CN105483140B - 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了埃博拉病毒GP蛋白密码子优化的一种核苷酸序列，还公开了能够表达该核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒及在制备预防埃博拉病毒病疫苗中的应用。所述核苷酸序列以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，携带的保护性抗原基因是密码子优化后的Zaire型埃博拉病毒Makona株包膜糖蛋白基因。包膜糖蛋白基因经密码子优化后，在转染细胞中的表达水平明显增高。所述核苷酸以腺病毒为载体作为埃博拉病毒病疫苗免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应。该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于应对突发埃博拉疫情和生物恐怖袭击。

Description

一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗
技术领域
本发明公开了一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗，目的在于预防埃博拉病毒病。本发明属于生物工程技术领域。
背景技术
埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)属于丝状病毒科，可引起人和灵长类动物产生出血热。1976年首次发现于苏丹南部和扎伊尔的埃博拉河地区，“埃博拉”由此得名。发病者有发烧、呕吐、腹泻、体内外出血、脑肝肾功能损害等，死亡率高达50％～90％。埃博拉病毒感染引起的疾病在2014年以前的称为“埃博拉出血热(Ebola hemorrhagic fever)”；2014年西非埃博拉疫情爆发之后，世界卫生组织和美国疾病预防控制中心已将埃博拉出血热更名为埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)。
目前已发现的埃博拉病毒包括5个亚种：扎伊尔型(Zaire ebolavirus,EBOV)、苏丹型(Sudan ebolavirus,SUDV)、塔伊森林型(Forest ebolavirus,TAFV,又叫科特迪瓦型或象牙海岸型)、本迪布焦型(Bundibugyoe ebolavirus,BDBV)和莱斯顿型(Restonebolavirus,RESTV)。前4种埃博拉病毒都有感染人类并导致类似临床症状的报道，目前仅在非洲发现。其中，扎伊尔型对人致病性最强,苏丹型次之。
在2014年西非埃博拉疫情肆虐之前，历史上埃博拉疫情共发生24起，死亡人数累积约1500人，主要发生在非洲中部的刚果、乌干达、苏丹等地，疫情一般发生在人烟稀少的地区，单次疫情死亡没有超过300人。2014年疫情起始于几内亚，迅速蔓延到了周边的利比里亚、塞拉利昂等国家，众多EVD患者出现在人口稠密的大城市，如几内亚的首都科纳克里，塞拉利昂的首都弗里敦，利比里亚首都蒙罗维亚和尼日利亚首都拉各斯，病毒呈现出沿交通干线传播的特征，而且首次传播到非洲大陆以外的地区，如美国、英国、西班牙等地。截止到2015年12月，死亡人数已逾万人。
截止到2015年12月，目前世界上还没有批准的埃博拉疫苗或者治疗药物。许多实验室和制药公司正在进行EBOV疫苗和治疗药物的研发。这些疫苗包括DNA疫苗、亚单位疫苗、非复制型和可复制型病毒载体疫苗，一些DNA疫苗或者基于活病毒载体的疫苗已经进入到临床研究阶段。
埃博拉病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)是埃博拉病毒包膜唯一的表面蛋白，具有2个阅读框，分别编码1个分泌型的小蛋白sGP和1个全长的跨膜GP。GP被认为是埃博拉病毒致病性的重要决定因素，它通过与受体结合介导病毒进入宿主细胞，并可通过与内皮细胞结合破坏微血管的完整性，引起血管渗漏。而与此同时，GP也是诱导产生保护性免疫反应的主要靶蛋白。目前，所有埃博拉病毒疫苗的研究基本上以GP(或GP联合NP)作为目标抗原，而在动物实验中证明有效的单克隆抗体(或抗体混合物)也都是靶向于GP的抗体。传统的灭活疫苗及亚单位疫苗对埃博拉病毒无效，目前在研的疫苗中动物保护效果良好的疫苗是以GP为目标抗原的基于活病毒载体的疫苗。如何实现以最低的免疫剂量来携带尽可能多的GP成为急需解决的问题。
AdMax***由含有loxP位点的穿梭质粒、骨架质粒和HEK-293细胞株组成，外源基因序列被构建入穿梭质粒后，通过与骨架质粒在HEK-293细胞中进行基因重组来产生重组腺病毒。
