CN105294542A - 一种含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种以1-脱氧野尻霉素为主要成分的桑叶提取物的制备方法，充分考虑了桑叶的原料特性以及目标成分1-脱氧野尻霉素的溶解特性，经过***的筛选和优化，确定了以食盐水隔水蒸煮软化、酶解、聚酰胺柱纯化、模拟移动床精制步骤为主的方法，分离效果极佳，最终得到的桑叶提取物中1-脱氧野尻霉素浓度大于95wt%。整个方法所用材料均为常规材料，成本低且收率高、且溶剂可循环利用，能降低环境污染，易于产业化。
Description
技术领域
本发明涉及一种桑叶提取物的制备方法，属于天然植物提取物领域。
背景技术
桑叶，（MulberryLeaf），学名：FoliumMori，是桑科植物桑的干燥叶，又名家桑、荆桑、桑椹树、黄桑叶等，栽培或野生，我国南北各地均有广泛种植，桑叶产量丰富。现代科学研究表明，桑叶含黄酮类、多糖类、维生素类、矿物质、氨基酸等多种化学成分，具有降血糖、降血压、抗衰老、抗菌、抗病毒等生理作用，尤其是桑叶中包含的多羟基生物碱类成分，研究显示具有较强降血糖活性，是近年来的研究热点。
此类多羟基生物碱中具有代表性的成分是1-脱氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，简称DNJ）。DNJ，化学名称为3,4,5-三羟基-2羟甲基四氢吡啶，C6H13NO4，分子量为163.7，CA号19130-96-2，是一种哌啶生物碱。作为强效的糖代谢酶抑制剂（比如α-葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖醛酸酶和糖原磷酸酶等），DNJ可显著延缓多糖的降解过程，可降低餐后血糖的峰值，稳定空腹血糖。此外，DNJ还有胰岛素增敏的作用，改善胰岛素抵抗。因此，DNJ具有极高的应用价值。但在桑叶中，其含量仅为0.11%，由此可见，要获得以其为主要成分的桑叶提取物并非易事。
目前，国内外对从桑叶中提取分离1-脱氧野尻霉素（DNJ）的方法进行了较多研究，多次采用溶剂提取法和酸提取法。溶剂提取主要采用乙酸乙酯、乙醇和石油醚等溶剂分步提取，酸提取法主要采用稀盐酸和稀硫酸提取，但普遍存在提取效率低、成本高的问题。
中国专利200710067498.3公开了一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法，将原料桑叶粉碎后用溶剂提取所需组分，再将其酸化后通过阳离子交换树脂，并用醇溶液洗脱后将洗脱液浓缩成浸膏，得到相应提取物。但该方法缺点在于其生产步骤需要将提取液冷却到10至-30℃，条件较为苛刻，且该方法中用到甲醇、二乙胺、三乙胺等有机溶剂均属于有毒、易燃的成分，不利于安全生产。
中国专利200810122998.7公开了一种从桑叶总生物碱中分离1-脱氧野尻霉素单体的方法，以1-脱氧野尻霉素含量在40%以上的桑叶总生物碱为原料，通过阳离子树脂后再经过多次重结晶得到1-脱氧野尻霉素单体。该方法对于制备1-脱氧野尻霉素的原料要求较高，且工艺也比较复杂。
中国专利201110021131.4公开了一种桑叶中1-脱氧野尻霉素的制备方法，采用高压脉冲电场提取，再经阳离子树脂、乙酸乙酯萃取、活性炭处理，最后再经乙醇重结晶得到1-脱氧野尻霉素单体。该方法采取的脉冲电场虽然提取效率较高，但对于设备和环境的要求较为苛刻，生产成本较高。
中国专利201110186498.1公开了一种利用膜分离技术制备1-脱氧野尻霉素的方法，得到纯度80%以上的1-脱氧野尻霉素。但在膜分离技术处理过程中，膜孔不可避免地会被堵塞和污染，需要定期的清洗检查，成本较高。
可以发现，现有的制备包含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的方法均存在诸多问题，要么大量使用了有毒溶剂，要么成本较高，要么需要定期的处理，等等。因此，本申请的发明人试图提出一种以1-脱氧野尻霉素为主的桑叶提取物的制备方法，并且方法步骤简便，成本低且收率高，易于工业化大生产。
