CN105349467A - 一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
<b>本发明公开了一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，该方法通过一级种子液的制备；二级种子液的制备；发酵培养基的制备及发酵等步骤，在发酵接种时</b><b>通过分时接种发酵方法，解决了发酵过程中动物双歧杆菌含量较低的问题。</b><b>通过该方法，发酵液中的动物双歧杆菌含量达到</b><b>1.0~3</b><b>×10</b><b>8</b><b>CFU/ml</b><b>，比较现有技术中的发酵方法，动物双歧杆菌的数量提高了约</b><b>100</b><b>倍，增强了复合益生菌健康功效。</b>
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，特别涉及一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法。
背景技术
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖***内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。可用于食品的益生菌包括链球菌属，乳杆菌属，动物双歧杆菌属等。
植物萃取物复合益生菌发酵饮品是指使用植物萃取物，接种几种不同的益生菌发酵制备的饮品。
现有技术中，由于链球菌属，乳杆菌属，动物双歧杆菌属三种益生菌的生长条件不同，同时接种三种益生菌，在发酵过程中，各种益生菌的数量会造成失衡。尤其是动物双歧杆菌，在培养中属于弱势菌种，这样会导致最终发酵液中的动物双歧杆菌数量比较少，影响复合益生菌健康功效。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，该方法大大提高了动物双歧杆菌的数量，解决了复合益生菌发酵过程中动物双歧杆菌的含量过少的技术问题，增强了复合益生菌健康功效。
本发明的技术方案是：一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，包括以下步骤：
步骤一：一级种子液的制备
取下述重量配比的原料制备而成：
酵母浸粉100份、葡萄糖200份、蔗糖200份、氯化钠50份、磷酸氢二钾20份、硫酸镁5份、纯化水8625份
按照上述原料配比配制一级种子培养基600ml，平均分装至6个三角瓶中，在温度121℃条件下灭菌30min，灭菌后的一级种子培养基冷却至37℃后备用；
一级种子培养基接种冻存菌种，分别接种动物双歧杆菌，嗜热链球菌，鼠李糖乳杆菌，置于37℃恒温培养箱中，静置培养；培养时间为24小时，得到动物双歧杆菌一级种子液、嗜热链球菌一级种子液、鼠李糖乳杆菌一级种子液，分别取样测定动物双歧杆菌一级种子液、嗜热链球菌一级种子液、鼠李糖乳杆菌一级种子液的pH值；动物双歧杆菌一级种子液pH值介于3.8-4.0之间，嗜热链球菌一级种子液pH值介于3.8-4.2之间，鼠李糖乳杆菌一级种子液pH值介于3.8-4.0之间，用于转接二级种子培养基；
优选地，动物双歧杆菌一级种子液pH值为3.9，嗜热链球菌一级种子液pH值为4.04，鼠李糖乳杆菌一级种子液pH值为3.97，用于转接二级种子培养基；
步骤二：二级种子液的制备
取下述重量配比的原料制备而成：
深色焦香麦芽400份、小麦麦芽200份、黄豆400份、葡萄糖200份、酵母浸粉100份、氯化钠50份、磷酸氢二钾20份、硫酸镁5份、纯化水8625份；
按照上述配比称取深色焦香麦芽和小麦麦芽，先用水冲洗一遍，再加入五倍重量的水浸泡30min，然后微沸萃取一小时，8层纱布过滤，获得深色焦香麦芽和小麦麦芽萃取液；按上述配比称取黄豆，用温水浸泡24小时，待黄豆萌发出芽后冲洗干净，然后加五倍重量的水，微沸萃取1小时，8层纱布过滤，获得黄豆萃取液；按上述配比称取葡萄糖、酵母浸粉、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、纯化水，配制二级种子培养基12L，平均分装至3个三角瓶中，在温度121℃条件下灭菌30min，灭菌后的二级种子培养基冷却至37℃后备用；
