CN105200017A - 一种去除a47l降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒，通过去除显性表位A47L重组痘苗病毒，从而降低痘苗病毒免疫优势的方法。以野生型痘苗病毒Western？Reserve株为载体，去除A47L基因同时***卵清蛋白(OVA)基因，构建表达OVA的重组病毒VACV-ΔA47L-OVA，并筛选纯化。本发明去除了显性表位A47L对外源抗原免疫原性的影响，可有效降低痘苗病毒的免疫优势效应，增加外源性抗原的免疫原性，从而提高以痘苗病毒为载体的活疫苗的有效性。可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体。

Description

一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒

技术领域

本发明涉及生物基因工程及免疫领域，具体涉及一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒。

背景技术

痘苗病毒是一种大分子DNA病毒，是人类消灭天花的主要疫苗，能够引起强烈的免疫反应和超长的免疫记忆。由于活痘苗病毒作为疫苗在天花免疫中的成功应用，痘苗病毒被当做衡量一个疫苗有效与否的“金标准”，受到广泛的重视。

现阶段世界上多个以痘苗病毒为载体的，旨在预防感染性疾病以及肿瘤的重组疫苗已经进入临床测试阶段，但其中的多数均未能达到理想的免疫效果。一个重要的原因就是，在重组疫苗引发的免疫应答中，针对载体本身的反应牢固地占据着优势地位，并显著地抑制了外源性目的抗原的免疫原性，即疫苗载体的免疫优势效应。痘苗病毒自身的一些表位，尤其是一些优势表位(dominantepitope)如B8R、A47L、K3L等的存在，能够在很大程度上影响宿主针对外源抗原的免疫应答。在保持痘苗病毒感染和复制能力的前提下，去除病毒本身的一些优势表位，从而降低载体本身对外源性目的抗原的限制作用，对于提高重组疫苗的有效性势必具有非常重要的作用。

A47L是痘苗病毒上的一种重要的D^b限制性的杀伤性T细胞表位。A47L位于痘苗病毒基因组的右侧末端，在正痘病毒中高度保守，而在其他非正痘病毒中缺乏相似序列。A47L在痘苗病毒感染中高转录高表达，但其功能在痘苗病毒生长和复制过程中是非必需的。

发明内容

为降低作为疫苗载体的痘苗病毒的免疫优势，提高重组痘苗病毒疫苗的安全性和有效性，本发明提供了一种重组痘苗病毒的方法，以痘苗病毒WesternReserve株为骨架，在去除A47L基因的同时***卵清蛋白(OVA)基因，构建表达OVA的重组病毒VACV-ΔA47L-OVA，此为本发明的目的。去除痘苗病毒的优势表位A47L对外源抗原免疫原性的抑制，可有效降低痘苗病毒自身的免疫优势，增加外源性抗原(如OVA)的免疫原性。本发明生成的A47L基因缺失的重组痘苗病毒(VACV-ΔA47L)，可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体，此为本发明的另一目的。

本发明所述的重组痘苗病毒，是将野生痘苗病毒的A47L基因替换为带有LacZ标记的OVA基因得到的重组痘苗病毒。

在本发明的实例中，所述野生痘苗病毒为野生型WR株痘苗病毒，所述的野生型WR株痘苗病毒的基因组DNA序列为GenBank号为AY243312.1的序列(VRL14-MAR-2006)。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种重组痘苗病毒的构建方法，包括如下步骤：

S1、构建质粒pSC11A47L-OVA；

S2、pSC11A47L-OVA在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组；

S3、筛选纯化获得重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)。

其中，所述步骤S1的具体步骤如下：

S11、取冻存的野生型痘苗病毒和本实验室构建的VACV-OVA病毒，使用Biomiga病毒基因组提取试剂盒，提取基因组DNA；

S12、根据野生型痘苗病毒的A47L基因及其上下游序列，设计引物，以野生型痘苗病毒基因组DNA为模板，PCR获得A47L基因的上下游同源序列臂A47LL如A47LR。