AdMax腺病毒***是由Frank Graham在1999年创建的一套重组腺病毒构建***，目前已被加拿大的Micobix公司开发成为一种腺病毒载体包装***。AdMax***进行重组腺病毒包装的基本原理是通过Cre-loxP或FLP-frt重组酶，使转染进HEK-293细胞的穿梭质粒和骨架质粒发生定点重组，产生重组腺病毒，这样得到的重组病毒是E1缺失的复制缺陷型腺病毒，病毒在不能够提供E1区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能力。AdMax***的特点是通过重组酶在真核细胞内完成重组出毒，高效且稳定，是目前最方便快捷的腺病毒包装***之一。
与现在使用最普及的AdEasy***相比，AdMax***出毒更快，能够高效率、简便而快速地获得重组腺病毒，并且病毒的产率(yielding)明显提高。利用AdMax***，只需要2～4周就能完成从质粒构建到重组出毒的全过程，成功率大于98％(其中95％的克隆含有目的基因)，因为重组出毒是在真核细胞内完成的，保持了对腺病毒的生存压力，因此有助于保持重组腺病毒基因组的完整性；而AdEasy***的出毒成功率只有18-34％(Stratagene公司新版的AdEasyXL***成功率在94％左右)，而且在原核细胞(BJ5183)中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。
虽然AdMax***具有出毒快，产率高等优点。但作为一种有效的活病毒载体疫苗，除了载体本身的优势，如何使***的外源目标蛋白更有效的表达至关重要。如果外源蛋白的表达水平过低，需通过增加免疫剂量来获得有效的免疫效果，这样必然会增加载体对接种者的不良影响。因此，通过对目标蛋白的基因进行优化，使其能够更高效的正确表达，是提高疫苗免疫效果的一种有效方法。
基于埃博拉病毒病的现实威胁，及现有技术在疫苗预防效果上效率不高，以及AdMax***在应用上存在的技术难题，本申请人欲通过对GP进行密码子优化，使其在真核细胞中的表达量明显增高，并提供具有更强免疫原性，在相同剂量下能够诱导更高水平的抗体的重组腺病毒载体埃博拉病毒病疫苗。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一种用于重组腺病毒载体埃博拉疫苗的GP蛋白基因密码子优化的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述核苷酸序列以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，经包装获得重组腺病毒载体埃博拉病毒病疫苗。
本发明还提供了含有上述核苷酸序列的载体。
在一个优选的实施方案中，所述载体为pDC316。
本发明还提供了一种能够表达上述核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒。
在一个优选的实施方案中，所述重组腺病毒载体来源于AdMax腺病毒***。
本发明还提供了上述重组腺病毒载体在制备预防埃博拉病毒病疫苗中的应用。
在一个优选的实施方案中，上述应用中，所述重组腺病毒被制备为注射剂。
最后，本发明提供了一种制备上述的可表达埃博拉GP蛋白的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建含有埃博拉病毒GP蛋白核苷酸编码序列的穿梭质粒载体；
(2)将步骤(1)所述载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；
(3)培养步骤(2)所述宿主细胞；
(4)从步骤(3)所述宿主细胞中提取可表达埃博拉GP蛋白的人复制缺陷重组腺病毒。
优选地，步骤(1)所述载体为pDC316。
优选地，步骤(2)所述骨架质粒为pBHGlox_E1,3Cre，两种质粒均属于AdMax腺病毒***，共同用于在宿主细胞中进行含有编码GP蛋白的核苷酸序列的重组腺病毒包装。
优选地，步骤(3)所述细胞为HEK 293细胞
优选地，在步骤(4)中采用Source 30Q和Sepharose4 FF两步法柱层析对重组埃博拉病毒GP蛋白进行提取并纯化。
本发明提供的可表达埃博拉GP蛋白的重组腺病毒作为埃博拉病毒病疫苗免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应。该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于应对突发埃博拉疫情和生物恐怖袭击。而且GP蛋白的基因经密码子优化后，在转染细胞中的表达水平明显增高，以其为基础而包装的重组腺病毒载体埃博拉病毒病疫苗所诱导的体液免疫水平在原有基础上又有很大程度的提高。体液免疫水平的提高对于预防埃博拉病毒病的感染具有重要的意义。
附图说明
图1穿梭质粒图谱；
图2GP体外表达鉴定Western blot检测图谱；
图3第一代毒种PCR鉴定图谱；
