CN105255952A - 一种通过过量表达ino2基因提高酒精生产效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过过量表达INO2基因提高酒精生产效率的方法，属于生物能源开发技术领域。本发明方法是在ino4单基因缺失菌株中过量表达INO2而获得的工程菌株发酵生产酒精，相比于野生型空载对照菌株，发酵进行到52h，生物量提高了186.6％，酒精产量提高了204.1％，酒精对菌体得率提高了5.6％，具有很好的工业应用价值和前景，同时为构建高产酒精的优良酿酒酵母基因工程菌株提供了重要的信息。

Description

一种通过过量表达INO2基因提高酒精生产效率的方法
技术领域
本发明涉及一种通过过量表达INO2基因提高酒精生产效率的方法，尤其是一种应用转录因子单基因缺失及过量表达的酿酒酵母提高酒精对菌体得率的方法，属于生物能源开发技术领域。
背景技术
化石能源(煤、石油、天然气等)是当前世界上最主要的能源，随着世界各国经济社会的发展，人类对能源的需求量日益递增，但化石能源的储量是有限的；同时，化石能源燃烧产生的温室气体造成的全球气候变暖及所带来的问题，一直困扰着人们。因此，寻找和发展可再生的新能源已成为全世界关注的热点。燃料酒精具有清洁、安全、环境友好、及原料可再生等优点，被认为是石油资源的理想替代品，市场潜力巨大。目前，已在欧洲、美国及巴西等国较为广泛地使用。
微生物发酵法生产燃料酒精是当前研究的热点，酿酒酵母是理想的酒精发酵生产菌株，具有：在简单的培养基上能够快速地生长及生产乙醇；对非生宜环境(如高渗透压、高温及乙醇毒害)具有较强的适应性；遗传改造操作方便；能够利用廉价的底物，发酵成本较低等特性。利用浓醪发酵生产乙醇的技术在过去10年获得了很大的进步，但和美国等发达国家相比仍然存在很大的差距，存在的主要问题在于：发酵前期的高浓度底物造成的高渗透压抑制；发酵后期的高浓度乙醇造成的毒害抑制；发酵过程中不易控制的高温度造成的抑制作用。这些问题的存在成为限制浓醪发酵技术生产效率提高的主要因素。
目前，对于酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)耐受高渗透压、高浓度酒精和高温的研究已取得了很多的进展，但相关耐受机制尚未研究清楚。因此，要想通过理性的改造手段来提高S.cerevisiae对逆境的耐受性十分困难。尽管传统的菌种选育手段(如自然筛选、诱变育种)在提高菌株对逆境耐受性方面已取得了一定的效果，但存在工作量大、存在随机性等缺点。近年来，随着分子生物学和组学技术的快速发展，为大规模研究酿酒酵母基因和乙醇发酵的关系提供了条件。目前，没有文献报道通过过量表达INO2可以提高酒精的生产效率。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种提高酒精生产效率的方法，所述方法是利用ino4基因缺失且过量表达INO2基因的酵母工程菌发酵生产酒精。
在本发明的一种实施方式中，所述工程菌是酿酒酵母工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述INO4基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述INO2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述INO4基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述INO2基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是在ino4单基因缺失株中过表达INO2基因。
在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将INO2基因片段克隆到表达质粒pHAC181(JiangL,2004)上得到重组高表达质粒pHAC181-INO2，再将重组质粒转化到ino4单基因缺失株中进行表达。
在本发明的一种实施方式中，所述表达质粒pHAC181是在YCplac181的SphI和EcoRV位点***3个组氨酸标签得到的，详见文献：AnalysesoftheeffectsofRck2pmutantsonPbs2pDD-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifyaMAPkinasedockingmotif,andunexpectedfunctionalinactivationduetoacidicsubstitutionofT379,MolGenGenomics,2004,271:208–219.