二级种子培养基，按照1%接种量分别接种长好的动物双歧杆菌一级种子液、嗜热链球菌一级种子液、鼠李糖乳杆菌一级种子液，接种后置于37℃恒温培养箱中，静置培养，培养时间为24小时，得到动物双歧杆菌二级种子液、嗜热链球菌二级种子液、鼠李糖乳杆菌二级种子液，分别取样测定动物双歧杆菌二级种子液、嗜热链球菌二级种子液、鼠李糖乳杆菌二级种子液的pH值，动物双歧杆菌二级种子液pH值介于3.5-3.8之间，嗜热链球菌二级种子液pH值介于3.8-4.0之间，鼠李糖乳杆菌二级种子液pH值介于3.5-3.8之间，用于转接发酵培养基；
优选地，动物双歧杆菌二级种子液pH值为3.66，嗜热链球菌二级种子液pH值为3.87，鼠李糖乳杆菌二级种子液pH值为3.59，用于转接发酵培养基；
步骤三：发酵培养基的制备及发酵
取下述重量配比的原料制备而成：
深色焦香麦芽300-600份、小麦麦芽100-300份、黄豆300-600份、葡萄糖100-300份、酵母浸粉50-200份、磷酸氢二钾10-50份、硫酸镁1-20份、纯化水7980-9139份；
优选地，深色焦香麦芽300份、小麦麦芽300份、黄豆375份、葡萄糖100份、酵母浸粉200份、磷酸氢二钾份40、硫酸镁20份、纯化水8565份；
按上述配比称深色焦香麦芽和小麦麦芽，先用水冲洗一遍，再加入五倍重量的水浸泡30min，然后微沸萃取一小时，8层纱布过滤，获得深色焦香麦芽和小麦麦芽萃取液；按上述配比称黄豆，用温水浸泡24小时，待黄豆萌发出芽后冲洗干净，然后加五倍重量的水，微沸萃取1小时，8层纱布过滤，获得黄豆萃取液；
将焦香麦芽萃取液、小麦麦芽萃取液、黄豆萃取液混合，转移至发酵罐中，称取上述配比的葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、纯化水投入发酵罐中，搅拌均匀后纯化水定容至300L；
发酵培养基在温度121℃条件下灭菌时间30min，冷却至37℃后，灭菌的纯化水定容至400L，37℃保温备用；灭菌后测定发酵培养基pH值为6.0~6.2之间；
先将长好的动物双歧杆菌二级种子液按照1%接种量接种至发酵培养基中，接种后每两小时取样测定发酵液的pH值，在接种动物双歧杆菌后4-8小时后，发酵液pH值下降至[微软用户1]时，然后将长好的嗜热链球菌二级种子液和鼠李糖乳杆菌二级种子液按照1%接种量接种至上述发酵培养基中；并间隔两小时取样测定发酵液的pH值和计数发酵液中的总菌含量及动物双歧杆菌的含量；当发酵液的pH值下降至3.36-3.42时，发酵终止；
菌落计数结果，总菌数在接种22-26小时达到最高数值3-6×10
8
CFU/ml；动物双歧杆菌在接种12小时左右达到最高数值1-4×10
8
CFU/ml。
本发明的优点效果是：本发明通过分时发酵技术，解决了发酵过程中动物双歧杆菌含量较低的问题。通过采用发酵培养基灭菌后先接种动物双歧杆菌，待动物双歧杆菌单独发酵4~8小时后，发酵液pH值下降至5.0~5.4之间，再接种嗜热链球菌和鼠李糖乳杆菌。发酵24小时后开始取样测定总益生菌菌含量和动物双歧杆菌含量。通过该方法，发酵液中的动物双歧杆菌含量达到1.0~3×10
8
CFU/ml，比较方法改进前，动物双歧杆菌的数量提高了约100倍。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明
实施例1：一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，包括以下步骤：（下文以“F”加“时间”表示从接种到发酵结束的发酵时间）
步骤一：一级种子液的制备
称取酵母浸粉6g、葡萄糖12g、蔗糖12g、氯化钠3g、磷酸氢二钾1.2g、硫酸镁0.3g、纯化水517.5g，配制一级种子培养基600ml，平均分装至6个三角瓶中，在温度121℃条件下灭菌30min，灭菌后的一级种子培养基冷却至37℃后备用；