S13、将获得的上下游同源臂A47LL和A47LR通过酶切和连接的方法分别替代pSC11质粒的TKL和TKR，获得中间质粒pSCA47L。

S14、根据GenBank中OVA基因序列，设计引物，以VACV-OVA病毒基因组DNA为模板，通过PCR获得OVA基因，将获得的OVA基因***中间质粒pSCA47L的P7.5启动子之后，得到痘苗病毒重组工具穿梭质粒pSCA47L-OVA。

其中，所述步骤S2的具体步骤如下：

待培养的CV-1细胞至80％单层时，以0.05MOI感染野生型痘苗病毒并使用Lipofectamine2000转染pSC11A47L-OVA质粒至感染细胞中，48小时后，收集病毒。

其中，所述步骤S3的具体步骤如下：

取上述收集的病毒反复冻融三次，超声破碎后感染新的CV-1细胞，并覆盖琼脂培养基；2天后，加入含有300μg/mLX-gaI的上层培养基筛选重组病毒。挑取孤立蓝斑病毒，连续单斑纯化5代。经PCR、基因测序和WesternBlot进行分子生物学鉴定无误后，进行重组病毒的体外增殖，并将最终收获的病毒采用密度梯度离心纯化，保存于-80℃。

本发明具有以下有益效果：

证实A47L为痘苗病毒本身具有的与复制和感染无关、但却显著抑制外源抗原免疫性的表位，去除A47L后，在痘苗病毒载体中***的外源性抗原能够成功地诱导有效的细胞免疫应答，并能够产生免疫记忆，再次感染诱发的细胞免疫反应明显增强。本发明构建的去除A47L基因的重组痘苗病毒，可显著提高以痘苗病毒为载体的疫苗的有效性，为疫苗研发提供良好的方法和载体。

附图说明

图1为本发明实施例中构建的pSC11A47L-OVA质粒图谱。

图2为本发明实施例中穿梭质粒目的基因***的检测，其中泳道A为***质粒的目的条带OVA(1527bp)，泳道B为质粒未***目的基因产生的条带(347bp)。

图3为本发明实施例中质粒pSC11A47L-OVA酶切鉴定示意图，其中泳道A为基因错误连接的酶切结果，泳道B为目的基因正确连接的酶切结果，均与使用VectorNTI分析的酶切结果(右侧)一致。

图4为本发明实施例中重组病毒的蓝斑筛选。

图5为本发明实施例中重组病毒的密度梯度离心纯化。

图6为本发明实施例中重组病毒中的A47L基因，以A47L鉴定引物对进行PCR反应，其中泳道A和B分别为VACV-ΔA47L和VACV-ΔA47L-OVA产生的A47L缺失的条带(502bp)，泳道C野生型痘苗病毒产生的A47L条带(1261bp)。

图7为本发明实施例中重组病毒中外源目的基因OVA扩增，其中泳道A显示在野生型痘苗病毒中无特异性条带产生，泳道B为VACV-ΔA47L-OVA产生的OVA条带，泳道C为VACV-OVA阳性对照。

图8为本发明实施例中外源性目的蛋白OVA的表达，其中泳道A和B分别为VACV-ΔA47L-OVA和阳性对照VACV-OVA感染细胞后表达的OVA蛋白条带，泳道C显示野生型痘苗病毒感染后细胞中无OVA蛋白表达。

图9为本发明实施例中重组病毒在BSC-1细胞中的生长曲线。

图10为本发明实施例中重组病毒在CV-1细胞中的生长曲线。

图11为本发明实施例中重组病毒诱导的初次细胞免疫应答。

图12为本发明实施例中重组病毒诱导的免疫记忆。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例

本实施例中痘苗病毒WR株在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室(本实验室，下同)保藏，内嵌OVA基因的重组痘苗病毒(VACV-OVA)由申请人构建并在本实验室保藏，仅去除A47L基因未***任何片段的重组痘苗病毒(VACV-ΔA47L)由申请人构建并在本实验室保藏。质粒pSC11由BernardMoss教授(美国NIH)惠赠，细胞株CV-1和BSC-1购自中国典型培养物保藏中心。所使用的小鼠为雌性6周龄C57BL/6小鼠，体重18-22g，购于中国预防医学科学院动物繁育中心，饲养及实验均在恒温恒湿的SPF级鼠房内进行。

