CN103704719B

CN103704719B - 一种具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法

Info

Publication number: CN103704719B
Application number: CN201310715323.4A
Authority: CN
Inventors: 童望宇; 韩毛振; 罗学才
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-12-23
Also published as: CN103704719A

Abstract

本发明属于益生菌微胶囊制备技术领域，具体地说是一种具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法。本发明在扩大培养过程中采用需氧性枯草杆菌与厌氧性双歧杆菌混合培养和优化控制，在胶囊制备过程中添加不被人体分解吸收的促进双歧杆菌生长繁殖的生长因子和适宜的微生物休眠条件。制备的枯草杆菌微胶囊在货架期内具有高活菌数、高抗逆性的特点。其产品不仅可应用于保健食品领域，也可应用于医药领域及饲料领域。

Description

一种具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法

技术领域

本发明涉及益生菌微胶囊制备技术领域，具体地说是一种具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法。

背景技术

双歧杆菌（Bifidobacterium）是一种厌氧性革兰氏阳性杆菌，不运动，不产芽孢，形态很不一致，末端常常分叉，故名双歧杆菌。双歧杆菌有32个亚型，生长时常要求有多种维生素，少数几个种可在含10%CO₂的空气中生长，发酵产物主要是乙酸和乳酸，不产生CO₂。最适生长温度是37～41℃。双歧杆菌具有治疗便秘、防治肿瘤、保护肝脏、防治心血管疾病和调整肠道功能紊乱等药理作用。保健食品中，双歧杆菌是最重要的益生菌之一。

枯草杆菌 (Bacillus subtilis)，是一种好氧性革兰氏阳性芽孢杆菌，有鞭毛，菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色。在液体培养基中生长时，常形成皱醭。枯草杆菌对乳糖分解有很好的效果，能够帮助对牛奶或奶粉的消化与吸收。进入肠道生长时，能消耗肠道内的氧气，促进双歧杆菌等有益厌氧微生物的生长繁殖。保健食品中，枯草杆菌属于益生菌。

***粮食与农业组织(FAO) 和世界卫生组织(WHO) 定义的益生菌是：活的微生物，当摄入适当量时，对宿主起有益健康的作用。人体内的益生菌主要有：乳杆菌类、双歧杆菌类、链球菌类、枯草杆菌和部分酵母菌等。随着人们生活水平的提高和对健康的关注，益生菌研究不断深入，许多益生菌保健产品已投入市场。然而，益生菌制品在从生产、保藏、运输、经口服过消化道到达肠道的过程中，需要经受一系列不良环境因素的影响，导致到达肠道的活菌数量大大减少，已经成为益生菌产品生产的瓶颈。

微囊化技术是当今世界解决此技术难题较为有效而又成熟的一种方法，在益生菌中的应用已有许多成功的报道。但厌氧性益生菌货架期短的问题仍然没有多大进展，主要问题是：菌株自身抗逆性差（对氧、酸、碱、热等环境因子敏感，尤其是氧），胶囊抗逆性与壁材溶解性间的矛盾。解决这些问题的主要出路在于降低环境因子对菌株的影响。因此，本专利将利用需氧枯草杆菌与厌氧双歧杆菌的互生关系，降低环境因子对微生物生存的影响；在微胶囊制备中使用优化的微生物休眠条件以保持菌体的生物活性；同时在微胶囊中添加人体不能分解的促双歧杆菌生长的低聚糖生长因子。

发明内容

本发明公开一种具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，旨在提高益生菌活菌的抗逆性、保藏期，降低活菌经过胃时的胃液破坏作用，使尽可能多的活的益生菌到达肠道定植，起到益生保健作用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

一种具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

（1）菌株的活化：将保存于-20℃左右条件下的双歧杆菌甘油管保存的种子和保存于4℃左右条件下的枯草杆菌单菌落分别接种于种子培养基中，在32-45 ℃条件下，双歧杆菌厌氧静置培养24-36 h、枯草杆菌100-300 rpm振荡培养12-24 h，进行初次活化；