一级种子培养基接种冻存菌种：分别于F0h接种动物双歧杆菌，F4h接种嗜热链球菌，鼠李糖乳杆菌，置于37℃恒温培养箱中，静置培养；培养时间为24h，于F24h得到动物双歧杆菌一级种子液、F28h得到嗜热链球菌一级种子液和鼠李糖乳杆菌一级种子液，分别取样测定动物双歧杆菌一级种子液、嗜热链球菌一级种子液、鼠李糖乳杆菌一级种子液的pH值。动物双歧杆菌一级种子液pH值为3.90，嗜热链球菌一级种子液pH值4.04，鼠李糖乳杆菌一级种子液pH值为3.97。
步骤二：二级种子液的制备
称取深色焦香麦芽48g、小麦麦芽24g，先用水冲洗一遍，再加入360g的纯化水浸泡30min，然后微沸萃取一小时，8层纱布过滤，获得深色焦香麦芽、小麦麦芽萃取液；称取黄豆48g，用温水浸泡24h，待黄豆萌发出芽后冲洗干净，然后加240g的水，微沸萃取1h，8层纱布过滤，获得黄豆萃取液；称取葡萄糖24g、酵母浸粉12g、NaCl6g、磷酸氢二钾2.4g、硫酸镁0.6g、纯化水定容至1.2L，平均分装至3个三角瓶中，在温度121℃条件下灭菌30min，灭菌后的二级种子培养基冷却至37℃后备用；
二级种子培养基，按照1%接种量分别于F24h接种长好的动物双歧杆菌一级种子液，于F28h接种长好的嗜热链球菌一级种子液和鼠李糖乳杆菌一级种子液，接种后置于37℃恒温培养箱中，静置培养，培养时间为24h，于F48h得到动物双歧杆菌二级种子液，于F52h得到嗜热链球菌二级种子液、鼠李糖乳杆菌二级种子液，分别取样测定动物双歧杆菌二级种子液、嗜热链球菌二级种子液、鼠李糖乳杆菌二级种子液的pH值及菌含量。动物双歧杆菌二级种子液pH值为3.66，菌数1.6×10
8
CFU/ml，嗜热链球菌二级种子液值为pH值为3.87，菌数1.4×10
8
CFU/ml，鼠李糖乳杆菌二级种子液值为pH3.59，菌数3.0×10
8
CFU/ml。
步骤三：发酵培养基的制备及发酵
称取深色焦香麦芽1.2kg和小麦麦芽1.2kg，先用水冲洗一遍，再加入12kg的纯化水浸泡30min，然后微沸萃取一小时，8层纱布过滤，获得深色焦香麦芽和小麦麦芽萃取液；称取黄豆1.5kg，用温水浸泡24h，待黄豆萌发出芽后冲洗干净，然后加7.5kg的纯化水，微沸萃取1h，8层纱布过滤，获得黄豆萃取液；
将焦香麦芽、小麦麦芽、黄豆萃取液混合，转移至发酵罐中，称取葡萄糖400g、酵母浸粉800g、磷酸氢二钾160g、硫酸镁80g投入发酵罐中，搅拌均匀,纯化水定容至30L；
发酵培养基在温度121℃条件下灭菌时间30min，冷却至37℃后，灭菌的纯化水定容至40L，37℃保温备用；灭菌后测定发酵培养基pH值为6.20；
接种，将长好的动物双歧杆菌二级种子液按1%接种量于F48h接种至发酵培养基中，接种后每两小时取样测定发酵液的pH值，于F52h将长好的嗜热链球菌二级种子液和鼠李糖乳杆菌二级种子液按照1%接种量接种至上述发酵培养基中；并间隔两小时取样测定发酵液的pH值和计数发酵液中的总菌含量及动物双歧杆菌的含量；于F96h发酵终止，发酵液pH值为3.41。发酵过程数据见下表：
实施例2：一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，包括以下步骤：（下文以“F”加“时间”表示从接种到发酵结束的发酵时间）
步骤一：一级种子液的制备
称取酵母浸粉6g、葡萄糖12g、蔗糖12g、氯化钠3g、磷酸氢二钾1.2g、硫酸镁0.3g、纯化水517.5g，配制一级种子培养基600ml，平均分装至6个100ml三角瓶中，在温度121℃条件下灭菌30min，灭菌后的一级种子培养基冷却至37℃后备用；
一级种子培养基接种冻存菌种：分别于F0h接种动物双歧杆菌，F8h接种嗜热链球菌，鼠李糖乳杆菌，置于37℃恒温培养箱中，静置培养；培养时间为24h，于F24h得到动物双歧杆菌一级种子液、F32h得到嗜热链球菌一级种子液和鼠李糖乳杆菌一级种子液，分别取样测定动物双歧杆菌一级种子液、嗜热链球菌一级种子液、鼠李糖乳杆菌一级种子液的pH。动物双歧杆菌一级种子液pH值为3.83，嗜热链球菌一级种子液pH值为4.10，鼠李糖乳杆菌一级种子液pH值为3.87。
步骤二：二级种子液的制备
