CN108795786A - 通过改良酵母细胞器而提高人参皂苷产率 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过改良酵母细胞器而提高人参皂苷产率。本发明涉及在具有人参皂苷生成能力的酵母中将INO2和INO4过表达或将OPI1去除从而提高人参皂苷生成能力的重组酵母、所述酵母的制备方法及利用所述酵母生产人参皂苷的方法。

Description

通过改良酵母细胞器而提高人参皂苷产率
技术领域
本发明涉及用于提高人参皂苷产率的重组酵母及利用该酵母生产人参皂苷的方法。
背景技术
皂苷是指在广泛存在于植物界的配糖体中非糖的部分由多个环状化合物构成的物质。作为在人参或红参中作为主要生理活性成分而包含的皂苷成分的三萜皂苷(triterpene saponin)与在其他植物中发现的皂苷化学结构不同，因此为了将人参中的皂苷与其他植物皂苷相区别称之为人参皂苷(Ginsenoside)，意思是人参(Ginseng)配糖体(Glycoside)。
人参皂苷根据糖苷配基(aglycone)的结构可分为原人参二醇类(Protopanaxadiol-type，PPD类)人参皂苷、原人参三醇类(Protopanaxatriol-type，PPT类)人参皂苷及齐墩果酸类(Oleanolic acid类)人参皂苷三种。这三种类型又根据化合物结构中环的3位碳、6位碳及20位碳的位置上通过糖苷键(glycosicid bond)附着的糖部位(糖苷配基)(sugar moieties(aglycones))的位置及数量再分类。齐墩果酸类人参皂苷的基本骨架是5环状，在此具有唯一的人参皂苷Ro，其糖苷配基为齐墩果酸(oleanolicacid)。目前已经分离出了40多种以上的人参皂苷，其中大部分为PPD类人参皂苷。PPD类人参皂苷中包括Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、七叶胆苷XVII(Gypenoside XVII)、化合物O(CompoundO)、化合物Mc1(Compound Mc1)、F2、化合物Y(Compound Y)、化合物Mc(Compound Mc)、Rg3、Rh2、C-K。PPT类人参皂苷包括Re、Rg1、Rf、Rg2、Rh1等。
已知人参的代表性药理效果是通过人参皂苷显示的，迄今为止，从人参及人参加工品中分离出了约30种不同人参皂苷(Shibata,2001)，且已有报道它们具有抗糖尿活性、抗炎作用、抗老化作用、抗癌作用等不同药理作用。此外，除了人参皂苷外，已知的人参的其他生理活性成分还有酚性成分、聚乙炔、生物碱、多糖等，酚性成分为抑制老化的有效成分，已知的有10多种以上的抗氧化酚性物质，已知它们还有抑制高血压、抗癌、抗氧化、美白活性等生理活性。最近的研究结果表明具有抗应激效果，对多种应激能够非特异性地维持肉体和精神上的稳定状态(Lee等，2008)。
世界范围内以商业目的栽培人参的国家有韩国、中国、日本、美国、加拿大、欧洲等。到1980年末为止韩国人参产量占全世界的约46％，进入90年代后减少为39％左右，中国占据了50％以上，美国和加拿大的花旗参占了10％，且近年来的现状是韩国的占有率进一步在下降。最主要原因是韩国的人参虽然被认为药效上非常优异，但是在价格竞争力方面非常弱。因此，虽然韩国人参的特点和优点都非常多，但是为了迎合目前巨变的世界局势以及WTO、国家间生物产业重点投资、经济危机等现状，迫切需要为提高目前人参产品的国际竞争力而付出巨大的努力。
人参的药理学研究结果加大了对作为人参的皂苷成分的人参皂苷的关注，面临需要进行大量生产的必要性，但是通过普通的耕作方法大量生产人参的有用物质需要面临4～6年的较长栽培期、遮光栽培导致的病虫害防止上的困难、轮流耕作等问题，因此迫切需要开发出新的替代生产方法。
近来基于生命工程技术发现大量人参皂苷相关基因，利用该基因在酵母中大量生产人参皂苷的技术开发也开始广受关注。人参皂苷是在植物体内通过包括甲羟戊酸生物合成路径的类异戊二烯合成路径生物合成的(Cristensen,2008)，因此正在尝试重新设计酵母的麦角固醇生物合成路径以开发人参皂苷生产菌株的合成生物学研究。最近中国的Huang和Zhang共同研究组报告了将人参的原人参二醇达玛烯二醇-II合成酶(protopanaxadiol dammarenediol-II synthase)原人参二醇合成酶(protopanaxadiolsynthasegenes)基因与从拟南芥中获得的NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochromeP450 reductase)基因一起在酵母酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)中进行表达从而成功生产原人参二醇。他们为了扩增角鲨烯和2,3-氧化角鲨烯(2,3-oxidosqualene)的供给，将N-末端HMG基因tHMG1进行过表达，同时过表达FPP合成酶基因(ERG20)、角鲨烯合成酶基因(EFG9)、2,3-氧化角鲨烯合成酶基因(ERG1)，从而扩增原人参二醇生产所需的前体的供给。此外，与酵母密码子进行配合合成原人参二醇合成基因，进一步提高原人参二醇转化效率，最终引入尿苷二磷酸糖基转移酶(uridin diphosphate glycosyl-transferase)基因从而完成了人参皂苷生物合成路径(Dai等,2013)。日后可以期待通过进一步优化作业能够提供一种替代从植物体中提取人参皂苷生产合成酵母的复杂工艺过程的经济的生产工艺。
在此背景下，本发明人为了提高利用酵母的人参皂苷产量而不断努力研究的结果，开发出了改良人参皂苷生产酵母的细胞器的基因表达调节的重组酵母及该酵母的制备方法，发现所述重组酵母相比以往的具有人参皂苷生产能力的酵母，其作为人参皂苷生物合成中间产物的原人参二醇的产量增加，由此完成了本发明。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种人参皂苷或其前体生产用重组酵母。
本发明的另一目的在于提供制备所述重组酵母的方法。
本发明的又一目的在于提供利用上述重组酵母以高产率生产人参皂苷或其前体的方法。
技术方案
具体说明如下。本发明中公开的各个说明及实施形态也分别适用于其他说明及实施形态。即本发明中公开的多种要素的所有组合属于本发明的范围。此外，下述的具体说明并不限定本发明的范围。
为了实现本发明的上述目的，根据本发明的一方面，本发明提供一种磷脂生物合成基因的转录调节因子的表达水平相比内在表达水平发生变化的人参皂苷或其前体生产用重组酵母。
本发明的特征在于，改良酵母细胞器中具有蛋白质合成、蛋白质的二级结构形成、将蛋白质输送至负责每个功能的细胞内位置的功能的内质网(Endoplasmic reticulum,ER)，以增加内质网的空间或调节对膜组成和未折叠蛋白的应激反应等，从而提高人参皂苷或其前体的生产。
本发明为了改良酵母的内质网而调节参与磷脂生物合成的基因的表达，具体为改变调节磷脂生物合成相关基因表达的转录调节因子的表达水平。更具体为上述磷脂生物合成相关基因的转录调节因子可以是选自由INO2、INO4及OPI1组成的组中的一者以上。
本发明中，术语“INO2”和“INO4”是调节包括磷脂生物合成相关基因以负责蛋白质结构形成等多种功能的70个以上基因表达的转录调节因子，为过表达时磷脂生物合成相关基因的表达也增加，增加内质网的大小，调节细胞膜组成要素和诱导未折叠蛋白质的应激反应的蛋白质。INO2和INO4是以复合体作用的转录调节因子，但有报告称与INO4不同INO2具有决定转录调节的功能，(Influence of gene dosage and autoregulation of theregulatory genes INO2 and INO4on inositol/choline-repressible genetranscription in the yeast Saccharomyces cerevisiae.Curr Genet.1997年6月；31(6):462-8.Schwank S,Hoffmann B,Sch-uller HJ.)。
所述INO2及编码其的基因信息可以通过美国国立卫生院基因银行(GenBank)等数据库获得，例如所述INO2基因可以具有序列号1的碱基序列，但不限于此。
此外，所述INO2基因除了包括上述序列号1表示的碱基序列之外，还包括作为与所述序列具有80％以上、具体地90％以上、更具体地95％以上、进一步具体地99％以上同源性的碱基序列的、编码示出与所述转录因子基本相同或相应的效果的转录因子的基因序列，而不受限制。此外，明确的是只要是具有这种同源性的碱基序列，部分序列缺失、变型、替换或附加的碱基序列也包括在本发明的范围内。
所述INO4及编码其的基因信息可以通过美国国立卫生院基因银行(GenBank)等数据库获得，例如所述INO4基因可以具有序列号2的碱基序列，但不限于此。
此外，所述INO4基因除了包括上述序列号2表示的碱基序列之外，还包括作为与所述序列具有80％以上、具体地90％以上、更具体地95％以上、进一步具体地99％以上同源性的碱基序列的、编码示出与所述转录因子基本相同或相应的效果的转录因子的基因序列，而不受限制。此外，明确的是只要是具有这种同源性的碱基序列，部分序列缺失、变型、替换或附加的碱基序列也包括在本发明的范围内。
本发明中，术语“OPI1”是指对磷脂前体可用性的响应，是INO2-INO4转录复合体的转录抑制因子。当前体有限时，OPI1留在内质网，INO2-INO4复合体活化磷脂生物合成所需的INO1及其他基因。相反，可利用的前体丰富时，OPI1接近细胞核以抑制所述基因的转录。OPI1可以用作为了ER靶向化而直接与磷脂酸结合，在磷脂酸被用于磷脂生物合成而急剧枯竭时检测前体可用性的机制。
所述OPI1及编码其的基因信息可以通过美国国立卫生院基因银行(GenBank)等数据库获得，例如所述OPI1基因可以具有序列号3的碱基序列，但不限于此。
此外，所述OPI1基因除了包括上述序列号3表示的碱基序列之外，还包括作为与所述序列具有80％以上、具体地90％以上、更具体地95％以上、进一步具体地99％以上同源性的碱基序列的、编码示出与所述转录因子基本相同或相应的效果的转录因子的基因序列，而不受限制。此外，明确的是只要是具有这种同源性的碱基序列，部分序列缺失、变型、替换或附加的碱基序列也包括在本发明的范围内。
上述术语“同源性”是指与给定氨基酸序列或碱基序列一致的程度，可表示为百分比。在本发明中，与给定氨基酸序列或碱基序列具有相同或类似的活性的其同源性序列以“％同源性”来表示。例如，可以使用计算分数(score)、同一性(identity)及相似度(similarity)等参数(parameter)的标准软件、具体地BLAST2.0，或可以通过在定义的严格条件下通过Southern杂交实验比较序列而确定，定义的适当杂交条件在本领域的技术范围内且可以通过本领域技术人员熟知的方法(例如，J.Sambrook等,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold SpringHarbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)进行确定。
在本发明中，术语“内在表达水平”是指微生物在天然状态或相应基因的表达水平变型前的亲本菌株中表达的mRNA或蛋白质的表达水平。其本质是在菌株等的细胞及组织等中在正常状况或特定基因表达被调节之前的状况下，给定mRNA或蛋白质产生的程度。内在表达水平可以在菌株的种类、细胞类型及组织间进行比较，或可以与通过某些刺激而诱发的表达水平比较。具体地，可以是在不调节磷脂生物合成基因的转录调节因子表达的微生物中所表达的mRNA或蛋白质表达水平。