主要试剂和材料：

DMEM，胎牛血清，脂质体(lipofectamine2000)转染试剂均购自Invitrogen公司，Taq酶、限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自NEB公司，病毒基因组提取试剂盒购自Biomiga公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。

步骤1、质粒pSC11A47L-OVA的构建和鉴定

将野生痘苗病毒WR株的基因组DNA序列的第152935-153939位(对应序列1的1-1005位，命名为上游同源左臂A47LL)和154628-155517位(对应序列2的1-890位，命名为下游同源右臂A47LR)，分别克隆替换pSC11质粒的TKL和TKR，进而将OVA基因连接到pSC11质粒的启动子P7.5之后，得到重组质粒pSC11A47L-OVA。

具体操作如下：

1.1野生型痘苗病毒WR株基因组DNA和VACV-OVA病毒基因组DNA提取

(1)取-80℃冻存的野生型痘苗病毒和VACV-OVA病毒各200μl，4℃解冻。

(2)加入等体积的PLYbuffer，漩涡混匀，室温放置15分钟。

(3)加入0.5倍体积的无水乙醇，移液器混匀。

(4)转移裂解液至吸附柱中，13000rpm离心1分钟，将过滤柱转移至一个新的收集管中。

(5)向过滤柱中加入650μlWashbuffer，13000rpm离心1分钟，弃废液。

(6)重复洗一次，弃废液。

(7)将过滤柱放入收集管中13000rpm离心2分钟以去除残留的乙醇。

(8)过滤柱放入新的收集管中，向过滤柱中加入30-50μlDEPC水，室温静置3分钟。

(9)13000rpm离心1分钟，洗脱DNA。

(10)野生型痘苗病毒基因组DNA和VACV-OVA基因组DNA放置于-20℃备用。

1.2引物设计与合成

根据野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列设计并合成如下两对引物：

扩增A47L上游同源臂的引物对：

A47LL-F1：5’-CCCAAGCTTTGATTCCATAGGCAGTCCAG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为HindIII酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第152935-152954位，即序列1的第1-20位)

A47LL-R1：5’-AACTGCAGATAAGGTGATTGGAATGGG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为PstI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第153921-153939位的反向互补序列，即序列1的第987-1005位的反向互补序列)；

扩增A47L下游同源臂的引物对：

A47LR-F1：5’-TCCCCCCGGGGATGGACAGTCTATTTTCCTTAG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为XmaI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第154628-154650位，即序列2的第1-23位)

A47LR-R1：5’-TATGGCGCCTATTGATGCGAGTTCGGTATG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为KasI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第155497-155517位的反向互补序列，即序列2的第870-890位的反向互补序列)。

根据OVA基因序列设计并合成引物：

OVA-F1：5’-CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为NcoI酶切位点识别序列，其后为序列3的第1-19位)

OVA-F2：5’-TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为XmaI酶切位点识别序列，其后为序列3的第1161-1180位的反向互补序列)。

1.3穿梭质粒pSC11A47L-OVA的构建及鉴定

(1)以步骤1.1中野生型痘苗病毒基因组DNA为模板，以步骤1.2中合成的A47L上下游同源臂引物对分别进行PCR，获得带有相应酶切位点的A47L的上下游同源臂A47LL和A47LR，以步骤1中VACV-OVA基因组DNA为模板，以步骤2中合成的OVA引物对进行PCR，获得带有相应酶切位点的OVA基因片段。

PCR扩增体系如下：DNA1μl，dNTPmix(2.5mM)5μl，正向引物F(10μM)1μl，反向引物R(10μM)1μl，10×Taqbuffer5μl，Taq酶1μl，加DEPC水至总体积50μl。

PCR扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，循环30次；72℃延伸5min，最后置于4℃。

