CN105861558A - 一种痘苗病毒穿梭载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种痘苗病毒穿梭载体，含有根据胸苷激酶基因TK及其上下游序列设计的同源重组臂TKL和TKR，在TKL和TKR之间存在两个多克隆位点，分别由P11和P7.5启动子启动基因表达，所述穿梭载体含有大肠杆菌复制起始位点pUC ori和氨苄青霉素抗性筛选标记，该穿梭载体的核苷酸序列如序列1所示。本发明提供的痘苗病毒穿梭载体以胸苷激酶TK基因作为减毒目标，同时又作为筛选标记，既可用于筛选重组痘苗病毒，又去除了痘苗病毒的TK基因，降低了病毒毒性。

Description

一种痘苗病毒穿梭载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及一种痘苗病毒穿梭载体，本发明还涉及该穿梭载体的制备方法及其应用。
背景技术
天花是迄今为止，人类在世界范围内利用疫苗这一免疫手段成功根除的唯一一种疾病。痘苗病毒(vaccinia virus，VACV)作为人类消灭天花的疫苗，在人体的应用长达一个多世纪，其安全性和有效性已经在实践中被充分验证。
痘苗病毒属于痘病毒科，正痘病毒属，是一种有包膜的双链DNA病毒，其基因组长达200kbp。作为疫苗的载体或溶瘤病毒，相比其他病毒载体如逆转录病毒、人单纯疱疹病毒和腺病毒等，痘苗病毒具有很多独特的优势，包括：1)安全性高，病毒DNA复制和转录全部在细胞质中完成，这就排除了基因组DNA整合到人染色体的可能性，增强了其作为疫苗载体的安全性；2)病毒本身的基因组大，可***较大的外源基因而仍具有感染性；3)重组病毒构建相对简单，不需要辅助病毒或包装细胞；4)依靠自身启动子，能够高效表达外源蛋白，有效地加工表达产物；5)宿主范围广；6)免疫原性高，能够刺激机体产生良好的免疫反应；7)费用低廉，冻干保存效价稳定。
痘苗病毒作为第一个成功应用于人类的疫苗，引起了长时间普遍的关注和研究，生物医学工作者对痘苗病毒的生物学特性、致病性、免疫性等诸多方面已有了较为透彻的了解。近年来，国外一些学者致力于将痘苗病毒应用于肿瘤的生物治疗，其中一些研究已取得较大突破，部分产品已进入二期临床。目前，全球仍有很多以重组痘苗病毒为生物制剂的研究处于医学临床试验阶段，涉及癌症、艾滋病、肝炎和疟疾等多种疾病的预防和治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种痘苗病毒穿梭载体，该载体可***两种外源基因。
本发明的另一个目的是提供一种痘苗病毒穿梭载体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种痘苗病毒穿梭载体的应用及其方法，即采用该痘苗病毒穿梭载体制备重组痘苗病毒，以胸苷激酶TK基因作为减毒目标和筛选标记。
本发明所采用的第一个技术方案是，一种痘苗病毒穿梭载体，含有根据胸苷激酶基因TK及其上下游序列设计的同源重组臂TKL和TKR，在TKL和TKR之间存在两个多克隆位点，分别由P11和P7.5启动子启动基因表达，所述穿梭载体含有大肠杆菌复制起始位点pUC ori和氨苄青霉素抗性筛选标记，该穿梭载体的核苷酸序列如序列1所示。
本发明的特点还在于，
该穿梭载体的出发载体为pcDNA3.1(+)。
本发明所采用的第二个技术方案是，一种痘苗病毒穿梭载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：
S1、根据野生型WR株痘苗病毒的TK基因及其上下游序列，设计引物，以病毒基因组为模板，PCR获得TK基因的左右臂同源序列TKL和TKR；
S2、将获得的TKL和TKR分别连接至载体pcDNA3.1(+)中，获得中间质粒pcTKLR；
S3、人工设计并合成含有痘苗病毒P11和P7.5启动子序列及两个多克隆位点的序列，即MCS序列。通过酶切连接的方法，连接至质粒pcTKLR中，获得中间质粒pcTKLRS；
S4、经过酶切连接，去掉pcTKLRS质粒中不相关的序列，最终获得穿梭载体pcTK2。
本发明所采用的第三个技术方案是，痘苗病毒穿梭载体的应用，采用痘苗病毒穿梭载体制备重组痘苗病毒的方法，包括步骤：
S5，穿梭载体与野生型痘苗病毒在CV-1细胞内重组；
具体步骤为：
1)在T25培养瓶中培养CV-1单层细胞，至80％覆盖；
2)用野生型痘苗病毒感染CV-1细胞；
3)采用脂质体法将穿梭载体质粒pcTK2转染至感染细胞，野生型痘苗病毒与pcTK2在TK基因左右侧位置发生同源重组；
4)48小时后，收集病毒；
S6，筛选获得重组病毒VACV-TK-；
