CN105055527A - 一种橄榄叶提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种橄榄叶提取物的制备方法及其制备的橄榄叶提取物。通过对橄榄叶的浸润、酶解提取、分离、干燥的工艺，得到了橄榄苦苷含量大于90%的橄榄叶提取物产品。整个方法仅由4个步骤构成，所采用试剂均为常见的无毒成分，收率高且成本低，所得到产品可直接用于制备药物和保健品、食品，是非常适于工业生产的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种橄榄叶提取物的制备方法，属于天然植物提取物领域。
背景技术
油橄榄(OleaeuropaeaL.)，属木犀科(Oleaceae)木犀榄属(Olea)常绿乔木，是世界著名的木本油料树种，有4000多年的栽培历史。油橄榄主要分布在北纬45°到南纬37°之间，中心分布区是地中海国家，希腊、意大利、突尼斯、西班牙为集中产地，现在包括中国的世界各国均有引种栽培。我国于1964年引种油橄榄以来，近十年来，在西部开发政策支持下，油橄榄的种植发展较快，甘肃、四川二省的基地建设已初具规模，并建立起橄榄油加工厂，油橄榄果实得到充分利用，但每年因修剪而废弃的油橄榄叶在数千吨以上，而未得到很好利用。
橄榄叶中主要含有裂环烯醚萜及其苷、黄酮及其苷、双黄酮及其苷、低分子单宁等成分，裂环烯醚萜类为主要活性成分。
橄榄苦苷(oleuropein)是橄榄叶中的苦味素，是一种双分子结构酚类和黄酮类物质，分子式C25H32O13，分子量540.52，熔点87～89℃，易吸湿，易溶于乙醇、丙酮、吡啶等，可溶于水、丁醇、乙酸乙酯等，几乎不溶于***、石油醚、氯仿等。据报道，橄榄苦苷具有天然的抗氧化、抗肿瘤、延缓衰老、增强心血管功能、治疗慢性***炎、增强免疫力、调解内分泌***、护肝、抗炎等重要的保健功能，同时还有降血脂、降血糖的药理作用，广泛用于食品、化妆和生物制药等领域。
橄榄苦苷主要从橄榄叶中提取获得。目前文献报道或专利公开的橄榄苦苷提取分离技术较多，橄榄叶提取技术主要包括有机溶剂提取技术、超临界CO2萃取技术、超声波萃取技术及微波萃取技术等。但是，有机溶剂提取具有杂质含量高、溶剂消耗大、成本高、污染大等缺点。超临界CO2萃取具有提取含量高、无污染等优点，但投入大、成本高。超声波及微波萃取虽然具有节能、高效等优点，但在生产上难以实现大规模化应用。
例如，中国专利CN1583052A公开一种橄榄叶提取物提取制备方法，将橄榄叶经消毒漂洗、干燥后，醇提，真空浓缩，在浓缩液中加入茶多酚抗氧化，经干燥获得橄榄叶提取物，但其制备的橄榄叶提取物中有效成分含量低。中国专利CN101003557A公开了一种富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，通过橄榄叶极性溶剂提取、碱性离心沉降、离心清液、膜耦合分离等步骤得到通过纳滤膜的浓缩液，然后介质吸附、解吸附得到洗脱液，真空浓缩后干燥，获得橄榄苦苷含量大于50％的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物。但该方法实际操作步骤过多，不利于工业化大生产，而且膜分离设备首期投资大，提高了产品成本。日本特开2002128678用含水溶剂提取，合成树脂处理后，干燥得到含橄榄苦苷25％以上的提取物。美国专利US5714150中采用醇水溶液热提二次以上，提取液真空浓缩后喷雾干燥或者真空干燥，其制备得到含橄榄苦苷30-40％的橄榄叶提取物。这些提取物中橄榄苦苷的含量太低，均不能满足市场要求。
王成章等的文章“引种阿斯油橄榄叶中橄榄苦苷提取分离及结构鉴定”中采用多次有机溶剂萃取、硅胶柱层析以及HPLC制备色谱，分离出了含量为95％的橄榄苦甙，但该法尽限于少量样品制备。欧洲专利EP1795201中将橄榄叶磨成直径0.05到1毫米的细粉，pH8.0碱水提取；水提液经有机溶剂萃取，萃取液真空低温干燥得到含橄榄苦苷40-45％的粗提物；此粗提物再经快速硅胶色谱柱纯化，收集含橄榄苦苷部分的解吸液，回收溶剂后得到含95-98％橄榄苦苷的非晶质固体。但该方法中虽然获得了较高的橄榄苦苷含量，但成本偏高，更适合于科学研究，难以实现规模化生产。
因此，本申请的发明人为了提出一种有效成分含量高、成本低、且方法简便、溶剂可循环利用，降低环境污染，易于产业化的方法，进行了深入研究，进而获得本发明。
发明内容
为了实现上述目的，本发明提供了一种橄榄叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将原料橄榄叶盐水浸泡1-2小时后，烘干，粉碎成细粉；
（2）向原料中加入3-8倍水，加入纤维素酶：碱性蛋白酶的复合酶，复合酶用量为原料的0.5-2重量%，保持在30-50℃下酶解0.5-2h，过滤，得酶解液；
（3）酶解液直接通过中性氧化铝柱，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，分别用1-3倍柱体积水、1-2倍柱体积95％乙醇溶液洗脱除杂，用6-10倍柱体积的0.2-0.5%冰醋酸-50%乙醇（1:1）溶液洗脱，收集洗脱液；
（4）挥去洗脱液中的冰醋酸和乙醇后，微波真空干燥，得橄榄苦苷含量大于90%的橄榄叶提取物产品。
步骤（1）中，盐水可以是饱和食盐水，粉碎的粒度优选是通过40-60目筛。
步骤（2）中，水量优选为4-6倍，更优选是5倍；复合酶优选是纤维素酶：碱性蛋白酶1:3的复合酶。
