CN105695510A - 去除b8r和a47l的重组痘苗病毒及制备方法和应用 - Google Patents

去除b8r和a47l的重组痘苗病毒及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种去除B8R和A47L的重组痘苗病毒及制备方法和应用，对痘苗病毒进行重组改造，去除B8R和A47L，其中B8R和A47L的碱基序列分别见序列表1和2。本发明同时去除B8R和A47L对外源抗原免疫原性的影响，痘苗病毒自身的免疫优势显著降低，在痘苗病毒载体中***的外源性抗原能够成功地诱导有效的细胞免疫应答，并能够产生免疫记忆，再次感染诱发的细胞免疫反应明显增强。本发明构建的重组痘苗病毒，可显著提高以痘苗病毒为载体的疫苗的有效性，为疫苗研发和基因治疗提供更为有效的方法和载体。

Description

去除B8R和A47L的重组痘苗病毒及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物基因工程及生物技术药物领域，具体涉及一种去除B8R和A47L的重组痘苗病毒，本发明还涉及该重组痘苗病毒的制备方法和应用。
背景技术
基因重组技术的发展为疫苗的研发提供了一个有效的手段。以活病毒为载体，***外源性目的基因的重组疫苗(recombinantvaccine)，占到为数众多的基因治疗研究的70％以上。
天花是迄今为止人类利用疫苗这一免疫手段成功根除的唯一一种感染性疾病。痘苗病毒(vacciniavirus)作为人类预防天花的疫苗，在根除天花中发挥了重要的作用。
痘苗病毒是一类病毒粒最大的双链DNA病毒，与天花病毒同属痘病毒科正痘病毒属(Poxvirus)。由于在天花免疫预防中的成功应用，痘苗病毒被当做衡量一个疫苗有效与否的“金标准”。痘苗病毒被广泛应用于人类长达一个多世纪，在人体的安全性和有效性已得到充分的证明。因而，痘苗病毒是最早被用做疫苗载体的病毒。由于在消除天花中的成功应用，痘苗病毒被认为是疫苗和其他生物治疗药物的理想载体。痘苗病毒作为疫苗及生物技术药物的载体，与其他载体(如逆转录病毒、人单纯疱疹病毒、腺病毒、及某些细菌)相比较，具有独特优势，包括：1)载体基因组大，可***较大的外源基因而不改变其生物学特性和感染性；2)重组病毒构建相对简单，易于构建多价疫苗；3)依靠自身启动子，能够高效表达外源蛋白，有效地加工表达产物，刺激机体产生良好的免疫反应；4)接种方便；5)易于生产；6)冻干保存效价稳定。
目前国际上有多家生物公司和研究小组进行以痘苗病毒为载体的疫苗和其他生物技术药物的研发，基本技术方案均为去除痘苗病毒不同区段的基因(如TK)，并***外源目的基因。上述产品有些已经进入II期临床。国内也有研究小组进行上述工作，但为数不多。痘苗病毒作为疫苗或药物的载体，一个显著的问题是痘苗病毒自身具有较强的免疫优势，使得外源性抗原的表达和免疫原性较弱。而目前以活痘苗病毒为载体的疫苗和生物技术药物均未对载体的免疫优势进行削弱，极大地制约了疫苗的有效性。另一方面，虽然痘苗病毒作为疫苗在大量人群中长期使用，其安全性得到了充分的肯定，但是痘苗病毒接种后仍会在少数个体中产生一些不良反应，尤其在一些免疫功能低下的特定人群中更易出现，包括局部甚至全身性疱疹，及较为罕见的神经***症状。目前国内外与本发明相似的现有技术方案均未考虑提高痘苗病毒的安全性。
研究表明B8R和A47L均为痘苗病毒免疫优势最强的抗原表位之一，去除B8R和A47L可显著降低痘苗病毒自身的免疫优势，从而提高外源性目的抗原的免疫原性。同时，B8R基因编码蛋白是一种干扰素γ(IFN-γ)的特异性受体，IFN-γ作为重要的免疫诱导和调节因子在一系列免疫应答中发挥重要的作用；B8R的缺失可降低痘苗病毒的毒力，并对机体的抗病毒免疫造成影响。A47L是痘苗病毒上的一种重要的激活杀伤性T细胞的抗原表位，在痘苗病毒感染中高转录高表达，在正痘病毒中高度保守，而在其他非正痘病毒中缺乏相似序列。研究未发现B8R和A47L具备痘苗病毒生长和复制过程中所必需的功能，去除B8R和A47L对痘苗病毒的感染复制等自身生物学特性无影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种去除B8R和A47L的重组痘苗病毒，解决了现有以活痘苗病毒为载体的疫苗和生物技术药物均未对载体的免疫优势进行削弱，极大地制约了疫苗的有效性的问题，且提高了痘苗病毒的安全性。