根据本发明的另一具体例，提供一种所述INO2、INO4、或INO2和INO4两者的表达水平相比内在表达水平增加或OPI1的表达水平相比内在表达水平减少的重组酵母。
本发明中，术语“表达水平相比内在表达水平增加”是指对相应的多肽进行编码的基因相比自然状态或变型前的状态表达更多，产生大量具有功能性的该多肽。
具体地，本发明中INO2及INO4的表达水平的增加可以通过如下方法实施，但不限于此：
1)增加编码所述转录因子的多核苷酸的复制数；
2)使表达调节序列变型以增加所述多核苷酸的表达；
3)使染色体上的多核苷酸序列变型以强化所述转录因子的活性；
4)上述方法的组合而强化的变型方法等。
上述1)增加多核苷酸复制数的方法不受特别限制，可以以与载体可操作地连接的形态实施，也可以***到宿主细胞内的染色体内实施。具体地，可以通过将编码本发明的酶的多核苷酸可操作地连接的载体(其可独立于宿主进行复制并起作用)引入到宿主细胞内而实施；或者可以通过将所述多核苷酸可操作地连接的载体(其可将所述多核苷酸***至宿主细胞内的染色体内)引入宿主细胞内以增加所述宿主细胞的染色体内的所述多核苷酸的复制数的方法而实施。
本发明中，术语“载体”是指含有以能够在适当的宿主内表达靶蛋白的方式编码可操作地连接到适当的调节序列的所述靶蛋白的多核苷酸的碱基序列的DNA产物。所述调节序列包括能够启动转录的启动子、用于调节这种转录的任意操纵基因序列、编码适当的mRNA核糖体结合部位的序列及调节转录和翻译终止的序列。载体转化到适当的宿主细胞内之后，可以独立于宿主基因组进行复制或起作用，可融合于基因组自身。
本发明中使用的载体只要是在宿主细胞内可复制的就不受特别限制，可以利用本领域已知的任意载体。通常使用的载体的示例为天然状态或重组状态的质粒，可以包括复制起点、启动子及终止子。所述复制起点可以包括酵母自主复制序列(autonomousreplication sequence,ARS)。所述酵母自主复制序列可以通过酵母着丝粒序列(centrometric sequence,CEN)稳定化。所述启动子可以选自由CYC启动子、TEF启动子、GPD启动子、PGK启动子及ADH启动子等组成的组。所述终止子可以选自由PGK1、CYC1及GAL1等组成的组。所述载体还可以包括选择标记。
因此，可以通过细胞内染色体***用载体将在染色体内编码靶蛋白的多核苷酸替换为变异多核苷酸。所述多核苷酸***染色体内可以通过本领域已知的任意方法，例如可以通过同源重组实现，但不限于此。
本发明中，术语“转化”是指将含有编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞内，使得在宿主细胞内表达上述多核苷酸编码的蛋白质。转化的多核苷酸只要是能够在宿主细胞内表达的，不管是***宿主细胞的染色体内还是在染色体外，均可使用。此外，所述多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。所述多核苷酸只要是能够引入到宿主细胞进行表达的，以任何形态导入均可。例如，所述多核苷酸可以以作为包括自主表达所需的所有要素的基因结构体的表达盒(expression cassette)形态引入到宿主细胞内。所述表达盒通常可以包括与所述多核苷酸可操作地连接的启动子(promoter)、转录终止信号、核糖体结合部位及翻译终止信号。所述表达盒可以是可自主复制的表达载体形态。此外，所述多核苷酸也可以是以自身的形态引入到宿主细胞，在宿主细胞中与表达所需的序列可操作地连接的多核苷酸，但不限于此。
此外，所述术语“可操作地连接”是指启动或介导编码本发明的靶蛋白的多核苷酸的转录的启动子序列与所述基因序列功能性地连接。
此外，2)使表达调节序列变型以增加多核苷酸的表达的方法不受特别限制，为了更加增强所述表达调节序列的活性，可以通过核酸序列的缺失、***、不可保留或可保留的取代或它们的组合来诱导序列的变异而实施；或用活性更强的核酸序列来代替实施。所述表达调节序列包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合部位的序列、调节转录及翻译的终止的序列等，但不限于此。
所述多核苷酸表达单元上部可以连接强的异源启动子代替原来的启动子，所述强的启动子可以举例为GPD启动子、TEF启动子、ADH启动子、CCW12、GAL启动子等，更具体地可以与作为源自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的启动子的PGK1启动子可操作地连接，从而提高编码所述酶的多核苷酸的表达率，但不限于此。
此外，3)使染色体上的多核苷酸序列变型的方法不受特别限制，为了更加增强所述多核苷酸序列的活性，可以通过核酸序列的缺失、***、不可保留或可保留的取代或它们的组合，来诱导表达调节序列的变异而实施；或用为了具有更强的活性而用改良的多核苷酸序列来代替实施。
本发明的一实施例中为了诱导INO2或INO4的过表达，制作用于将所述基因的启动子取代为作为高表达组成型启动子的PGK1启动子的PGK1启动子取代载体，将利用所述载体制作的取代盒转导至PDD酵母变异株，从而制备了INO2或INO4过表达重组酵母(实施例2)。
本发明中，术语“表达水平相比内在表达水平减少”是指编码该多肽的基因没有表达，或基因表达相比自然状态或变型前状态显示特定的减少，或者即使表达也无法生成具有功能性的该多肽。
此外，编码所述多肽的基因不仅包括完全失活的还包括其表达水平相比内在表达水平弱化或显著降低而基本没有表达的基因。因此，基因失活可以是完全失活(敲除，knockout)或者部分失活(例如，基因是显示低于内在表达水平的亚等位基因(hypomorph)或示出其所影响的活性部分减少的突变基因生成物)。
具体地，本发明中OPI1的失活可以是通过以下方法实施，但不受特别限制：
1)编码所述蛋白质的多核苷酸的部分或全部缺失；
2)使表达调节序列变型以减少所述多核苷酸的表达；
3)使染色体上的所述多核苷酸序列变型以减弱所述蛋白质的活性；或
4)这些方法的组合等。
1)使编码所述蛋白质的多核苷酸的部分或全部缺失的方法可以通过利用细胞内染色体***用载体将编码染色体内内在的靶蛋白的多核苷酸替代为部分核酸序列缺失的多核苷酸或标记基因而实施。所述“部分”根据多核苷酸的种类而不同，但是优选为1至300个，更优选为1至100个，进一步优选为1至50个。
此外，2)使表达调节序列变型以减少所述多核苷酸的表达的方法不受特别限制，为了使得所述表达调节序列的活性更加弱化，可以通过核酸序列的缺失、***、不可保留或可保留的取代或它们的组合来诱导表达调节序列上的变异而实施；或用具有更弱活性的核酸序列来替代实施。所述表达调节序列可以包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合部位的序列及调节转录和翻译终止的序列，但不限于此。
同时，3)使染色体上的所述多核苷酸序列变型的方法，为了将所述蛋白质活性更加弱化，可以通过多核苷酸序列的缺失、***、不可保留或可保留的取代或它们的组合来诱导序列上的变异而实施，或者为具有更弱的活性而替换为改良的多核苷酸序列而实施，但不限于此。
本发明一实施例中制作了用于去除OPI1的缺失盒，将其转导至PDD酵母变异株中，从而制备了去除了OPI1的重组酵母(实施例3)。
根据本发明一具体例，将利用所述重组酵母生产作为人参皂苷生物合成的中间产物的角鲨烯、2,3-氧化角鲨烯及原人参二醇的生成量与对照组比较并测量，结果确认了在INO2及INO4过表达的重组酵母和去除OPI1的重组酵母中相比对照组，上述中间产物的生成量均增加，尤其是确认了在INO2过表达的重组酵母中，生成量增加幅度最大(实施例4、表5、表6及图4)。
本发明重组酵母能够增加人参皂苷、角鲨烯及2,3-氧化角鲨烯的生成量。
本发明中，术语“人参皂苷生产用重组酵母”是指自然地具有人参皂苷生成能力的酵母或在没有人参皂苷生成能力的亲本菌株中赋予人参皂苷生成能力的酵母。
本发明中，术语“人参皂苷(ginsenoside)”是指源自人参的达玛烷(dammarane)类皂苷或其衍生物，具有与其他植物中所发现的皂苷不同的特殊化学结构。所述人参皂苷不受特别限制，可以举例为原人参二醇(protopanaxadiol，PPD)类人参皂苷、原人参三醇(protopanaxatriol，PPT)类人参皂苷等；作为其他例子，可以单独或以混合物形式使用PPD、PPT、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rs1、C-O、C-Y、C-Mc1、C-Mc、F1、F2、化合物K(compound K)、七叶胆苷XVII(Gypenoside XVII)、七叶胆苷LXXV(Gypenoside LXXV)、Rs2、PPD、Re、Rg1、Rf、F1、Rg2、PPT及Rh1等；作为另一例子，可以单独或以混合物形式使用PPD、PPT、化合物K(compound K)、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、F1、F2、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2等。具体地可以为原人参二醇类人参皂苷。
本发明中，术语“人参皂苷前体生产用重组酵母”是指自然具有人参皂苷前体生成能力的酵母或在没有人参皂苷前体生成能力的亲本菌株中赋予人参皂苷前体生成能力的酵母。
本发明中，术语“人参皂苷前体”是指人参皂苷生物合成代谢过程的中间产物。人参皂苷生物合成由于甲羟戊酸(mevalonic acid)代谢路径而生成异戊烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸，它们又变型为角鲨烯和角鲨烯氧化而成的2,3-氧化角鲨烯。通过2,3-氧化角鲨烯的环化生成达玛烯二醇-II，其可合成为各种人参皂苷。人参皂苷前体可包括所有这些中间产物。此外，还可以包括通过该前体生成的其他类型的皂苷等。进一步可以包括β-香树脂醇(β-amyrin)或齐墩果酸酯(Oleanate)。
具体地，人参皂苷前体生产用重组酵母可以生产角鲨烯或2,3-氧化角鲨烯。
根据本发明的一具体例，提供一种所述人参皂苷前体包括角鲨烯和2,3-氧化角鲨烯的重组酵母。
本发明中，术语“角鲨烯”属于一种类异戊二烯或萜类化合物，是具有6个双键的多不饱和脂肪，化学式为C30H50。角鲨烯是人参皂苷生物合成的中间产物，通过甲羟戊酸(mevalonic acid)路径生成。此外，在体内起到强力的抗氧化作用，用于类固醇激素和维生素D、胆汁酸、作为细胞膜的组成成分的胆固醇的生物合成，也可以用作新型流感等的疫苗免疫助剂。
本发明中，术语“2,3-氧化角鲨烯”不仅是包含人参皂苷的皂苷，且是作为细胞膜固醇前体的羊毛甾醇和环木菠萝烯醇的合成前体。其通过角鲨烯环氧酶氧化角鲨烯而成。
所述酵母可以是属于酵母属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issachenkia)、亚罗酵母属(Yarrowia)或汉森酵母属(Hansenula)的菌株。
属于酵母属的菌株可以是例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)、布拉酵母(S.boulardii)、博伊丁酵母(S.bulderi)、里约酵母(S.cariocanus)、卡里奥库斯酵母(S.cariocus)、薛瓦酵母(S.chevalieri)、大连糖酵母(S.dairenensis)、葡萄酒酵母(S.ellipsoideus)、真贝酵母(S.eubayanus)、少孢酵母(S.exiguus)、佛罗伦糖化酵母(S.florentinus)、克鲁费酵母(S.kluyveri)、马提尼酒糖酵母(S.martiniae)、摩纳酵母(S.monacensis)、诺地酵母(S.norbensis)、奇异酵母(S.paradoxus)、巴氏酵母(S.pastorianus)、斯潘思龙酵母(S.spencerorum)、图列茨酵母(S.turicensis)、单孢酵母(S.unisporus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)和左娜图酵母(S.zonatus)。