然后按1-5%的比例分别将初次活化的双歧杆菌和枯草杆菌培养液再次接入种子培养基中进行第二次活化4-12 h，活化条件与初次活化相同；按1：1左右的体积比混合双歧杆菌与枯草杆菌的培养液，得活化种子混合液；

（2）扩大培养：将活化种子混合液按1-10%（V/V）的比例接种于装有pH 6.5-8.5的2-20%天然有机体原料培养基的发酵罐中，天然有机体原料培养基的装液量为发酵罐容积50-80%，在35-45℃条件下静置培养24-48 h，收集菌液，其总活菌数≥2×10⁹ cfu/ml，得发酵液；

（3）洗涤：将发酵液于3000-8000 rpm下离心5-30 min，弃上清液，按体积比1：1-5将菌体沉淀用无菌水振荡混均，离心弃上清，反复洗涤1-3次，随后用1-5%乳清蛋白溶液重新悬浮菌体，其总活菌数≥1×10¹⁰ cfu/ml，得菌悬液；

（4）菌胶液制备：按比例将1-10%（W/V）海藻酸钠、0.5-1%（W/V）羧甲基壳聚糖、0.1-1 %（W/V）低聚糖、1-5 %（W/V）胡萝卜、0.5-2%（V/V）甘油和0.1-1%（V/V）吐温80加入到菌悬液中，搅拌混匀，厌氧室脱氧30-120 min，得菌胶液；

（5）微胶囊制备：用注射泵将菌胶液以10-30 ml/min流速注入1-10 ℃冷却的1-10%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴加边以100-300 rpm的速度搅拌，固化30-60 min，无菌水洗涤三次，得湿微胶囊；

（6）干燥保藏：将湿微胶囊进行低温真空干燥后进行真空包装，得益生菌干微胶囊。

所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）-步骤（5）均按无菌操作规程进行。

所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，对步骤（5）中所述湿微胶囊进行低温真空干燥为40 ^oC以下的任何一种干燥方式，并进行真空包装。

所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的双歧杆菌菌株指的是野生型双歧杆菌、基因工程双歧杆菌中的一种或几种，所述的枯草杆菌菌株指的是野生型枯草杆菌、基因工程枯草杆菌中的一种或几种；所述种子培养基为改进性PYTG培养基。

所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的厌氧方法为N₂和N₂、CO₂、H₂混合气进行脱氧的任一种。

所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述天然有机体原料为全脂牛奶、羊奶、马奶、大豆水解液、花生水解液和酵母水解液中的任一种。

所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述乳清蛋白为牛奶中的乳清蛋白。

所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述低聚糖为人体不能利用而双歧杆菌易于吸收的低聚果糖和低聚果葡糖及其衍生物的任一种。

一种益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌株的活化：将保存于-20℃的双歧杆菌甘油管保存的种子和4℃枯草杆菌单菌落分别接种于种子培养基中，在32-45 ℃条件下，双歧杆菌厌氧静置培养24-36 h、枯草杆菌100-300 rpm振荡培养12-24 h，进行初次活化；然后按1-5%的接种量第二次接入种子培养基中，分别用初次活化条件培养4-12 h进行再次活化，按1：1的体积比混合双歧杆菌与枯草杆菌的培养液，得活化种子混合液。

所述双歧杆菌菌株和枯草杆菌菌株为野生型双歧杆菌、基因工程双歧杆菌、野生型枯草杆菌和基因工程枯草杆菌中的任一种；所述种子培养基为改进性PYTG培养基；所述厌氧方法为N₂和N₂、CO₂、H₂混合气进行脱氧的任一种。

（2）扩大培养：将活化种子液按1-10%（V/V）的比例接种于装有2-20%天然有机体原料培养基（pH 6.5-8.5）的发酵罐中（装液量为50-80%），在35-45℃条件下静置培养24-48h，收集菌液（菌浓≥2×10⁹ cfu/ml），得发酵液。

所述天然有机体原料为全脂牛奶、羊奶、马奶、大豆水解液、花生水解液和酵母水解液中的任一种。

（3）洗涤：将发酵液于3000-8000 rpm下离心5-30 min，弃上清，按体积比1：1-5将菌体沉淀用无菌水振荡混均，离心弃上清，反复洗涤1-3次，随后用1-5%乳清蛋白溶液重新悬浮菌体（菌浓≥1×10¹⁰ cfu/ml），得菌悬液。