本发明的第二个目的是提供一种去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的应用。
本发明所采用的技术方案是，去除B8R和A47L的重组痘苗病毒，对痘苗病毒进行重组改造，去除B8R和A47L，其中B8R和A47L的碱基序列分别见序列表1和2。
本发明所采用的第二个技术方案是：去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，构建质粒pB8R-OVA和pA47L-EGFP；
步骤2，将质粒pB8R-OVA在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组，获得中间产物重组病毒VACV-ΔB8R-OVA；然后质粒pA47L-EGFP在CV-1细胞中与VACV-ΔB8R-OVA病毒重组，获得终产物重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP；
步骤3，筛选纯化重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP。
本发明所采用的第三个技术方案是，去除B8R和A47L的重组痘苗病毒作为疫苗和生物技术药物载体的应用。
本发明的有益效果是，本发明同时去除B8R和A47L对外源抗原免疫原性的影响，痘苗病毒自身的免疫优势显著降低，在痘苗病毒载体中***的外源性抗原能够成功地诱导有效的细胞免疫应答，并能够产生免疫记忆，再次感染诱发的细胞免疫反应明显增强。本发明构建的重组痘苗病毒，可显著提高以痘苗病毒为载体的疫苗的有效性，为疫苗研发和基因治疗提供更为有效的方法和载体。
附图说明
图1是终产物VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP病毒筛选时显示的绿色荧光蛋白阳性的空斑；
图2是重组病毒中B8R和A47L基因；分子量标记MarkerIII，泳道1和2分别为野生型痘苗病毒产生的B8R(1111bp)和A47L(1109bp)条带，泳道3和4显示VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP无特异条带产生；
图3是重组病毒中OVA基因扩增，分子量标记MarkerIII，泳道1和2分别为中间产物VACV-ΔB8R-OVA和终产物VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP产生的OVA条带(1455bp)，泳道3显示野生型痘苗病毒无特异条带产生；
图4是OVA蛋白的表达，泳道1、2、3分别为终产物VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP、中间产物VACV-ΔB8R-OVA和野生型痘苗病毒感染后细胞中OVA蛋白的表达；
图5是重组病毒在BSC-1细胞中的生长曲线；
图6是重组病毒在CV-1细胞中的生长曲线；
图7是重组病毒诱导的初次细胞免疫应答；
图8是重组病毒诱导的免疫记忆；
图9是小鼠感染重组病毒后的体征及神经行为评分变化曲线；
图10是小鼠感染重组病毒后的体重变化曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
野生型痘苗病毒WR株在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室(以下称本实验室)保藏，内嵌OVA基因的重组痘苗病毒(VACV-OVA)由申请人构建并在本实验室保藏。质粒pEGFP-N1购自Clontech公司，质粒pSC11由美国NIH的BernardMoss教授惠赠，细胞系CV-1和BSC-1购自中国典型培养物保藏中心。所使用的小鼠为雌性6周龄C57BL/6小鼠，体重18-22g，购自中国预防医学科学院动物繁育中心，饲养于恒温恒湿的SPF级鼠房。
主要试剂和材料：
DMEM，胎牛血清，脂质体(lipofectamine2000)转染试剂均购自Invitrogen公司，Taq酶、限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自NEB公司，病毒基因组提取试剂盒购自Biomiga公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。所有引物合成及测序均委托上海英潍捷基公司进行。
