过酶促化学反应现场生成，如：
本发明的酶循环反应***为可保证样本在其中能进行如式1～3所示的反应的***，因此其应为能保证所用酶的活性的缓冲液体系，较佳的为pH6～9的缓冲液体系。所述的缓冲液可为本领域常用的各种缓冲液，如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙基磺酸)(HEPES)缓冲液等。缓冲液的浓度(缓冲对的总浓度)无特殊要求，一般为20～300mmol/L。
根据需要，本发明的酶循环反应***还可包括能稳定和/或促进酶活性的酶稳定剂。所述的酶稳定剂较佳的为甘露糖醇、甘油、聚乙二醇(优选聚乙二醇2000～8000)、EDTA、金属离子(如钾离子或钠离子)、牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。所述的酶稳定剂的用量按常规用量选择，一般为0.1～500mmol/L。
本发明的方法中，所述的反应和测定的温度以所用酶可发挥活性的温度下进行即可，一般为25～39℃，较佳的为37℃。较佳的，在进行所述的反应前，将所述的酶循环反应***在上述温度下进行哺育，以使酶循环反应***温度均一平衡。所述的哺育的时间较佳的为2～5分钟，更佳的为5分钟。
本发明的方法中，具体操作只要使待测样本能在所述的酶循环反应***中进行如式1～3所示的反应，测定氨的生成速率即可。例如，可将待测样本直接置于所述的酶循环反应***中，或者可将待测样本与所述的酶循环反应***中部分成分混合，之后再与其他成分混合。
较佳的，在所述的反应开始之后，延迟一定时间再进行测定，以还原样本中氧化型同型半胱氨酸和排除待测样本中干扰物的副反应，使检测结果更准确。所述的延迟的时间较佳的为0.5～3分钟，更佳的为1～3分钟。
本发明的方法中，所述的测定一般在所述的反应开始后1～15分钟内完成为宜。
本发明的方法中，所述的测定酶循环反应生成的氨的生成速率并计算的方法按本领域常规方法进行，如速率法或两点法(也称固定时间法)，通过参照标准品或绘制标准浓度曲线等，计算出同型半胱氨酸含量，在此不再赘述。
具体测定氨的生成速率的方法可采用现有的各种检测氨的方法，本发明优选常用的谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶循环反应检测法，反应式如式5-6所示。
本发明一较佳实例中：采用谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶循环反应和固定时间法进行测定和计算，具体为：所述的酶循环反应***中还包括α-酮戊二酸或其盐(如钠盐)、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶，酶循环反应生成的氨在α-酮戊二酸或其盐、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶的作用下，进行如式5-6所示的反应，检测反应体系在还原型辅酶吸收波长下所选的两个测定时间点的吸光度差值，参照标准品或标准浓度曲线，计算得待测样品中同型半胱氨酸含量。
上述谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶组成的酶循环反应检测法中，所述的谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶的用量为催化有效量以上，一般可为0.1～50kU/L(U为国际单位)。所述的α-酮戊二酸或其盐的用量以过量为宜，一般可为1～50mmol/L，较佳的为1～20mmol/L。所述的还原型辅酶的用量以过量为宜，一般可为0.1～1mmol/L，较佳的为0.2～0.3mmol/L。所述的还原型辅酶可为酶学领域可用于式4反应的各种还原型辅酶，如NADH、NADPH、硫代NADH或硫代NADPH等。相应的，检测在所选用的还原型辅酶的吸收波长下进行。例如，采用NADH或NADPH时，可在340nm下进行检测。采用硫代NADH或硫代NADPH时，特定吸收波长为398nm处，但实际应用时，可采用分析仪器上固定设置的波长，如自动生化分析仪上固定设置的405nm或410nm下进行检测。除上述谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶组成的酶循环反应检测法外，也可采用其他方法测氨，在此不再列举。
本发明的方法可采用常规仪器进行，如紫外/可见光分光光度计分析仪、半自动或全自动生化分析仪。
本发明还涉及一种同型半胱氨酸的测定试剂，其包括下述成分：蛋氨酸合成酶(Methioninesynthetase EC 2.1.1.13，)、蛋氨酸γ-裂解酶(Methionine gamma-lyase EC 4.4.1.11)、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶(O-Acetylhomoserine aminocarboxypropyltransferase EC 2.5.1.49)、5-甲基四氢叶酸或其盐和O-乙酰-L-高丝氨酸。
