CN107201383A - 一种可提高d-乳酸生产强度的d-乳酸生产方法 - Google Patents

一种可提高d-乳酸生产强度的d-乳酸生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可提高D‑乳酸生产强度的D‑乳酸生产方法，包括以下步骤：平板培养：将芽孢杆菌BS1‑5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度30～45℃，培养时间20～48h；种子培养：将平板培养的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度30～45℃，培养时间12～24h；发酵产酸：将获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为3％～15％，发酵温度30～45℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在4.5～7.0，加入渗透压保护剂控制发酵罐内渗透压的提高。在D‑乳酸菌种发酵产酸过程中，由于有主产物乳酸的不断产生发酵罐内的pH会逐渐降低，而渗透压保护剂能够很好的缓解环境中渗透压过高的问题，因此发酵过程中添加适当的渗透压保护剂，从而提高了生产强度。

Description

一种可提高D-乳酸生产强度的D-乳酸生产方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种利用发酵调控手段以提高D-乳酸生产效率的方法。
背景技术
乳酸是世界三大有机酸之一，它可以广泛的用于食品、医药、化工和农业等领域。特别的D-乳酸可以广泛的应用于医药、化工和农业领域。以D-乳酸为单体合成的聚乳酸以其良好的生物可降解性能及其他优良的使用特性(如透明性、热塑性、产物安全性等)已成为21世纪最具发展前景的绿色环保材料。此外以高纯的D-乳酸制造的生物农药“骠马”和“威霸”等除草剂，作为新型的低毒性农药，能够有效的除草杀虫既经济又可靠。市场上，同等级的D-乳酸价格比L-乳酸贵5～10倍。因此D-乳酸的生产和纯化逐渐受到重视。
乳酸的制备方法有发酵法、化学合成法和酶法。其中，发酵法和化学合成法得到工业上的应用，而我国主要采用发酵法。与L-乳酸相比，目前D-乳酸在发酵菌种的多样性以及发酵水平方面仍然具有较大的差距，因此进一步改善D-乳酸的生产菌种、提高菌种的发酵性能对于推动D-乳酸工业的发酵及扩大D-乳酸应用具有重要意义。
在D-乳酸菌种发酵产酸过程中，由于有主产物乳酸的不断产生发酵罐内的pH会逐渐降低，为了维持菌体生长的最适pH，在发酵过程中需要通过不断补碱来维持pH，随着发酵过程中碱的不断流入，发酵液中的金属离子浓度的不断升高必然导致渗透压的升高，过高的渗透压将影响菌体的生长和产酸。而渗透压保护剂比如甜菜碱、海藻糖、脯氨酸、甘氨酸等渗透压保护剂能够很好的缓解环境中渗透压过高的问题，因此发酵过程中添加适当的渗透压保护剂，从而提高了生产强度。专利文件CN101457243公开了一种提高L-谷氨酸发酵产率的新工艺，发明内容主要是在发酵培养基中添加了甜菜碱、脯氨酸的方法，来有效提高L-谷氨酸的发酵产率。目前还未见国内外利用渗透压保护剂应用于D-乳酸的发酵生产中。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种可提高D-乳酸生产强度的D-乳酸生产方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种可提高D-乳酸生产强度的D-乳酸生产方法，包括以下步骤：
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度30～45℃，培养时间20～48h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度30～45℃，培养时间12～24h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为3％～15％，发酵温度30～45℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在4.5～7.0，加入渗透压保护剂控制发酵罐内渗透压的提高。
所述平板培养基包括以下组分：葡萄糖10～30g/L，酵母膏1～3g/L，无水乙酸钠1～4g/L，无水硫酸镁0.1～0.4g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，琼脂15～25g/L。
所述种子培养基包括以下组分：葡萄糖10～40g/L，酵母膏1～3g/L，蛋白胨1～3g/L，无水硫酸镁0.1～0.4g/L，碳酸钙10～30g/L。
所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖150～180g/L，酵母膏4～8g/L，玉米浆干粉4～6g/L，硫酸镁0.4～0.6g/L，麸皮8～12g/L。
所述渗透压保护剂甜菜碱、海藻糖、脯氨酸或甘氨酸，在D-乳酸发酵起始时或发酵过程中添加到发酵罐内，添加量为0.2～5g/L。
本发明所使用的菌种为一株高生长产酸速率的D-乳酸生产菌，已于2012年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，其分类命名为芽孢乳杆菌(Sporolactobacillussp.)BS1-5，保藏登记号为CCTCC NO.M2012516，其更具体分类为菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillussp.inulinus)。
本发明提高D-乳酸发酵生产强度的方法主要为在D-乳酸发酵开始时或发酵中添加少量渗透压保护剂在发酵培养基中以缓解由于金属碱的不断加入到发酵罐中带来的渗透压的提高，渗透压的提高会影响D-乳酸菌种的生长与产酸。渗透压保护剂的加入，菌体密度有一定的提高，同时较大幅度的缩短发酵周期。其原理是：根据微生物厌氧发酵产D-乳酸的特性，在发酵体系中添加了适量的渗透压保护剂，而这些保护剂大都是亲水性的物质，他们能够进入细胞，维持菌体细胞在高底物、高产物、和高金属离子浓度时的渗透压，防止菌体因渗透压过高而失水死亡。较高的菌体量保证了D-乳酸的浓度与生产强度较大幅度的提高，从而可以降低D-乳酸生产过程中的能耗，提高了生产效率。
具体实施方式
用以下的实施例对本发明作进一步说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的进一步说明，并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度30℃，培养时间48h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度30℃，培养时间24h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为15％，发酵温度30℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在6.0。
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，酵母膏1，无水乙酸钠1，无水硫酸镁0.1，磷酸二氢钾1，琼脂15。
种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，酵母膏1，蛋白胨1，无水硫酸镁0.1，碳酸钙10。
发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖150，酵母膏4，玉米浆干粉4，硫酸镁0.4，麸皮8。
发酵产酸阶段采用氢氧化钠作为pH调节剂，表1为添加和未添加了渗透压保护剂甜菜碱的实验结果：
表1未添加与添加甜菜碱的实验结果
实施例2
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度45℃，培养时间20h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度45℃，培养时间12h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为3％，发酵温度45℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在7.0。
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖30，酵母膏3，无水乙酸钠4，无水硫酸镁0.4，磷酸二氢钾3，琼脂25。
种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖40，酵母膏3，蛋白胨3，无水硫酸镁0.4，碳酸钙30.
发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖150，酵母膏8，玉米浆干粉6，硫酸镁0.6，麸皮12。
发酵产酸阶段采用氢氧化钠作为pH调节剂，渗透压保护剂为甜菜碱，下表为添加和未添加了渗透压保护剂的实验结果：
表2未添加与添加甜菜碱的实验结果
实施例3
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间24h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间20h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为10％，发酵温度37℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在6.5。
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，无水乙酸钠2，无水硫酸镁0.3，磷酸二氢钾2，琼脂20。
种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，无水硫酸镁0.3，碳酸钙20。
发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖150，酵母膏6，玉米浆干粉5，硫酸镁0.5，麸皮10。
发酵产酸阶段采用氢氧化钠作为pH调节剂，渗透压保护剂为甜菜碱、海藻糖、脯氨酸或甘氨酸，下表3、4、5、6为添加和未添加了渗透压保护剂的实验结果：
表3未添加与添加甜菜碱的实验结果
表4未添加与添加甘氨酸的实验结果
表5未添加与添加海藻糖的实验结果
表6未添加与添加脯氨酸的实验结果
实施例4
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间24h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间20h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为10％，发酵温度37℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在6.5。
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，无水乙酸钠2，无水硫酸镁0.3，磷酸二氢钾2，琼脂20。
种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，无水硫酸镁0.3，碳酸钙20。
发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖160，酵母膏6，玉米浆干粉5，硫酸镁0.5，麸皮10。
发酵产酸阶段采用氨水作为pH调节剂，渗透压保护剂为海藻糖，下表为添加和未添加了渗透压保护剂的实验结果：
表7未添加与添加海藻糖的实验结果
实施例5
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间24h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间20h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为10％，发酵温度37℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在6.5。
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，无水乙酸钠2，无水硫酸镁0.3，磷酸二氢钾2，琼脂20。
种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，无水硫酸镁0.3，碳酸钙20。
发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖180，酵母膏6，玉米浆干粉5，硫酸镁0.5，麸皮12。
发酵产酸阶段采用氢氧化钠作为pH调节剂，渗透压保护剂为海藻糖，下表为添加和未添加了渗透压保护剂的实验结果：
表8未添加与添加海藻糖的实验结果
实施例6
(1)平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间24h；
(2)种子培养：将经步骤(1)平板培养的的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间20h；
(3)发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为10％，发酵温度37℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在6.5。
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，无水乙酸钠2，无水硫酸镁0.3，磷酸二氢钾2，琼脂20。
种子培养基成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，无水硫酸镁0.3，碳酸钙20。
发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖150，酵母膏6，玉米浆干粉5，硫酸镁0.5，麸皮10。
发酵产酸阶段采用氨水作为pH调节剂，渗透压保护剂为甜菜碱，下表为添加和未添加了渗透压保护剂的实验结果：
表9未添加与添加甜菜碱的实验结果