本发明去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法和鉴定过程，具体包括如下步骤：
步骤1、质粒pSC11-OVA的构建和鉴定
1.1OVA基因片段的获得
从病毒VACV-OVA中获得所需的OVA编码基因，并在其两端添加构建重组质粒所需的酶切位点。具体操作如下：
1.1.1取-80℃冻存的VACV-OVA病毒200μl，解冻后加入等体积的PLYbuffe混匀，室温放置15分钟。加入0.5倍体积的无水乙醇，转移裂解液至吸附柱中，离心后将过滤柱转移至一个新的收集管中，650μlWashbuffer清洗过滤柱2次，离心弃废液。将过滤柱放入新的收集管中，加入30-50μlDEPC水洗脱DNA，将病毒基因组DNA放置于-20℃备用。
1.1.2利用OVA引物OVA-F1和OVA-R1从VACV-OVA基因组DNA中获得带有相应酶切位点的OVA基因片段。
OVA-F1：5’-CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为NcoI酶切位点识别序列，其后为序列3的第1-19位)；
OVA-R1：5’-TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为XmaI酶切位点识别序列，其后为序列3的第1161-1180位的反向互补序列)。
PCR扩增体系为：DNA1μl，dNTPmix(2.5mM)5μl,引物OVA-F1(10μM)1μl，OVA-R1(10μM)1μl，10×Taqbuffer5μl，Taq酶1μl，加DEPC水至总体积50μl。
PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸70秒，循环30次；72℃延伸5分钟，最后置于4℃；
PCR扩增结果：PCR产物上样电泳，OVA基因片段为1200bp。
1.2pSC11-OVA的构建和鉴定
用限制性内切酶NcoI和XmaI对OVA基因片段进行双酶切，与经同样双酶切的质粒pSC11的大片段进行连接，将OVA基因连接到pSC11质粒的启动子P7.5之后，获得重组质粒，酶切和测序鉴定无误后，得到质粒pSC11-OVA。具体步骤如下：
A.酶切体系：1μg相应质粒或基因片段，2μL10xTbuffer，2μLBSA，5U相应的限制性内切酶，ddH2O定容至20μL，酶切条件37℃，3小时；
B.酶切产物上样电泳，切胶回收线性条带；将目的条带与载体连接；
C.连接反应体系：3μL目的片段，1μL线性质粒，1μLDNA连接酶，1μL10xbuffer，定容至10μL，16℃连接过夜；
D.向冰上解冻的感受态DH5a中加入上述连接产物5μL，混匀后冰上静置30分钟；42℃热击1分钟；冰上放置5分钟后，加入500μL预热的LB培养基，摇床培养40分钟；3000rpm离心5分钟，弃上清；
E.重新加入30μL新鲜LB培养基，混匀后涂布含Amp的LB固体平板；37℃培养12小时；
F.挑取单克隆细菌接种到含Amp的液体培养基，摇床培养，180rpm，14小时，同时对挑取的单克隆细菌培养物进行菌落PCR，验证外源基因是否有效***。
步骤2、质粒pB8R-OVA的构建和鉴定
将野生痘苗病毒WR株的基因组DNA序列的第169650-170606位(对应序列4的1-957位，命名为同源左臂B8RL)和第171345-172146位(对应序列5的1-802位，命名为同源右臂B8RR)，分别克隆替换pSC11-OVA质粒的TKL和TKR，得到重组质粒pSB8R-OVA。具体操作如下：
2.1野生型痘苗病毒WR株基因组DNA提取
取-80℃冻存的野生型痘苗病毒VACV-WR200μl，解冻后加入等体积的PLYbuffe混匀，室温放置15分钟，加入0.5倍体积的无水乙醇，转移裂解液至吸附柱中，离心后将过滤柱转移至一个新的收集管中，650μlWashbuffer清洗过滤柱2次，离心弃废液，将过滤柱放入新的收集管中，加入30-50μlDEPC水洗脱DNA，将野生型痘苗病毒VACV-WR基因组DNA放置于-20℃备用；
2.2引物设计与合成
根据野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列设计并合成如下两对引物：
扩增B8R上游同源臂的引物对：