具体步骤为：
1)在6孔板中培养143TK-细胞，至80％覆盖；
2)采用步骤S5中的病毒感染143TK-细胞，并覆盖琼脂培养基；
3)3天后挑取孤立病毒噬斑，进行进一步筛选，连续单斑筛选5代；
S7，对重组病毒进行PCR及测序鉴定,并进行体外增殖和纯化；
具体步骤为：
1)PCR和基因测序进行分子生物学鉴定；
2)鉴定无误后，进行重组病毒的体外增殖；
3)将最终收获的重组病毒采用密度梯度离心纯化，保存于-80℃。
通过穿梭载体制备表达两种外源基因的重组痘苗病毒，具体步骤为，将痘苗病毒穿梭载体pcTK2的两个表达盒***外源基因，即在启动子P11和P7.5后分别***EGFP基因和Lac Z基因，构建了验证穿梭载体pcTKEZ，以此制备重组痘苗病毒，结果两个外源基因均能在痘苗病毒中正常表达，表明穿梭载体构建成功，且提供了一种可表达外源基因的重组痘苗病毒，该病毒可作为疫苗和基因治疗的载体。
本发明的有益效果是，
(1)本发明提供的痘苗病毒穿梭载体用于制备重组痘苗病毒，以胸苷激酶TK基因作为减毒目标，同时又作为筛选标记，既可用于筛选重组痘苗病毒，又去除了痘苗病毒TK基因，降低了病毒毒性。
(2)本发明提供的痘苗病毒穿梭载体包含早/晚期启动子和晚期启动子，根据表达时间的早晚，可满足不同外源基因表达量不同的需求。
(3)本发明提供的痘苗病毒穿梭载体为以痘苗病毒为载体的活疫苗研发和基因治疗提供了重要工具。
附图说明
图1为本发明中穿梭载体pcTK2的构建步骤；
图2为本发明中验证穿梭载体pcTKEZ示意图；
图3为本发明中重组痘苗病毒EGFP基因PCR图，1号为重组痘苗病毒(738bp)，2号为阴性对照VACV-WR，DNA Marker为Marker III；
图4为本发明中重组痘苗病毒LacZ基因部分片段PCR图，1号为重组痘苗病毒(2024bp)，2号为阴性对照VACV-WR，DNA Marker为Marker III；
图5为本发明中重组痘苗病毒表达EGFP产生的绿色荧光蛋白，A为重组痘苗病毒，B为阴性对照VACV-WR；
图6为本发明中重组病毒在CV-1细胞中的生长曲线；
图7为本发明中重组病毒在Vero细胞中的生长曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
在本发明的实例中，野生痘苗病毒为野生型WR株痘苗病毒，野生型WR株痘苗病毒的基因组DNA序列为GenBank号为AY243312.1的序列(VRL 14-MAR-2006)。
以下实施例中的野生型痘苗病毒WR株在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室(本实验室，下同)保藏。质粒pcDNA3.1(+)由本实验室保藏。质粒pEGFP-N1和pSV-lacZ购自Clontech公司，细胞系CV-1，Vero和134TK-均购自中国典型培养物保藏中心。
主要试剂和材料：
DMEM，胎牛血清，脂质体(lipofectamine 2000)转染试剂均购自Invitrogen公司，Q5高保真聚合酶、限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自NEB公司，病毒基因组提取试剂盒购自Biomiga公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。
实施例1、质粒pcTK-2的构建及鉴定(如图1所示)
将野生痘苗病毒WR株的基因组DNA序列的第80269-80996位(对应序列2的1-728位，命名为上游同源右臂TKL)和第81029-81938位(对应序列3的1-910位，命名为下游同源左臂TKR)，分别克隆至pcDNA3.1(+)质粒，得到含有TK重组臂的pcTKLR质粒，进而将人工合成的含有多克隆位点的启动子表达盒连接到pcTKLR质粒的TKL与TKR之间，得到中间质粒pcTKLRS，然后经酶切连接，去掉pcTKLRS中不相关的序列，获得目的质粒pcTK2。
具体操作如下：
步骤1.野生型痘苗病毒WR株基因组DNA提取
(1)取-80℃冻存的野生型痘苗病毒200μl，4℃解冻。
(2)加入等体积的PLY buffer，漩涡混匀，室温放置15分钟。
(3)加入0.5倍体积的无水乙醇，移液器混匀。
(4)转移裂解液至吸附柱中，13000rpm离心1分钟，将过滤柱转移至一个新的收集管中。
(5)向过滤柱中加入650μl Wash buffer，13000rpm离心1分钟，弃废液。
(6)重复洗一次，弃废液。
(7)将过滤柱放入收集管中13000rpm离心2分钟以去除残留的乙醇。