PCR扩增结果：PCR产物上样电泳，A47LL为1022bp，A47LR为909bp，OVA为1200bp，切胶回收目的条带。

(2)首先用限制性内切酶HindIII和PstI对上游同源臂A47LL进行双酶切，与经同样双酶切的pSC11质粒的大片段进行连接，得到中间质粒pSC11-A，接着用限制性内切酶XmaI和KasI对下游同源臂A47LR进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pSC11-A的大片段进行连接，得到中间质粒pSC11A47L，最后用限制性内切酶NcoI和XmaI对OVA基因片段进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pSC11A47L的大片段进行连接，获得重组质粒，酶切和测序鉴定无误后，得到质粒pSC11A47L-OVA。

具体步骤如下：

酶切体系如下：1μg相应质粒或基因片段，2μL10xTbuffer，2μLBSA，5U相应的限制性内切酶，ddH₂O定容至20μL。酶切条件37℃，3h。

酶切产物上样电泳，切胶回收线性条带；将目的条带与载体连接；

连接反应体系如下：3μL目的片段，1μL线性质粒，1μLDNA连接酶，1μL10xbuffer，定容至10μL，16℃连接过夜；

向冰上解冻的感受态DH5a中加入上述连接产物5μL，混匀后冰上静置30min；42℃热击1min；冰上放置5min后，加入500μL预热的LB培养基，摇床培养30-60min；3000rpm离心5min，弃上清；重新加入30μL新鲜LB培养基，混匀后涂布含Amp的LB固体平板；37℃培养过夜，不超过16h。挑取单克隆细菌接种到含Amp的液体培养基，摇床培养，180rpm，14h；对挑取的单克隆细菌培养物进行菌落PCR，验证外源基因OVA是否有效***。

验证引物对：

OVA-F2：5’-GGGAAGGATCGACAGATTTG-3’

OVA-R2：5’-GCTAGTCACAATCACCACTTTC-3’

体系如下：菌液1μL，10xTaqbuffer2.5μL，dNTP2μL，Taq酶0.5μL，引物各1μL，ddH₂O定容至25μL。扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次；72℃延伸5min，置于4℃。PCR产物上样电泳，对符合要求的细菌培养物提取质粒；使用XhoI和EcoRV对上一步得到的质粒进行双酶切，上样电泳验证大小，并与VectorNTI分析预测的酶切结果进行比对。对验证正确的克隆送上海英潍捷基公司进行测序。

步骤2、痘苗病毒的重组和筛选

2.1痘苗病毒重组

(1)以T25培养瓶培养CV-1细胞至80％单层；

(2)以0.05MOI感染野生型痘苗病毒，37℃培养2小时；

(3)去除病毒液，按照转染试剂Lipofectamine2000说明书转染pSC11A47L-OVA至感染细胞中，培养48小时；

(4)收集细胞，反复冻融三次，进行超声破碎后，保存于-80℃。

2.2VACV-ΔA47L-OVA病毒的筛选

(1)用6孔板培养CV-1细胞至80％单层；

(2)取经超声破碎后的病毒悬液，做倍比稀释，感染CV-1细胞，37℃培养2小时；

(3)每孔覆盖3ml琼脂培养基，培养2天；

(4)每孔加入2ml含X-gaI的上层琼脂培养基，培养过夜；

(5)观察蓝斑产生情况，挑取孤立蓝斑进行进一步筛选，连续单斑纯化5代，至病毒纯化。

步骤3、重组病毒的鉴定和纯化

3.1重组病毒的鉴定

将上述重组痘苗病毒VACV-ΔA47L-OVA经BSC-1细胞连续传代(＞10次)后，提取重组病毒DNA，使用PCR验证其中的A47L和OVA基因，并用WesternBlot验证OVA蛋白在感染细胞中的表达。

3.3.1PCR鉴定A47L和OVA基因

A47L鉴定引物：

A47L-JDF1：5’-AGTATAGGTGTATGGCATTAGCC-3’(野生型痘苗病毒第153679-153701位，即序列1的第745-767位)

A47L-JDR1：5’-AGTGACAGTGGATCTCTGAGG-3’(野生型痘苗病毒第154889-154909位的反向互补序列，即序列2的第262-282位的反向互补序列)

