CN107400714A - 结直肠癌用药相关基因检测的多重pcr引物组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结直肠癌用药相关基因检测的多重PCR引物组，引物组包括上游引物组和下游引物组，其中，上游引物的5’端序列与测序引物的部分序列互补，上游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列；下游引物的5’端序列与测序引物的部分序列互补，下游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列，下游引物的中间位置序列为分子标签序列。还公开了含有多重PCR引物组的检测试剂盒以及结直肠癌用药相关基因的检测方法，采用本发明的试剂盒和检测方法能同时检测治疗结直肠癌的靶向药物相关8个基因外显子区域和化疗药物相关23个多态性位点的突变，可以直接用于辅助临床结直肠癌用药，以及用于癌症早期诊断、辅助诊断及筛查或癌症愈后监测。
Description
技术领域
本发明涉及二水石膏制备技术领域，尤其是一种结直肠癌个体化用药相关基因检测的多重PCR引物组、试剂盒以及检测方法。
背景技术
结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)为结肠癌和直肠癌的总称，指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的癌变，是全世界第三大常见恶性肿瘤，其死亡率较高。目前癌症治疗除了手术切除、放射疗法等方式外，还有化学药物治疗和针对癌细胞进行攻击的靶向药物治疗。靶向药物治疗是利用癌细胞中独特的结构或分子，以专一性的药物攻击这些特殊结构进而杀死癌细胞。最重要的是，标靶药物较不会攻击正常细胞，对正常细胞伤害较小，可减少许多副作用(如白血球、血小板降低、贫血、呕吐、掉头发等现象)，也可抑制癌细胞增长、转移与抗药性的恶性转化能力。靶向药物治疗也是近年来癌症治疗的新趋势，也是医学界最热门的研究重点，许多以此为目标的临床试验研究正持续进行中。
目前，美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于结直肠癌治疗的靶向药物有：西妥昔单抗、贝伐单抗、贝伐单抗、瑞戈非尼、雷莫芦单抗和阿柏西普。与上述药物药效相关的基因共8个，包括：KRAS、NRAS、BRAF、EGFR、PIK3CA、MET、HER2、PTEN。同时，目前临床上使用的化疗药物包括：顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、依托泊苷、吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、环磷酰胺、Methotrexate/甲氨蝶呤、伊立替康、培美曲塞、多柔比星、表柔比星、他莫昔芬、来曲唑、替莫唑胺，与上述药物药效相关的多态性位点共23个，包括：rs1042522、rs11615、rs12132152、rs13181、rs1695、rs1799782、rs1799983、rs1801131、rs1801133、rs2032582、rs2070744、rs2297595、rs25487、rs3212986、rs34743033、rs3918290、rs4148323、rs8175347、BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、D17S250。
高通量测序技术(high throughput sequencing)又称下一代测序(nextgeneration sequencing,NGS)或大规模并行测序(massively parallel sequencing,MPS)，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，大大提高了测序的通量。同时，随着生物信息学的快速发展，高通量测序数据的分析已经实现了高度自动化。基于此，市场上涌现出越来越多的基于高通量测序的基因检测方法，包括遗传性乳腺癌BRCA1/2检测。
人单倍体基因组大小为30亿碱基对左右，数据量庞大。因此，综合考虑研究目的和经济效益，一般需要在高通量测序之前先进行感兴趣的目标序列富集。目前常用的序列富集方法包括芯片杂交捕获和多重PCR扩增，核心技术主要掌握在国外大生物科技公司手上，如Roche、Agilent、Life Technologies等。其中，杂交捕获的特点是能够对外显子组甚至更大的目标区域进行捕获，但操作流程较复杂，需要依赖专门仪器设备；多重PCR操作简单灵活，只需要PCR仪即可进行，能在几个小时内完成目标序列富集和文库构建，适用于相对较小的目标序列富集。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可用于指导结直肠癌个体化用药的8个基因外显子区域突变和23个多态性位点检测的多重PCR引物组，通过该引物组能准确快速地扩增出8个基因外显子区域和23个多态性位点相关序列，以便检测8个基因外显子区域的突变和23个多态性位点，用以指导结直肠癌患者的个体化用药(靶向药物治疗)，提高治疗效果。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种结直肠癌用药相关基因检测的多重PCR引物组，所述引物组包括上游引物组和下游引物组，其中，所述上游引物的5’端序列与测序引物的部分序列互补，所述上游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列；所述下游引物的5’端序列与测序引物的部分序列互补，所述下游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列，所述下游引物的中间位置序列为分子标签序列；所述多重PCR引物组用于对待测样品中多个目标区域的核苷酸序列进行扩增；所述引物组用于扩增的目标区域包括8个靶向药物相关基因外显子区域和23个化疗药物多态性位点周围序列，其中，所述8个靶向药物相关基因为：KRAS、NRAS、BRAF、EGFR、PIK3CA、MET、HER2和PTEN；所述23个化疗药物多态性位点为：rs1042522、rs11615、rs12132152、rs13181、rs1695、rs1799782、rs1799983、rs1801131、rs1801133、rs2032582、rs2070744、rs2297595、rs25487、rs3212986、rs34743033、rs3918290、rs4148323、rs8175347、BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346和D17S250。
应当说明的是，周围序列是指多态性位点前后各100bp左右的序列；测序引物指Illuminate测序仪测序文库构建的接头引物，所述接头引物为SEQ ID NO:432和SEQ IDNO:433所示的核苷酸序列；而下游引物的5’端还与SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列互补。