图4重组腺病毒埃博拉疫苗GP表达鉴定Western blot检测图谱；
图5疫苗纯化Source 30Q层析图谱；
图6疫苗纯化Sepharose 4 FF层析图谱；
图7重组腺病毒埃博拉疫苗纯化样本PCR鉴定图谱；
图8重组腺病毒载体埃博拉疫苗纯化样品GP表达鉴定Western blot检测图谱；
图9重组腺病毒载体埃博拉疫苗负染透射电镜观察图；
图10重组腺病毒载体埃博拉疫苗冷冻切片透射电镜观察图；
图11疫苗免疫小鼠血清抗体IgG水平随时间变化曲线图；
图12流式细胞术检测疫苗免疫小鼠脾细胞IFNγ分泌水平的统计分析图；
图13ELISPOT检测疫苗免疫小鼠脾细胞IFNγ分泌水平统计分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗的制备
1.GP基因密码子优化及合成。
对2014年西非几内亚暴发流行的Zaire型埃博拉病毒Makona株(Genebank编号：KJ660346.1)包膜糖蛋白的基因使用Upgene软件(Gao,W.,Rzewski,A.,Sun,H.,Robbins,P.D.,&Gambotto,A.(2004).UpGene:Application of a web-based DNA codonoptimization algorithm.Biotechnol Prog,20(2),443-448.doi:10.1021/bp0300467)进行密码子优化，使其更适合在真核细胞中表达。密码子优化后，GP核苷酸序列整体变化24.2％。同时，将GP原始信号肽(1aa-32aa)改为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA，并在翻译起始密码子前面加入Kozak序列，进行基因合成。与此同时，作为对照，将包膜糖蛋白基因的原始序列进行合成。密码子优化GP基因序列(酶切位点为EcoRI和HindIII)见SEQ ID NO:1，GP原始基因序列(酶切位点为EcoRI和HindIII)见SEQ ID NO:2。
2.载体构建和GP的体外表达鉴定。
2.1载体构建。
以上合成的基因序列，分别用EcoRI和HindIII进行双酶切，回收目的基因片断，将其连接至AdMax腺病毒***(加拿大Microbix Biosystems Inc.)的穿梭质粒pDC316上，转化DH5-α感受态，涂布Ampr LB平板，挑单克隆进行菌落PCR鉴定，并对PCR鉴定为阳性的克隆进行测序验证。GP基因序列未进行密码子优化的质粒记为pDC316-GGP，GP基因密码子优化后的质粒记为pDC316-GGPopt，质粒图谱如图1所示。其中A为pDC316-GGPopt质粒图谱，B为pDC316-GGP质粒图谱。
2.2 GP的体外表达鉴定。
将以上构建的2个穿梭质粒和pDC316载体，使用转染试剂TurboFectTransfection Reagent转染至293T细胞，48小时后收细胞进行WB检测。实验方法如下：
转染：实验前一天，293T细胞以8×105细胞/孔接种6孔板，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。转染前1小时，将培养基换成新鲜的含2％胎牛血清的MEM培养基，每孔2mL。转染时，每个转染孔取对应质粒2μg，加入到200μL无胎牛血清的MEM培养基中，混匀，加入转染试剂3μL，轻轻混匀，室温放置15分钟。将质粒和转染试剂混合液轻轻滴加到6孔板中，轻摇混匀。细胞于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，5小时后将培养基换成新鲜的含10％胎牛血清的MEM培养基，48小时后收集细胞，制备样品，进行WB检测。
样品制备：转染48小时后，小心地吸弃培养基，用PBS洗涤细胞一次。将6孔板置于冰上，每孔各加入120μL细胞裂解液(含50mmol/L DTT、1×蛋白酶抑制剂和250U/mL核酸酶的1×SDS-PAGE Buffer)。用细胞刮刀将裂解的细胞收集起来，转移至1.5mL EP管中，冰浴15分钟，95℃加热5分钟，冰浴冷却，4℃12000rpm离心5分钟，取上清分装，冻存，用于WB检测。