B8RL-F1：5’-cccAAGCTTatgtttctgtaagcgttggc-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为HindIII酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第169650-169669位，即序列4的第1-20位)；
B8RL-R1：5’-ggGGTACCaatgaacaaaactgcgag-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为KpnI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第170589-170606位的反向互补序列，即序列4的第940-957位的反向互补序列)；
扩增B8R下游同源臂的引物对：
B8RR-F1：5’-tcccCCCGGGgttaccacttttcttagcatgc-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为XmaI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第171345-171366位，即序列5的第1-22位)；
B8RR-R1：5’-tatGGCGCCttatagcggggagacgatc-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为KasI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第172128-172146位的反向互补序列，即序列5的第784-802位的反向互补序列)。
2.3pB8R-OVA的构建及鉴定
2.3.1以步骤2.1中野生型痘苗病毒基因组DNA为模板，以步骤2.2中合成的B8R上下游同源臂引物对分别进行PCR，获得带有相应酶切位点的B8R的上下游同源臂B8RL和B8RR。
PCR扩增体系为：DNA1μl，dNTPmix(2.5mM)5μl,正向引物F(10μM)1μl，反向引物R(10μM)1μl，10×Taqbuffer5μl，Taq酶1μl，加DEPC水至总体积50μl。
PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸80秒，循环30次；72℃延伸10分钟，最后置于4℃；
PCR扩增结果：PCR产物上样电泳，B8RL为974bp，B8RR为821bp。
2.3.2首先用限制性内切酶HindIII和KpnI对上游同源臂B8RL进行双酶切，与经同样双酶切的pSC11-OVA质粒的大片段进行连接，得到中间质粒pB8Rtemp-OVA，接着用限制性内切酶XmaI和KasI对下游同源臂B8RR进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pB8Rtemp-OVA的大片段进行连接，获得重组质粒，酶切和测序鉴定无误后，得到质粒pB8R-OVA。具体步骤如下：
A.酶切体系：1μg相应质粒或基因片段，2μL10xTbuffer，2μLBSA，5U相应的限制性内切酶，ddH2O定容至20μL，酶切条件37℃，3小时；
B.酶切产物上样电泳，切胶回收线性条带；将目的条带与载体连接；
C.连接反应体系：3μL目的片段，1μL线性质粒，1μLDNA连接酶，1μL10xbuffer，定容至10μL，16℃连接过夜；
D.向冰上解冻的感受态DH5a中加入上述连接产物5μL，混匀后冰上静置30分钟；42℃热击1分钟；冰上放置5分钟后，加入500μL预热的LB培养基，摇床培养40分钟；3000rpm离心5分钟，弃上清；
E.重新加入30μL新鲜LB培养基，混匀后涂布含Amp的LB固体平板；37℃培养12小时；
F.挑取单克隆细菌接种到含Amp的液体培养基，摇床培养，180rpm，14小时，同时对挑取的单克隆细菌培养物进行菌落PCR，验证外源基因是否有效***。
步骤3、质粒pSC11-EGFP的构建和鉴定
3.1EGFP基因片段的获得
从质粒pEGFP-N1中获得所需的EGFP编码基因，并在其两端添加构建重组质粒所需的酶切位点。具体操作如下：
利用EGFP引物EGFP-F1和EGFP-R1从质粒pEGFP-N1中获得带有相应酶切位点的EGFP基因片段。