称取深色焦香麦芽480g、小麦麦芽240g，先用水冲洗一遍，再加入3.6kg的纯化水浸泡30min，然后微沸萃取一小时，8层纱布过滤，获得深色焦香麦芽、小麦麦芽萃取液；称取黄豆480g，用温水浸泡24h，待黄豆萌发出芽后冲洗干净，然后加2.4kg的水，微沸萃取1h，8层纱布过滤，获得萃取液；称取葡萄糖240g、酵母浸粉120g、NaCl60g、磷酸氢二钾24g、硫酸镁6g、纯化水定容至12L，平均分装至3个三角瓶中，在温度121℃条件下灭菌30min，灭菌后的二级种子培养基冷却至37℃后备用；
二级种子培养基，按照1%接种量分别于F24h接种长好的动物双歧杆菌一级种子液，于F32h接种长好的嗜热链球菌一级种子液和鼠李糖乳杆菌一级种子液，接种后置于37℃恒温培养箱中，静置培养，培养时间为24h，于F48h得到动物双歧杆菌二级种子液，于F56h得到嗜热链球菌二级种子液、鼠李糖乳杆菌二级种子液，分别取样测定动物双歧杆菌二级种子液、嗜热链球菌二级种子液、鼠李糖乳杆菌二级种子液的pH及菌含量。动物双歧杆菌二级种子液pH值为3.56，菌数1.8×10
8
CFU/ml，嗜热链球菌二级种子液pH值为3.89，菌数2.0×10
8
CFU/ml，鼠李糖乳杆菌二级种子液pH值为3.49，菌数3.7×10
8
CFU/ml。
步骤三：发酵培养基的制备及发酵
称取深色焦香麦芽12kg和小麦麦芽12kg，先用水冲洗一遍，再加入120kg的纯化水浸泡30min，然后微沸萃取一小时，8层纱布过滤，获得深色焦香麦芽和小麦麦芽萃取液；称取黄豆16kg，用温水浸泡24h，待黄豆萌发出芽后冲洗干净，然后加80kg的纯化水，微沸萃取1h，8层纱布过滤，获得黄豆萃取液；
将焦香麦芽、小麦麦芽、黄豆萃取液混合，转移至发酵罐中，称取葡萄糖4kg、酵母浸粉8kg、磷酸氢二钾1.6kg、硫酸镁800g投入发酵罐中，搅拌均匀,纯化水定容至300L；
发酵培养基在温度121℃条件下灭菌时间30min，冷却至37℃后，灭菌的纯化水定容至400L，37℃保温备用；灭菌后测定发酵培养基pH值为6.13；
接种，将长好的动物双歧杆菌二级种子液按1%接种量于F48h接种至发酵培养基中，接种后每两小时取样测定发酵液的pH，于F56h将长好的嗜热链球菌二级种子液和鼠李糖乳杆菌二级种子液按照1%接种量接种至上述发酵培养基中；并间隔两小时取样测定发酵液的pH和计数发酵液中的总菌含量及动物双歧杆菌的含量；于F96h发酵终止，发酵液pH值为3.38。发酵过程数据见下表：
Claims (7)
1.一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：一级种子液的制备
取下述重量配比的原料制备而成：
酵母浸粉100份、葡萄糖200份、蔗糖200份、氯化钠50份、磷酸氢二钾20份、硫酸镁5份、纯化水8625份；
按照上述原料配比配制一级种子培养基600ml，平均分装至6个三角瓶中，在温度121℃条件下灭菌30min，灭菌后的一级种子培养基冷却至37℃后备用；
一级种子培养基接种冻存菌种，分别接种动物双歧杆菌，嗜热链球菌，鼠李糖乳杆菌，置于37℃恒温培养箱中，静置培养；培养时间为24小时，得到动物双歧杆菌一级种子液、嗜热链球菌一级种子液、鼠李糖乳杆菌一级种子液，分别取样测定动物双歧杆菌一级种子液、嗜热链球菌一级种子液、鼠李糖乳杆菌一级种子液的pH值；动物双歧杆菌一级种子液pH值介于3.8-4.0之间，嗜热链球菌一级种子液pH值介于3.8-4.2之间，鼠李糖乳杆菌一级种子液pH值介于3.8-4.0之间，用于转接二级种子培养基；
步骤二：二级种子液的制备
取下述重量配比的原料制备而成：
深色焦香麦芽400份、小麦麦芽200份、黄豆400份、葡萄糖200份、酵母浸粉100份、氯化钠50份、磷酸氢二钾20份、硫酸镁5份、纯化水8625份；
按照上述配比称取深色焦香麦芽和小麦麦芽，先用水冲洗一遍，再加入五倍重量的水浸泡30min，然后微沸萃取一小时，8层纱布过滤，获得深色焦香麦芽和小麦麦芽萃取液；按上述配比称取黄豆，用温水浸泡24小时，待黄豆萌发出芽后冲洗干净，然后加五倍重量的水，微沸萃取1小时，8层纱布过滤，获得黄豆萃取液；按上述配比称取葡萄糖、酵母浸粉、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、纯化水，配制二级种子培养基12L，平均分装至3个三角瓶中，在温度121℃条件下灭菌30min，灭菌后的二级种子培养基冷却至37℃后备用；