WB检测：使用10孔的12％SDS-PAGE胶进行SDS-PAGE，上样量每孔10μL。电泳条件：80V，15min；180V，直到溴酚蓝刚好从凝胶中出来为止。将SDS-PAGE胶上的蛋白质通过电转仪转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为300mA，1小时。电转完成后，将硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉封闭1小时，然后以1:500的稀释度加入抗Zaire型GP兔血清，4℃放置过夜。将膜用WB洗涤液洗涤4次，每次于摇床上摇动7分钟。然后加入以1:5000稀释于5％脱脂奶粉的HRP标记的抗小鼠IgG抗体，室温孵育1小时。用WB洗涤液将膜洗涤4次，使用ImmobilonTM WesternChemiluminescent HRP Subsrate(MILLIPORE)进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。结果如图2所示，其中1：转染pDC316空载体细胞样品；2：转染密码子未优化穿梭质粒pDC316-GGP细胞样品；3：转染密码子优化穿梭质粒pDC316-GGPopt细胞样品；4：蛋白质分子质量标准。2个载体GP均可在转染的293T细胞中良好表达。其中密码子优化后GP的表达量有所增加，根据灰度分析，GP密码子优化后其在293T细胞中的表达量约为未优化的2倍。
3.疫苗的包装、制备和鉴定。
3.1疫苗的包装
将以上构建好的载体pDC316-GGP和pDC316-GGPopt分别与AdMax腺病毒***的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK 293细胞进行重组腺病毒的包装。过程如下：
a)转染前一天，将HEK293细胞接种于六孔板中，每孔5×105个细胞,培养基为MEM+10％FBS，置37℃含5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
b)转染当天换液，用新鲜的含10％FBS的MEM培养基继续培养。待细胞生长至底面积的80-90％时，取骨架质粒(pBHGlox_E1,3Cre)和穿梭质粒，用LipofectamineTM 2000脂质体按其所附说明书进行转染。具体步骤为：
(1)每个转染孔取骨架质粒4μg，穿梭质粒1μg，混和均匀。
(2)质粒用300μL无血清的MEM培养液进行稀释，室温放置5min。
(3)取10μL脂质体用300μL无血清MEM培养液进行稀释，室温放置5min。
(4)将两者混和，室温避光放置30min。然后将混合物加入到细胞中。
c)转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm2细胞培养瓶中，用含5％FBS的MEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cm2细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落时进行收毒。
d)将出毒的细胞培养瓶先后置于-70℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液3000rpm离心5min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为第一代毒种(P1)，作为随后大量病毒扩增的毒种。
所包装的埃博拉重组腺病毒一代毒种，分别记为Ad5-GGP和Ad5-GGPopt。
3.2第一代毒种的鉴定
3.2.1 PCR扩增EBOV-GP全序列
使用pDC316载体的通用引物，扩增EBOV-GP的全序列，引物序列如下：
pDC316-F:ACGTGGGTATAAGAGGCG
pDC316-R:CGATGCTAGACGATCCAG
根据天根生物病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)说明书，提取埃博拉重组腺病毒一代毒种基因组，使用以上引物，进行PCR鉴定。
PCR扩增条件为：
反应程序为：
PCR扩增结果如图3所示，其中1：阳性对照；2：DNA分子质量标准(Takara DL2000)；3：Ad5-GGPopt一代毒种DNA/RNA扩增产物；4：Ad5-GGP一代毒种DNA/RNA扩增产物。图3显示目的条带均正确。
3.2.2埃博拉重组腺病毒目标蛋白表达鉴定
将埃博拉重组腺病毒一代毒种感染293T细胞，48小时后收集细胞进行GP的Western blot检测，可以看到疫苗感染的细胞均出现了目标条带，结果如图4所示。其中1：Ad5-GGP感染细胞样品；2：Ad5-GGPopt感染细胞样品；3：空白细胞样品；4：蛋白质分子质量标准。
3.3重组腺病毒的扩大培养和纯化
3.3.1重组腺病毒工作种子批培育。
经构建、鉴定合格的毒种，记为P1代。将P1代在HEK293细胞上感染一次后收获的病毒种子液作为原代种子批(记作P2代)。从原代种子批随机复苏一支毒种。连续传代2次构建主种子批(记为P4代)；从P4代开始，连续传代2次构建工作种子批(记为P6代)。
3.3.2重组腺病毒小规模培养。
HEK293细胞在37℃、5％CO2条件下130rpm悬浮培养。毒种接种时，将活度大于95％的细胞稀释至1.0×106cells/mL，终体积为1L。P6代重组腺病毒以MOI 10感染HEK293细胞，37℃，5％CO2，130rpm摇动培养。每隔24小时取样，检测细胞活度和密度。