EGFP-F1：ATACTCGAGTCCACCGGTCGCCACCATG(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为XhoI酶切位点识别序列，其后序列为pEGFP-N1质粒的第663-681位，即序列6的第1-19位)；
EGFP-R1：AACTGCAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为PstI酶切位点识别序列，其后序列为pEGFP-N1质粒的第1381-1400位的反向互补序列，即序列6的第719-738位的反向互补序列)。
PCR扩增体系为：pEGFP-N1质粒DNA1μl，dNTPmix(2.5mM)5μl,引物EGFP-F1(10μM)1μl，EGFP-R1(10μM)1μl，10×Taqbuffer5μl，Taq酶1μl，加DEPC水至总体积50μl。
PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸50秒，循环30次；72℃延伸5分钟，最后置于4℃；
PCR扩增结果：PCR产物上样电泳，EGFP基因片段为745bp。
3.2pSC11-EGFP的构建和鉴定
用限制性内切酶XhoI和PstI对EGFP基因片段进行双酶切，与经同样双酶切的质粒pSC11的大片段进行连接，用EGFP基因替代pSC11质粒中的LacZ，连于启动子P11之后，获得重组质粒，酶切和测序鉴定无误后，得到质粒pSC11-EGFP。具体步骤如下：
A.酶切体系：1μg相应质粒或基因片段，2μL10xTbuffer，2μLBSA，5U相应的限制性内切酶，ddH2O定容至20μL，酶切条件37℃，3小时；
B.酶切产物上样电泳，切胶回收线性条带；将目的条带与载体连接；
C.连接反应体系：3μL目的片段，1μL线性质粒，1μLDNA连接酶，1μL10xbuffer，定容至10μL，16℃连接过夜；
D.向冰上解冻的感受态DH5a中加入上述连接产物5μL，混匀后冰上静置30分钟；42℃热击1分钟；冰上放置5分钟后，加入500μL预热的LB培养基，摇床培养40分钟；3000rpm离心5分钟，弃上清；
E.重新加入30μL新鲜LB培养基，混匀后涂布含Amp的LB固体平板；37℃培养12小时；
F.挑取单克隆细菌接种到含Amp的液体培养基，摇床培养，180rpm，14小时，同时对挑取的单克隆细菌培养物进行菌落PCR，验证外源基因是否有效***。
步骤4、质粒pA47L-EGFP的构建和鉴定
将野生痘苗病毒WR株的基因组DNA序列的第152935-153939位(对应序列7的1-1005位，命名为同源左臂A47LL)和154628-155517位(对应序列8的1-890位，命名为同源右臂A47LR)，分别克隆替换pSC11-EGFP质粒的TKL和TKR，得到重组质粒pA47L-EGFP。具体操作如下：
4.1引物设计与合成
根据野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列设计并合成如下两对引物：
扩增A47L上游同源臂的引物对：
A47LL-F1：5’-CCCAAGCTTTGATTCCATAGGCAGTCCAG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为HindIII酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第152935-152954位，即序列7的第1-20位)；
A47LL-R1：5’-AACTGCAGATAAGGTGATTGGAATGGG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为PstI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第153921-153939位的反向互补序列，即序列7的第987-1005位的反向互补序列)；
扩增A47L下游同源臂的引物对：
A47LR-F1：5’-TCCCCCCGGGGATGGACAGTCTATTTTCCTTAG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为XmaI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第154628-154650位，即序列8的第1-23位)；
