CN110079868A - Brca1/2基因变异检测文库构建方法和试剂盒 - Google Patents

Brca1/2基因变异检测文库构建方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及BRCA1/2基因变异检测文库构建方法和试剂盒。本发明提供一种BRCA1/2基因的扩增子文库构建方法，所述方法包括对样本中包含BRCA1/2基因区域进行靶向扩增，所述靶向扩增包括1)以所述样本为模板，通过第一引物进行第一轮PCR扩增，2)以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二引物进行第二轮PCR扩增，以及3)以第二轮PCR扩增产物为模板，通过第三轮PCR扩增构建BRCA1/2基因的扩增子文库。本发明还提供用于构建BRCA1/2基因的扩增子文库和/或检测BRCA1/2基因变异的试剂盒。本发明的方法和试剂盒能够在一个试剂管中进行PCR反应，简单快速构建扩增子文库，显著降低了操作的繁琐程度和对检测样本的需求量，提高了测序数据的整体质量。

Description

BRCA1/2基因变异检测文库构建方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测文库构建方法和产品。具体而言，本发明涉及用于BRCA1/2基因变异检测的文库构建方法和试剂盒。
背景技术
耗资30亿美元历时10余年完成的人类基因组计划(Human Genome Proiect，HGP)给基因组学研究带来了天翻地覆的变化，通过测定人类基因组DNA的序列，探寻基因在染色体上的位置，明确基因的结构和功能，解读人类的全部遗传信息，人类第一次在分子水平上全面认识自我。新一代测序技术催生了丰富多彩的基因组图谱。
新一代测序技术又称大规模平行测序(massively parallel sequencing，MPS)，是指采用“边合成边测序”的原理、对于几十万到几百万DNA分子同时进行平行的测序反应，然后通过生物信息学分析所得到的原始图像数据或电化学信号、最终得到待测样品的核酸序列或拷贝数等信息的测序技术，又称为高通量测序、深度测序等。
然而，有些研究并不需要对全基因组进行测序，而只需对特定的基因组区域进行研究。扩增子测序就是通过设计感兴趣的基因组区域的引物，通过PCR扩增，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的研究策略。
扩增子测序技术通常会使用大量的引物，为了避免大量引物二聚体的生成，常见的方法是将反应体系从一管拆分至多管，从而降低每管反应中引物的数量，减少引物二聚体的生成。但是该方法，大大增加了操作的繁琐程度及检测样本的需求量。同时，目前主要的扩增子建库技术，对目标区域进行扩增时，通常会使用多循环PCR程序，由于不同引物之前扩增效率不同，通过双向引物指数型PCR扩增，经过多循环PCR程序后，扩增区域的均一性会出现显著的差别，最终可能导致测序数据质量整体变差。
发明内容
本发明针对当前新一代测序过程使用的扩增子测序技术存在的不足进行针对性研究，提出了新的BRCA1/2基因变异检测文库构建方法，大大缩短了变异检测时整个文库构建流程所需的工作量，同时降低了对样本量的需求。
在一些实施方案中，本发明提供一种BRCA1/2基因的扩增子文库构建方法，所述方法包括对样本中包含BRCA1/2基因区域进行靶向扩增，所述靶向扩增包括1)以所述样本为模板，通过第一引物进行第一轮PCR扩增，2)以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二引物进行第二轮PCR扩增，以及3)以第二轮PCR扩增产物为模板，通过第三轮PCR扩增构建BRCA1/2基因的扩增子文库。在一些实施方案中，所述样本可以包含来自受试者的基因组DNA或通过反转录获得的cDNA。在一些实施方案中，所述样本可以包含来自受试者的BRCA1/2基因。在一些实施方案中，来自受试者的BRCA1/2基因可以包括野生型BRCA1/2基因或变异BRCA1/2基因。
在一些实施方案中，本发明的方法中的第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增可以进行适当的循环数，例如进行1-10个循环，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个循环。在一些实施方案中，本发明的方法中的第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增仅进行1个循环，即一个变性、退火、延伸循环。在一些实施方案中，本发明的方法中一个变性、退火、延伸循环中可以包括一次或多次退火，例如1，2，3，4，5次退火。