优选地，所述上游引物组为SEQ ID NO:216～SEQ ID NO:430所示的核苷酸序列。应当说明的是，SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列作为通用的下游引物(URS)，其本身为Illuminate测序仪接头引物的一部分，能特异性结合到第一轮PCR扩增的产物下游。
优选地，所述下游引物组为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:215所示的核苷酸序列。应当说明的是，本发明的多重PCR引物组包括但不限于SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列，还包括与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列一致性达到90％、91％、92％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸序列，只要引物能将目标区域的核苷酸序列扩增出来，均落在本发明的保护范围之内；引物组中的“n”为A、C、G、T中的任意一种碱基。
优选地，所述引物组还包括SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列和用于Illuminate测序仪测序文库构建的接头引物(即SEQ ID NO:432～SEQ ID NO:433所示的核苷酸序列)。
优选地，所述分子标签序列为一段随机的8～10个核苷酸序列。分子标签序列(即barcode)可用于准确统计原始模板的分子量。
作为本发明的另一个方面，本发明还提供了结直肠癌用药相关基因的检测试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物组。
优选地，所述上游引物组包括F1-无分子标签引物池和F2-无分子标签引物池；所述下游引物组包括R1-分子标签引物池和R2-分子标签引物池；
其中，所述R1-分子标签引物池包含SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:118所示的核苷酸序列；所述R2-分子标签引物池包含SEQ ID NO:119～SEQ ID NO:215所示的核苷酸序列；所述F1-无分子标签引物池包含SEQ ID NO:216～SEQ ID NO:333所示的核苷酸序列；所述F2-无分子标签引物池包含SEQ ID NO:334～SEQ ID NO:430所示的核苷酸序列。
应当说明的是，8个靶向药物相关基因外显子区域和23个化疗药物多态性位点周围序列总长一共约36.7kb,而Illuminate测序仪测序读长为150bp，为此，我们设计了430条引物以覆盖全部目标序列；由于部分基因的最长编码外显子长达几K，单对引物无法扩增该长度的区域，且测序读长达不到该长度，所以需要将长度过大的外显子进行划分(将扩增区域部分重复的引物划分到不同的引物池)，把引物组分成上下游各2个引物池，在多个PCR反应体系进行目标区域核苷酸序列的富集和扩增；本试剂盒使用特殊的引物设计算法，能保证每一对引物的扩增效率，且显著降低引物间的相互作用，只需要把上(下)游引物组分成2个引物池，在2个PCR反应体系中富集和扩增全部目标区域的核苷酸序列。
更优选地，所述试剂盒还包括：通用的下游引物(URS，即SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列)、用于Illuminate测序仪测序文库构建的接头引物(即SEQ ID NO:432～SEQ IDNO:433所示的核苷酸序列)、PCR Buffer和KOD酶。
作为本发明的第三个方面，本发明还提供了一种结直肠癌用药相关基因的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)采用上述R1-分子标签引物池、R2-分子标签引物池对待检测样品基因分别进行PCR扩增，获得第一轮PCR产物；
(2)将步骤(1)获得的第一轮PCR产物分别用上述F1-无分子标签引物池和SEQ IDNO:431所示的核苷酸序列，F2-无分子标签引物池和SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列进行第二轮PCR扩增；
(3)对第二轮PCR产物进行测序分析，以获得样品基因的突变和位点多态性信息。应当说明的是，检测突变的类型包括：一个或多个碱基的置换、***和/或缺失。
由此，第一轮PCR只使用下游引物组，对目标区域的原始核苷酸序列进行富集，最终第一轮PCR扩增产物均带有分子标签；第二轮PCR使用上游引物组和SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列，以第一轮PCR扩增产物为模板，进一步富集和扩增目标区域的核苷酸序列。
优选地，所述步骤(3)中的测序分析包括如下步骤：
(31)将步骤(2)获得的第二轮PCR产物混合后用磁珠纯化，再使用用于Illuminate测序仪测序文库构建的接头引物(即SEQ ID NO:432和SEQ ID NO:433所示的核苷酸序列)进行第三轮PCR扩增；
(32)将步骤(31)所构建的测序文库经检测合格后，采用Illumina第二代测序仪进行测序分析。
应当说明的是，检测合格是指测序文库的浓度大于0.5ng/μL；文库中的核酸片段中80～90％分布在200～400bp以内；进行检测的仪器可以是Qubit荧光定量仪和Agilent2100bioanalyzer；
与现有的多重PCR不同，本申请中第一轮PCR仅采取了一轮PCR,最终第一轮PCR扩增产物均带有分子标签；该检测方法中引物使用特殊的设计算法(参见实施例1)，能保证每一对引物的扩增效率和特异性，且显著降低引物间的相互作用，只需要把上(下)游引物组分成2个引物池，在2个PCR反应体系中富集和扩增全部目标区域的核苷酸序列，就可以实现对目标序列富集的高度特异性；同时，该检测方法中的测序文库构建方法更简化，快速，样本起始量也显著降低，只需要20ng DNA即可。
综上所述，本发明的有益效果为：
(1)采用本发明的多重PCR引物组和检测方法富集获得的目标区域序列具有高度特异性；
(2)本发明对目标区域序列的富集效果达到了100％覆盖度，并且目标区域平均测序深度达1万倍以上；
(3)本发明的检测方法仅需在2个PCR反应体系进行，一方面减少了实验操作步骤，同时也将样本起始量降低到了20ng；
(4)采用本发明的试剂盒和检测方法能同时检测治疗结直肠癌的靶向药物相关8个基因外显子区域和化疗药物相关23个多态性位点的突变，可以直接用于辅助临床结直肠癌用药，以及用于癌症早期诊断、辅助诊断及筛查或癌症愈后监测。
附图说明
图1为本发明实施例2中正常人血液样本文库2100结果；
图2为本发明实施例2中MCF10A细胞系样本文库2100结果；
图3为本发明实施例2中结直肠癌FFPE样本文库2100结果；