所述乳清蛋白为牛奶中的乳清蛋白，典型的为酸奶离心（6000 rpm, 20 min）后得到的上清液。

（4）菌胶液制备：按比例将1-10%（W/V）海藻酸钠、0.5-1%（W/V）羧甲基壳聚糖、0.1-1 %（W/V）低聚糖、1-5 %（W/V）胡萝卜、0.5-2%（V/V）甘油和0.1-1%（V/V）吐温80加入到菌悬液中，搅拌混匀，厌氧室脱氧30-120 min，得菌胶液。

所述低聚糖为人体不能利用而双歧杆菌易于吸收的低聚果糖和低聚果葡糖及其衍生物的任一种。

（5）微胶囊制备：用注射泵将菌胶液以10-30 ml/min流速注入1-10 ℃冷却的1-10%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（100-300 rpm），固化30-60 min，无菌水洗涤三次，得湿微胶囊；

以上所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法所制备的益生菌微胶囊可应用于保健食品、医药和饲料领域。

本发明的有益效果是：在扩大培养时采用优化的培养条件，包括溶氧、温度、pH、时间和培养基，特别是通过混合培养中的需氧枯草杆菌的生长为厌氧双歧杆菌生长提供好的厌氧生长环境；在微胶囊制备中添加不被人体分解吸收的促进双歧杆菌生长繁殖的生长因子和适宜的微生物休眠条件。提高了益生菌活菌的抗逆性、货架期，从而使尽可能多的益生菌到达肠道定植，起到益生保健功能。

本发明通过整合微生物的培养方法与胶囊制备技术生产的益生菌微胶囊具有货架期内高活菌数、高抗逆性的优点。其产品不仅可应用于保健食品、医药和饲料领域。本发明的菌株为益生菌，原料与生产过程均无毒无害，可实现无污染物排放，绿色、安全、环保。

具体实施方式

为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。

以下实施例使用以下材料：

所用水均符合国家“生活饮用水卫生标准”（GB 5749—2006）。

野生菌：青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentisCGMCC 1.2190，枯草杆菌B. subtilis 168。

工程菌：青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis IBL291, 枯草杆菌B.subtilis IBL 241 [WB800N/pHCMC05-svu022]。

天然有机体原料：全脂奶粉，雀巢全脂奶粉，双城雀巢有限公司；豆粕，大豆豆粕，山东嘉冠油脂化工有限公司。

种子培养基为改进性PYTG培养基（g/L）：10.0 g大豆豆粕粉，5.0 g胰蛋白胨，10.0g酵母提取物，10.0 g葡萄糖，40 ml盐溶液（L-0.5 g半胱氨酸，0.2 g氯化钙，0.48 g硫酸镁，1.0 g磷酸氢二钾），pH值7.0 ± 0.1, 分装（固体培养基加1.5%琼脂，1 ml刃天青）,在115 ^oC下灭菌20 min，所用试剂均为分析纯。

实施例1

一种益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌株的活化：将保存于-20℃的野生型双歧杆菌甘油管保存的菌种和保存于4℃的野生型枯草杆菌单菌落分别接种于种子培养基中，在35-43 ℃条件下，野生型双歧杆菌厌氧（N₂、CO₂、H₂混合气脱氧）静置培养24-28 h、野生型枯草杆菌100-300 rpm振荡培养18-24 h，进行初次活化；然后按2-4%的接种量第二次接入种子培养基中，分别用初次活化条件培养8-10 h进行再次活化，按1：1的体积比混合野生型双歧杆菌与野生型枯草杆菌的培养液，得活化种子混合液；

（2）扩大培养：将活化种子混合液按2-5%（V/V）的比例接种于装有5-15%大豆水解液培养基（pH 6.5-7.5）的发酵罐中（装液量为发酵罐容积60-70%），在37-41℃条件下静置培养30-36 h，收集菌液（菌浓≥5×10⁹ cfu/ml），得发酵液；