(8)过滤柱放入新的收集管中，向过滤柱中加入30-50μl DEPC水，室温静置3分钟。
(9)13000rpm离心1分钟，洗脱DNA。
(10)野生型痘苗病毒基因组DNA放置于-20℃备用。
步骤2.引物设计与合成
根据野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列设计并合成如下两对引物：
扩增TK上游同源臂的引物对：
TKL-F1：5’-CCCAAGCTTAACGATGTTCTTCGCAG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为HindIII酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第80269-80285位，即序列2的第1-17位)
TKL-R1：5’-CCGAATTCAACAATGTCTGGAAAGAACTG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为EcoRI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的80976-80996位的反向互补序列，即序列2的第708-728位的反向互补序列)。
扩增TK下游同源臂的引物对：
TKR-F1：5’-TCCCCCCGGGAATAGTTATAGTAGCCGCACTC-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为XmaI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第81029-81050位，即序列3的第1-22位)
TKR-R1：5’-TATGGCGCCCTGAATATGAAGGAGCAAAAG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为KasI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第81918-81938位的反向互补序列，即序列3的第890-910位的反向互补序列)；
去除不相关序列，保留Bla promoter-pUC origin片段的引物对：
P-F1：5’-TATGGCGCCGGCGTAATCATGGTCATAGCTG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为KasI酶切位点识别序列，其后序列为pcDNA3.1(+)质粒的第3262-3282位)
P-R1：5’-CCCAAGCTTCACTACTCAGCGACCTCCAAC-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为HindIII酶切位点识别序列，其后序列为pcDNA3.1(+)质粒的第98-118位的反向互补序列)
步骤3.含多克隆位点的表达盒的人工设计与合成：
选择痘苗病毒早期启动子P11和晚期启动子P7.5，并筛选合适的多克隆位点，多克隆位点位于启动子之后，在两启动子之间设计连接片段，使两启动子保持距离，该人工序列在5’端和3’端的酶切位点分别为XhoI和XmaI。将设计的人工序列送华大基因公司进行合成。合成序列见序列4。
步骤4.穿梭质粒pcTK2的构建及鉴定
(1)以步骤1中野生型痘苗病毒基因组DNA为模板，以步骤2中合成的TK上下游同源臂引物对TKL-F1、TKL-R1和TKR-F1、TKR-R1分别进行PCR，获得带有相应酶切位点的TK上下游同源臂TKL和TKR。
PCR反应体系为：DNA 1μl，dNTP mix(10mM)1μl,正向引物F(10μM)2.5μl，反向引物R(10μM)2.5μl，5×Q5buffer 10μl，Q5聚合酶0.5μl，加DEPC水至总体积50μl。
PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸2分钟，最后置于4℃；
PCR结果：PCR产物上样电泳，TKL为745bp，TKR为929bp，切胶回收目的条带。
(2)首先用限制性内切酶HindIII和EcoRI对上游同源臂TKL进行双酶切，与经同样双酶切的pcDNA3.1(+)质粒的大片段进行连接，得到中间质粒pcTKL，接着用限制性内切酶XmaI和KasI对下游同源臂TKR进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pcTKL的大片段进行连接，得到中间质粒pcTKLR。