图4为本发明中多重PCR序列富集方法的原理示意图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1结直肠癌个体化用药基因突变检测的多重PCR引物设计及合成
使用专利申请名称为一种扩增BRCA1/2基因的多重PCR引物及其设计方法(申请号为201610737156.7)的引物设计软件进行引物设计，输入为需要进行引物设计的基因组区域(bed文件格式，每行内容为“染色体-制表符-起始坐标-制表符-终止坐标”)，输出为设计好可在一个反应中进行扩增的多对引物。其具体实现思路如下：1)使用Primer3软件，针对每个目标区域设计出尽可能多的可用引物作为备选；2)根据引物扩增的特异性、引物是否包含简单重复序列、引物上是否存在高频的SNP位点(定义为dbSNP中较小等位基因频率在千分之五以上的位点)等条件对步骤1中设计好的引物进行过滤；3)对于满足上一步过滤条件的引物，每个目标区域挑选Primer3分值最高的一对引物，不同目标区域挑选的引物之间要满足“引物间相互作用最小化”的原则，即最小化引物3’末端及引物整体互补率。具体要求一般为引物-引物之间3’末端碱基互补数不高于10，引物-引物之间整体互补率不高于75％，该原则可有效避免引物二聚体的形成。
本试剂盒的目标区域为结直肠癌靶向药物8个相关基因的编码外显子和外显子-内含子边界10碱基，以及化疗药物相关23个多态性位点。因为部分基因的最长编码外显子长达几K，单对引物无法扩增该长度的区域，且测序读长达不到该长度，所以需要将长度过大的外显子进行划分，分到两个PCR反应体系中进行。最终的结直肠癌个体化用药基因突变检测多重PCR引物设计概况如表1所示。
表1结直肠癌个体化用药基因突变检测多重PCR引物设计概况
实施例2不同类型样本文库构建和突变检测
一、实验材料
本试验涉及的样本分别有：正常人血液的基因组DNA、MCF10A细胞系基因组DNA、结直肠癌FFPE基因组DNA，采用DNA提取试剂盒提取各类型样本的基因组DNA。
基因组DNA提取：使用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit，参照试剂盒说明书进行基因组DNA的提取。获得的基因组DNA进行凝胶电泳和使用NanoDrop100进行质量检测，要求基因组DNA没有明显的降解，浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0，并使用Qubit 3.0进行精确定量。
结直肠癌用药相关基因的检测试剂盒，包括实施例1中的引物组、通用的下游引物(URS)、用于Illuminate测序仪测序文库构建的接头引物(即SEQ ID NO:432～SEQ ID NO:433所示的核苷酸序列)、PCR Buffer和KOD酶；
引物组分为四个引物池：R1-分子标签引物池、R2-分子标签引物池、F1-无分子标签引物池和F2-无分子标签引物池；四个引物池分别配制为四个引物池混合液；
其中，R1-分子标签引物池包含SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:118所示的核苷酸序列；R2-分子标签引物池包含SEQ ID NO:119～SEQ ID NO:215所示的核苷酸序列；F1-无分子标签引物池包含SEQ ID NO:216～SEQ ID NO:333所示的核苷酸序列；F2-无分子标签引物池包含SEQ ID NO:334～SEQ ID NO:430所示的核苷酸序列。
所有引物纯度应达到电泳级(PAGE)级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果，证明使用PAGE纯化后应有明显单峰PAGE图谱。
所有试剂购买自正规厂家：KOD(TOYOBO)、2×PCR Buffer(TOYOBO)、VAHTS DNAAdapters set1/set2for Illumina(诺唯赞)、VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)、dsDNA HS Assay Kit(life technologies)、Agilent DNA 1000Kit(Agilent)等。
二、主要仪器
Illumina Nextseq 500测序仪、Agilent 2100bioanalyzer、Qubit荧光定量仪、PCR仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、移液器。
三、多重PCR扩增，文库构建和NGS测序
(1).第一轮多重PCR扩增
1.引物加入灭菌纯化水溶解，终浓度为400nM。SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:118等物质的量混合，配制成扩增引物混合液R1-barcode，所述的SEQ ID NO:119～SEQ ID NO:215等物质的量混合，配制成扩增引物混合液R2-barcode。SEQ ID NO:216～SEQ ID NO:333等物质的量混合，配制成扩增引物混合液F1-non barcode，所述的SEQ ID NO:334～SEQ IDNO:430等物质的量混合，配制成扩增引物混合液F2-non barcode。引物混合液的终浓度均为50nM。
2.将同一待测样本分成A、B两管进行反应。扩增体系为：
PCR扩增程序为：
| 温度 | 时间 |
| 98℃ | 2min |
| 58℃ | 15min |
| 68℃ | 15min |
3.使用磁珠对PCR扩增产物进行纯化和片段筛选。
(2).第二轮PCR扩增
1.将经纯化的第一轮PCR扩增产物作为DNA模板，分别用扩增引物混合液F1-nonbarcode、F2-non barcode，进行第二轮PCR扩增反应。扩增体系为：
PCR扩增程序为：
2.同一样本的PCR扩增产物等物质的量混合后，使用磁珠对其进行纯化和片段筛选。
(3).文库构建
1.将经纯化的第二轮PCR扩增产物作为DNA模板，用Illuminate测序仪测序接头引物，进行第三轮PCR扩增反应，得到文库。扩增体系为：
PCR扩增程序为：
2.使用磁珠对扩增后的文库进行纯化和片段筛选。
(4).文库质检和测序
1.使用Qubit荧光定量仪对文库浓度进行定量。
2.使用Agilent 2100bioanalyzer对文库质量进行质检。
3.使用Nextseq 500测序仪对样本文库进行测序。
四、实验结果和数据分析
上述文库在Illumina Nextseq 500进行上机测序，测序模式为PE150。对于测序数据，经过生物信息分析，得到的统计数据指标用于评价序列富集效果。
正常人血液、MCF10A细胞系和结直肠癌FFPE三种样本的高通量测序文库2100分析结果如图1、2、3，最后产生了高质量的测序文库，且文库的长度分布与各自的设计预期相符。
表2测序数据统计