A47LR-R1：5’-TATGGCGCCTATTGATGCGAGTTCGGTATG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为KasI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：AY243312.1的第155497-155517位的反向互补序列，即序列8的第870-890位的反向互补序列)。
4.2pA47L-EGFP的构建及鉴定
4.2.1以步骤2.1提取的野生型痘苗病毒基因组DNA为模板，以步骤4.1中合成的A47L上下游同源臂引物对分别进行PCR，获得带有相应酶切位点的A47L的上下游同源臂A47LL和A47LR。
PCR扩增体系如下：DNA1μl，dNTPmix(2.5mM)5μl,正向引物F(10μM)1μl，反向引物R(10μM)1μl，10×Taqbuffer5μl，Taq酶1μl，加DEPC水至总体积50μl。
PCR扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，循环30次；72℃延伸5min，最后置于4℃。
PCR扩增结果：PCR产物上样电泳，A47LL为1022bp，A47LR为909bp。
4.2.2首先用限制性内切酶HindIII和PstI对上游同源臂A47LL进行双酶切，与经同样双酶切的pSC11-EGFP质粒的大片段进行连接，得到中间质粒pA47Ltemp-EGFP,接着用限制性内切酶XmaI和KasI对下游同源臂A47LR进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pA47Ltemp-EGFP的大片段进行连接，获得重组质粒，酶切和测序鉴定无误后，得到质粒pA47L-EGFP。
具体步骤如下：
A.酶切体系：1μg相应质粒或基因片段，2μL10xTbuffer，2μLBSA，5U相应的限制性内切酶，ddH2O定容至20μL，酶切条件37℃，3小时；
B.酶切产物上样电泳，切胶回收线性条带；将目的条带与载体连接；
C.连接反应体系：3μL目的片段，1μL线性质粒，1μLDNA连接酶，1μL10xbuffer，定容至10μL，16℃连接过夜；
D.向冰上解冻的感受态DH5a中加入上述连接产物5μL，混匀后冰上静置30分钟；42℃热击1分钟；冰上放置5分钟后，加入500μL预热的LB培养基，摇床培养40分钟；3000rpm离心5分钟，弃上清；
E.重新加入30μL新鲜LB培养基，混匀后涂布含Amp的LB固体平板；37℃培养12小时；
F.挑取单克隆细菌接种到含Amp的液体培养基，摇床培养，180rpm，14小时，同时对挑取的单克隆细菌培养物进行菌落PCR，验证外源基因是否有效***。
步骤5、痘苗病毒的重组和筛选
5.1中间产物VACV-ΔB8R-OVA病毒的获得和筛选
5.1.1VACV-ΔB8R-OVA病毒的重组
5.1.1.1以T25培养瓶培养CV-1细胞至80％单层；
5.1.1.2以0.05MOI剂量感染野生型痘苗病毒，37℃培养2小时；
5.1.1.3去除病毒液，按照转染试剂Lipofectamine2000说明书转染pB8R-OVA至感染细胞中，培养48小时；
5.1.1.4收集细胞，反复冻融三次，进行超声破碎后，保存于-80℃。
5.1.2VACV-ΔB8R-OVA病毒的筛选
5.1.2.1用6孔板培养CV-1细胞至80％单层；
5.1.2.2取步骤5.1.1获得的病毒悬液，超声破碎后做倍比稀释，感染CV-1细胞，37℃培养2小时；
5.1.2.3每孔覆盖3ml琼脂培养基，培养2天；
5.1.2.4每孔加入2ml含X-gal的上层琼脂培养基，培养过夜；
5.1.2.5观察蓝斑产生情况，挑取孤立蓝斑进行进一步筛选，连续单斑纯化5代，至病毒纯化。
5.2终产物VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP病毒的获得和筛选
5.2.1VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP病毒的重组
按步骤5.1.1的基本操作转染质粒pA47L-EGFP至VACV-ΔB8R-OVA病毒感染的CV-1细胞中，并收集保存。
5.2.2VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP病毒的筛选