已经发现第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增能够通过仅进行1个循环(优选在1个循环中进行多次退火)构建高质量BRCA1/2基因的扩增子文库。在一些实施方案中，本发明的方法构建的BRCA1/2基因的扩增子文库的测序深度分布更加均匀。在一些实施方案中，变性、退火、延伸循环的温度可以根据采用的第一和/或第二引物适当的选择。在一些实施方案中，本发明的方法中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增的退火温度没有特别限制，例如可以采用55℃-70℃之间的任何退火温度，例如55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃，66℃，67℃，68℃，69℃，70℃或任何之间的温度。在一些实施方案中，本发明的方法中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增的退火时间没有特别限制，例如可以退火30-180秒，例如30秒，45秒，60秒，75秒，90秒，105秒，120秒，135秒，150秒，165秒，180秒或任何之间的时间。在一些实施方案中，所述退火包括在55℃-70℃之间的不同温度退火。在一些实施方案中，例如所述退火可以包括在57℃退火30秒，59℃退火30秒，61℃退火30秒和62℃退火30秒，其总退火时间在30-180秒之间。举例而言，所述退火可以包括在55℃退火15秒，56℃退火30秒，61℃退火45秒和62℃退火15秒，其总退火时间在30-180秒之间。
在一些实施方案中，本发明方法中的第一引物和第二引物可以分别为正向引物和反向引物，或反之，即第一引物和第二引物可以分别为反向引物和正向引物。
在一些实施方案中，本发明方法中的第一引物和第二引物包含靶向BRCA1/2基因的特异性序列。在一些实施方案中，如本领域技术人员已知的，可以向扩增产物添加接头或index序列。在一些实施方案中，本发明方法中的第一引物和第二引物还可以包含接头和/或index序列。在一些实施方案中，接头或index序列可以在第三轮PCR扩增中添加。在一些实施方案中，本发明方法中的接头和/或index序列没有特别限制，本领域技术人员可以采用适当的序列作为接头和/或index序列。
在一些实施方案中，本发明方法中的第一轮PCR、第二轮PCR和/或第三轮PCR包括纯化步骤。对PCR扩增产物进行纯化的方法是本领域技术人员熟知的，例如可以通过磁珠进行所述纯化步骤。在一些实施方案中，本发明的第一轮PCR、第二轮PCR和/或第三轮PCR(包括纯化步骤)在一个试剂管中进行。如上所述，为了避免大量引物二聚体的生成，扩增子测序技术过程中通常需要将反应体系从一管拆分至多管以降低每管反应中引物的数量，减少引物二聚体的生成。相比之下，本发明的方法可以采用单引物进行少数循环(例如仅进行一个循环)，能够在一个试剂管中进行PCR而不需要将PCR反应体系从一管拆分至多管。在一些实施方案中，本发明的方法显著降低了操作的繁琐程度。更为重要的是，本发明的方法通过在单个试剂管中进行，能够减少对检测样本的需求量，从而使得现有技术中由于样品量不足而不能进行的检测成为可能。通过减少操作步骤和降低样品需求，本发明的方法还能够降低多步操作导致的误差，提高检测的灵敏度和可靠性，提高测序数据的整体质量。
在一些实施方案中，本发明方法中的第一引物和/或第二引物包括下述一个或多个引物中靶向BRCA1/2基因的特异性序列(下述序列包含的接头和/或index序列可以替换为任何适当的接头和/或index序列，只要其中靶向BRCA1/2基因的特异性序列不变即可)：
在一些实施方案中，本发明的方法包括本文所列靶向BRCA1/2基因的特异性序列的一个或多个。在一些实施方案中，本文所列靶向BRCA1/2基因的特异性序列可以相互组合，但优选采用正向引物和反向引物配对的组合。在一些实施方案中，本发明的方法包括本文所列靶向BRCA1/2基因的特异性序列中的任意一对或多对正向引物和反向引物(即所列引物编号匹配的引物对，例如BRCA1_17_F1和BRCA1_17_R1的引物对)。
在一些实施方案中，除了靶向BRCA1/2基因的特异性序列之外，本发明的序列可以包含任何适当的用于高通量测序分析的接头和/或引物，这样的序列根据高通量测序分析的平台不同而可以不同，并且是本领域技术人员已知的。例如，在一些实施方案中，适当的序列可以包括适合Illumina测序分析的接头和/或引物。在一些实施方案中，适当的序列包括例如下述序列中的一个或多个：
TruSeq Universal Adapter：
5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3′；
TruSeq Indexed Adapter：5′GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG3′；