发明内容
为了实现上述目的，本发明提供了一种以1-脱氧野尻霉素为主要成分的桑叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料前处理：桑叶原料，食盐水隔水蒸煮0.5-2小时，自然冷却；
（2）提取：将前处理后的原料置于提取罐中，加入原料重量1-3倍的水，加入果胶酶和半纤维素酶的复合酶（2：1），常温下提取1-3h，过滤，得提取液；
（3）树脂纯化：将步骤(2)得到的提取物浓缩成浸膏，用50%乙醇溶解上样，通过聚酰胺层析柱分离，上样量与聚酰胺比为1∶20，树脂柱径高比为1∶10，流动相为3%磷酸溶液-乙醇（1:4），收集洗脱液；
（4）模拟移动床精制：将步骤(4)中的洗脱液通过模拟移动床色谱分离，得到富含1-脱氧野尻霉素的提取物；其中，模拟移动床色谱填充的吸附剂为硅胶，洗脱剂为0.1%三乙胺水溶液；吸附区流速1-2BV/h；洗脱区流速1-3BV/h；切换时间为500-800s；温度控制在20℃-40℃；压力控制在0.1MPa-0.5MPa；
（5）将步骤(4)中富含1-脱氧野尻霉素的组分浓缩、离心、干燥得到本发明的提取物。
其中，步骤（1）中，食盐的加入量为水量的1-5%；
其中，步骤（2）中，复合酶用量为水的1-3重量%；
其中，步骤（4）中，模拟移动床色谱吸附区流速优选2BV/h；洗脱区流速优选3BV/h；切换时间优选600s；温度优选30℃；压力优选0.3MPa。
其中，步骤（5）中，将富含1-脱氧野尻霉素的提取物浓缩至固形物含量为30～50wt.％，抽滤，40℃～60℃真空干燥得桑叶提取物产品。
本发明还提供了由上述制备方法制得的桑叶提取物，包含浓度大于95wt.%的1-脱氧野尻霉素。
本发明所述的桑叶提取物的提取方法操作简便，产业上应用前景好，产率与产品纯度较高，以本发明的技术方案得到的产品含1-脱氧野尻霉素95%以上。
本发明选择了食盐水隔水蒸煮软化、酶解、聚酰胺柱纯化、模拟移动床精制的联合方法，充分考虑了桑叶的原料特性以及目标成分1-脱氧野尻霉素的溶解特性，经过***的筛选和优化，确定了上述分离精制法，分离效果极佳，最终得到的桑叶提取物中，1-脱氧野尻霉素浓度大于95wt.%，优于现有技术中已有的各种制备方法。整个方法所用材料均为常规材料，成本低且收率高、且溶剂可循环利用，能降低环境污染，易于产业化。
本申请的发明人进行了大量试验，因需要考虑的因素太多，以及筛选过程反复，下文提供的实验结果仅用于表明本发明的制备方法为一个完整的相互关联的制备方法，是经过发明人细致工作得到的成果，并非是现有技术手段的简单组合。其中，测定1-脱氧野尻霉素的方法为本领域公知的方法，可以采用HPLC法进行检测，具体参数不再详列。
实验材料：桑叶、水、食盐、复合酶、50%乙醇、3%磷酸溶液、1%三乙胺水溶液
实验方法：以本发明实施例1的方法为基础，通过省略不同步骤，比较最终产品中1-脱氧野尻霉素的含量。
实验结果见下表。
| 1-脱氧野尻霉素（%） | |
| 实施例1的方法 | 97.81 |
| 实施例1的方法（但省略食盐水蒸步骤） | 88.67 |
| 实施例1的方法（但酶解步骤不加酶） | 69.53 |
| 实施例1的方法（但选用大孔树脂柱替换聚酰胺柱） | 82.30 |
| 实施例1的方法（但省略树脂纯化步骤） | 71.29 |
| 实施例1的方法（但省略模拟移动床精制） | 73.82 |
| 实施例1的方法（但用干硅胶柱替换模拟移动床精制） | 79.94 |
实施例1