Claims (5)

1.一种可提高D-乳酸生产强度的D-乳酸生产方法，其特征在于包括以下步骤：
平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度30～45℃，培养时间20～48h；
种子培养：将经步骤(1)平板培养的的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度30～45℃，培养时间12～24h；
发酵产酸：将步骤(2)获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为3％～15％，发酵温度30～45℃，通入氮气保持其厌氧的环境，采用中和剂将发酵体系的pH控制在4.5～7.0，加入渗透压保护剂控制发酵罐内渗透压的提高。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述平板培养基包括以下组分：葡萄糖10～30g/L，酵母膏1～3g/L，无水乙酸钠1～4g/L，无水硫酸镁0.1～0.4g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，琼脂15～25g/L。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述种子培养基包括以下组分：葡萄糖10～40g/L，酵母膏1～3g/L，蛋白胨1～3g/L，无水硫酸镁0.1～0.4g/L，碳酸钙10～30g/L。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖150～180g/L，酵母膏4～8g/L，玉米浆干粉4～6g/L，硫酸镁0.4～0.6g/L，麸皮8～12g/L。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述渗透压保护剂甜菜碱、海藻糖、脯氨酸或甘氨酸，在D-乳酸发酵起始时或发酵过程中添加到发酵罐内，添加量为0.2～5g/L。
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