毒种接种72小时后，当细胞活度下降到40％以下时，每个细胞摇瓶各加入10mL吐温-20(终浓度1％)，130rpm，继续摇动1小时。细胞培养液于6000rpm离心30分钟，取上清，-70℃冻存。沉淀用等体积20mM Tris，250mM NaCl，1mM MgCl2，pH 7.5重悬，加入1％的吐温-20，130rpm，37℃摇1小时。悬液于6000rpm离心45分钟，取上清，于-70℃冻存。
3.3.3重组腺病毒的纯化
以上-70℃冻存的重组腺病毒培养液(2瓶共4L)，融化后合并。用300kDa膜包超滤浓缩至500mL，加入等体积20mM Tris+150mM NaCl+2mM MgCl2 pH7.5(A液)，超滤换液3次后，浓缩至最小体积(约200mL)，排空膜包及管路后，用少量A液冲洗管路(约150mL)，所得液体合并至超滤浓缩液，混匀。加入Benzonase(30U/mL)，37℃水浴，酶解4h。
采用Source 30Q和Sepharose4 FF两步分离纯化腺病毒颗粒；第一步柱层析主要去除大部分杂蛋白质，收集洗脱峰，而第二步柱层析去除杂DNA分子和部分杂蛋白，收集的是流穿样品。具体过程如下：
Source 30Q层析：Source 30Q层析过程如图5所示，层析柱用A液平衡，上样，上样流速为5mL/min；上样结束，用A液平衡至Uv基线，10mL/min,50min,0％B-20％B梯度洗脱，分管收集洗脱峰，最后100％B洗脱，B液为20mM Tris+2M NaCl+2mM MgCl2 pH7.5。洗脱峰出现在NaCl浓度530mM左右的缓冲液里。
Sepharose 4 FF层析：上述洗脱峰使用Sepharose 4 FF进一步纯化。Sepharose 4FF层析过程如图6所示，流动相为A液，流速5mL/min，限压0.3MPa，收集外水体积峰。纯化后的疫苗经鉴定后用0.22μm一次性滤器过滤除菌，分装保存于-70℃冰箱中。
3.4重组腺病毒载体埃博拉疫苗纯化样品的鉴定和滴度测定
3.4.1 PCR扩增EBOV-GP全序列和测序
实验方法和过程同3.2.1，结果如图7所示，其中1：阳性对照；2：Ad5-GGPopt纯化样品DNA/RNA扩增产物；3：Ad5-GGP纯化样品DNA/RNA扩增产物；4：阴性对照；5：DNA分子质量标准(Takara DL2000)。疫苗纯化样品均检测到目标条带。将目标条带胶回收并测序，比对结果表明，疫苗纯品所包含的序列完全正确。
3.4.2 WB检测
将埃博拉重组腺病毒纯化样品以MOI＝10感染293T细胞，48小时后收集细胞进行GP的Western blot检测，结果如图8所示，其中1：空白细胞样品；2：表达炭疽保护性抗原PA的重组腺病毒(Ad5-PAopt)感染细胞样品；3：Ad5-GGP感染细胞样品；4：Ad5-GGPopt感染细胞样品；5：蛋白质分子质量标准。可以看到疫苗纯化样品感染的细胞均出现了目标条带，对照重组腺病毒感染的细胞和空白细胞没有目标条带。
3.4.3滴度测定
使用Clontech Adeno-XTM Rapid Titer Kit进行重组腺病毒滴度的测定。操作按试剂盒所附说明书进行，具体方法如下：
a)将HEK293细胞接种于24孔板。细胞密度为5×105cells/mL，每孔接种0.5mL，培养基为MEM+10％FBS；
b)使用培养基把将要检测的病毒从10-2至10-6进行10倍稀释，制备一系列稀释度的病毒样品，每孔50μL加入到细胞中；
c)细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养48小时；
d)吸弃细胞的培养基，让细胞稍微晾干(不要过干)，每孔轻轻加入0.5mL冰甲醇，于-20℃放置10分钟，对细胞进行固定；
e)吸弃甲醇，用PBS+1％BSA将细胞轻轻地洗3次，每孔加入0.25mL抗-Hexon抗体稀释液(1:1000稀释)，37℃孵育1小时；
f)吸弃抗-Hexon抗体，用PBS+1％BSA将细胞轻轻洗3次，每孔加入0.25mL HRP标记的Rat Anti-Mouse Antibody(1:500稀释)，37℃孵育1小时；
g)在吸弃0.25mL HRP标记的Rat Anti-Mouse Antibody之前，将10×DAB底物用1×Stable Peroxidase Buffer稀释成1×DAB工作液，让其达到室温；
h)吸弃Rat Anti-Mouse Antibody稀释液，用PBS+1％BSA将细胞轻轻地洗3次。每孔加入0.25mL DAB工作液，室温放置10分钟；
i)吸弃DAB工作液，用PBS将细胞轻轻地洗2次；
j)于显微镜下对棕色/黑色的阳性细胞进行计数，每孔至少随机计数3个视野，计算其平均阳性细胞数；
k)计算感染滴度(ifu/mL)，公式如下：
滴度测定结果显示，Sepharose 4 FF层析洗脱的峰尖，感染滴度达1.0×1010ifu/mL。
3.4.4电镜观察形态
3.4.4.1负染