二级种子培养基，按照1%接种量分别接种长好的动物双歧杆菌一级种子液、嗜热链球菌一级种子液、鼠李糖乳杆菌一级种子液，接种后置于37℃恒温培养箱中，静置培养，培养时间为24小时，得到动物双歧杆菌二级种子液、嗜热链球菌二级种子液、鼠李糖乳杆菌二级种子液，分别取样测定动物双歧杆菌二级种子液、嗜热链球菌二级种子液、鼠李糖乳杆菌二级种子液的pH值，当动物双歧杆菌二级种子液pH值介于3.5-3.8之间，嗜热链球菌二级种子液pH值介于3.8-4.0之间，鼠李糖乳杆菌二级种子液pH值介于3.5-3.8之间，用于转接发酵培养基；
步骤三：发酵培养基的制备及发酵
取下述重量配比的原料制备而成：
深色焦香麦芽300-600份、小麦麦芽100-300份、黄豆300-600份、葡萄糖100-300份、酵母浸粉50-200份、磷酸氢二钾10-50份、硫酸镁1-20份、纯化水7980-9139份；
按上述配比称深色焦香麦芽和小麦麦芽，先用水冲洗一遍，再加入五倍重量的水浸泡30min，然后微沸萃取一小时，8层纱布过滤，获得深色焦香麦芽和小麦麦芽萃取液；按上述配比称黄豆，用温水浸泡24小时，待黄豆萌发出芽后冲洗干净，然后加五倍重量的水，微沸萃取1小时，8层纱布过滤，获得黄豆萃取液；
将焦香麦芽萃取液、小麦麦芽萃取液、黄豆萃取液混合，转移至发酵罐中，称取上述配比的葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、纯化水投入发酵罐中，搅拌均匀后纯化水定容至300L；
发酵培养基在温度121℃条件下灭菌时间30min，冷却至37℃后，灭菌的纯化水定容至400L，37℃保温备用；灭菌后测定发酵培养基pH值为6.0~6.2之间；
先将长好的动物双歧杆菌二级种子液按照1%接种量接种至发酵培养基中，接种后每两小时取样测定发酵液的pH值，在接种动物双歧杆菌后4-8小时后，发酵液pH值下降至5.0-5.4时，然后将长好的嗜热链球菌二级种子液和鼠李糖乳杆菌二级种子液按照1%接种量接种至上述发酵培养基中；并间隔两小时取样测定发酵液的pH值和计数发酵液中的总菌含量及动物双歧杆菌的含量；当发酵液的pH值下降至3.36-3.42时，发酵终止；
菌落计数结果，总菌数在接种22-26小时达到最高数值3-6×108CFU/ml；动物双歧杆菌在接种12小时达到最高数值1-4×108CFU/ml。
2.根据权利要求1所述的一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，其特征在于：步骤一中，动物双歧杆菌一级种子液pH值为3.9，嗜热链球菌一级种子液pH值为4.04，鼠李糖乳杆菌一级种子液pH值为3.97，用于转接二级种子培养基。
3.根据权利要求1所述的一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，其特征在于：步骤二中，动物双歧杆菌二级种子液pH值为3.66，嗜热链球菌二级种子液pH值为3.87，鼠李糖乳杆菌二级种子液pH值为3.59，用于转接发酵培养基。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，其特征在于：步骤三中，取下述重量配比的原料制备而成：
深色焦香麦芽300份、小麦麦芽300份、黄豆375份、葡萄糖100份、酵母浸粉200份、磷酸氢二钾份40、硫酸镁20份、纯化水8565份。
5.根据权利要求1所述的一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，其特征在于：步骤三中，灭菌后测定发酵培养基pH值为6.10~6.2之间。
6.根据权利要求1所述的一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，其特征在于：步骤三中，灭菌后测定发酵培养基pH值为6.13。
7.根据权利要求1所述的一种植物萃取物复合益生菌分时发酵培养方法，其特征在于：步骤三中，当发酵液的pH值下降至3.38时，发酵终止。
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