根据本发明一具体例，所述酵母可以是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，但不限于此。
通常，所述酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)已知为多种发酵过程中使用的酵母菌的一种，已知具有将糖分转化为乙醇的活性。
生产所述人参皂苷的酵母不受特别限制，其可以是以如下方式变型的酵母：为了强化用于作为人参皂苷生物合成必需的前体的角鲨烯的生物合成增大的甲羟戊酸(mevalonic acid)代谢途径，而将HMG-CoA转化为甲羟戊酸(mevalonic acid)的HMG-CoA还原酶(HMG-CoA reductase；tHMG1)和将角鲨烯转化为2,3-氧化角鲨烯的源自人参的角鲨烯环氧酶(Panax ginseng,squalene epoxidase；PgSE)的活性相比内在活性增加，且为了导入人参皂苷生物合成代谢路径，引入了将2,3-氧化角鲨烯转化为达玛烯二醇-Ⅱ的源自人参的达玛烯二醇-Ⅱ合成酶(Panax ginseng,dammarenediol-II synthase；PgDDS)、将达玛烯二醇-Ⅱ转化为原人参二醇的源自人参的细胞色素P450 CYP716A47(Panax ginsengcytochrome P450 CYP716A47；PgPPDS)和源自人参的NADPH-细胞色素P450还原酶(Panaxginseng NADPH-cytochrome P450 reductase；PgCPR)的活性。
根据本发明的另一具体例，所述酵母进一步为人参皂苷合成相关基因表达相比内在表达水平增加的重组酵母。
根据本发明的另一具体例，提供所述基因是选自由源自人参的达玛烯二醇-Ⅱ合成酶(Panax ginseng,dammarenediol-II synthase，PgDDS)、源自人参的细胞色素P450CYP716A47(Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A47，PgPPDS)、源自人参的NADPH-细胞色素P450还原酶(P NADPH-cytochrome P450 reductase，PgCPR)、酿酒酵母HMG-CoA还原酶(S.cerevisiae HMG-CoA reductase，tHMG1)和源自人参的角鲨烯环氧酶(Panaxginseng,squalene epoxidase，PgSE)组成的组中的一者以上基因的重组酵母。
根据本发明一实施例，人参皂苷生物合成代谢路径相关酶通过转化而被引入，甲羟戊酸(mevalonic acid)代谢路径相关酶通过作为高表达组成型启动子的GPD1(TDH3)启动子而被转录，以相比内在表达增加的水平进行表达(实施例1)。
此时，编码所述酶的基因不受特别限制，但具体可以分别包括序列号3至7记载的碱基序列或与其具有70％以上、更具体地80％以上，更具体地90％以上同源性的碱基序列。
根据本发明的另一方面，提供一种人参皂苷生成能力提高的重组酵母的制备方法，其包括改变人参皂苷生成酵母菌株中磷脂生物合成基因的转录调节因子的表达水平的步骤。
根据本发明的重组酵母的制备方法，所述磷脂生物合成基因是INO2、INO4或两者的表达水平相比内在表达水平增加的，或者OPI1的表达水平相比内在表达水平减少的基因。
所述人参皂苷生成酵母菌株、磷脂生物合成基因的转录调节因子、INO2、INO4、OPI1及内在表达水平等如前文所述。
根据本发明的另一具体例，所述人参皂苷生成酵母菌株可以是选自由源自人参的达玛烯二醇-Ⅱ合成酶(Panax ginseng,dammarenediol-II synthase，PgDDS)、源自人参的细胞色素P450 CYP716A47(Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A47，PgPPDS)、源自人参的NADPH-细胞色素P450还原酶(PNADPH-cytochrome P450 reductase，PgCPR)、酿酒酵母HMG-CoA还原酶(S.cerevisiae HMG-CoA reductase，tHMG1)和源自人参的角鲨烯环氧酶(Panax ginseng,squalene epoxidase，PgSE)组成的组中的一种以上基因的表达水平相比内在表达水平增加的菌株。
根据本发明的又一方面，提供一种人参皂苷前体生成能力提高的重组酵母的制备方法，其包括改变人参皂苷前体生成酵母菌株中磷脂生物合成基因的转录调节因子的表达水平的步骤。
根据本发明的重组酵母制备方法，所述人参皂苷前体包括角鲨烯和2,3-氧化角鲨烯。
根据本发明的重组酵母的制备方法，所述磷脂生物合成基因是INO2、INO4或两者的表达水平相比内在表达水平增加，或者OPI1的表达水平相比内在表达水平减少的基因。
所述磷脂生物合成基因的转录调节因子、INO2、INO4、OPI1及内在表达水平如前文所述。
根据本发明的再一方面，提供一种人参皂苷或其前体的生产方法，其包括培养所述重组酵母的步骤。
根据本发明的上述方法，所述培养酵母的步骤不受特别限制，可以通过公知的分批培养方法、连续培养方法、分批补料式培养方法等实施。此时，培养条件不受特别限制，可以使用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)，调节为适当的pH(例如pH5至9，具体地pH6至8，更具体地pH6.8)，可以氧或含氧气体混合物导入培养物中以维持嗜氧条件。培养温度可以维持为20至45℃，具体地25至40℃，培养约10至160小时。上述培养中生成的人参皂苷分泌到培养基中或残留在细胞内。
另外，培养所用的培养基中作为碳源可以单独使用或混合使用：糖和碳水化物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)；油脂和脂肪(例如大豆油、葵花籽油、花生油和可可豆油)；脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)；醇(例如甘油和乙醇)及有机酸(例如醋酸)等，但不限于此。作为氮源可以单独或混合使用：含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取液、肉汁、麦芽提取液、玉米浸渍液、大豆粉末和尿素)；或无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等，但不限于此。作为磷源可以单独或混合使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，与此相应的钠盐等，但不限于此。也可以包括其他金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素等生长必须促进物质。
所述方法可以进一步包括将生成的人参皂苷回收的步骤。该回收步骤可以是从培养的细胞或其上清液中回收的步骤，本领域技术人员可以选择适当的回收过程。
本发明的所述培养步骤中生成的人参皂苷回收方法可以根据培养方法，例如根据分批式、连续式或分批补料式等培养方法，利用本领域公知的适当方法，从培养液中收集目标产物。
有益效果
本发明的人参皂苷生成能力提高的重组酵母变型为，具有序列号1的碱基序列的INO2、具有序列号2的碱基序列的INO4及两者的表达水平相比内在表达水平增加，或具有序列号3的碱基序列的OPI1的表达水平相比内在表达水平减少，从而人参皂苷生成能力加强，因此可以有效地用于人参皂苷的生产。
附图说明
图1是通过作为转录调节因子的INO2、INO4和OPI1的磷脂生物合成相关基因调节以及与其相关的细胞内功能的简略示意图。
图2是人参皂苷生物合成代谢路径的示意图。
图3是作为为了过表达INO2或INO4基因而制作的载体的pUC57-URA3HA-PGK1载体地图的示意图。
图4是INO2或INO4过表达，或去除OPI1的情况下，与对照组相比角鲨烯、2,3-氧化角鲨烯和原人参二醇的生成量图谱。
具体实施方式
下面通过实施例和实验例更详细地描述本发明。但这些实施例和实验例仅用于示例性地说明本发明，本发明的范围并不由这些实施例和实验例限定。
实施例1：PPD酵母变异株的制作
本发明的酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae；S.cerevisiae)CEN.PK2-1D野生型菌株[(MATαura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3△1；MAL2-8；SUC2),EUROSCARF入藏号为30000B]，在其中引入人参皂苷生物合成代谢路径，并加强了用于增大作为人参皂苷生物合成所需的前体的角鲨烯的生物合成的甲羟戊酸(mevalonic acid)代谢路径，从而制备了能够生成原人参二醇的酵母菌株，将该酵母菌株命名为PPD酵母变异株。
PPD菌株的基因型为酿酒酵母CEN.PK2-1DΔtrp1::PGPD1tHMG1+PGPD1 PgSEΔleu2::PGPD1 PgDDS+PGPD1 PgPPDS+PGPD1 PgCPR。为了强化人参皂苷生物合成酶PgDDS(Panaxginseng,dammarenediol-II synthase,序列号4)、PgPPDS(Panax ginseng cytochromeP450 CYP716A47,序列号5)及PgCPR(Panax ginseng NADPH-cytochrome P450 reductase,序列号6)和甲羟戊酸(mevalonic acid)代谢路径，将编码代谢路径酶tHMG1(S.cerevisiaeHMG-CoA reductase,序列号7)及PgSE(Panax ginseng,squalene epoxidase,序列号8)的基因，分别从作为高表达组成型启动子的GPD1(TDH3)启动子转录而表达。
实施例2：INO2或INO4过表达酵母变异株的制作
为了确认在PPD酵母变异株中参与磷脂生物合成以增加内质网(Endoplasmicreticulum)的大小并诱导对细胞膜组成物质调节和未折叠蛋白质的应激反应的INO2或INO4的过表达是否参与所述酵母变异株的生长及PPD生成能力，制作了上述基因过表达的酵母变异株。首先，为了诱导INO2或INO4的过表达，制作用于将所述基因启动子取代为作为高表达组成型启动子的PGK1启动子的PGK1启动子取代载体，利用所述载体制作的取代盒转导至PDD酵母变异株中，从而制作了INO2或INO4过表达酵母变异株。
具体地，为了制作PGK1启动子取代载体，利用PGK1 pro F和PGK1 pro R引物组合(表1)实施聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，以使在酿酒酵母CEN.PK2-1D的基因组DNA中，作为高表达组成型启动子的PGK1启动子部位序列在5'-和3'-位置分别具有限制酶SacI和XbaI识别部位，将PCR片段扩增后，将其进行电泳获得目标片段。此时PCR反应在95℃变性30秒，在56℃退火30秒，在72℃延伸30秒，反复该过程25次。利用SacI和XbaI处理上述扩增的片段，***到用相同限制酶处理的pUC57-URA3HA载体(Ju Young Lee,Chang Duk Kang,Seung Hyun Lee,Young Kyoung Park and Kwang Myung Cho(2015)Engineering cellular redox balance in Saccharomyces cerevisiae for improvedproduction of L-lactic acid.Biotechnol.Bioeng.,112,751-758.)载体中，制作了pUC57-URA3HA-PGK1载体(图3)。
[表1]
用于制作pUC57-URA3HA-PGK1载体的引物序列及限制酶
将如上制作的pUC57-URA3HA-PGK1载体作为模板，利用作为INO2启动子部位的同源重组序列的P_INO2F和P_INO2R引物组合进行PCR，制作了将INO2启动子取代为PGK1启动子的盒(casette)。同样，利用作为INO4启动子部位的同源重组序列的P_INO4F和P_INO4 R引物组合进行PCR，制作了将INO4启动子取代为PGK1启动子的盒(casette)。此时，PCR反应在95℃变性30秒、在56℃退火30秒、在72℃延伸2分钟，该过程重复25次。
将制作的INO2启动子或INO4启动子取代用盒分别引入到所述PPD酵母变异株中。引入通过普通的热冲击转化(heat shock transformation)实施，转化后将细胞在尿嘧啶缺陷型培养基(无氨基酸的酵母氮基6.7g、CSM减去尿嘧啶(CSM minus uracil)0.77g、葡萄糖20g、1L基准)中培养，使得基因组上的INO2启动子或INO4启动子通过所述盒被取代为PGK1启动子。
其结果确认到，针对获得的酵母变异株，为了确认被取代为PGK1启动子，以上述细胞基因组为模板，利用INO2至PGK1F与INO2至PGK1R引物组合进行PCR，确认了INO2启动子取代为PGK1启动子。此外，利用INO4至PGK1F与INO4至PGK1R引物组合进行PCR，确认了INO4启动子取代为PGK1启动子。结果，制作了PPD-INO2(PINO2::PPGK1)和PPD-INO4((PINO4::PPGK1)酵母变异株。
[表2]
用于PGK1启动子取代盒制作及取代确认的引物序列
实施例3：OPI1去除酵母变异株的制作
为了确认作为在PPD酵母变异株中参与磷脂生物合成以增加内质网大小并抑制诱导细胞膜组成物质调节及未折叠蛋白质的应激反应的基因表达的因-OPI1的缺损与否参与所述酵母变异株的生长及PPD生成能力，制作了去除所述基因的酵母变异株。首先，制作了用于去除OPI1的缺失盒，将其转导至PDD酵母变异株中，从而制作了OPI1缺失酵母变异株。
具体地，为了制作OPI1缺失用盒，以pUC57-URA3HA载体为模板，利用作为OPI1同源重组序列的Del OPI1 F和Del OPI1 R引物组合(表3)进行PCR，从而获得OPI1缺失用盒。此时，PCR反应在95℃变性30秒、在56℃退火30秒、在72℃延伸1分钟，该过程重复25次。
[表3]
用于制作OPI1缺失用盒的引物序列
将上述制作的OPI1缺失用盒引入到PPD酵母变异株中。引入通过通常的热冲击转化(heat shock transformation)实施，转化后将细胞在尿嘧啶缺陷型培养基(无氨基酸的酵母氮基6.7g、CSM减去尿嘧啶(CSM minus uracil)0.77g、葡萄糖20g、1L基准)中培养，使得基因组上的OPI1 ORF取代为所述盒。为了确认所得的菌株中OPI1的去除，以所述细胞的基因组为模板，利用OPI1 F和OPI1 R引物组合(表4)进行PCR，确认了OPI1基因的去除。结果，制作了PPDΔOPI1(Δopi1)酵母变异株。
[表4]
用于确认OPI1去除的引物序列
实施例4：转化的酵母变异株的生长及PPD生成量确认
将上述制作的转化酵母变异株在含有2％葡萄糖的最小培养基(minimal URAdrop-out media)50ml中接种为OD600值为0.5，在30℃下以250rpm搅拌，在嗜氧条件下培养144小时。培养过程中利用分光光度计(spectrophotometer)测定OD600值来测定细胞生长。培养过程中细胞内代谢产物(角鲨烯、2,3-氧化角鲨烯、原人参二醇)用HPLC(高效液相色谱，High performance liquid chromatography)进行分析。
培养结果(144h)，细胞生长，即培养物的OD600值和细胞内各代谢产物浓度如下表5、表6和图所示。
[表5]
根据上述制作的转化酵母变异株的培养的代谢产物浓度
[表6]
根据上述制作的转化酵母变异株的培养的代谢产物浓度的倍数值
在表5和表6中，对照组表示PPD酵母变异株(酿酒酵母CEN.PK2-1DΔtrp1::PGPD1tHMG1+PGPD1 PgSEΔleu2::PGPD1 PgDDS+PGPD1 PgPPDS+PGPD1 PgCPR)，INO2过表达变异株表示PPD-INO2(PINO2::PPGK1)、INO4过表达变异株表示PPD-INO4(PINO4::PPGK1)、OPI1去除酵母变异株表示PPDΔOPI1(Δopi1)。表6中的值表示以对照组酵母变异菌的各代谢产物(角鲨烯、2,3-氧化角鲨烯、原人参二醇)的生成浓度为1时，所制作的各酵母变异株中生成的代谢产物的倍数值。
从上述结果可以知道，所述酵母变异株的转化对细胞生长没有太大影响。此外，观察细胞内代谢产物浓度测定结果，当INO2和INO4过表达或OPI1去除时，随着磷脂生物合成增加，通过内质网的大小变大等改良，人参皂苷生物合成代谢产物增加，可以预测其最终提高人参皂苷的生成能力。
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tcttccaacg cttccatgaa ctccgattca catctacata taagatcacc aaaaaagcag 480
cataggtata ccgaattaaa tcaaagatat cctgaaacac atccacacag taacacaggg 540
gagttaccca caaacacagc agatgtgcca actgagttca ccacgaggga aggacctcat 600
cagcctatcg gcaatgacca ctacaacccg ccaccgtttt cagtacctga gatacgaatc 660
ccagactctg atattccagc caatatcgag gacgaccctg tgaaggtacg gaaatggaaa 720
cacgttcaaa tggagaagat acgaagaata aacaccaaag aagcctttga aaggctcatt 780
aaatcagtaa ggaccccacc aaaggaaaac gggaaaagaa ttcccaagca tattctttta 840
acttgtgtaa tgaacgatat caagtccatt agaagcgcaa atgaagcact acagcacata 900
ctggatgatt cctga 915
<210> 2
<211> 456
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 2
atgacgaacg atattaagga gatacaaaca atacagccgg gattgtccga gattaaggag 60
ataaagggtg aactggctaa tgtgaagaaa aggaaacgca ggtctaagaa gattaataaa 120
ttgactgatg gtcaaatacg tataaatcat gtttcgtctg aaaaaaaaag gagagaattg 180
gaaagagcta tatttgacga actggtagca gtagtacctg acctgcaacc ccaggaaagt 240
cggtcagaac taatcatata cctgaaaagc ttgagttact taagttggtt gtatgaaagg 300
aatgaaaagc tgagaaaaca aatcatagct aagcatgagg caaaaaccgg cagcagcagc 360
agcagcgatc ccgtacaaga acaaaatgga aacattcggg atttagtacc gaaggagtta 420
atttgggagc tgggtgatgg acagagtggt cagtga 456
<210> 3
<211> 1215
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 3
atgtctgaaa atcaacgttt aggattatca gaggaagagg tagaagcggc tgaagtactt 60
ggggtgttga aacaatcatg cagacagaag tcgcagcctt cagaggacgt ctcacaagct 120
gacaaaatgc cggcaagtga gtcgtctacg acgccgctaa acattttgga tcgcgtaagt 180
aacaaaatta tcagtaacgt agtgacattc tacgatgaaa taaacaccaa caagaggcca 240
ctgaaatcaa tagggaggct gctagacgat gacgatgacg agcatgatga ttacgactac 300
aacgacgatg agttcttcac caacaagaga cagaagctgt cgcgggcgat tgccaagggg 360
aaggacaact tgaaagagta caagctgaac atgtccatcg agtctaagaa gaggcttgta 420
acgtgcttgc atcttttaaa gctggccaat aagcagcttt ccgataaaat ctcgtgttta 480
caggaccttg ttgaaaagga gcaggtgcat cctttgcaca agcaagatgg aaatgctagg 540
acgaccactg gagctggcga ggacgagaca tcgtcagacg aagacgacga cgatgaggag 600
ttttttgatg cctcagagca ggtcaacgcc agcgagcagt ctattgtggt gaaaatggag 660
gtggtcggca cagtcaagaa agtctactcg ctgatatcga agttcacagc aaattcgctg 720
ccggagcccg caagatctca ggttcgggaa agtcttctaa acttacccac aaattggttc 780
gacagcgtcc acagtacatc actgccgcat catgcttcgt ttcattatgc caactgtgaa 840
gaacaaaaag tggagcaaca gcaacagcaa cagcaacagc agcagcagca gcaacttttg 900
cagcagcaac tcctgcaaca gcaacagcaa aaaaggaaca aggatggcga cgactcagcc 960
tcgccgtcct cctccgtaac tgcgaatggg aaagtactca ttctcgccaa agaatccctg 1020
gaaatggtga gaaatgtcat gggcgtagtc gactccacgt tgggcaaggc tgaagaatgg 1080
gtgaagcaga aacaggaggt aaaagaaatg atcagggagc gtttcttgca acagcagcaa 1140
cagtacaggc agcaacagca gaaggatggc aattacgtaa agccctctca ggacaacgtg 1200
gatagcaagg actaa 1215
<210> 4
<211> 769
<212> PRT
<213> 人参
<400> 4
Met Trp Lys Gln Lys Gly Ala Gln Gly Asn Asp Pro Tyr Leu Tyr Ser
1 5 10 15
Thr Asn Asn Phe Val Gly Arg Gln Tyr Trp Glu Phe Gln Pro Asp Ala
20 25 30
Gly Thr Pro Glu Glu Arg Glu Glu Val Glu Lys Ala Arg Lys Asp Tyr
35 40 45
Val Asn Asn Lys Lys Leu His Gly Ile His Pro Cys Ser Asp Met Leu
50 55 60
Met Arg Arg Gln Leu Ile Lys Glu Ser Gly Ile Asp Leu Leu Ser Ile
65 70 75 80
Pro Pro Leu Arg Leu Asp Glu Asn Glu Gln Val Asn Tyr Asp Ala Val
85 90 95
Thr Thr Ala Val Lys Lys Ala Leu Arg Leu Asn Arg Ala Ile Gln Ala
100 105 110
His Asp Gly His Trp Pro Ala Glu Asn Ala Gly Ser Leu Leu Tyr Thr
115 120 125
Pro Pro Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Ile Ser Gly Thr Ile Asp Thr Ile
130 135 140
Leu Thr Lys Gln His Lys Lys Glu Leu Ile Arg Phe Val Tyr Asn His
145 150 155 160
Gln Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Ser Tyr Ile Glu Gly His Ser Thr
165 170 175
Met Ile Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Met Leu Arg Leu Leu Gly Glu
180 185 190
Gly Leu Ala Glu Ser Asp Asp Gly Asn Gly Ala Val Glu Arg Gly Arg
195 200 205
Lys Trp Ile Leu Asp His Gly Gly Ala Ala Gly Ile Pro Ser Trp Gly
210 215 220
Lys Thr Tyr Leu Ala Val Leu Gly Val Tyr Glu Trp Glu Gly Cys Asn
225 230 235 240
Pro Leu Pro Pro Glu Phe Trp Leu Phe Pro Ser Ser Phe Pro Phe His
245 250 255
Pro Ala Lys Met Trp Ile Tyr Cys Arg Cys Thr Tyr Met Pro Met Ser
260 265 270
Tyr Leu Tyr Gly Lys Arg Tyr His Gly Pro Ile Thr Asp Leu Val Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Gln Glu Ile Tyr Asn Ile Pro Tyr Glu Gln Ile Lys Trp
290 295 300
Asn Gln Gln Arg His Asn Cys Cys Lys Glu Asp Leu Tyr Tyr Pro His
305 310 315 320
Thr Leu Val Gln Asp Leu Val Trp Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser Glu
325 330 335
Pro Phe Leu Lys Arg Trp Pro Phe Asn Lys Leu Arg Lys Arg Gly Leu
340 345 350
Lys Arg Val Val Glu Leu Met Arg Tyr Gly Ala Thr Glu Thr Arg Phe
355 360 365
Ile Thr Thr Gly Asn Gly Glu Lys Ala Leu Gln Ile Met Ser Trp Trp
370 375 380
Ala Glu Asp Pro Asn Gly Asp Glu Phe Lys His His Leu Ala Arg Ile
385 390 395 400
Pro Asp Phe Leu Trp Ile Ala Glu Asp Gly Met Thr Val Gln Ser Phe
405 410 415
Gly Ser Gln Leu Trp Asp Cys Ile Leu Ala Thr Gln Ala Ile Ile Ala
420 425 430
Thr Asn Met Val Glu Glu Tyr Gly Asp Ser Leu Lys Lys Ala His Phe
435 440 445
Phe Ile Lys Glu Ser Gln Ile Lys Glu Asn Pro Arg Gly Asp Phe Leu
450 455 460
Lys Met Cys Arg Gln Phe Thr Lys Gly Ala Trp Thr Phe Ser Asp Gln
465 470 475 480
Asp His Gly Cys Val Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ala Leu Lys Cys
485 490 495
Leu Leu Leu Leu Ser Gln Met Pro Gln Asp Ile Val Gly Glu Lys Pro
500 505 510
Glu Val Glu Arg Leu Tyr Glu Ala Val Asn Val Leu Leu Tyr Leu Gln
515 520 525
Ser Arg Val Ser Gly Gly Phe Ala Val Trp Glu Pro Pro Val Pro Lys
530 535 540
Pro Tyr Leu Glu Met Leu Asn Pro Ser Glu Ile Phe Ala Asp Ile Val
545 550 555 560
Val Glu Arg Glu His Ile Glu Cys Thr Ala Ser Val Ile Lys Gly Leu
565 570 575
Met Ala Phe Lys Cys Leu His Pro Gly His Arg Gln Lys Glu Ile Glu
580 585 590
Asp Ser Val Ala Lys Ala Ile Arg Tyr Leu Glu Arg Asn Gln Met Pro
595 600 605
Asp Gly Ser Trp Tyr Gly Phe Trp Gly Ile Cys Phe Leu Tyr Gly Thr
610 615 620
Phe Phe Thr Leu Ser Gly Phe Ala Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Asp Asn
625 630 635 640
Ser Glu Ala Val Arg Lys Gly Val Lys Phe Phe Leu Ser Thr Gln Asn
645 650 655
Glu Glu Gly Gly Trp Gly Glu Ser Leu Glu Ser Cys Pro Ser Glu Lys
660 665 670
Phe Thr Pro Leu Lys Gly Asn Arg Thr Asn Leu Val Gln Thr Ser Trp
675 680 685
Ala Met Leu Gly Leu Met Phe Gly Gly Gln Ala Glu Arg Asp Pro Thr
690 695 700
Pro Leu His Arg Ala Ala Lys Leu Leu Ile Asn Ala Gln Met Asp Asn
705 710 715 720
Gly Asp Phe Pro Gln Gln Glu Ile Thr Gly Val Tyr Cys Lys Asn Ser
725 730 735
Met Leu His Tyr Ala Glu Tyr Arg Asn Ile Phe Pro Leu Trp Ala Leu
740 745 750
Gly Glu Tyr Arg Lys Arg Val Trp Leu Pro Lys His Gln Gln Leu Lys
755 760 765
Ile
<210> 5
<211> 482
<212> PRT
<213> 人参
<400> 5
Met Val Leu Phe Phe Ser Leu Ser Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Phe Ala Tyr Phe Ser Tyr Thr Lys Arg Ile Pro Gln Lys Glu Asn
20 25 30
Asp Ser Lys Ala Pro Leu Pro Pro Gly Gln Thr Gly Trp Pro Leu Ile
35 40 45
Gly Glu Thr Leu Asn Tyr Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Val Ser Glu
50 55 60
Asn Phe Val Lys Tyr Arg Lys Glu Lys Tyr Ser Pro Lys Val Phe Arg
65 70 75 80
Thr Ser Leu Leu Gly Glu Pro Met Ala Ile Leu Cys Gly Pro Glu Gly
85 90 95
Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Thr Glu Lys Lys Leu Val Gln Val Trp Phe
100 105 110
Pro Ser Ser Val Glu Lys Met Phe Pro Arg Ser His Gly Glu Ser Asn
115 120 125
Ala Asp Asn Phe Ser Lys Val Arg Gly Lys Met Met Phe Leu Leu Lys
130 135 140
Val Asp Gly Met Lys Lys Tyr Val Gly Leu Met Asp Arg Val Met Lys
145 150 155 160
Gln Phe Leu Glu Thr Asp Trp Asn Arg Gln Gln Gln Ile Asn Val His
165 170 175
Asn Thr Val Lys Lys Tyr Thr Val Thr Met Ser Cys Arg Val Phe Met
180 185 190
Ser Ile Asp Asp Glu Glu Gln Val Thr Arg Leu Gly Ser Ser Ile Gln
195 200 205
Asn Ile Glu Ala Gly Leu Leu Ala Val Pro Ile Asn Ile Pro Gly Thr
210 215 220
Ala Met Asn Arg Ala Ile Lys Thr Val Lys Leu Leu Thr Arg Glu Val
225 230 235 240
Glu Ala Val Ile Lys Gln Arg Lys Val Asp Leu Leu Glu Asn Lys Gln
245 250 255
Ala Ser Gln Pro Gln Asp Leu Leu Ser His Leu Leu Leu Thr Ala Asn
260 265 270
Gln Asp Gly Gln Phe Leu Ser Glu Ser Asp Ile Ala Ser His Leu Ile
275 280 285
Gly Leu Met Gln Gly Gly Tyr Thr Thr Leu Asn Gly Thr Ile Thr Phe
290 295 300
Val Leu Asn Tyr Leu Ala Glu Phe Pro Asp Val Tyr Asn Gln Val Leu
305 310 315 320
Lys Glu Gln Val Glu Ile Ala Asn Ser Lys His Pro Lys Glu Leu Leu
325 330 335
Asn Trp Glu Asp Leu Arg Lys Met Lys Tyr Ser Trp Asn Val Ala Gln
340 345 350
Glu Val Leu Arg Ile Ile Pro Pro Gly Val Gly Thr Phe Arg Glu Ala
355 360 365
Ile Thr Asp Phe Thr Tyr Ala Gly Tyr Leu Ile Pro Lys Gly Trp Lys
370 375 380
Met His Leu Ile Pro His Asp Thr His Lys Asn Pro Thr Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Pro Glu Lys Phe Asp Pro Thr Arg Phe Glu Gly Asn Gly Pro Ala
405 410 415
Pro Tyr Thr Phe Thr Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Met Cys Pro Gly
420 425 430
Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Val Ile Leu Ile Phe Met His Asn Val Val
435 440 445
Thr Asn Phe Arg Trp Glu Lys Leu Ile Pro Asn Glu Lys Ile Leu Thr
450 455 460
Asp Pro Ile Pro Arg Phe Ala His Gly Leu Pro Ile His Leu His Pro
465 470 475 480
His Asn
<210> 6
<211> 709
<212> PRT
<213> 人参
<400> 6
Met Leu Lys Val Ser Pro Phe Asp Leu Met Thr Glu Ile Leu Arg Gly
1 5 10 15
Gly Ser Ile Asp Pro Pro Asn Ser Ser Val Ser Ala Ala Gly Ala Ser
20 25 30
Met Gln Pro Ser Leu Ala Met Leu Val Val Asn Arg Glu Leu Leu Met
35 40 45
Leu Leu Thr Thr Ser Val Ala Val Leu Ile Gly Cys Val Val Val Leu
50 55 60
Val Trp Arg Lys Ser Ser Ser Gln Lys His Ala Lys Ser Phe Glu Ala
65 70 75 80
Pro Lys Leu Leu Ile Pro Lys Ile Glu Pro Glu Glu Val Val Asp Asp
85 90 95
Gly Lys Lys Lys Val Thr Ile Phe Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala
100 105 110
Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Ala Glu Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Glu
115 120 125
Lys Ala Ile Phe Lys Val Ile Asp Leu Asp Asp Tyr Ala Pro Glu Asp
130 135 140
Asp Asp Tyr Glu Thr Lys Leu Lys Lys Glu Ser Leu Ala Phe Phe Phe
145 150 155 160
Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe
165 170 175
Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Lys Glu Lys Arg Glu Trp Leu Asn Asn
180 185 190
Leu Gln Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe
195 200 205
Asn Lys Ile Ala Lys Val Val Asp Asp Gly Leu Ala Glu Gln Gly Ala
210 215 220
Lys Arg Leu Val Pro Val Gly Met Gly Asp Asp Asp Gln Cys Ile Glu
225 230 235 240
Asp Asp Phe Thr Ala Trp Arg Glu Leu Val Trp Pro Glu Leu Asp Gln
245 250 255
Leu Leu Leu Asp Glu Glu Asp Thr Ala Ala Ala Thr Pro Tyr Thr Ala
260 265 270
Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val Val Phe His Asp Arg Thr Asp Ser Ser
275 280 285
Thr Leu Leu Asn Gly Thr Thr Ser Val Ser Asn Gly His Ala Phe Tyr
290 295 300
Asp Ala Gln His Pro Cys Arg Ala Asn Val Ala Val Lys Arg Glu Leu
305 310 315 320
His Thr Leu Glu Ser Asp Arg Ser Cys Thr His Leu Glu Phe Asp Ile
325 330 335
Ser Ser Thr Gly Leu Ala Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val Tyr
340 345 350
Thr Glu Asn Leu Ile Glu Ile Val Glu Glu Ala Glu Arg Leu Leu Ala
355 360 365
Ile Ser Pro Asp Thr Tyr Phe Ser Ile His Thr Glu Lys Glu Asp Gly
370 375 380
Ser Pro Val Ser Gly Ser Ser Leu Gln Pro Pro Phe Pro Pro Cys Thr
385 390 395 400
Leu Arg Glu Ala Leu Arg Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ser Ser Pro Lys
405 410 415
Lys Ser Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro Ser Glu
420 425 430
Ala Asp Arg Leu Arg Phe Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu Tyr
435 440 445
Ala Gln Trp Ile Val Ala Asn Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val Leu Ala
450 455 460
Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Ser Val
465 470 475 480
Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg
485 490 495
Met Ala Pro Ser Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Phe Glu Arg
500 505 510
Thr Pro Ala Gly Arg Ile His Lys Gly Val Cys Ser Thr Trp Met Lys
515 520 525
Asn Ala Val Ser Leu Glu Glu Gly Asn Asp Cys Ser Arg Ala Pro Ile
530 535 540
Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Ser Arg Met Pro
545 550 555 560
Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe
565 570 575
Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Lys Glu Ala Gly Ala Glu Leu Gly Pro
580 585 590
Ala Val Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Asn Arg Lys Leu Asp Phe Ile Tyr
595 600 605
Glu Asp Glu Leu Asn Asn Phe Val Glu Ser Gly Ala Ile Ser Glu Met
610 615 620
Val Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Thr Lys Glu Tyr Val Gln His
625 630 635 640
Lys Met Ser Gln Lys Ala Ser Glu Ile Trp Asn Met Ile Ser Glu Gly
645 650 655
Ala Tyr Ile Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Arg Asp Val
660 665 670
His Arg Thr Leu His Thr Ile Ala Gln Glu Gln Gly Ala Leu Asp Ser
675 680 685
Ser Lys Ala Glu Ser Leu Val Lys Asn Leu Gln Met Thr Gly Arg Tyr
690 695 700
Leu Arg Asp Val Trp
705
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<211> 527
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 7
Met Ala Ala Asp Gln Leu Val Lys Thr Glu Val Thr Lys Lys Ser Phe
1 5 10 15
Thr Ala Pro Val Gln Lys Ala Ser Thr Pro Val Leu Thr Asn Lys Thr
20 25 30
Val Ile Ser Gly Ser Lys Val Lys Ser Leu Ser Ser Ala Gln Ser Ser
35 40 45
Ser Ser Gly Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asp Asp Ser Arg Asp Ile
50 55 60
Glu Ser Leu Asp Lys Lys Ile Arg Pro Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ser Ser Gly Asn Thr Lys Gln Leu Lys Asn Lys Glu Val Ala Ala
85 90 95
Leu Val Ile His Gly Lys Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu
100 105 110
Gly Asp Thr Thr Arg Ala Val Ala Val Arg Arg Lys Ala Leu Ser Ile
115 120 125
Leu Ala Glu Ala Pro Val Leu Ala Ser Asp Arg Leu Pro Tyr Lys Asn
130 135 140
Tyr Asp Tyr Asp Arg Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly
145 150 155 160
Tyr Met Pro Leu Pro Val Gly Val Ile Gly Pro Leu Val Ile Asp Gly
165 170 175
Thr Ser Tyr His Ile Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala
180 185 190
Ser Ala Met Arg Gly Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr
195 200 205
Thr Val Leu Thr Lys Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Phe
210 215 220
Pro Thr Leu Lys Arg Ser Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu
225 230 235 240
Glu Gly Gln Asn Ala Ile Lys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe
245 250 255
Ala Arg Leu Gln His Ile Gln Thr Cys Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe
260 265 270
Met Arg Phe Arg Thr Thr Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ile
275 280 285
Ser Lys Gly Val Glu Tyr Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly
290 295 300
Trp Glu Asp Met Glu Val Val Ser Val Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp
305 310 315 320
Lys Lys Pro Ala Ala Ile Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val
325 330 335
Val Ala Glu Ala Thr Ile Pro Gly Asp Val Val Arg Lys Val Leu Lys
340 345 350
Ser Asp Val Ser Ala Leu Val Glu Leu Asn Ile Ala Lys Asn Leu Val
355 360 365
Gly Ser Ala Met Ala Gly Ser Val Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala
370 375 380
Asn Leu Val Thr Ala Val Phe Leu Ala Leu Gly Gln Asp Pro Ala Gln
385 390 395 400
Asn Val Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr Leu Met Lys Glu Val Asp Gly
405 410 415
Asp Leu Arg Ile Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile
420 425 430
Gly Gly Gly Thr Val Leu Glu Pro Gln Gly Ala Met Leu Asp Leu Leu
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Gly Val Arg Gly Pro His Ala Thr Ala Pro Gly Thr Asn Ala Arg Gln
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Leu Ala Arg Ile Val Ala Cys Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu
465 470 475 480
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485 490 495
Asn Arg Lys Pro Ala Glu Pro Thr Lys Pro Asn Asn Leu Asp Ala Thr
500 505 510
Asp Ile Asn Arg Leu Lys Asp Gly Ser Val Thr Cys Ile Lys Ser
515 520 525
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<211> 545
<212> PRT
<213> 人参
<400> 8
Met Glu Leu Glu Arg Ser Tyr Arg Glu Asn Asp Glu Tyr Phe Leu Met
1 5 10 15
Phe Ala Ala Thr Leu Leu Phe Gly Phe Val Leu Tyr Leu Phe Thr Leu
20 25 30
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Lys Lys Gly Gly Ala Gly Ser Met
35 40 45
Glu Ile Ile Asn Gly Ala Tyr Lys Met Thr Ser Ser Ser Glu Val Asn
50 55 60
Gly His Cys Thr Pro Glu Asp Ile Ala Gly Ser Ser Asp Asp Val Ile
65 70 75 80
Ile Val Gly Ala Gly Val Ala Gly Ser Ala Leu Ala Tyr Thr Leu Ala
85 90 95
Lys Asp Gly Arg Arg Val His Val Ile Glu Arg Asp Leu Thr Glu Gln
100 105 110
Asp Arg Ile Val Gly Glu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Tyr Leu Lys Leu
115 120 125
Val Glu Leu Gly Leu Glu Asp Cys Val Asn Glu Ile Asp Ala Gln Arg
130 135 140
Val Phe Gly Tyr Ala Leu Tyr Met Asp Gly Lys Asn Thr Arg Leu Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Leu Glu Lys Phe His Ala Asp Val Ala Gly Arg Ser Phe His
165 170 175
Asn Gly Arg Phe Ile Gln Arg Met Arg Glu Lys Ala Ala Ser Leu Pro
180 185 190
Asn Val Arg Met Glu Gln Gly Thr Val Thr Ser Leu Val Glu Gln Lys
195 200 205
Gly Thr Val Lys Gly Val Arg Tyr Lys Thr Lys Asn Gly Gln Glu Met
210 215 220
Ser Ala Ala Tyr Ala Pro Leu Thr Ile Val Cys Asp Gly Cys Phe Ser
225 230 235 240
Asn Leu Arg His Ser Leu Cys Asn Pro Lys Val Asp Val Pro Ser Cys
245 250 255
Phe Val Gly Leu Ile Leu Glu Asn Ile Asp Leu Pro His Ile Asn His
260 265 270
Gly His Val Ile Leu Ala Asp Pro Ser Pro Ile Leu Phe Tyr Lys Ile
275 280 285
Ser Ser Thr Glu Ile Arg Cys Leu Val Asp Val Pro Gly Gln Lys Val
290 295 300
Pro Ser Ile Ala Asn Gly Glu Leu Ala His Tyr Leu Lys Thr Ser Val
305 310 315 320
Ala Pro Gln Ile Pro Pro Glu Leu Tyr Lys Ser Phe Ile Ala Ala Ile
325 330 335
Asp Lys Gly Lys Ile Lys Thr Met Pro Asn Arg Ser Met Pro Ala Asp
340 345 350
Pro His Ser Thr Pro Gly Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ala Phe Asn Met
355 360 365
Arg His Pro Leu Thr Gly Gly Gly Met Thr Val Ala Leu Ser Asp Ile
370 375 380
Val Leu Ile Arg Asp Leu Leu Arg Pro Leu Arg Asp Leu His Asp Ser
385 390 395 400
Ser Thr Leu Cys Lys Tyr Leu Glu Ser Phe Tyr Thr Leu Arg Lys Pro
405 410 415
Val Ala Ser Thr Ile Asn Thr Leu Ala Gly Ala Leu Tyr Lys Val Phe
420 425 430
Cys Ala Ser Pro Asp Lys Ala Arg Gln Glu Met Arg Asp Ala Cys Phe
435 440 445
Asp Tyr Leu Ser Leu Gly Gly Ile Cys Ser Glu Gly Pro Ile Ala Leu
450 455 460
Leu Ser Gly Leu Asn Pro Arg Pro Met Ser Leu Phe Phe His Phe Phe
465 470 475 480
Ala Val Ala Ile Tyr Gly Val Gly Arg Leu Leu Ile Pro Phe Pro Ser
485 490 495
Pro Arg Lys Met Trp Leu Gly Ala Arg Leu Ile Ser Gly Ala Ser Gly
500 505 510
Ile Ile Phe Pro Ile Ile Lys Ser Glu Gly Val Arg Gln Met Phe Phe
515 520 525
Pro Ala Thr Val Pro Ala Tyr Tyr Arg Ala Pro Pro Ile Thr Lys Lys
530 535 540
Met
545
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PGK pro F
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<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PGK pro R
<400> 10
gactagttct agatgtttta tatttgttgt aaaaagtaga taattacttc c 51
<210> 11
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P_INO2 F
<400> 11
catttagcag cgccagcgcc cttctaagct cttccatacc tatacgcatg aggtttcccg 60
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<210> 12
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P_INO2 R
<400> 12
ttatccagat ctaggatacc cagtaattcg ttcccagttg cttgttgcat tgttttatat 60
ttgttgtaaa aagtagataa 80
<210> 13
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P_INO4 F
<400> 13
aaaaatgaat ccgggatatt caattctagg aacctcgaac tatattgcat aggtttcccg 60
actggaaagc 70
<210> 14
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P_INO4 R
<400> 14
tcggacaatc ccggctgtat tgtttgtatc tccttaatat cgttcgtcat tgttttatat 60
ttgttgtaaa aagtagataa 80
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INO2至PGK1 F
<400> 15
gcgcccttct aagctcttcc 20
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INO2至PGK1 R
<400> 16
acccagtaat tcgttcccag ttg 23
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INO4至PGK1 F
<400> 17
ccgggatatt caattctagg aacct 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INO4至PGK1 R
<400> 18
tttcttcaca ttagccagtt caccc 25
<210> 19
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Del OPI1 F
<400> 19
ttaaagcgtg tgtatcagga cagtgttttt aacgaagata ctagtcattg ccagtcacga 60
cgttgtaaaa 70
<210> 20
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Del OPI1 R
<400> 20
tataatatta ttactggtgg taatgcatga aagacctcaa tctgtctcgg aggtttcccg 60
actggaaagc 70
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OPI1 F
<400> 21
gcgtgtgtat caggacagtg t 21
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OPI1 R
<400> 22
ctggtggtaa tgcatgaaag acctc 25

Claims (15)

1.一种人参皂苷或其前体生产用重组酵母，其中，所述重组酵母的磷脂生物合成基因的转录调节因子的表达水平相比内在表达水平发生变化。
2.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，所述磷脂生物合成基因的转录调节因子是选自由INO2、INO4及OPI1组成的组中的一者以上。
3.根据权利要求2所述的重组酵母，其中，所述INO2、所述INO4、或所述INO2和所述INO4的表达水平相比内在表达水平增加；或者OPI1的表达水平相比内在表达水平减少。
4.根据权利要求3所述的重组酵母，其中，所述INO2的基因由序列号1的碱基序列构成；INO4的基因由序列号2的碱基序列构成；OPI1的基因是由序列号3的碱基序列构成。
5.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，所述酵母选自由酿酒酵母(S.cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)、布拉酵母(S.boulardii)、博伊丁酵母(S.bulderi)、里约酵母(S.cariocanus)、卡里奥库斯酵母(S.cariocus)、薛瓦酵母(S.chevalieri)、大连糖酵母(S.dairenensis)、葡萄酒酵母(S.ellipsoideus)、真贝酵母(S.eubayanus)、少孢酵母(S.exiguus)、佛罗伦糖化酵母(S.florentinus)、克鲁费酵母(S.kluyveri)、马提尼酒糖酵母(S.martiniae)、摩纳酵母(S.monacensis)、诺地酵母(S.norbensis)、奇异酵母(S.paradoxus)、巴氏酵母(S.pastorianus)、斯潘思龙酵母(S.spencerorum)、图列茨酵母(S.turicensis)、单孢酵母(S.unisporus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)和左娜图酵母(S.zonatus)组成的组中。
6.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，所述酵母进一步为参与人参皂苷合成的基因的表达相比内在表达水平增加的酵母。
7.根据权利要求6所述的重组酵母，其中，所述基因选自由源自人参的达玛烯二醇-Ⅱ合成酶(Panax ginseng,dammarenediol-II synthase，PgDDS)、源自人参的细胞色素P450CYP716A47(Panax ginseng cytochrome P450CYP716A47，PgPPDS)、源自人参的NADPH-细胞色素P450还原酶(P NADPH-cytochrome P450reductase，PgCPR)、酿酒酵母HMG-CoA还原酶(S.cerevisiae HMG-CoA reductase，tHMG1)和源自人参的角鲨烯环氧酶(Panaxginseng,squalene epoxidase，PgSE)组成的组中的一种以上基因。
8.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，所述前体是角鲨烯或2,3-氧化角鲨烯。
9.一种人参皂苷生成能力提高的重组酵母的制备方法，所述方法包括如下步骤：将人参皂苷生产酵母菌株中磷脂生物合成基因的转录调节因子的表达水平进行改变。
10.根据权利要求9所述的重组酵母的制备方法，其中，作为所述磷脂生物合成基因，INO2、INO4、或INO2和INO4的表达水平相比内在表达水平增加；或者OPI1的表达水平相比内在表达水平减少。
11.根据权利要求9所述的重组酵母的制备方法，其中，所述人参皂苷生产酵母菌株是选自由源自人参的达玛烯二醇-Ⅱ合成酶(Panax ginseng,dammarenediol-II synthase，PgDDS)、源自人参的细胞色素P450CYP716A47(Panax ginseng cytochromeP450CYP716A47，PgPPDS)、源自人参的NADPH-细胞色素P450还原酶(P NADPH-cytochromeP450reductase，PgCPR)、酿酒酵母HMG-CoA还原酶(S.cerevisiae HMG-CoAreductase，tHMG1)和源自人参的角鲨烯环氧酶(Panax ginseng,squalene epoxidase，PgSE)组成的组中的一种以上基因的表达水平相比内在表达水平增大的人参皂苷生产酵母菌株。
12.一种人参皂苷前体生成能力提高的重组酵母的制备方法，所述方法包括如下步骤：将人参皂苷前体生产酵母菌株中磷脂生物合成基因的转录调节因子的表达水平进行改变。
13.根据权利要求12所述的重组酵母的制备方法，其中，所述人参皂苷前体包括角鲨烯和2,3-氧化角鲨烯。
14.根据权利要求12所述的重组酵母的制备方法，其中，作为所述磷脂生物合成基因，INO2、INO4、或INO2和INO4的表达水平相比内在表达水平增加；或者OPI1的表达水平相比内在表达水平减少。
15.一种生产人参皂苷或其前体的方法，包括培养根据权利要求1至8中任一项所述的重组酵母的步骤。
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