PCR Primer 1.0：5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGA 3′；
PCR Primer20：5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT 3′；
flow cell锚定TruSeq Universal Adapter：5′AATGATACGGCGACCACCGA3′；
flow cell锚定TruSeq Indexed Adapter：5′CAAGCAGAAGACGGCATACG 3′；
Read 2Sequencing Primer：5′GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3′；
Multiplexing Index Read Sequencing Primer：5′GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 3′；Read1Sequencing Primer：5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3′。
在一些实施方案中，已经发现现有引物设计主要参考的参数为引物的Tm值及GC含量以及引物长度等，但是这样的基于Tm的引物设计原则无法消除DNA聚合酶引入的扩增偏好性，导致扩增偏好性较为严重，可能会显著影响检测结果的准确性，因此优选根据实验结果对BRCA1/2引物特异性靶向区域的起始位点和终止位点进行调整，选择有利的引物序列。在一些实施方案中，发明人已经发现上述调整的BRCA1/2特异性引物序列与现有引物序列构建文库相比可显著降低DNA聚合酶的扩增偏好性，提高检测结果的整体准确度。在一些实施方案中，本发明的方法中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增包括在55℃-70℃退火30-180秒，任选地所述退火包括55℃-70℃之间的不同温度退火30-180秒。在一些实施方案中，本发明的方法中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增包括在57℃、59℃、61℃和62℃各退火30秒。在一些实施方案中，本发明的方法中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增包括在52℃、55℃、58℃和61℃各退火30秒。
在一些实施方案中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含容器，所述容器分别包含适合进行本发明所述方法的PCR试剂，例如DNA聚合酶，引物，和PCR缓冲液。在一些实施方案中，所述容器包含本文所列靶向BRCA1/2基因的特异性序列的一个或多个引物。在一些实施方案中，所述试剂盒可以用于构建BRCA1/2基因的扩增子文库和/或检测BRCA1/2基因变异。
在一些实施方案中，本发明提供检测BRCA1/2基因变异的方法，所述方法包括通过本文描述的方法制备高通量测序文库，然后进行高通量测序，从而检测BRCA1/2基因是否存在变异。在一些实施方案中，本发明提供检测BRCA1/2基因变异的试剂盒，所述试剂盒包含容器，所述容器分别包含适合进行本发明所述方法的PCR试剂，例如DNA聚合酶，引物，和PCR缓冲液。在一些实施方案中，所述容器包含本文所列靶向BRCA1/2基因的特异性序列的一个或多个引物。在一些实施方案中，所述方法可以对来自受试者的基因组DNA或通过反转录获得的cDNA中是否存在BRCA1/2基因变异进行检测。在一些实施方案中，来自受试者的BRCA1/2基因可以包括野生型BRCA1/2基因或变异BRCA1/2基因。在一些实施方案中，本发明提供本发明的试剂盒在制备用于检测BRCA1/2基因变异的产品(例如检测试剂盒)中的用途。
在一些实施方案中，本发明的方法使用单引物PCR建库流程，大大降低了引物二聚体形成的可能及对建库流程的影响，最终可以实现一个反应完成BRCA1/2基因变异检测。
在一些实施方案中，本发明的方法采用了适合用于本发明方法的改进的引物设计，提高测序数据的整体质量。
在一些实施方案中，本发明的方法采用改进的引物，在多重PCR过程中，可降低由DNA聚合酶引入的扩增偏好性，从而提高检测结果的整体准确度。
在一些实施方案中，本发明的方法采用单引物PCR进行建库。目前进行扩增子测序采用的文库构建流程，进行多重PCR时同时将配对的上下游引物同时加入到反应体系中。该流程在引物数量较多时，或者引物位置之间存在明显的交错，极易形成引物二聚体。且不同引物扩增效率的差异，随着PCR的指数扩增，逐步被放大，最终可能导致测序数据质量整体变差。本发明使用的单引物扩增方法，将正向引物和反向引物分作两次放入反应体系中进行反应，减少了二聚体形成的可能，同时由于只有单条引物参与PCR过程，扩增产物的增长方式为线性增长，极大的减少了不同引物之间PCR效率的差异，从而提高测序数据的整体质量。