(3)用限制性内切酶XhoI和XmaI对步骤3中设计合成的含多克隆位点表达盒的人工序列进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pcTKLR的大片段进行连接，得到中间质粒pcTKLRS。
(4)以pcDNA3.1(+)质粒DNA为模板，以步骤2中合成的用于去除不相关序列、保留Bla promoter-pUC origin片段的引物对P-F1、P-R1进行PCR，获得带有相应酶切位点的Bla promoter-pUC origin片段。
PCR反应体系为：DNA 1μl，dNTP mix(10mM)1μl，正向引物F(10μM)2.5μl，反向引物R(10μM)2.5μl，5×Q5buffer 10μl，Q5聚合酶0.5μl，加DEPC水至总体积50μl。
PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸70秒，循环30次；72℃延伸2分钟，最后置于4℃；
PCR结果：PCR产物上样电泳，片段大小为2303bp，切胶回收目的条带。
(5)用限制性内切酶KasI和HindIII对上述基因片段进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pcTKLRS的小片段进行连接，获得目的质粒。经酶切和测序鉴定无误后，得到穿梭质粒，命名为pcTK2。
实施例2、构建验证穿梭载体pcTKEZ
为验证穿梭载体的有效性，将两个表达盒***了外源基因进行表达验证，在启动子P7.5和P11后分别***EGFP基因(增强型绿色荧光蛋白基因，序列5)和Lac Z基因(β一半乳糖苷酶基因，序列6)，步骤如下：
1.用限制性内切酶BamHI和XbaI对pEGFP-N1进行双酶切，回收751bp片段，与经同样双酶切的穿梭质粒pcTK2的4327bp片段进行连接，将EGFP***到pcTK2的P7.5启动子之后，获得中间质粒pcTKE。
2.以pSV-lacZ质粒的DNA序列为模板，扩增lacZ基因，引物如下：
LacZ-F1：5’-CCGCTCGAGGAGATGGATCCCGTCGTTTTAC-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为XhoI酶切位点识别序列，其后序列为pSV-lacZ质粒的第698-719位)
LacZ-R1：5’-AACTGCAGCTTACGCGAAATACGGGCAG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为PstI酶切位点识别序列，其后序列为pSV-lacZ质粒的第3779-3798位)
PCR反应体系为：DNA 1μl，dNTP mix(10mM)1μl,正向引物F(10μM)2.5μl，反向引物R(10μM)2.5μl，5×Q5buffer 10μl，Q5聚合酶0.5μl，加DEPC水至总体积50μl；
PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸100秒，循环30次；72℃延伸2分钟，最后置于4℃；
PCR结果：PCR产物上样电泳，片段大小为3118bp，切胶回收目的条带。
用限制性内切酶BamHI和XbaI对上述片段进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pcTKE的大片段进行连接，将EGFP***到pcTKE的P11启动子之后，获得目的质粒。
3.经酶切和测序鉴定无误后，得到验证穿梭载体，命名为pcTKEZ，质粒示意图见图2。
实施例3、痘苗病毒的重组，筛选与鉴定
1.痘苗病毒重组
(1)以T25培养瓶培养CV-1细胞至80％单层；
(2)以0.05MOI感染野生型痘苗病毒，37℃培养2小时；
(3)去除病毒液，按照转染试剂Lipofectamine 2000说明书转染pcTKEZ至感染细胞中，培养48小时；
(4)收集细胞，反复冻融三次，进行超声破碎后，保存于-80℃。
2.痘苗病毒的筛选
(1)用6孔板培养143TK-细胞至80％单层；
(2)取经超声破碎后的病毒悬液，做倍比稀释，感染143TK-细胞，37℃培养2小时；
(3)每孔覆盖3ml含BrdU的琼脂培养基进行正向筛选，培养2天；
(4)每孔加入2ml含X-gal的上层琼脂培养基，培养过夜；
(5)在荧光显微镜下观察病毒噬斑绿色荧光蛋白表达情况，同时观察蓝斑情况，挑取孤立蓝斑进行进一步筛选，连续单斑纯化5代，至病毒纯化。
3.重组痘苗病毒的鉴定