步骤（3）中，微波真空干燥温度：40-60℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟。
本发明通过对橄榄叶的浸润、酶解提取、分离、干燥的工艺，得到了富含橄榄苦苷的产品：经过***的筛选和优化，首先确定了原料前处理步骤，在制备前用盐水进行浸润，并通过适度的粉碎，更为彻底地溶出有效成分，进一步地，采用中性氧化铝柱，酶解液无需浓缩即可直接上柱，极大地降低了能耗，最后经冰醋酸-乙醇洗脱液洗脱及干燥后，得到了橄榄苦苷含量大于90%的橄榄叶提取物产品。整个方法仅由4个步骤构成，所采用试剂均为常见的无毒成分，收率高且成本低，所得到产品可直接用于制备药物和保健品、食品，是非常适于工业生产的方法。
本发明还提供了上述制备方法制得的橄榄叶提取物。
具体实施方式
以下将详细介绍本发明的研发过程。
一、酶解工艺的研究
实验材料：橄榄叶粉末，果胶酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、溶菌酶
实验方法：取橄榄叶粉末，加入原料重量1.5-2倍的水，并加入1%的酶，超声处理。测定酶解后的上清液中橄榄苦苷的含量。
实验结果见下表。
| 酶种类 | 橄榄苦苷（mg/100ml） |
| 纤维素酶 | 24.32 |
| 碱性蛋白酶 | 19.06 |
| 果胶酶 | 19.59 |
| 淀粉酶 | 20.28 |
| 脂肪酶 | 14.17 |
| 溶菌酶 | 15.89 |
| 纤维素酶：碱性蛋白酶（1:1） | 28.45 |
| 纤维素酶：碱性蛋白酶（1:2） | 30.25 |
| 纤维素酶：碱性蛋白酶（1:3） | 39.54 |
| 纤维素酶：淀粉酶（1:1） | 25.11 |
| 纤维素酶：脂肪酶（1:1:1） | 20.19 |
由此可见，纤维素酶与碱性蛋白酶的复合酶对橄榄苦苷的溶出非常有利，特别优选纤维素酶：碱性蛋白酶（1:3）。
二、酶解前工艺的研究
实验材料：橄榄叶、水、食盐水、生石灰水、小苏打水、纤维素酶、碱性蛋白酶
实验方法：取橄榄叶，分别加入5-10倍水、食盐水、生石灰水、小苏打水浸润1小时后，烘干，粉碎后进行酶解（纤维素酶：碱性蛋白酶1:3），测定酶解上清液中橄榄苦苷的含量。
实验结果见下表。
| 工艺 | 橄榄苦苷（mg/100ml） |
| 水浸润后酶解 | 40.61 |
| 饱和食盐水浸润后酶解 | 62.17 |
| 生石灰水浸润后酶解 | 51.59 |
| 小苏打水浸润后酶解 | 42.38 |
发明人极为惊喜地发现，经饱和食盐水浸润后的橄榄叶再经酶解，可以极大提高橄榄苦苷的溶出。该原因尚未明确，与现有技术中采用生石灰水浸提的方法似乎不同，但发明人猜测是较为肥厚的橄榄叶中因食盐水的渗入，与纤维素酶和碱性蛋白酶相互作用后，发挥了异常的组合作用导致。
三、柱层析的筛选
实验方法：取酶解后的上清液，浓缩后，置预处理好的中性氧化铝柱树脂100g中，摇床动态吸附8小时后，装柱，分别用1-3倍柱体积水、30%乙醇、50%乙醇、80％乙醇、0.5%冰醋酸、正丁醇、乙酸乙酯溶液或其混合液洗脱，收集洗脱液进行橄榄苦苷含量测定，部分洗脱液蒸干计算干膏量。
实验结果见下表。
| 洗脱液种类 | 干膏量（g） | 橄榄苦苷含量 |
| 水 | 3.82 | 55.21 |
| 30%乙醇 | 4.24 | 79.09 |
| 50%乙醇 | 4.65 | 82.35 |
| 80%乙醇 | 4.11 | 77.26 |
| 0.5%冰醋酸 | 4.97 | 80.42 |
| 正丁醇 | 3.89 | 67.09 |
| 30%乙醇-0.5%冰醋酸（1:1） | 5.49 | 85.21 |
| 50%乙醇-0.5%冰醋酸（1:1） | 6.25 | 92.89 |
| 80%乙醇-0.5%冰醋酸（1:1） | 5.02 | 78.54 |
| 正丁醇-0.5%冰醋酸（1:1） | 4.85 | 75.67 |
结果表明，50%乙醇-0.5%冰醋酸（1:1）的效果最好。
本发明人还进行了其他多方面的筛选，包括粉碎的粒度、树脂柱型号的筛选等等，最终获得了本发明的技术方案，得到了一种方法简便、易于施行、且得到包含超过90%以上橄榄苦苷的橄榄叶提取物，可直接用于制备食品、保健品或药品。
实施例1：一种橄榄叶提取物，其通过如下方法制得，包括如下步骤：
（1）将原料橄榄叶盐水浸泡1小时后，烘干，粉碎成40-60目细粉；
（2）向原料中加入5倍水，加入纤维素酶：碱性蛋白酶1:3的复合酶，复合酶用量为原料的1重量%，保持在30-50℃下酶解0.5h，过滤，得酶解液；
（3）酶解液直接通过中性氧化铝柱，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，分别用1-3倍柱体积水、1-2倍柱体积95％乙醇溶液洗脱除杂，用6倍柱体积的0.2-0.5%冰醋酸-50%乙醇（1:1）溶液洗脱，收集洗脱液；
（4）挥去洗脱液中的冰醋酸和乙醇后，微波真空干燥，温度：40-60℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟，得产品。经测定，该产品中橄榄苦苷含量为96.03%。
实施例2：一种橄榄叶提取物，其通过如下方法制得，包括如下步骤：
（1）将原料橄榄叶盐水浸泡2小时后，烘干，粉碎成细粉；