在一些实施方案中，本发明主要提供了一种新型的在人BRCA1/2基因变异检测试剂盒。本发明针对当前新一代测序过程使用的扩增子测序技术存在的不足进行优化，大大缩短了整个文库构建流程所需的工作量，同时降低了对样本量的需求。
术语说明：
扩增子建库：扩增子文库构建法，利用多重PCR技术用于对靶向DNA区域进行富集，从而构建新一代测序用文库的方法。
Tm值：DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。
基因组文库：将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆形成的集合，可用于下游的扩增、Sanger测序或新一代测序。
新一代测序技术：又称大规模平行测序(massively parallel sequencing(MPS))，是指采用“边合成边测序”的原理、对于几十万到几百万DNA分子同时进行平行的测序反应，然后通过生物信息学分析所得到的原始图像数据或电化学信号、最终得到待测样品的核酸序列或拷贝数等信息的测序技术，又称为高通量测序、深度测序、下一代测序等。
附图说明
图1显示现有扩增子测序采用的文库构建流程，进行多重PCR时同时将配对的上下游引物同时加入到反应体系中。
图2显示本发明使用的单引物扩增方法的示例性流程。
图3显示本发明的方法与现有方法(CleanPlex BRCA1&2panel，PARAGON-916005)的示例性对比。
图4显示现有方法(CleanPlex BRCA1&2panel，PARAGON-916005)产物中引物或者引物二聚体的存在。
图5显示本发明方法产物中无引物及二聚体残留。
图6显示使用PARAGON-916005及本发明构建的文库，测序后测序深度的均一性分析。本发明测序深度最高值与最低值差异更小，整体测序深度分布更加均匀。
具体实施方式
BRCA1/2文库构建
1主要试剂及仪器
2实验操作
2.1 Forward Primer-PCR
2.1.1使用Hot-StartDNA P0lymerase in a Ready-to-Use MasterMix，在PCR管中，按下表配置F-PCR mix：
2.1.2轻微涡旋混匀后简单离心，将PCR管放置在PCR仪内，运行下列程序：
2.2 F primer PCR产物纯化
2.2.1提前将agencourt ampu0re XP-PCR purification beads从4℃冰箱取出，室温平衡30min；
2.2.2室温平衡后的ampure beads涡旋混匀，取48ul ampure beads(1.2X)至新的1.5mL离心管，并将上一步40ul PCR产物全部转入；
2.2.3将PCR产物与磁珠涡旋混匀，室温孵育5min；
2.2.4孵育完成后，将离心管置于磁力架上静置2-3min，待溶液澄清后，吸弃溶液，期间切忌接触磁珠；
2.2.5在离心管中加入新鲜的80％乙醇200ul，静置30s，后，吸弃乙醇，重复洗涤一遍；
2.2.6吸弃乙醇后，将磁珠晾干至表面呈磨砂状，磁珠晾干后，加入11ulNuclease-free H2O，室温孵育3min；
2.2.7孵育完成后，将离心管置于磁力架上，静置2-3min，待溶液澄清后，吸取10ul溶液转移至新的PCR管中，吸取到少量磁珠不会影响后续实验；
23 Reverse Primer-PCR
2.3.1使用Hot-StartDNA Polymerase in a Ready-to-Use MasterMix，在PCR管内，按下表配置R-PCR mix：
2.3.2轻微涡旋混匀后简单离心，将PCR管放置在PCR仪内，运行下列程序：
2.4 Reverse Primer-PCR产物纯化
2.4.1室温平衡后的ampure beads涡旋混匀；
2.4.2取48ul ampure beads(1.2X)至新的1.5mL离心管，并将上一步40ul PCR产物全部转入；
2.4.3将PCR产物与磁珠涡旋混匀，室温孵育5min；
2.4.4孵育完成后，将离心管置于磁力架上静置2-3min，待溶液澄清后，吸弃溶液，期间切忌接触磁珠；
2.4.5在离心管中加入新鲜的80％乙醇200ul，静置30s后，吸弃乙醇，重复洗涤一遍；
2.4.6吸弃乙醇后，将磁珠晾干至表面呈磨砂状，磁珠晾干后，加入21ulNuclease-free H2O，室温孵育3min；
2.4.7孵育完成后，将离心管置于磁力架上，静置2-3min，待溶液澄清后，吸取20ul溶液转移至新的PCR管中；
2.5 Index-PCR
2.5.1在2.4.7的0.2ml PCR Tube中配制以下反应体系；
2.5.2涡旋混匀，离心后进行以下反应：
2.6 PCR产物回收