取5kg桑叶，3%食盐水隔水蒸煮1小时，自然冷却；移至提取罐中，加入原料重量2倍的水，按水量的2%加入果胶酶和半纤维素酶的复合酶（2：1），常温下搅拌提取2h，过滤，得提取液；将提取物浓缩成浸膏，用50%乙醇溶解上样，通过聚酰胺层析柱分离，用流动相3%磷酸溶液-乙醇（1:4）洗脱，收集洗脱液；将洗脱液通过模拟移动床色谱分离，其中，模拟移动床色谱填充的吸附剂为硅胶，洗脱剂为0.1%三乙胺水溶液；吸附区流速2BV/h；洗脱区流速2BV/h；切换时间为600s；温度控制在25℃；压力控制在0.3MPa；得到桑叶分离组分；将上述分离组分浓缩至固形物含量50重量%，抽滤，50℃真空干燥得本发明的桑叶提取物产品。经检测，产品中1-脱氧野尻霉素含量为97.81wt.%。
实施例2
取5kg桑叶，1%食盐水隔水蒸煮2小时，自然冷却；移至提取罐中，加入原料重量1倍的水，按水量的3%加入果胶酶和半纤维素酶的复合酶（2：1），常温下搅拌提取1h，过滤，得提取液；将提取物浓缩成浸膏，用50%乙醇溶解上样，通过聚酰胺层析柱分离，用流动相3%磷酸溶液-乙醇（1:4）洗脱，收集洗脱液；将洗脱液通过模拟移动床色谱分离，其中，模拟移动床色谱填充的吸附剂为硅胶，洗脱剂为0.1%三乙胺水溶液；吸附区流速2BV/h；洗脱区流速3BV/h；切换时间为700s；温度控制在20℃；压力控制在0.4MPa；得到桑叶分离组分；将上述分离组分浓缩至固形物含量50重量%，抽滤，50℃真空干燥得本发明的桑叶提取物产品。经检测，产品中1-脱氧野尻霉素含量为97.05wt.%。
实施例3
取5kg桑叶，5%食盐水隔水蒸煮0.5小时，自然冷却；移至提取罐中，加入原料重量3倍的水，按水量的1%加入果胶酶和半纤维素酶的复合酶（2：1），常温下搅拌提取3h，过滤，得提取液；将提取物浓缩成浸膏，用50%乙醇溶解上样，通过聚酰胺层析柱分离，用流动相3%磷酸溶液-乙醇（1:4）洗脱，收集洗脱液；将洗脱液通过模拟移动床色谱分离，其中，模拟移动床色谱填充的吸附剂为硅胶，洗脱剂为0.1%三乙胺水溶液；吸附区流速1BV/h；洗脱区流速2BV/h；切换时间为700s；温度控制在40℃；压力控制在0.5MPa；得到桑叶分离组分；将上述分离组分浓缩至固形物含量50重量%，抽滤，50℃真空干燥得本发明的桑叶提取物产品。经检测，产品中1-脱氧野尻霉素含量为96.28wt.%。
Claims (3)
1.一种以1-脱氧野尻霉素为主要成分的桑叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料前处理：桑叶原料，食盐水隔水蒸煮0.5-2小时，自然冷却；
（2）提取：将前处理后的原料置于提取罐中，加入原料重量1-3倍的水，加入果胶酶和半纤维素酶的复合酶（2：1），常温下提取1-3h，过滤，得提取液；
（3）树脂纯化：将步骤(2)得到的提取物浓缩成浸膏，用50%乙醇溶解上样，通过聚酰胺层析柱分离，上样量与聚酰胺比为1∶20，树脂柱径高比为1∶10，流动相为3%磷酸溶液-乙醇（1:4），收集洗脱液；
（4）模拟移动床精制：将步骤(4)中的洗脱液通过模拟移动床色谱分离，得到富含1-脱氧野尻霉素的提取物；其中，模拟移动床色谱填充的吸附剂为硅胶，洗脱剂为0.1%三乙胺水溶液；吸附区流速1-2BV/h；洗脱区流速1-3BV/h；切换时间为500-800s；温度控制在20℃-40℃；压力控制在0.1MPa-0.5MPa；
（5）将步骤(4)中富含1-脱氧野尻霉素的组分浓缩、离心、干燥得到本发明的提取物。
2.如权利要求1的制备方法，步骤（1）中，食盐的加入量为水量的1-5%；步骤（2）中，复合酶用量为水的1-3重量%；步骤（4）中，模拟移动床色谱吸附区流速优选2BV/h；洗脱区流速优选3BV/h；切换时间优选600s；温度优选30℃；压力优选0.3MPa；步骤（5）中，将富含1-脱氧野尻霉素的提取物浓缩至固形物含量为30～50wt.％，抽滤，40℃～60℃真空干燥得桑叶提取物产品。
3.如权利要求1-2的方法制得的桑叶提取物，1-脱氧野尻霉素的含量大于95wt.%。
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