如表2所示，目标区域大小约为63Kb，本实施例三个文库测序均产生了超过1000万条read序列，测序数据量分别为1567Mb、2828Mb和1533Mb。测序数据中超过94％的短序列能够比对上基因组，比对上基因组的数据中96％以上比对到了目标区域，证明了多重PCR引物对目标序列富集的高度特异性。此外，本实施例对目标区域序列的富集效果达到了100％覆盖度，并且目标区域平均测序深度达1万X以上。本实施例仅需在2个PCR反应体系进行，一方面减少了实验操作步骤，同时也将样本起始量降低到了20ng(表1)。
综上，本实施例中的多重PCR序列富集技术(技术原理如图4所示)是一种高效、可靠的高通量测序序列富集方法。本实施例中的试剂盒能同时检测治疗结直肠癌的靶向药物相关8个基因外显子区域和化疗药物相关23个多态性位点的突变，可以直接用于指导临床结直肠癌用药，以及用于癌症早期诊断，辅助诊断及筛查和癌症愈后监测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
<110> 广州永诺生物科技有限公司、广州永诺健康科技有限公司
<120> 结直肠癌用药相关基因检测的多重PCR引物组和试剂盒
<130> 2017
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nactgcagct ggcctcggg 49
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntggatcctc aggactctgt ct 52
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ncatcaggcc ccctctttct c 51
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntggcagatg gggagtgcg 49
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nccctccagc caccctctc 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ngggcaatga agggtacatc ct 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ngctgggagg acttcaccc 49
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<211> 49
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<213> 人工序列
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agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ncgaccacac ccctccagg 49
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<211> 52
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<213> 人工序列
<400> 16
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 19
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
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<213> 人工序列
<400> 21
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 23
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntggttattt gcattttaga ataggat 57
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 29
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nacagatact catcctcaat gtgattac 58
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nagcatcagc atttgacttt acct 54
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<213> 人工序列
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agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nactgctaaa cactaatata acctttgg 58
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
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<213> 人工序列
<400> 33
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nacagaccaa ttggcatgct ct 52
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agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntctttctcc tgctcagtga ttt 53
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<213> 人工序列
<400> 35
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<400> 59
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nttctccact tagattttct ccaattt 57
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn natgaacccc cagccttgg 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn naggagctgg aggcagagat a 51
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<213> 人工序列
<400> 62
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<213> 人工序列
<400> 63
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<400> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntctctctct aaaacactga tttccca 57