将上述经多次单斑纯化的重组痘苗病毒进行小量增殖，然后提取重组痘苗病毒基因组，方法如实施例1。对重组痘苗病毒进行PCR鉴定和基因测序。
EGFP鉴定引物：
EGFP-F1：5’-TCCACCGGTCGCCACCATG-3’
EGFP-R1：5’-CTTTACTTGTACAGCTCGTC-3’
lacZ鉴定引物：
LacZ-F1：5’-TGTCGTCGTCCCCTCAAAC-3’
LacZ-R1：5’-CCAACGCTTATTACCCAGCTCG-3’
以上述提取的重组痘苗病毒的基因组DNA为模板，用上述2对鉴定引物分别进行PCR反应，同时设置野生型VACV-WR为对照。
PCR反应体系：
PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸20秒或100秒，循环30次；72℃延伸2分钟，最后置于4℃；
PCR结果：产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，EGFP基因：738bp，lacZ基因部分片段：2024bp，观察结果并回收目的片段，将回收的目的片段送测序。
4.鉴定结果
基因组PCR检测结果表明，外源基因已整合进痘苗病毒基因组中。重组痘苗病毒EGFP基因为阳性，而阴性对照VACV-WR无EGFP基因(图3)；重组痘苗病毒LacZ基因为阳性，而阴性对照VACV-WR无LacZ基因(图4)；蓝白斑实验表明，重组痘苗病毒可正常表达外源基因lacZ，噬斑周围形成蓝色物质；同时，荧光检测结果表明，重组痘苗病毒可正常表达外源基因EGFP，产生明亮的绿色荧光，而阴性对照VACV-WR无荧光出现(图5，以野生痘苗病毒为阴性对照)。
以上结果表明，以该穿梭载体制备的重组痘苗病毒可同时正常表达两种外源基因，且相互之间无影响。
实施例4、重组痘苗病毒的生物学特性检测
1.取鉴定无误后的重组痘苗病毒，此处命名为VACV-TK-，用Vero细胞进行培养增殖。将收获的病毒采用密度梯度离心进行纯化，分装后保存于-80℃。
2.用VACV-TK-与野生痘苗病毒VACV-WR分别感染CV-1和Vero细胞，感染剂量为0.05MOI，培养条件34℃/5％CO2。分别于24、48和72小时收集病毒，进行滴度测定和噬斑形成能力及噬斑特性的检测。
3.检测结果
VACV-TK-的生长曲线与对照组野生型痘苗病毒VACV-WR在CV-1和Vero细胞中均非常相似(图6和图7)。同一时间点(感染后3天)，在CV-1细胞中形成的病毒噬斑，其大小、形状无明显差别，表明TK缺失和外源基因***后，痘苗病毒本身的生物学特性，包括噬斑形成和在细胞中的感染复制能力等均无明显改变。
以上结果表明，本发明制备了一种可表达量两种外源基因的重组痘苗穿梭载体，该载体包含不同启动子，表达早晚不同，可满足不同外源基因表达量不同的需求，同时提高了重组痘苗病毒安全性，为活病毒载体疫苗的研制和基因治疗提供了更为有效的载体，为生物技术药物的研发奠定了坚实的基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种痘苗病毒穿梭载体，其特征在于，含有根据胸苷激酶基因TK及其上下游序列设计的同源重组臂TKL和TKR，在TKL和TKR之间存在两个多克隆位点，分别由P11和P7.5启动子启动基因表达，所述穿梭载体含有大肠杆菌复制起始位点pUC ori和氨苄青霉素抗性筛选标记，该穿梭载体的核苷酸序列如序列1所示。
2.根据权利要求1所述的痘苗病毒穿梭载体，其特征在于，该穿梭载体的出发载体为pcDNA3.1(+)。
3.一种如权利要求1或2所述的痘苗病毒穿梭载体的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
S1、根据野生型WR株痘苗病毒的TK基因及其上下游序列，设计引物，以病毒基因组为模板，PCR获得TK基因的左右臂同源序列TKL和TKR；
S2、将获得的TKL和TKR通过酶切连接的方法先后连接至载体pcDNA3.1(+)中，获得中间质粒pcTKLR；
S3、人工设计并合成含有痘苗病毒P11和P7.5启动子序列及两个多克隆位点的序列，通过酶切连接的方法，连接至质粒pcTKLR中，获得中间质粒pcTKLRS；
S4、经过酶切连接，去掉pcTKLRS质粒中不相关的序列，最终获得穿梭载体pcTK2。
4.根据权利要求3所述的痘苗病毒穿梭载体的制备方法，其特征在于，S1中根据野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列设计并合成如下两对引物：
扩增TK上游同源臂的引物对：