取步骤5.2.1获得的病毒，梯度稀释后感染6孔板培养的CV-1细胞，覆盖琼脂培养基，观察绿色荧光的生成情况，挑取绿色荧光蛋白阳性的孤立空斑进行进一步筛选，连续单斑纯化5代，至病毒纯化。
步骤6，重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP的鉴定
将步骤5.2.2得到的重组病毒(VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP)进行小量增殖，然后进行PCR、基因测序和WesternBlot等分子生物学鉴定。
(1)PCR和基因测序鉴定
a.提取经小量增殖的重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP的基因组DNA；
b.鉴定引物设计：
B8R鉴定引物：
JDB8R-F1：5’-ATACGGCTAACTTCACATTCG-3’(VACV-WR第171010-171030位)；
JDB8R-R1：5’-AACTTCCATGCACCATCATAC-3’(VACV-WR第172200-172220位的反向互补序列)；
A47L鉴定引物：
JDA47L-F1：5’-ATAAGAGGGGTGCTTCCAGAG-3’(VACV-WR第153330-153350位)；
JDA47L-R1：5’-GATGTGGACAAACGGACTAAG-3’(VACV-WR第154418-154438位的反向互补序列)。
OVA鉴定引物：
JDOVA-F1：5’-CCCACCCGCTTTTTATAGTAAG-3’
JDOVA-R1：5’-CCCTCATCTTGAAAATGGTTAG-3’
c.以纯化的重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP的基因组DNA为模板，用上述3对鉴定引物进行PCR检测反应，同时设置野生型VACV-WR的DNA为模板的对照。
PCR扩增体系为：
PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸100秒，循环30次；72℃延伸10分钟，最后置于4℃；
d.PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，观察结果并回收目的片段，将回收的目的片段送测序。
(2)目的蛋白鉴定
a.小量增殖经纯化的重组痘苗病毒，至70％细胞病变时，收取细胞；
b.离心，将上清转移至15ml离心管内，加入等体积饱和硫酸铵溶液，置于旋转摇床4℃过夜，使蛋白质充分沉淀；
c.细胞用PBS洗两次后，加1mlRIPA裂解液混匀，摇床冰上震荡1小时，4℃/12000rpm离心10分钟，取上清置于新的1.5ml离心管中，-20℃过夜后，将上清液4℃/12000rpm离心10分钟，弃上清保留沉淀；
d.将上述两步收获的蛋白混匀；
e.按照改良的BCA蛋白定量分析试剂盒提供的蛋白定量方法，进行蛋白的定量分析。一抗采用兔抗OVA抗体，二抗采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，暗室中进行曝光检测重组痘苗病毒的OVA蛋白表达。
步骤7、重组痘苗病毒的生产和纯化
取鉴定无误后的重组痘苗病毒，用BSC-1细胞进行培养增殖。将收获的病毒采用密度梯度离心进行纯化，分装后保存于-80℃。
步骤8、重组病毒的生长特性检测
用重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP与对照病毒分别感染CV-1和BSC-1细胞，感染剂量为0.05MOI，培养条件34℃/5％CO2。分别于12、24、36、48、60和72小时收集病毒，进行滴度测定和噬斑形成能力及噬斑特性的检测。
步骤9、细胞免疫应答检测
C57BL/6小鼠随机分组，每组5只，每只小鼠腹腔注射200μL内含滴度为106PFU的野生型或重组病毒。初次免疫应答组7天后收集小鼠脾脏细胞，抗原肽B8R、A47L或OVA257-264刺激后分别进行细胞表面分子和胞内细胞因子染色，标记CD8+和IFN-γ+细胞。免疫记忆组在初次感染病毒6周后，每只小鼠再次注射106PFU的重组病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP，7天后收集小鼠脾脏细胞，抗原肽刺激后标记CD8+和IFN-γ+细胞。采用美国BectonDickinson公司FACScan流式细胞仪进行细胞表面和细胞内标记物的流式细胞检测，每份样品测定量为2×105细胞，采用FlowJo软件对流式结果进行分析。