OVA鉴定引物：

OVA-F1：5’-CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG-3’

OVA-R1：5’-TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3’

以纯化的重组痘苗病毒的基因组DNA为模板，用上述3对鉴定引物进行PCR检测反应，同时分别设置野生型痘苗病毒和/或重组痘苗病毒VACV-OVA或VACV-ΔA47L的基因组DNA为模板的对照。

PCR扩增体系为：

PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸90秒，循环30次；72℃延伸10分钟，最后置于4℃；

PCR结果：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，观察条带并回收目的片段送测序。

3.1.2WesternBlot验证OVA蛋白表达

(1)小量增殖经纯化的重组痘苗病毒，至70％细胞病变时，收取细胞；

(2)离心，将上清转移至15ml离心管内，加入等体积饱和硫酸铵溶液，置于旋转摇床4℃过夜，使蛋白质充分沉淀；

(3)细胞用PBS洗两次后，加1mlRIPA裂解液混匀，摇床冰上震荡1小时，4℃/12000rpm离心10分钟，取上清置于新的1.5ml离心管中，-20℃过夜后，将上清液4℃/12000rpm离心10分钟，弃上清保留沉淀；

(4)将上述两步收获的混匀，-20℃保存备用。

按照改良的BCA蛋白定量分析试剂盒提供的蛋白定量方法，进行蛋白的定量分析。一抗采用兔抗OVA抗体，二抗采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，暗室中进行曝光检测重组痘苗病毒的OVA蛋白表达，同时以野生型痘苗病毒为阴性对照，以VACV-OVA为阳性对照。

3.2重组病毒的纯化

取鉴定无误后的重组痘苗病毒，用BSC-1细胞进行培养增殖。将收获的病毒采用密度梯度离心进行纯化，分装后保存于-80℃。

步骤4、各项指标检测

4.1重组病毒的生物学特性

以野生型痘苗病毒和重组病毒(VACV-ΔA47L和VACV-ΔA47L-OVA)分别感染CV-1和BSC-1细胞，感染剂量为0.05MOI，培养条件为34℃/5％CO₂。分别于12、24、36、48、60、72小时收获细胞，冻融3次，超声破碎后，测定滴度并绘制病毒生长曲线。

4.2细胞免疫应答反应检测

C57BL/6小鼠随机分组，每组3-4只，每只小鼠腹腔注射200μL内含滴度为10⁶PFU的野生型或重组病毒。初次免疫应答组7天后收集小鼠脾脏细胞，抗原肽A47L或OVA_257-264刺激后分别进行细胞表面分子和胞内细胞因子染色，标记CD8⁺和IFN-γ⁺细胞。免疫记忆组在初次感染病毒6周后，每只小鼠再次注射10⁶PFU的重组病毒VACV-ΔA47L-OVA，7天后收集小鼠脾脏细胞，抗原肽刺激后标记CD8⁺和IFN-γ⁺细胞。流式细胞检测采用美国BectonDickinson公司FACScan流式细胞仪，每份样品均测定2x10⁵细胞，采用FlowJo软件对流式结果进行分析。每实验重复三次。

结果

1、转移质粒pSC11A47L-OVA的构建与鉴定

构建成功的质粒pSC11A47L-OVA如图1所示。使用OVA-F1/R1引物对以VACV-OVA基因组DNA为模板扩增OVA基因，将其连接入线性化的中间质粒pSC11A47L载体中。使用验证引物OVA-F2/R2引物对，以PCR反应验证外源基因OVA导入情况，PCR扩增后得到大小为1527bp的产物(图2)，与预期大小一致。对于成功导入的质粒，用酶切方法鉴定外源基因***的正确性，并与使用VectorNTI分析预测的酶切结果(图3)进行比对，确定正向连接的质粒，并经测序验证无误。

2、重组病毒的鉴定

采用蓝斑筛选法连续纯化5代(图4)，采用基因测序并使用PCR和WesternBlot进行分子生物学鉴定无误后，进行重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)的体外增殖，并将收获的病毒采用密度梯度离心进行纯化(图5)，分装后保存于-80℃。使用PCR验证重组病毒中的A47L基因和OVA基因，并用WesternBlot验证OVA蛋白在感染细胞中的表达。检测结果表明A47L在重组病毒中稳定缺失(图6)，而***的OVA基因经多次传代后仍稳定存在(图7)，其产物表达良好，表现为45kD的蛋白条带(图8)。