在本发明的一种实施方式中，所述ino4单基因缺失株购自Invotrogen公司，编号为Sc04163923_s1。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵生产是将酵母工程菌活化后转接至发酵培养基，使得接种种子菌液后发酵培养基的OD600为0.4-0.5，于28-30℃、200-220r/min培养7-8小时后转为静置培养，静置培养50-52h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵生产是将酵母工程菌活化后转接至发酵培养基，使得接种种子菌液后发酵培养基的OD600为0.5，于30℃、220r/min培养8小时后转为静置培养，继续培养52h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有葡萄糖100g/L、硫酸铵7.5g/L、磷酸二氢钾3.5g/L、七水硫酸镁0.75g/L、酵母提取物0.2g/L、组氨酸0.02g/L、尿嘧啶0.02g/L、亮氨酸0.1g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述活化优选YPD培养基。在YPD固体培养基上划线，于30℃培养2d以初步活化菌种，再转接至YPD液体培养基中，30℃、220r/min摇床培养23h至饱和。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种酒精生产效率提高的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌缺失了编码氨基酸序列如SEQIDNO.3的ino4基因且过表达编码氨基酸序列如SEQIDNO.4的INO2基因。
所述酿酒酵母工程菌是在ino4单基因缺失的酿酒酵母中过表达INO2基因。
本发明的有益效果：
本发明应用在ino4单基因缺失菌株中过量表达INO2而获得的工程菌株发酵生产酒精，相比于野生型空载对照菌株，发酵进行到52h，生物量提高了186.6％，酒精产量提高了204.1％，酒精对菌体得率提高了5.6％，具有很好的工业应用价值和前景，同时为构建高产酒精的优良酿酒酵母基因工程菌株提供了重要的信息。
附图说明
图1：菌体生物量比较图；其中ino4+INO2代表在ino4单基因缺失菌株中过量表达INO2而获得的工程菌株，WT+V代表含有空载的野生型对照菌株；
图2：酒精产量比较图；其中ino4+INO2代表在ino4单基因缺失菌株中过量表达INO2而获得的工程菌株，WT+V代表含有空载的野生型对照菌株；
图3：酒精得率比较图；其中ino4+INO2代表在ino4单基因缺失菌株中过量表达INO2而获得的工程菌株，WT+V代表含有空载的野生型对照菌株。
具体实施方式
高效液相色谱测定酒精含量的方法：发酵液中酒精含量的测定采用高效液相色谱仪(HPLC)检测。发酵液经处理且上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，利用RID(示差折光检测器)进行检测，液相色谱方法如下：L。色谱柱：ShodexSH1011糖柱有机酸柱；柱温：50℃；
流动相：0.0275％(v/v)稀硫酸，经0.22μm滤膜过滤并除气；流速：1mL/min；检测时间：17min；进样量：20μL。
酒精对菌体得率的计算方法：产率计算公式如下：
y = p x
式中y为酒精产率，p为酒精浓度，X为细胞干重x＝0.2Z,Z为OD值。
YPD培养基的组成：葡萄糖2％，酵母提取物1％，蛋白胨2％，去离子水容，pH自然，高压灭菌(115℃，20min)。
发酵培养基的组成(g/L)：葡萄糖100，硫酸铵7.5，磷酸二氢钾3.5，七水硫酸镁0.75，酵母提取物0.2，组氨酸0.02，尿嘧啶0.02，亮氨酸0.1，去离子水定容，pH自然，高压灭菌(115℃，20min)。
实施例1：酿酒酵母基因工程菌的构建
以购自Invotrogen公司，编号为Sc04163923_s1的ino4单基因缺失菌株YOL108C为出发菌株，过表达是通过构建高表达质粒pHAC181-INO2，具体方法为将INO2基因片段(包含启动子序列以及ORF框，不包含终止密码子)，然后将这个片段克隆到高表达质粒pHAC181上，最后对正确的重组子进行DNA测序，验证序列没有发生突变，最终得到重组高表达质粒pHAC181-INO2，再通过醋酸锂法将质粒pHAC181-INO2导入ino4单基因缺失株，从而获得INO2基因高表达菌株。
实施例2：酿酒酵母酒精发酵
根据固体培养基的配制方法，提前配制好YPD平板和YPD液体培养基。
在YPD平板上划线活化本发明的酿酒酵母基因工程菌、野生型菌株BY4743BG(含G418抗性基因的BY4743)和ino4单基因缺失的酿酒酵母菌株YOL108C；ino4单基因缺失株YOL108C是在BY4743BG背景菌中利用G418抗性基因替换基因INO4获得的；(http://clones.lifetechnologies.com/cloneinfo.php？clone＝yeast)。将YPD平板放入30℃恒温培养箱培养2d。在超净台工作，从每个活化的菌株平板上取一个大的单菌落接种于30mL的YPD液体培养基中，30℃，220r/min摇床培养23h至饱和。培养23小时后，在EP管中加入50μL经过过夜培养菌株菌液，稀释20倍，测OD600值。根据测得的OD600值，计算所加种子菌液量，使得接种种子菌液后的发酵培养基的最终OD600值为0.5，并在超净台上加入计算所得的种子菌液量于100mL的发酵培养基中。
将发酵培养基放入30℃，220r/min的摇床培养，8小时后转为静置培养。
在32h和52h发酵时间点，取1000μL的菌液于1.5mL的EP管中，在12000rpm的离心机中离心4min，离心好后分别向两组1.5mL的EP管中转移600μL的上清液，一组加600μL三氯乙酸保存在4℃的冰箱中保存过夜，第二天通过液相测定酒精浓度。另一组不加三氯乙酸，置于-20℃的冰箱中保存备用。
同时，在32h和52h发酵时间点，取3组50μL发酵菌液样品，在1.5mL的EP管中稀释20倍，测定OD值，记录数据，用于计算菌体生物量。
将保存在4℃冰箱中的第一组上清液样品，室温下12000rpm离心2min，取600μL的上清液过滤，过滤液转移到液相样品瓶中，测定酒精浓度。不能马上安排测液相的样品，保存到-20℃的冰箱中。
将待测液相样品，上液相机器，拷贝测试数据，将数据做成Excel表，并作出OD、酒精产量、酒精产率图，如图1-3所示，应用本发明的酿酒酵母基因工程菌株发酵生产酒精，相比于野生型对照菌株(含有空载pHAC181的野生型菌株BY4743BG，用WT+V表示)，发酵进行到52h，生物量提高了186.6％，酒精产量提高了204.1％，酒精对菌体得率提高了5.6％。此外，本发明还发现，单独缺失INO2或INO4基因会导致酒精生产效率降低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高酒精生产效率的方法，其特征在于，所述方法是利用ino4基因缺失且过量表达INO2基因的酵母工程菌发酵生产酒精。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ino4基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述INO2基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法是在ino4单基因缺失的酿酒酵母中过表达INO2基因。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵生产是将酵母工程菌活化后转接至发酵培养基，使得接种种子菌液后发酵培养基的OD600为0.4-0.5，于28-30℃、200-220r/min培养7-8小时后转为静置培养，静置培养50-52h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵生产是将酵母工程菌活化后转接至发酵培养基，使得接种种子菌液后发酵培养基的OD600为0.5，于30℃、220r/min培养8小时后转为静置培养，继续培养52h。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有葡萄糖100g/L、硫酸铵7.5g/L、磷酸二氢钾3.5g/L、七水硫酸镁0.75g/L、酵母提取物0.2g/L、组氨酸0.02g/L、尿嘧啶0.02g/L、亮氨酸0.1g/L。
8.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌缺失了编码氨基酸序列如SEQIDNO.3的ino4基因且过表达编码氨基酸序列如SEQIDNO.4的INO2基因。
9.根据权利要求8所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌是在ino4单基因缺失的酿酒酵母中过表达INO2基因。
10.权利要求8或9所述酿酒酵母工程菌在酒精生产方面的应用。
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