本发明的测定试剂可配合现有市售的测定氨的试剂盒，进行测定。或者，本发明的测定试剂还可包含测定氨的试剂，如还包含α-酮戊二酸或其盐、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶，以适用采用谷氨酸脱氢酶反应检测法测定氨。所述的α-酮戊二酸或其盐、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶或谷氨酸氧化酶同前述。显然，若采用其他方法测定氨，本发明的测定试剂可还含有相应的测定氨的试剂。
根据需要，所述的测定试剂还可包含酶稳定剂和/或缓冲成分。所述的酶稳定剂同前述。所述的缓冲成分为可形成前述缓冲液的成分。
所述的测定试剂可为固体干粉形式(如冻干粉)，待使用时再加水配制成溶液，也可还包括水，为水溶液形式。所述的水溶液形式可为能直接使用的水溶液形式，或需经稀释才使用的浓缩液形式。
所述的测定试剂中，各成分的量以能进行如式1～3所示的反应的量选择。若为能直接使用的水溶液形式时，各成分的量可同前述进行选择。若为固体干粉形式或需经稀释才使用的浓缩液形式，各成分的量可以能溶解和/或稀释为能直接使用的水溶液形式的量进行选择。
所述的测定试剂可为所有成分混合的单一试剂形式，也可为包含独立包装各成分的成套试剂盒形式，还可为将各成分分为若干独立包装组分的成套试剂盒形式(如双组份或三组分成套试剂盒)。
本发明一较佳实例中，所述的测定试剂为单一试剂，其为包含蛋氨酸合成酶、蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、5-甲基四氢叶酸或其盐和O-乙酰-L-高丝氨酸。较佳的，其还含有酶稳定剂。
本发明另一较佳实例中，所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1和2的双组份成套试剂盒，试剂1包含还原型辅酶、α-酮戊二酸或其盐、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、蛋氨酸γ-裂解酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、乙酰辅酶A和L-高丝氨酸，试剂2包含蛋氨酸合成酶和5-甲基四氢叶酸或其盐。较佳的，试剂1和2还含有酶稳定剂。显然的，其他任意组合形式的双组份成套试剂盒也可适用于本发明。
本发明另一较佳实例中，所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1和2的双组份成套试剂盒，试剂1包含还原型辅酶、α-酮戊二酸或其盐、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、O-乙酰-L-高丝氨酸，试剂2包含蛋氨酸合成酶和5-甲基四氢叶酸或其盐。较佳的，试剂1和2还含有酶稳定剂。显然的，其他任意组合形式的双组份成套试剂盒也可适用于本发明。
本发明另一较佳实例中，所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1、2和3的三组份成套试剂盒，试剂1包含α-酮戊二酸或其盐、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、还原型辅酶和谷氨酸脱氢酶，试剂2包含谷氨酸氧化酶、蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶和O-乙酰-L-高丝氨酸，试剂3包含蛋氨酸合成酶和5-甲基四氢叶酸或其盐。较佳的，试剂1、2和3还含有酶稳定剂。显然的，其他任意组合形式的三组份成套试剂盒也可适用于本发明。
本发明另一较佳实例中，所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1、2和3的三组份成套试剂盒，试剂1包含α-酮戊二酸或其盐、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)、高丝氨酸O-乙酰转移酶、乙酰辅酶A、L-高丝氨酸、还原型辅酶和谷氨酸脱氢酶，试剂2包含谷氨酸氧化酶、蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶，试剂3包含蛋氨酸合成酶和5-甲基四氢叶酸或其盐。较佳的，试剂1、2和3还含有酶稳定剂。显然的，其他任意组合形式的三组份成套试剂盒也可适用于本发明。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的积极进步效果在于：本发明建立了一种全新的同型半胱氨酸的酶学测定方法及测定试剂。本发明方法无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉，可实现临床快速、大流量的样本检测，使同型半胱氨酸成为临床上常规检测项目成为可能，具有极高的科学和经济价值。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1 测定试剂