3、重组病毒的生物学特性

以野生型痘苗病毒和重组病毒(VACV-ΔA47L和VACV-ΔA47L-OVA)分别感染BSC-1和CV-1细胞，在不同时间收获病毒并绘制病毒生长曲线。结果表明，在同一时间点，三种病毒空斑形成的大小、形状无明显差别；VACV-ΔA47L-OVA在BSC-1和CV-1细胞中的生长曲线与对照的野生型痘苗病毒和VACV-ΔA47L均非常相似(图9、图10)。A47L基因缺失及外源OVA***对病毒本身的生物学特性，包括空斑形成和在细胞中的繁殖复制等无明显影响。

4、重组病毒引发的免疫应答

给予C57BL/6小鼠腹腔注射10⁶PFU剂量的重组病毒VACV-ΔA47L-OVA，7天后检测发现，相比野生病毒，针对A47L的免疫应答被消除，但重组病毒可成功诱导针对OVA的特异性细胞免疫应答(图11)；在初次免疫6周后给予免疫加强，则针对OVA的免疫应答明显增强(图12)。以上结果表明，去除A47L后，其他强抗原表位包括外源性抗原，仍旧能够成功诱导初次免疫应答并具有免疫记忆效应。

综上所述，外源性OVA基因导入痘苗病毒后，对痘苗病毒的生物学特性无明显影响，且具有良好的表达；A47L缺失能够稳定传代，且对痘苗病毒的生物学特性无明显影响。去除A47L的重组病毒能够引起有效的针对OVA的细胞免疫反应和免疫记忆效应。因此，去除A47L的痘苗病毒可更好地表达外源性基因。通过去除病毒本身的抑制性表位，可望为多价抗原复制性疫苗提供更为有效的痘苗病毒载体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种去除A47L基因从而降低自身免疫优势的重组WR株痘苗病毒。

2.一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，利用病毒体外重组，以OVA取代A47L，获得A47L基因缺失的重组痘苗病毒，包括如下步骤：

S1、构建质粒pSC11A47L-OVA；

S2、在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组；

S3、通过多轮筛选获得重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)。

3.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，在质粒pSC11中***A47L左右侧同源序列(分别为A47LL和A47LR)及OVA，抗性筛选标记为氨苄青霉素抗性基因，同时包含重组病毒筛选标记LacZ基因。

4.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，所述步骤S1的具体步骤如下：以野生型痘苗病毒的基因组DNA为模板，通过PCR获得A47L左右侧同源片段，通过酶切和连接的方法，以A47LL替代质粒pSC11的TKL片段，A47LR替代质粒pSC11的TKR片段，以VACV-OVA病毒基因组DNA为模板，通过PCR获得有合适酶切位点的OVA基因片段，通过酶切和连接的方法将OVA片段插在P7.5启动子之后。

5.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，利用质粒pSC11A47L-OVA对野生型痘苗病毒进行体外重组，最终以OVA取代病毒中的A47L。

6.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤如下：培养CV-1细胞至80％单层时，以0.05MOI感染野生型痘苗病毒病毒并使用Lipofectamine2000转染pSC11A47L-OVA质粒至感染细胞中，48小时后，收集病毒。

7.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，利用蓝斑筛选和密度梯度离心纯化重组病毒。

8.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法，其特征在于，所述步骤S3的具体步骤如下：取步骤S2收集的病毒冻融三次并超声破碎后感染CV-1细胞，并覆盖琼脂培养基；2天后，加入含有300μg/mLX-gal的上层培养基。挑取孤立蓝斑病毒。重复以上步骤单斑纯化5代，鉴定无误后，使用CV-1细胞进行重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)的体外增殖。将收获的病毒反复冻融三次，超声破碎后采用密度梯度离心纯化病毒，分装保存于-80℃。