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<400> 66
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<400> 68
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<212> DNA
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<400> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntggaaggaa ggaaatgggt agg 53
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ngaacgatgt ggcgccttc 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
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<213> 人工序列
<400> 74
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<213> 人工序列
<400> 79
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<400> 82
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<212> DNA
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<400> 84
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<400> 88
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
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<210> 90
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
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<210> 91
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntccaataaa ttctcagatc cagga 55
<210> 92
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntcttgtgaa acaacagtgc cac 53
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nacacacagg taacggctga g 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntccttgtca ttatctgcac gct 53
<210> 95
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntggatcaga gtcagtggtg tc 52
<210> 96
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nttaccaatg caacagactt taaaga 56
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<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntggacaggt tttgaaagat atttgtgt 58
<210> 98
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nggtgcactg taataatcca gactg 55
<210> 99
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ngctggccat atatatattt aaacc 55
<210> 100
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntcactgaag acccaggtcc a 51
<210> 101
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nccacaggca tggcgcggc 49
<210> 102
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nggtcctagg cctgggagg 49
<210> 103
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ncaagcttgg ccagttccgt 50
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<213> 人工序列
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agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nctgggggtg tcaccttctg 50
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<213> 人工序列
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agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nccctgtggt tatcaagggt ca 52
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<211> 49
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agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nggactttcc acctatggga c 51
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 111
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nagcagataa gacagtatta ctagtt 56