该测定试剂为冻干粉形式，所含成分如下表所示：
| 成分 | 每升用量 |
| 蛋氨酸合成酶 | 5ku |
| 蛋氨酸γ-裂解酶 | 5ku |
| O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶 | 12ku |
| 5-甲基四氢叶酸或其盐 | 10mmol |
| O-乙酰-L-高丝氨酸 | 10mmol |
| 三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐 | 2mmol |
| 牛血清白蛋白 | 0.5g |
| 甘露糖醇 | 100mmol |
使用时，采用pH7.2，测定氨浓度的液体缓冲溶液溶解定容该测定试剂至1升。对待测样本进行同型半胱氨酸浓度的测定。
实施例2 同型半胱氨酸浓度的测定
仪器：紫外恒温分光光度计
测定试剂：水溶液形式的单一试剂，所含成分如下表所示：
| 成分 | 浓度 |
| HEPES缓冲液(pH6.4) | 30mmol/L |
| 蛋氨酸合成酶 | 12ku/L |
| 蛋氨酸γ-裂解酶 | 15ku/L |
| O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶 | 15ku/L |
| 谷氨酸氧化酶 | 1ku/L |
| 谷氨酸脱氢酶 | 1ku/L |
| 硫代NADH | 0.28mmol/L |
| 三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐 | 1mmol |
| 5-甲基四氢叶酸二钠 | 2mmol |
| O-乙酰-L-高丝氨酸 | 2mmol |
| α-酮戊二酸 | 50mmol/L |
| 甘露糖醇 | 100mmol/L |
| 牛血清白蛋白 | 2.5g/L |
| 吐温-20 | 0.2％ |
| 叠氮钠 | 0.2g/L |
测定样本时，采用固定时间法，将上述测定试剂在37℃下哺育5分钟，将待测样本置于测定试剂中，试剂与样本的比例没有固定要求，但同一测定批次内应一致，如试剂∶样本为3000∶90，延迟2分钟后进行测定，在测定仪器允许的读数时间范围内，读取至少2个有效点。
实施例3 同型半胱氨酸浓度的测定
仪器：全自动生化分析仪
测定试剂：水溶液形式的双组份成套试剂盒，所含成分如下表所示：
测定时，试剂与样本的比例没有固定要求，但同一测定批次内应一致，此处试剂1∶样本∶试剂2为2100∶90∶700。将待测样本加入试剂1，37℃下哺育5分钟，并读取样本空白吸光度变化值，再加入试剂2，延迟2分钟后进行测定，测定10分钟内反应体系的吸光度变化值，测定波长为340nm。
实施例4 同型半胱氨酸浓度的测定
仪器：全自动生化分析仪
测定试剂：水溶液形式的三组份成套试剂盒，所含成分如下表所示：
测定时，试剂与样本的比例没有固定要求，但同一测定批次内应一致，此处试剂1∶样本∶试剂2∶试剂3为1800∶90∶700。将待测样本加入试剂1，37℃下哺育5分钟，并读取样本空白吸光度变化值，再加入试剂2，延迟2分钟后进行测定，测定15分钟内反应体系的吸光度变化值，测定波长为340nm。也可以在测定前先混合试剂1与试剂2，然后作为双试剂测定。
实施例5 同型半胱氨酸浓度的测定
仪器：全自动生化分析仪
测定试剂：干粉形式的单一试剂，所含成分如下表所示：
| 试剂组份 | 配置为1升溶液的浓度 |
| Tris缓冲液(pH8.8) | 150mmol/L |
| 蛋氨酸合成酶 | 100ku/L |
| 蛋氨酸γ-裂解酶 | 100ku/L |
| O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶 | 100ku/L |
| 谷氨酸氧化酶 | 10ku/L |
| 谷氨酸脱氢酶 | 10ku/L |
| 硫代NADH | 0.3mmol/L |
| 三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐 | 25mmol/L |
| 5-甲基四氢叶酸二钠 | 1mmol/L |
| O-乙酰-L-高丝氨酸 | 0.5mmol/L |
| α-酮戊二酸二钠 | 17mmol/L |
| 甘露糖醇 | 60mmol/L |
| 牛血清白蛋白 | 10g/L |
| 叠氮钠 | 5g/L |
测定前，将测定试剂用水复溶，装入试剂瓶。测定时，试剂37℃下孵育5分钟，将待测样本按40∶1的试剂样品比置于其中进行反应，延迟3分钟后进行测定，测定10分钟内反应体系的吸光度变化值，测定波长为405nm。
实施例6 同型半胱氨酸浓度的测定
仪器：全自动生化分析仪
测定试剂：干粉形式的双组份成套试剂盒，所含成分如下表所示：
测定前先复溶试剂，将待测样本按60∶1的总试剂样品比加入试剂1中，37℃下哺育5分钟，再加入试剂2，延迟2分钟后进行测定，测定10分钟内反应体系的吸光度变化速率，测定波长为340nm。