2.6.1将上一步50ul反应产物全部转移到1.5ml离心管中，加60ul涡旋均匀的AMpure Beads(1.2x)，涡旋混匀，室温放置5min后静置于磁力架上，AMpure Beads完全分离后弃上清。
2.6.2保持样品置于磁力架上，加200ul 80％乙醇，30s后去上清，然后再重复洗涤一次；
2.6.3晾干至无液滴残留；
2.6.4加41ul Nuclease-free water涡旋混匀，室温放置5min后静置于磁力架上，AMpure Beads完全分离后转移40ul上清至1.5ml离心管中；
2.6.5向上述离心管中加入48ul AMpure Beads(1.2X)混旋均匀，室温放置5min后静置于磁力架上，AMpure Beads完全分离后弃上清；
2.6.6重复2.6.2-2.6.3步骤1次；
2.6.7加21ul Nuclease-free water涡旋混匀，室温放置5min后静置于磁力架上，AMpure Beads完全分离后转移20ul上清至1.5ml离心管中；
2.7产物QC
2.7.1参考试剂及仪器使用说明，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit在Qubit 3.0仪器上进行文库浓度检测。
2.7.2参考试剂及仪器使用说明，使用24DNA Extended Range Labchip及HT DNAHigh Sens Reagent Kit，Dual Protocol，在Labchip GX Touch仪器上进行文库片段大小检测。
3.本发明的方法与现有方法的比较(参见例如图3)
本发明优势：
1.无需将初始样分成两份进行文库构建，降低了操作繁琐度及对初始样本量的需求。
2.靶向扩增时将双向引物分两步进行扩增，且只需要1个PCR循环，降低了引物二聚体形成的可能性，减少了PCR时长，不会引入PCR指数扩增带来的均一性变化。
3.整体操作时长显著减少。
与现有方法(例如商品化产品CleanPlex BRCA1&2panel，
PARAGON-916005)的对比：
1.整体操作时长缩短约半个小时：
2.文库质量：
a.图4中图片源于CleanPlex BRCA1&2panel，PARAGON-916005产品说明书中质控部分说明，可以观察到，产物中仍然存在少量引物或者引物二聚体：
b.图5中为本发明产物质控，可以看到，无引物及二聚体残留：
3.将测序结果进行均一性分析(图6)，本发明测序深度最高值与最低值差异更小，整体测序深度分布更加均匀：
引物列表

Claims (10)

1.一种BRCA1/2基因的扩增子文库构建方法，所述方法包括对样本中包含BRCA1/2基因区域进行靶向扩增，所述靶向扩增包括1)以所述样本为模板，通过第一引物进行第一轮PCR扩增，2)以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二引物进行第二轮PCR扩增，以及3)以第二轮PCR扩增产物为模板，通过第三轮PCR扩增构建BRCA1/2基因的扩增子文库。
2.权利要求1所述的方法，其中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增仅进行1个循环。
3.权利要求1-2任一项所述的方法，其中第一引物和第二引物分别为正向引物和反向引物，或分别为反向引物和正向引物。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中第一引物和第二引物包含靶向BRCA1/2基因的特异性序列，任选地还包含接头和/或index序列。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述样本包含野生型或变异BRCA1/2基因序列。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中第一轮PCR、第二轮PCR和/或第三轮PCR包括纯化步骤，例如通过磁珠进行纯化步骤，任选地所述第一轮PCR、第二轮PCR和/或第三轮PCR在一个试剂管中进行。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中第一引物和/或第二引物包括下述一个或多个引物中靶向BRCA1/2基因的特异性序列：
8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中第一轮PCR扩增和/或第二轮PCR扩增包括在55℃-70℃退火30-180秒，任选地所述退火包括55℃-70℃之间的不同温度退火30-180秒。
9.一种试剂盒，所述试剂盒包含容器，所述容器分别包含适合进行权利要求1-8任一项所述方法的PCR试剂，例如DNA聚合酶，引物，和PCR缓冲液。
10.权利要求9所述的试剂盒，其用于构建BRCA1/2基因的扩增子文库和/或检测BRCA1/2基因变异。
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