（3）洗涤：将发酵液于5000 rpm下离心10-15 min，弃上清，按体积比1：1-2将菌体沉淀用无菌水振荡混均，离心弃上清，反复洗涤2次，随后用2%乳清蛋白溶液重新悬浮菌体（活菌数≥2×10¹⁰ cfu/ml），得菌悬液；

（4）菌胶液制备：按比例将4%（W/V）海藻酸钠、0.5%（W/V）羧甲基壳聚糖、0.2 %（W/V）低聚果糖、（W/V）、2-3 %（W/V）胡萝卜、0.8-1%（V/V）甘油和0.2%（V/V）吐温80加入到菌悬液中，搅拌混匀，厌氧室用N₂、CO₂、H₂混合气脱氧60-90 min，得菌胶液；

（5）微胶囊制备：用注射泵将菌胶液以20 ml/min流速注入4-5 ℃冷却的2-4%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（200 rpm），固化40-50 min，无菌水洗涤三次，得湿微胶囊；

该益生菌干微胶囊产品的保质期≥2年，活菌数≥1×10¹¹个/g,芽孢≧60%；淡黄色，无异味。

实施例2

一种益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌株的活化：将保存于-20℃的双歧杆菌工程菌甘油管保存的菌种和保存于4℃的枯草杆菌工程菌单菌落分别接种于种子培养基中，在37-41℃条件下，双歧杆菌厌氧（N₂脱氧）静置培养24-28 h、枯草杆菌工程菌100-300 rpm振荡培养18-24 h，进行初次活化；然后按2-4%的接种量第二次接入种子培养基中，分别用初次活化条件培养8-10 h进行再次活化，按1：1的体积比混合双歧杆菌工程菌与枯草杆菌工程菌的培养液，得活化种子混合液；

（2）扩大培养：将活化种子混合液按2-5%（V/V）的比例接种于装有5-10%全脂牛奶培养基（pH 7.0）的发酵罐中（装液量为60-70%），在37-41℃条件下静置培养30-36 h，收集菌液（菌浓≥1×10¹⁰ cfu/ml），得发酵液；

（3）洗涤：将发酵液于5000 rpm下离心10-15 min，弃上清，按体积比1：1-2将菌体沉淀用无菌水振荡混均，离心弃上清，反复洗涤2次，随后用2%乳清蛋白溶液重新悬浮菌体（菌浓≥5×10¹⁰ cfu/ml），得菌悬液；

（4）菌胶液制备：按比例将5%（W/V）海藻酸钠、1.5%（W/V）羧甲基壳聚糖、0.2 %（W/V）低聚果糖、（W/V）、2-3 %（W/V）胡萝卜、0.8-1%（V/V）甘油和0.2%（V/V）吐温80加入到菌悬液中，搅拌混匀，厌氧室用N₂气脱氧60-90 min，得菌胶液；

该枯草杆菌干微胶囊产品的保质期≥2年，活菌数≥2×10¹¹个/g,芽孢≧60%；淡黄色，无异味。

实施例3

一种益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌株的活化：将保存于-20℃的野生双歧杆菌甘油管保存的菌种和保存于4℃的枯草杆菌工程菌单菌落分别接种于种子培养基中，在37-39 ℃条件下，野生型双歧杆菌厌氧（N₂、CO₂、H₂混合气脱氧）静置培养24-28 h、枯草杆菌工程菌200 rpm振荡培养18-24 h，进行初次活化；然后按2-4%的接种量第二次接入种子培养基中，分别用初次活化条件培养8-10 h进行再次活化，按1：1的体积比混合野生型双歧杆菌与枯草杆菌工程菌的培养液，得活化种子混合液；

（2）扩大培养：将活化种子混合液按2-5%（V/V）的比例接种于装有5-15%羊奶培养基（pH 7.0）的发酵罐中（装液量为60-70%），在37-39℃条件下静置培养30-36 h，收集菌液（菌浓≥5×10⁹ cfu/ml），得发酵液；

（3）洗涤：将发酵液于5000 rpm下离心10-15 min，弃上清，按体积比1：2将菌体沉淀用无菌水振荡混均，离心弃上清，反复洗涤2次，随后用2%乳清蛋白溶液重新悬浮菌体（菌浓≥2×10¹⁰ cfu/ml），得菌悬液；