将纯化的重组腺病毒液体滴于载网，静置5-10min后用滤纸吸去载网边缘多余的液体。于载网未完全干时，滴上磷钨酸钠染色液，染色3-5min，用滤纸吸去载网边缘多余液体，自然干燥，透射电镜观察。结果如图9所示，其中A：放大2万倍的观察结果；B：放大15万倍的观察结果。重组腺病毒载体埃博拉疫苗的形状与腺病毒一致。
3.4.4.2冷冻切片
将纯化的重组腺病毒埃博拉疫苗以MOI 10感染HEK293细胞，待细胞开始病变，从培养瓶上脱落时，收细胞，进行冷冻切片处理，透射电镜观察，结果如图10所示，其中A：放大0.5万倍的观察结果；B：放大1.5万倍的观察结果。可以看到细胞内遍布腺病毒样颗粒。
实施例2埃博拉病毒病疫苗在小鼠模型上的免疫学评价。
1.实验材料。
1.1实验动物
SPF级雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)，购自军事医学科学院实验动物中心。小鼠于军事医学科学院丰台院动物房饲养。
1.2实验材料
荧光标记抗体PerCP/Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD3e(clone 145-2c11)，FITC RatAnti-Mouse CD8a(clone 53-6.7)购自美国Biolegend公司；荧光标记抗体PE Rat Anti-Mouse IFN-γ(clone XMG1.2)，固定穿透液Cytofix/CytopermTM Fixation andPermeabilizaiton Solution，洗液Perm/WashTM Buffer，BDTM ELISPOT set，BDTM ELISPOTAEC substrate set和阻断GolgiStop购自美国BD公司；ACK红细胞裂解液自配；RPMI1640培养基购自弘博康公司；TMB，过氧化脲，PMA和ionomycin购自美国sigma公司；BSA购自Merck公司；HRP标记抗小鼠IgG抗体购自美国Santa Cruz公司；截短分泌型GP(46aa-364aa)为本室纯化；对照重组腺病毒载体疫苗Ad5-PAopt为本室构建。
2.小鼠免疫。
根据实验设计，将纯化的重组腺病毒埃博拉疫苗和重组腺病毒载体对照疫苗用生理盐水稀释到感染滴度为2×108ifu/mL，使用1mL注射器，经左后腿内侧肌肉注射免疫，每只50μL，每只小鼠的免疫剂量为1×107ifu。小鼠免疫分组情况如下：
表1.体液免疫水平检测及细胞免疫水平免疫后22周检测小鼠分组情况。
表2.细胞免疫水平免疫后2周检测小鼠分组情况。
3.体液免疫水平的检测。
3.1采血及血清分离
小鼠免疫后，在特定的时间点上经尾静脉采血。血液于室温静置1小时以上。待血清形成，5000rpm离心10分钟，将血清转移至新的离心管，-20℃冻存，待用。
3.2血清抗体水平ELISA检测
实验前一天，ELISA板条用截短分泌型GP以4μg/mL的浓度进行包被，于4℃放置过夜。实验当天，甩弃孔内液体，用ELISA洗液(PBS+0.1％吐温-20)清洗3次。甩弃洗液，并于干净吸水纸上拍净孔内液体，每孔加入120μL2％BSA，于37℃封闭1小时。甩弃封闭液，将板清洗3次，每孔加入100μL样品稀释液(PBST+0.2％BSA)。血清样品以特定的初始稀释度进行对倍稀释(初始稀释度通过预实验来确定)，每个样品设8个稀释度。同时每板设定2个不加血清的空白对照孔。血清稀释完成后，于37℃孵育1小时。ELISA板用洗液洗4次，每孔100μL加入对应稀释好的二抗(抗小鼠IgG抗体)，于37℃孵育50分钟。用洗液洗板4次，甩净孔内的液体，进行显色反应。显色过程为每孔加入50μL的显色液A液，再加入50μL的显色液B液，显色5分钟后用2mol/L硫酸终止反应。最后在酶标仪上检测450nm处的吸光值。样品中OD450大于空白孔2.1倍读数的孔设为阳性孔。每个血清样品中稀释度最大的阳性孔的稀释倍数记为本样品的抗体滴度。
检测结果如图11所示，GP密码子优化后，埃博拉疫苗免疫小鼠能在更短的时间内产生抗体，免疫后1周即可检测到特异性抗体；同时，抗体水平更高，血清抗体滴度为未优化的4倍；除此之外，抗体滴度在免疫后22周以内能够维持在一个稳定的水平上。
4.细胞免疫水平的检测。
4.1脾淋巴细胞的分离
颈椎脱臼处死，于70％酒精浸泡3分钟。将小鼠于生物安全柜内无菌取出脾脏，放到置于无菌平皿中的200目细胞筛上。加入10mL RPMI1640完全培养基，用注射器的活塞将脾轻柔地研磨成单个细胞，再用20mL RPMI1640完全培养基冲洗细胞筛，以获得更多的脾细胞。将脾细胞悬液转移至50mL离心管中，于4℃500g离心5分钟。弃上清，细胞用3mL ACK红细胞裂解液重悬，室温裂解5分钟，加入27mL RPMI1640完全培养基，4℃500g离心5分钟。弃上清，细胞再用30mL RPMI1640完全培养基清洗一次，用适量培养基重悬，经200目细胞筛过滤至10mL试管中，取50μL稀释20倍后进行计数，待用。