TKL-F1：5’-CCCAAGCTTAACGATGTTCTTCGCAG-3’；
TKL-R1：5’-CCGAATTCAACAATGTCTGGAAAGAACTG-3’；
扩增TK下游同源臂的引物对：
TKR-F1：5’-TCCCCCCGGGAATAGTTATAGTAGCCGCACTC-3’；
TKR-R1：5’-TATGGCGCCCTGAATATGAAGGAGCAAAAG-3’；
对TK上下游同源臂引物对分别进行PCR，获得带有相应酶切位点的TK上下游同源臂TKL和TKR；
PCR反应体系为：DNA 1μl，dNTP mix(10mM)1μl,正向引物F(10μM)2.5μl，反向引物R(10μM)2.5μl，5×Q5buffer 10μl，Q5聚合酶0.5μl，加DEPC水至总体积50μl；
PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸2分钟，最后置于4℃；
PCR结果：PCR产物上样电泳，TKL为745bp，TKR为929bp，切胶回收目的条带。
5.根据权利要求3所述的痘苗病毒穿梭载体的制备方法，其特征在于，S2中首先用限制性内切酶HindIII和EcoRI对上游同源臂TKL进行双酶切，与经同样双酶切的pcDNA3.1(+)质粒的大片段进行连接，得到中间质粒pcTKL，接着用限制性内切酶XmaI和KasI对下游同源臂TKR进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pcTKL的大片段进行连接，得到中间质粒pcTKLR。
6.根据权利要求3所述的痘苗病毒穿梭载体的制备方法，其特征在于，S3中用限制性内切酶XhoI和XmaI对人工设计并合成含有痘苗病毒P11和P7.5启动子序列进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pcTKLR的大片段进行连接，得到中间质粒pcTKLRS。
7.根据权利要求3所述的痘苗病毒穿梭载体的制备方法，其特征在于，S4中以pcDNA3.1(+)质粒DNA为模板，以用于去除不相关序列、保留Blapromoter-pUC origin片段的引物对进行PCR，获得带有相应酶切位点的Blapromoter-pUC origin片段；
PCR反应体系为：DNA 1μl，dNTP mix(10mM)1μl,正向引物F(10μM)2.5μl，反向引物R(10μM)2.5μl，5×Q5buffer 10μl，Q5聚合酶0.5μl，加DEPC水至总体积50μl；
PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸70秒，循环30次；72℃延伸2分钟，最后置于4℃；
PCR结果：PCR产物上样电泳，片段大小为2303bp，切胶回收目的条带；
其中去除不相关序列，保留Bla promoter-pUC origin片段的引物对：
P-F1：5’-TATGGCGCCGGCGTAATCATGGTCATAGCTG-3’；
P-R1：5’-CCCAAGCTTCACTACTCAGCGACCTCCAAC-3’；
用限制性内切酶KasI和HindIII对上述基因片段进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pcTKLRS的小片段进行连接，获得目的质粒，经酶切和测序鉴定无误后，得到穿梭载体。
8.一种痘苗病毒穿梭载体在制备重组痘苗病毒作为活病毒载体疫苗及亚单位疫苗制备及生物制药中的应用。
9.采用权利要求1或2所述的痘苗病毒穿梭载体制备重组痘苗病毒的方法，其特征在于，包括步骤：
S5，穿梭载体与野生型痘苗病毒在CV-1细胞内重组；
具体步骤为：
1)在T25培养瓶中培养CV-1单层细胞，至80％覆盖；
2)用野生型痘苗病毒感染CV-1细胞；
3)采用脂质体法将穿梭载体质粒pcTK2转染至感染细胞，野生型痘苗病毒与pcTK2在TK基因左右侧位置发生同源重组；
4)48小时后，收集病毒；
S6，筛选纯化获得重组病毒VACV-TK-；
具体步骤为：
1)在6孔板中培养143TK-细胞，至80％覆盖；
2)采用步骤S44中的病毒感染143TK-细胞，并覆盖琼脂培养基；
3)3天后挑取孤立病毒噬斑，进行进一步筛选，连续单斑筛选5代；
S7，对重组病毒进行PCR及测序鉴定，鉴定无误后，进行重组病毒的体外增殖，并将最终收获的病毒采用密度梯度离心纯化，保存于-80℃。
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