（4）菌胶液制备：按比例将4%（W/V）海藻酸钠、1.0%（W/V）羧甲基壳聚糖、0.2 %（W/V）低聚果糖、（W/V）、5 %（W/V）胡萝卜、0.8%（V/V）甘油和0.2%（V/V）吐温80加入到菌悬液中，搅拌混匀，厌氧室用N₂、CO₂、H₂混合气脱氧60-90 min，得菌胶液；

（5）微胶囊制备：用注射泵将菌胶液以20 ml/min流速注入4-5 ℃冷却的2-4%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（200 rpm），固化60 min，无菌水洗涤三次，得湿微胶囊；

该枯草杆菌干微胶囊产品的保质期≥2年，活菌数≥5×10¹⁰个/g,芽孢≧60%；淡黄色，无异味。

实施例4

一种益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌株的活化：将保存于-20℃的双歧杆菌工程菌甘油管保存的菌种和保存于4℃的野生枯草杆菌单菌落分别接种于种子培养基中，在37-39 ℃条件下，工程菌双歧杆菌厌氧（N₂、CO₂、H₂混合气脱氧）静置培养24-28 h、野生型枯草杆菌200 rpm振荡培养18-24 h，进行初次活化；然后按2-4%的接种量第二次接入种子培养基中，分别用初次活化条件培养8-10 h进行再次活化，按1：1的体积比混合野生型双歧杆菌与枯草杆菌工程菌的培养液，得活化种子混合液；

（2）扩大培养：将活化种子混合液按2-5%（V/V）的比例接种于装有5-15%马奶培养基（pH 7.0）的发酵罐中（装液量为60-70%），在37-39℃条件下静置培养30-36 h，收集菌液（菌浓≥1×10¹⁰ cfu/ml），得发酵液；

（3）洗涤：将发酵液于5000 rpm下离心10-15 min，弃上清，按体积比1：2将菌体沉淀用无菌水振荡混均，离心弃上清，反复洗涤2次，随后用2%乳清蛋白溶液重新悬浮菌体（菌浓≥3×10¹⁰ cfu/ml），得菌悬液；

（4）菌胶液制备：按比例将5%（W/V）海藻酸钠、1.0%（W/V）羧甲基壳聚糖、0.2 %（W/V）低聚果糖、（W/V）、3.0 %（W/V）胡萝卜、1.0%（V/V）甘油和0.2%（V/V）吐温80加入到菌悬液中，搅拌混匀，厌氧室用N₂、CO₂、H₂混合气脱氧60-90 min，得菌胶液；

该枯草杆菌干微胶囊产品的保质期≥2年，活菌数≥1×10¹¹个/g,芽孢≧60%；淡黄色，无异味。

实施例5

一种益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌株的活化：将保存于-20℃的野生型双歧杆菌甘油管保存的菌种和保存于4℃的野生型枯草杆菌单菌落分别接种于种子培养基中，在45 ℃条件下，野生型双歧杆菌厌氧静置培养24 h、野生型枯草杆菌100 rpm振荡培养12 h，进行初次活化；然后按1%的接种量第二次接入种子培养基中，分别用初次活化条件培养4 h进行再次活化，按1：1的体积比混合野生型双歧杆菌与野生型枯草杆菌的培养液，得活化种子混合液；

（2）扩大培养：将活化种子混合液按10%（V/V）的比例接种于装有20%花生水解液培养基（pH 6.5）的发酵罐中（装液量为80%），在45℃条件下静置培养24 h，收集菌液（菌浓≥2×10⁹ cfu/ml），得发酵液；

（3）洗涤：将发酵液于3000 rpm下离心30 min，弃上清，按体积比1：1将菌体沉淀用无菌水振荡混均，离心弃上清，反复洗涤3次，随后用5%乳清蛋白溶液重新悬浮菌体（菌浓≥5×10⁹ cfu/ml），得菌悬液；

（4）菌胶液制备：按比例将1%（W/V）海藻酸钠、1%（W/V）羧甲基壳聚糖、1%（W/V）低聚糖、（W/V）、1 %（W/V）胡萝卜、0.5%（V/V）甘油和1%（V/V）吐温80加入到菌悬液中，搅拌混匀，厌氧室脱氧120 min，得菌胶液；