4.2流式细胞术检测特异性细胞因子分泌情况。
4.2.1小鼠脾细胞的体外刺激
将上面分离的小鼠脾细胞取适量稀释至4×106cells/mL，每孔0.5mL加入到24孔板中。每只小鼠的脾细胞分别设特异CTL表位刺激孔和无刺激孔。特异CTL表位刺激所使用的肽为GF-9和LV-9，浓度分别为10μg/mL。作为阳性对照，加入PMA和ionomycin刺激孔，其中PMA浓度为100ng/mL，ionomycin浓度为1μg/mL。细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养1小时后，每孔各加入适量的GolgiStop(4μL作用于6mL细胞)作为细胞因子分泌的阻断剂。总共培养6小时后进行相关抗原的染色，用于细胞内细胞因子的流式细胞术检测。
4.2.2细胞表面抗原和细胞内细胞因子的染色
脾细胞经体外刺激6小时后，转移至流式管中，4℃，500g离心5分钟，弃上清。用PBS+2％FBS按说明书推荐的使用量先稀释好适量的荧光标记抗体PerCP/Cy5.5-conjugatedanti-CD3(clone 145-2c11)和FITC conjugated anti-CD8(clone 53-6.7)，每管加入50μL，轻轻混匀，4℃放置30分钟。30分钟后，每管加入3mL PBS+2％FBS，4℃，500g离心5分钟，弃上清。每管加入200μL Cytofix/CytopermTM Fixation and Permeabilizaiton Solution，于4℃放置20分钟，对细胞进行固定和穿孔。20分钟后，每管加入1mL1×Perm/WashTMBuffer，4℃，600g离心5分钟，弃上清。用1×Perm/WashTM Buffe按说明书推荐使用量先稀释好适量的PE conjugated anti-IFN-γ(clone XMG1.2)抗体，每管加50μL，轻轻混匀，于4℃放置30分钟。最后，每管分别用1mL1×Perm/WashTM Buffer和3mL的PBS各洗一次，弃上清后用200μL PBS重悬，上机检测。为了在检测时调节各染料间的荧光补偿，设置不染色管、单染PerCP/Cy5.5-conjugated anti-CD3管、单染FITC conjugated anti-CD8管和单染PEconjugated anti-IFN-γ管，其中PE conjugated anti-IFN-γ单染管使用的是阳性刺激的细胞。
4.2.3上机检测
使用BeckmanCyAnTM ADP进行流式细胞术检测。首先调节合适的电压，使用单荧光染色样品调节各染料间的荧光补偿，然后上样。通过FSC和SSC圈出淋巴细胞，设为门1。从门1出来的细胞，通过FL3(PerCP/Cy5.5)和SSC，圈出CD3细胞，设为门2。从门2中出来的细胞，通过FL1(FITC)和FL2(PE)作点图，分析CD8细胞中IFN-γ阳性细胞占总T细胞(CD3细胞)的百分比。或直接圈出CD8细胞，通过FL1(FITC)和FL2(PE)作点图，分析CD8细胞中IFN-γ阳性细胞的百分比。使用Beckman开发的Summit流式分析软件对检测结果进行分析。
如图12所示，结果显示，免疫后2周和22周，重组腺病毒埃博拉疫苗免疫小鼠的脾细胞，其CD8阳性细胞分泌的IFN-γ的水平明显高于对照疫苗组。而对于GP密码子优化与未优化的两种重组腺病毒埃博拉疫苗之间，IFN-γ的分泌水平无统计学差异。
4.3细胞因子的ELISPOT检测
使用BDTM ELISPOT mouse IFN-γSet进行IFN-γ的ELISPOT检测。按试剂盒说明书所给方法进行操作，其方法如下：ELISPOT板用5μg/mL抗小鼠IFN-γ抗体包被，4℃放置过夜。实验前用RPMI1640+10％FBS培养基于室温封闭2小时。实验时弃封闭液，每孔先加入100μL含有埃博拉病毒GP CTL表位GF-9和LV-9的RPMI1640+10％FBS培养基，GF-9和LV-9的浓度分别为10μg/mL。按设计每孔加入100μL分离的小鼠脾细胞，细胞浓度为2×106cells/mL。阳性对照孔每孔加入50ng/mL的PMA和500ng/mL的ionomycin，同时设置无刺激对照孔和不加细胞的空白对照孔。细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养18-24小时。次日，弃板内细胞，每孔200μL用蒸馏水洗两次，然后用洗液PBS+0.1％吐温-20洗3次，每次放置2-3分钟。弃板内洗液，每孔100μL加入以1:250稀释于PBS+10％FBS的Biotinylated anti-mouse IFN-γ，室温放置2个小时。2小时后弃孔内液体，用洗液洗3次，每次放置2-3分钟，每孔加入100μL以1:100稀释于PBS+10％FBS的streptavidin-horseradish peroxidase，室温放置1小时。弃去孔内液体，用洗液洗4次，然后用PBS洗3次。使用BDTM ELISPOT AEC substrate set进行生色反应。待孔内斑点长至合适大小时(一般于室温反应15-25分钟)弃去显色底物，用大量的蒸馏水冲洗以终止反应。将板晾干，使用酶联斑点成像分析***进行斑点计数。
实验结果如图13所示，无论是免疫后2周还是免疫后22周，埃博拉疫苗组免疫小鼠的脾细胞分泌的IFN-γ的量明显高于对照疫苗组。而GP密码子优化与未优化的两种重组腺病毒疫苗之间，无论是免疫后2周还是免疫后22周，两者免疫小鼠的脾细胞所分泌的IFN-γ的量无显著性差异。这一结果与流式细胞术检测的结果相一致。
5.免疫学评价小结
GP密码子优化后，埃博拉重组腺病毒载体疫苗在小鼠模型上虽然细胞免疫水平保持不变，但体液免疫水平明显增高。细胞免疫反应与体液免疫反应对机体抵抗埃博拉病毒感染都是至关重要的。近年来在动物模型中的研究表明，相比于细胞免疫反应，埃博拉GP特异的IgG抗体水平与攻毒动物存活的相关性更高(Wong,G.,Richardson,J.S.,Pillet,S.,Patel,A.,Qiu,X.,Alimonti,J.,...Kobinger,G.P.(2012).Immune parameterscorrelate with protection against ebola virus infection in rodents andnonhuman primates.Sci Transl Med,4(158),158ra146.doi:10.1126/scitranslmed.3004582)。后继的研究表明，单克隆抗体混合物ZMapp可对攻毒5天后症状明显的恒河猴给予100％的治疗效果(Qiu,X.,Wong,G.,Audet,J.,Bello,A.,Fernando,L.,Alimonti,J.B.,...Kobinger,G.P.(2014).Reversion of advanced Ebola virusdisease in nonhuman primates with ZMapp.Nature,514(7520),47-53.doi:10.1038/nature13777)。尽管ZMapp在人体上的疗效还没有得到相关的临床论证，但在西非埃博拉疫情中确实有一些接受ZMapp治疗的患者存活了下来。这些结果充分体现了埃博拉GP特异的抗体对抵抗埃博拉病毒感染的重要性。我们将GP密码子优化后，其构建的重组腺病毒载体疫苗免疫后的小鼠，不但抗体产生的时间提前，而且抗体滴度也明显增高。这一优化将很大程度上改善该疫苗对抵抗埃博拉病毒感染的效果。

Claims (12)

1.一种编码埃博拉病毒GP蛋白的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种含有权利要求1所述核苷酸分子的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为pDC316。
4.一种表达权利要求1所述核苷酸分子的人复制缺陷重组腺病毒。
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒来源于AdMax腺病毒***。
6.权利要求4或5所述重组腺病毒在制备预防埃博拉病毒病疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组腺病毒被制备为注射剂。
8.一种制备权利要求5所述的人复制缺陷重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建含有权利要求1所述的编码埃博拉病毒GP蛋白的核苷酸分子的穿梭质粒载体；
(2)将步骤(1)所述载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；
(3)培养步骤(2)所述宿主细胞；
(4)收获从步骤(3)所述细胞释放的人复制缺陷重组腺病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述载体为pDC316。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述骨架质粒为pBHGlox_E1,3Cre。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述细胞为HEK293细胞。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中采用Source30Q和Sepharose4FF两步法柱层析对重组腺病毒进行提取并纯化。
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