实施例7 同型半胱氨酸浓度的测定
仪器：全自动生化分析仪
测定试剂：试剂1为液体形式，试剂2和试剂3为干粉形式的三组份成套试剂盒，所含成分如下表所示：
测定前将待测样本按40∶1的总试剂样品比加入试剂1，再加入试剂2，37℃下孵育5分钟，再加入试剂3，延迟2分钟后进行测定，测定10分钟内反应体系的吸光度变化值，测定波长为340nm。
上述实施例试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理及其应用，本发明绝不局限于上述举例的应用范围；此外，在本发明相关领域中的专业技术人员，可以根据本发明的原理和方法配制出与之类似的各种测定试剂，但并不脱离出本发明的原理和应用范围。
Claims (13)
1.一种同型半胱氨酸浓度的测定方法，其特征在于其包括如下步骤：将待测样本在酶循环反应***中，进行如式1～3所示的反应，测定酶循环反应生成的氨的生成速率并计算，即得待测样本中同型半胱氨酸含量；所述的酶循环反应***包括蛋氨酸合成酶、蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、以及5-甲基四氢叶酸或其盐和O-乙酰-L-高丝氨酸；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述的蛋氨酸合成酶的用量为1～100kU/L；
和/或，所述的蛋氨酸γ-裂解酶的用量为1～100kU/L；
和/或，所述的O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶的用量为1～100kU/L；
和/或，所述的5-甲基四氢叶酸或其盐的用量为0.1～50mmol/L；
和/或，所述的O-乙酰-L-高丝氨酸用量为1～200mmol/L，或通过酶反应现场生成。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的酶循环反应***为pH6～9的缓冲液体系；
所述的缓冲液较佳的为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙基磺酸)缓冲液；
所述的缓冲液的浓度较佳的为20～300mmol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的酶循环反应***还包括酶稳定剂；
所述的酶稳定剂较佳的为甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、EDTA、钾离子、钠离子、牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的酶循环反应***中还包括α-酮戊二酸或其盐、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶，所述的测定酶循环反应生成的氨的生成速率的方法为谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶组成的酶循环反应检测法，所述的酶循环测氨反应的反应式如式5-6所示；
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述的谷氨酸脱氢酶的用量为0.1～50kU/L；
和/或，所述的谷氨酸氧化酶的用量为0.1～50ku/L
和/或，所述的α-酮戊二酸或其盐的用量为1～50mmol/L，较佳的为1～20mmol/L；
和/或，所述的还原型辅酶的用量为0.1～1mmol/L，较佳的为0.2～0.3mmol/L；
和/或，所述的还原型辅酶为NADH、NADPH、硫代NADH或硫代NADPH。
7.一种同型半胱氨酸的测定试剂，其特征在于其包括下述成分：蛋氨酸合成酶、蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、以及5-甲基四氢叶酸或其盐和O-乙酰-L-高丝氨酸。
8.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于：所述的测定试剂还包含α-酮戊二酸或其盐、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶；
所述的谷氨酸脱氢酶的用量较佳的为0.1～50kU/L；
和/或，所述的谷氨酸氧化酶的用量为0.1～50ku/L
和/或，所述的α-酮戊二酸或其盐的用量较佳的为1～50mmol/L，更佳的为1～20mmol/L；
和/或，所述的还原型辅酶较佳的为0.1～1mmol/L，更佳的为0.2～0.3mmol/L；
和/或，所述的还原型辅酶较佳的为NADH、NADPH、硫代NADH或硫代NADPH。
9.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于：所述的测定试剂还包含酶稳定剂和/或缓冲成分；
所述的酶稳定剂较佳的为甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、EDTA、钾离子、钠离子、牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种；
所述的缓冲成分较佳的为能形成pH6～9的缓冲液的成分；所述的缓冲液较佳的为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙基磺酸)缓冲液；所述的缓冲液的浓度较佳的为20～300mmol/L。
10.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于：所述的测定试剂为固体干粉形式，或者还包括水，为水溶液形式；所述的水溶液形式为能直接使用的水溶液形式，或需经稀释才使用的浓缩液形式。
11.如权利要求10所述的测定试剂，其特征在于：
所述的测定试剂为能直接使用的水溶液形式时，
所述的蛋氨酸合成酶的用量为1～100kU/L；
和/或，所述的蛋氨酸γ-裂解酶的用量为1～100kU/L；
和/或，所述的O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶的用量为1～100kU/L；
和/或，所述的5-甲基四氢叶酸或其盐的用量为0.1～50mmol/L；
和/或，所述的O-乙酰-L-高丝氨酸的用量为0.1～200mmol/L，或现场生成；
所述的测定试剂为固体干粉形式或需经稀释才使用的浓缩液形式，各所述成分的含量以能溶解和/或稀释为能直接使用的水溶液形式中各成分的含量进行选择。
12.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于：所述的测定试剂为所有成分混合的单一试剂形式，或者为包含独立包装各成分的成套试剂盒形式，或者为将各成分分为若干独立包装组分的成套试剂盒形式。
13.如权利要求7～12任一项所述的测定试剂，其特征在于：
所述的测定试剂为下述中的任一种：
(1)所述的测定试剂为单一试剂，其包含蛋氨酸合成酶、蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、5-甲基四氢叶酸或其盐、O-乙酰-L-高丝氨酸、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、α-酮戊二酸或其盐、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶；
(2)所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1和2的双组份成套试剂盒，试剂1包含蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、O-乙酰-L-高丝氨酸、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、还原型辅酶、α-酮戊二酸或其盐、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶，试剂2包含蛋氨酸合成酶、5-甲基四氢叶酸或其盐；以及
(3)所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1和2的双组份成套试剂盒，试剂1包含蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、谷氨酸氧化酶、乙酰辅酶A、L-高丝氨酸、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、还原型辅酶、α-酮戊二酸或其盐、谷氨酸脱氢酶、试剂2包含蛋氨酸合成酶、5-甲基四氢叶酸或其盐；以及
(4)所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1、2和3的三组份成套试剂盒，试剂1包含α-酮戊二酸或其盐、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、还原型辅酶和谷氨酸脱氢酶，试剂2包含蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、谷氨酸氧化酶、乙酰辅酶A，L-高丝氨酸、，试剂3包含蛋氨酸合成酶、5-甲基四氢叶酸或其盐。
(5)所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1、2和3的三组份成套试剂盒，试剂1包含α-酮戊二酸或其盐、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、还原型辅酶和谷氨酸脱氢酶，试剂2包含蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、谷氨酸氧化酶、O-乙酰-L-高丝氨酸，试剂3包含蛋氨酸合成酶、5-甲基四氢叶酸或其盐。
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