（5）微胶囊制备：用注射泵将菌胶液以30 ml/min流速注入1 ℃冷却的10%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（100 rpm），固化60 min，无菌水洗涤三次，得湿微胶囊；

该益生菌干微胶囊产品的保质期≥2年，活菌数≥5×10⁹个/g,芽孢≧80%；淡黄色，无异味。

实施例6

一种益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌株的活化：将保存于-20℃的双歧杆菌工程菌甘油管保存的菌种和保存于4℃的枯草杆菌工程菌单菌落分别接种于种子培养基中，在32 ℃条件下，双歧杆菌工程菌厌氧静置培养36 h、枯草杆菌工程菌100 rpm振荡培养24 h，进行初次活化；然后按5%的接种量第二次接入种子培养基中，分别用初次活化条件培养12 h进行再次活化，按1：1的体积比混合双歧杆菌工程菌与枯草杆菌工程菌的培养液，得活化种子混合液；

（2）扩大培养：将活化种子混合液按1%（V/V）的比例接种于装有2%酵母水解液培养基（pH 8.5）的发酵罐中（装液量为50%），在35℃条件下静置培养48 h，收集菌液（菌浓≥1×10⁹ cfu/ml），得发酵液；

（3）洗涤：将发酵液于8000 rpm下离心5 min，弃上清，按体积比1：5将菌体沉淀用无菌水振荡混均，离心弃上清，反复洗涤1次，随后用1%乳清蛋白溶液重新悬浮菌体（菌浓≥2×10⁹ cfu/ml），得菌悬液；

（4）菌胶液制备：按比例将10%（W/V）海藻酸钠、0.5%（W/V）羧甲基壳聚糖、0.1%（W/V）低聚糖、（W/V）、5 %（W/V）胡萝卜、2%（V/V）甘油和0.1%（V/V）吐温80加入到菌悬液中，搅拌混匀，厌氧室脱氧30 min，得菌胶液；

（5）微胶囊制备：用注射泵将菌胶液以10 ml/min流速注入10 ℃冷却的1%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（300 rpm），固化30 min，无菌水洗涤三次，得湿微胶囊；

该益生菌干微胶囊产品的保质期≥2年，活菌数≥1×10⁹个/g,芽孢≧80%；淡黄色，无异味。

以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims

1.一种具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

（1）菌株的活化：将保存于-20℃条件下的双歧杆菌甘油管保存的种子和保存于4℃条件下的枯草杆菌单菌落分别接种于种子培养基中，在32-45 ℃条件下，双歧杆菌厌氧静置培养24-36 h、枯草杆菌100-300 rpm振荡培养12-24 h，进行初次活化；然后按1-5%的比例分别将初次活化的双歧杆菌和枯草杆菌培养液再次接入种子培养基中进行第二次活化4-12 h，活化条件与初次活化相同；按1：1的体积比混合双歧杆菌与枯草杆菌的培养液，得活化种子混合液；

2.根据权利要求1所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）-步骤（5）均按无菌操作规程进行。

3. 根据权利要求1所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，对步骤（5）中所述湿微胶囊进行低温真空干燥为40 ℃以下的任何一种干燥方式，并进行真空包装。

4.根据权利要求1所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的双歧杆菌菌株指的是野生型双歧杆菌、基因工程双歧杆菌中的一种或几种，所述的枯草杆菌菌株指的是野生型枯草杆菌、基因工程枯草杆菌中的一种或几种；所述种子培养基为改进性PYTG培养基。

5.根据权利要求1所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的厌氧方法为N₂和N₂、CO₂、H₂混合气进行脱氧的任一种。

6.根据权利要求1所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述天然有机体原料为全脂牛奶、羊奶、马奶、大豆水解液、花生水解液和酵母水解液中的任一种。

7.根据权利要求1所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述乳清蛋白为牛奶中的乳清蛋白。

8.根据权利要求1所述的具有高活菌数的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述低聚糖为人体不能利用而双歧杆菌易于吸收的低聚果糖及其衍生物的任一种。