（2）向原料中加入3倍水，加入纤维素酶：碱性蛋白酶的复合酶，复合酶用量为原料的2重量%，保持在30-50℃下酶解0.5h，过滤，得酶解液；
（3）酶解液直接通过中性氧化铝柱，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，分别用1-3倍柱体积水、1-2倍柱体积95％乙醇溶液洗脱除杂，用10倍柱体积的0.2-0.5%冰醋酸-50%乙醇（1:1）溶液洗脱，收集洗脱液；
（4）挥去洗脱液中的冰醋酸和乙醇后，微波真空干燥，温度：40-60℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟，得产品。经测定，该产品中橄榄苦苷含量为93.92%。
实施例3：一种橄榄叶提取物，其通过如下方法制得，包括如下步骤：
（1）将原料橄榄叶盐水浸泡1小时后，烘干，粉碎成50-60目细粉；
（2）向原料中加入7倍水，加入纤维素酶：碱性蛋白酶1:3的复合酶，复合酶用量为原料的1重量%，保持在30-50℃下酶解0.5h，过滤，得酶解液；
（3）酶解液直接通过中性氧化铝柱，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，分别用1-3倍柱体积水、1-2倍柱体积95％乙醇溶液洗脱除杂，用8倍柱体积的0.2-0.5%冰醋酸-50%乙醇（1:1）溶液洗脱，收集洗脱液；
（4）挥去洗脱液中的冰醋酸和乙醇后，微波真空干燥，温度：40-60℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟，得产品。经测定，该产品中橄榄苦苷含量为95.40%。
Claims (7)
1.一种橄榄叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将原料橄榄叶盐水浸泡1-2小时后，烘干，粉碎成细粉；
（2）向原料中加入3-8倍水，加入纤维素酶：碱性蛋白酶的复合酶，复合酶用量为原料的0.5-2重量%，保持在30-50℃下酶解0.5-2h，过滤，得酶解液；
（3）酶解液直接通过中性氧化铝柱，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，分别用1-3倍柱体积水、1-2倍柱体积95％乙醇溶液洗脱除杂，用6-10倍柱体积的0.2-0.5%冰醋酸-50%乙醇（1:1）溶液洗脱，收集洗脱液；
（4）挥去洗脱液中的冰醋酸和乙醇后，微波真空干燥，得橄榄苦苷含量大于90%的橄榄叶提取物产品。
2.如权利要求1的方法，步骤（1）中，盐水可以是饱和食盐水。
3.如权利要求1的方法，步骤（1）中，粉碎的粒度优选是通过40-60目筛。
4.如权利要求1的方法，步骤（2）中，水量优选为4-6倍，更优选是5倍。
5.如权利要求1的方法，步骤（2）中，复合酶优选是纤维素酶：碱性蛋白酶1:3的复合酶。
6.如权利要求1的方法，步骤（3）中，微波真空干燥温度：40-60℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟。
7.上述方法制得的富含橄榄苦苷的提取物。
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160603 Address after: 011517 the Inner Mongolia Autonomous Region Helingeer County of Hohhot city Shengle Economic Zone Applicant after: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 010010, building 3, unit 7, Wanda District, Wanda Plaza, Xinhua East Street, the Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot, 602, China Applicant before: Bai Xinliang |
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| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 011517 Hohhot city Helingeer County Inner Mongolia Shengle economic Park Applicant after: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 011517 Hohhot city Helingeer County Inner Mongolia Shengle economic Park Applicant before: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 028400 no.0427, Dongjiao Industrial Park, Kailu Town, Kailu County, Tongliao City, Inner Mongolia Autonomous Region Patentee after: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 011517 Hohhot city Helingeer County Inner Mongolia Shengle economic Park Patentee before: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
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| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A preparation method of olive leaf extract Effective date of registration: 20210222 Granted publication date: 20180629 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Helingeer County sub branch Pledgor: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021150000016 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20220321 Granted publication date: 20180629 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Helingeer County sub branch Pledgor: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2021150000016 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A preparation method of olive leaf extract Effective date of registration: 20220330 Granted publication date: 20180629 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Helingeer County sub branch Pledgor: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2022150000027 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230301 Granted publication date: 20180629 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Helingeer County sub branch Pledgor: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2022150000027 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A preparation method of olive leaf extract Effective date of registration: 20230307 Granted publication date: 20180629 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Hohhot branch Pledgor: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2023150000031 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20231031 Granted publication date: 20180629 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Hohhot branch Pledgor: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2023150000031 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A preparation method for olive leaf extract Effective date of registration: 20231101 Granted publication date: 20180629 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Hohhot branch Pledgor: INNER MONGOLIA CHANGHUI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2023150000154 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |