CN105177034A - 一种基因工程菌及其在利用甘油生产2,3-丁二醇中的应用 - Google Patents

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杨套伟
胡桂元
刘梅
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李磊
周昌洋
张显
徐美娟
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Abstract

本发明从Bacillus？subtilis？CTCC？M2009200中克隆出参与2,3-丁二醇合成途径中辅酶循环再生的关键酶基因甘油脱氢酶(gdh)和乙偶姻还原酶(acr)以及调控2,3-丁二醇支路关键酶酶活的调控因子aslR，并将该基因与穿梭表达质粒pMA5-HpaII连接，成功构建了携带基因gdh,acr和aslR基因的穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR，并转入Bacillus？subtilis？CTCC？M2009200中，获得加强gdh,acr和alsR基因表达的重组枯草芽孢杆菌(命名为GAR)。对原始菌以及重组菌GAR进行利用甘油发酵生产2,3-丁二醇实验，结果表明，与原始菌株相比，重组菌2,3-丁二醇产量提高了17.2％，副产物如乙偶姻、乳酸和丁二酸的积累分别降低69.2％、45.2％和47.4％，且发酵周期有所缩短。通过补料流加甘油，发酵48h，发酵液中2,3-丁二醇积累量达到102.6g/L，这是现有技术所不能达到的结果。

Description

一种基因工程菌及其在利用甘油生产2,3-丁二醇中的应用
技术领域
一种基因工程菌及其在利用甘油发酵生产2,3-丁二醇中的应用，属于生物工程中基因工程和发酵技术领域。
背景技术
随着能源资源的日益短缺和环境问题的日益严重，开发可再生的生物质资源为原料，经过化学、生物及其集成方法生产各种化学品、功能材料和能源物质的生物炼制技术越来越受到国内外的高度重视。生物柴油作为一种极具发展前景的生物资源，以其具有环保和可再生性受到世界各国的关注，该产业在全球范围内迅速发展。但其经济性仍然不能与传统的化石能源相抗衡。其原因主要有两方面：一方面是原料油脂价格较高；另一方面就是副产物甘油没有得到很好的综合利用。在生物柴油的生产过程中可得到约10％的副产物甘油，在原料端成本无法有效控制的前提下，如何对副产物粗甘油进行深度开发，已成为生物柴油产业可持续发展的关键和保障，同时也是无法回避的关键问题。如果能够利用生物柴油副产物甘油开发高附加值产品(如1,3-丙二醇、乙二醇、2,3-丁二醇等)，就能有效地降低生物柴油生产成本、提高资源利用率、延伸产业链，是建立高效、经济的生物质能源综合利用产业的重要措施，将大大提升生物柴油产业的整体技术水平和循环效益。
2,3-丁二醇是重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航天等领域。2,3-丁二醇脱氢生成双乙酰，是一种高价值食品风味剂，具有一定的抑菌效果；在脱氢酶的作用下，生成的3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)是一种应用广泛的天然食用香料；脱水生成的甲乙酮可作为一种高价值的液体燃料添加剂，亦是重要的低沸点溶剂，应用于涂料、粘结剂、润滑剂、燃料、油墨等行业；脱水生成的1,3-丁二烯可用于合成橡胶、ABS树脂及SBS弹性体等；酯化产品是合成聚酯和聚氨酯的前体。而且2,3-丁二醇是一种极具价值的液体燃料，其燃烧值与甲醇(22.1kJ/g)、乙醇(29.0kJ/g)相当。另外，2,3-丁二醇及其衍生物亦可广泛用于药用载体、增塑剂、柔软剂等的生产。
近年来用糖质原料发酵生产2,3-丁二醇取得了较好的实验室研究结果，但生物法生产2,3-丁二醇尚未实现工业化。然而从2,3-丁二醇的应用前景、生产技术成熟度、知识产权状况及未来发展趋势看，开发以廉价的非粮糖质为原料(如生物柴油副产物粗甘油)发酵生产2,3-丁二醇具有很好的发展前景。目前报道的2,3-丁二醇生产菌株多为克雷伯氏菌属(Klebsiella)肠杆菌属(Enterobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)等，但这些菌大都是用糖质原料发酵生产2,3-丁二醇，而在国内利用粗甘油为原料生产2,3-丁二醇还未见报道；另外，这些菌种具有潜在致病性，不符合符合工业化安全生产的要求。因此，使用安全菌种利用甘油发酵2,3-丁二醇具有良好的工业化前景。申请人前期公开了一种利用一株安全菌株BacillussubtilisCTCCM2009200发酵生物柴油副产物粗甘油生产2,3-丁二醇的方法(ZL201210360637.2)，为生物柴油副产物粗甘油进行工业化深度开发提供了基础。但是，该菌株发酵效率较低，不适合工业化生产要求，本发明基于此，对该菌株进行基因工程改造，提高其利用甘油合成2,3-丁二醇的效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因工程改造BacillussubtilisCTCCM2009200的方法，提高其利用甘油发酵生产2,3-丁二醇的效率。
本发明所使用菌种为BacillussubtilisCTCCM2009200(已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CTCCM2009200，相关信息已在专利ZL201210360637.2中公开)。本发明首先从BacillussubtilisCTCCM2009200中克隆出参与2,3-丁二醇合成途径中辅酶循环再生的关键酶基因甘油脱氢酶(gdh)和乙偶姻还原酶(acr)以及调控2,3-丁二醇支路关键酶酶活的调控因子aslR，并将该基因与穿梭表达质粒pMA5-HpaII连接，成功构建了携带基因gdh,acr和aslR基因的穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR，并转入BacillussubtilisCTCCM2009200中，获得加强gdh,acr和alsR基因表达的重组枯草芽孢杆菌(命名为GAR)。并对原始菌及重组菌GAR利用甘油合成2,3-丁二醇发酵性能检测，说明加强gdh,acr和alsR基因的表达能够提高2,3-丁二醇产量，降低副产物如3-羟基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的积累。
基于以上研究，对原始菌以及重组菌GAR进行利用甘油发酵生产2,3-丁二醇实验，结果表明，与原始菌株相比，重组菌2,3-丁二醇产量提高了17.2％，副产物如乙偶姻、乳酸和丁二酸的积累分别降低69.2％、45.2％和47.4％，且发酵周期有所缩短。为了进一步提高重组菌的发酵性能，我们采用补料流加，发酵48h，发酵液中2,3-丁二醇积累量达到102.6g/L，这是现有技术所不能达到的结果。
本发明的有益效果：
本发明人所用菌株是一株安全菌株B.subtilis，通过加强辅酶循环再生速率提高B.subtilis合成2,3-丁二醇效率，并减少发酵过程中副产物如3-羟基-2-丁酮、乙酸、乳酸和丁二酸等的积累，这有利于提高生产效率，降低生产成本。
具体实施方式
实施例1：目的基因的扩增及重组枯草芽孢杆菌的构建
(1)质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh构建具体过程如下：
首先，以B.subtilis菌株的染色体DNA为模板，利用引物P1和P2，通过PCR技术扩增得到一段901bp大小的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的acr基因，将纯化后的acr基因经限制性内切酶NdeI和BamHI消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒pMA5-HapII连接(pMA5-HapII质粒相关信息已在申请人前期申请的专利中公开，申请号：201310342415.2)，构建重组质粒pMA5-HapII-acr，经双酶切验证后，表明该重组质粒构建成功。随后，利用引物P3和P4通过PCR扩增得到核苷酸序列为SEQIDNO：2所示的基因gdh，将纯化后的acr基因经限制性内切酶BamHI和MluI消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒pMA5-HapII连接，构建另一个重组载体pMA5-HapII-gdh；然后以重组载体pMA5-HapII-gdh为模板，利用引物P4和P5通过PCR技术扩增出带有启动子HapII的基因片段HapII-gdh；最后，将该基因片段通过限制性内切酶MluI处理后，与同样经过MluI处理和去磷酸化处理的载体pMA5-HapII-acr在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜连接，将连接液转化至大肠杆菌感受态E.coliJM109中，挑取阳性转化子，提取转化子中的质粒，经酶切验证并确认重组质粒pMA5-HapII-acr-HapII-gdh构建成功。
以B.amyloliquefaciens基因组总DNA为模板，PCR扩增引物设计如下：
(2)质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR构建具体过程如下：
首先，以B.subtilis菌株的染色体DNA为模板，利用引物P6/P7和P8/P9引物对，通过PCR技术分别扩增得到PbdhA启动子片段(专利申请公布号CN102876703A)和核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的alsR基因；接着，将纯化后的PbdhA片段经限制性内切酶EcoRI和EcoRV消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh连接，构建重组质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA；随后将纯化的alsR基因与质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA，构建重组质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR，经双酶切验证后，表明该重组质粒构建成功。将重组质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR以电击转化的方法转化至B.subtilis，挑取阳性转化子，即得到重组枯草芽孢杆菌GAR。
实施例2：菌原始菌及重组菌的发酵性能验证
(1)种子培养
从活化平板上挑取单菌落接种于种子培养基中，种子培养温度37℃，摇床转速160r/min，培养时间为12h左右，种子培养基组成：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L。
(2)发酵培养
初始发酵培养体积为2.5L，采用的发酵培养基成分如下：
发酵培养基成分：甘油80g/L，甜菜糖蜜15g/L(或蔗糖10g/L),玉米浆5g/L，尿素3g/L，柠檬酸钠6g/L，K2HPO44g/L，MgSO40.2g/L；将上述发酵培养基用5mol/L的NaOH调节其pH至6.5，在121℃下高温灭菌30min。
发酵发酵条件：将上述培养好的种子液按4％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度37℃，空气流量为120m3/h·m3培养基，搅拌转速为350r/min。定时取样测定细胞浓度、底物残留量和3-羟基-2-丁酮产量。发酵结束后，发酵液中产物2,3-丁二醇和乙偶姻用气相色谱测定(GC-1690J气相色谱仪，杭州科晓化工仪器公司)。色谱条件如下：毛细管柱，30m×0.32mm色谱柱中固定液为AT.SE-30，，检测器为FID，柱温150℃，汽化室与检测器的温度均为250℃，载气为N2，流速0.1Mpa，进样量2μL，采用外标法定量。利用液相色谱分析发酵液中有机酸含量。色谱条件:色谱柱为KC-811，流动相A为4mM高氯酸，流动相B为超纯水，流动相梯度为0～7.5min25％～75％A，7.51～15min75％A，流动相流速为1.0mL/min，紫外检测波长为210nm，进样量为20μl，柱温为60℃。结果发现，与原始菌株相比，重组菌2,3-丁二醇产量提高了17.2％，副产物如乙偶姻、乳酸和丁二酸的积累分别降低69.2％、45.2％和47.4％，且发酵周期有所缩短。
(3)补料流加发酵培养
种子培养基发酵培养条件和实施例3(1)和3(2)相同，当发酵液中甘油残留浓度低于15g/L，通过补料泵一次性补加30-40g/L左右的甘油，当甘油糖消耗速率低于3g/L·h时停止补料，当残留在发酵液中的甘油被消耗完时结束发酵。通过补料流加发酵，2,3-丁二醇产量达到102.6g/L。
序列表

Claims (3)

1.一种重组质粒，其特征在于：将SEQIDNO：1所示的乙偶姻还原酶基因acr，SEQIDNO：2所示的甘油脱羧酶基因gdh和SEQIDNO：3所示的alsR调控子基因共同克隆到穿梭载体pMA5-HpaII-PbdhA构建成为重组穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR
2.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：将权利要求1所述重组质粒转化至保藏编号为CTCCM2009200的枯草芽孢杆菌中,获得重组枯草芽孢杆菌。
3.一种应用于2,3-丁二醇合成的菌株，其特征在于：权利要求2所述的菌株。
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