<210> 112
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ncttccagtg cctccaccc 49
<210> 113
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn naatcccttt ggtgctcacg t 51
<210> 114
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nggagttgtt gaaatgaaaa tgttgtctg 59
<210> 115
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
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<211> 50
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 117
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
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<213> 人工序列
<400> 119
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 203
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agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntgaagccat cgtatatatt caca 54
<210> 210
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 210
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn naggactctg aagatgtacc tatgg 55
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 433
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 433
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 64
Claims (9)
1.一种结直肠癌用药相关基因检测的多重PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物组和下游引物组，
其中，所述上游引物的5’端序列与测序引物的部分序列互补，所述上游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列；
所述下游引物的5’端序列与测序引物的部分序列互补，所述下游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列，所述下游引物的中间位置序列为分子标签序列；
所述引物组用于扩增的目标区域包括8个靶向药物相关基因外显子区域和23个化疗药物多态性位点周围序列，所述8个靶向药物相关基因为：KRAS、NRAS、BRAF、EGFR、PIK3CA、MET、HER2和PTEN；所述23个化疗药物多态性位点为：rs1042522、rs11615、rs12132152、rs13181、rs1695、rs1799782、rs1799983、rs1801131、rs1801133、rs2032582、rs2070744、rs2297595、rs25487、rs3212986、rs34743033、rs3918290、rs4148323、rs8175347、BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346和D17S250。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述上游引物组为SEQ ID NO:216～SEQID NO:430所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述下游引物组为SEQ ID NO:1～SEQID NO:215所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列和用于Illuminate测序仪测序文库构建的接头引物。
5.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述分子标签序列为一段随机的8～10个核苷酸序列。
6.结直肠癌用药相关基因的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1～5任一项所述的引物组。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物组包括F1-无分子标签引物池和F2-无分子标签引物池；所述下游引物组包括R1-分子标签引物池和R2-分子标签引物池；
其中，所述R1-分子标签引物池包含SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:118所示的核苷酸序列；所述R2-分子标签引物池包含SEQ ID NO:119～SEQ ID NO:215所示的核苷酸序列；所述F1-无分子标签引物池包含SEQ ID NO:216～SEQ ID NO:333所示的核苷酸序列；所述F2-无分子标签引物池包含SEQ ID NO:334～SEQ ID NO:430所示的核苷酸序列。
8.一种结直肠癌用药相关基因的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)采用权利要求7中的R1-分子标签引物池、R2-分子标签引物池对待检测样品基因分别进行PCR扩增，获得第一轮PCR产物；
(2)将步骤(1)获得的第一轮PCR产物分别用权利要求7中的F1-无分子标签引物池和SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列，F2-无分子标签引物池和SEQ ID NO:431所示的核苷酸序列进行第二轮PCR扩增；
(3)对第二轮PCR产物进行测序分析，以获得样品基因的突变和位点多态性信息。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的测序分析包括如下步骤：
(31)将步骤(2)获得的第二轮PCR产物混合后用磁珠纯化，再使用用于Illuminate测序仪测序文库构建的接头引物进行第三轮PCR扩增；
(32)将步骤(31)所构建的测序文库经检测合格后，采用Illumina第二代测序仪进行测序分析。
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