步骤10、小鼠感染体征及行为观察
实验组每组5只C57BL/6小鼠，每只小鼠腹腔注射200μl内含106PFU的病毒(野生型痘苗病毒、VACV-ΔB8R-OVA、VACV-ΔA47L-OVA或VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP)；腹腔注射PBS(200μl)的5只C57BL/6小鼠为正常对照。注射后1-14天观察记录小鼠体征、行为和体重变化，一般情况和神经行为学评分参考Bederso和Clark评分并略作改进：0分：一般情况良好，体毛光滑，无神经功能障碍；1分：精神不振、弓背、四肢无力、活动迟缓，提尾见前肢回收屈曲，抓力减弱；3分：毛色暗淡并有竖毛、脱毛现象，皮肤松弛，怠惰少动，后肢运动障碍；4分：无自主活动，双后肢瘫痪或小鼠死亡。
结论：
一、质粒pB8R-OVA和pA47L-EGFP的构建
质粒pcB8R-OVA的构建。使用引物以VACV-OVA病毒基因组DNA为模板获得带有相应酶切位点的OVA基因片段(序列表3)，以野生型痘苗病毒基因组DNA为模板获得带有相应酶切位点的B8R的上下游同源臂B8RL和B8RR(序列表4和5)。将上述基因片段依序连接入线性化的pSC11载体中，经测序验证各基因片段***正确。
质粒pA47L-EGFP的构建。利用EGFP引物从质粒pEGFP-N1中获得EGFP基因片段(序列表6)，将其替换pSC11质粒中的LacZ，连于P11启动子之后。以野生型痘苗病毒基因组DNA为模板，获得A47L基因的上下游同源序列臂A47LL和A47LR(序列表7和8)，通过酶切连接的方法分别替代pSC11质粒中原有的TKL和TKR，获得重组质粒pA47L-EGFP。该质粒经测序验证无误。
二、痘苗病毒的重组和重组病毒的筛选
在体外培养的CV-1细胞感染野生型痘苗病毒后，采用脂质体转染法将pB8R-OVA质粒转染至感染细胞中，并进行蓝斑筛选，连续单斑纯化5代，获得中间产物VACV-ΔB8R-OVA病毒；再用该病毒感染CV-1细胞，将质粒pA47L-EGFP转染至感染细胞中，利用绿色荧光蛋白阳性的空斑进行筛选(图1)，连续单斑纯化5代，获得终产物VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP病毒。
三、重组病毒的鉴定及增殖
经PCR和基因测序及WesternBlot进行分子生物学鉴定，重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP去除B8R和A47L基因并***OVA和EGFP，经多次连续纯化和传代，B8R和A47L稳定缺失(图2)，***的OVA可稳定存在(图3)，产物表达良好(图4)；EGFP荧光表达良好。
将鉴定无误的重组病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP进行体外增殖，并将收获的病毒采用密度梯度离心进行纯化，分装后保存于-80℃。
四、重组病毒的生物学特性
为检测B8R/A47L缺失和外源基因***对病毒感染复制等生物学特性的影响，对野生型和重组病毒的生长及噬斑形成进行了对比。采用野生型痘苗病毒、VACV-ΔB8R-OVA、VACV-ΔA47L-OVA和VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP分别感染CV-1和BSC-1细胞，在不同时间收获病毒并绘制病毒生长曲线。VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP生长曲线与对照组野生型痘苗病毒、VACV-ΔB8R和VACV-ΔA47L基本相似(图5、图6)。同一时间点(感染后3天)比较野生型痘苗病毒和重组病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP在CV-1细胞中形成的病毒噬斑，其大小、形状无明显差别，表明B8R/A47L缺失和OVA/EGFP***后，痘苗病毒本身的生物学特性，在细胞中的感染性和复制能力等均无明显改变。
五、外源抗原OVA诱发的细胞免疫应答
病毒感染7天后，检测小鼠体内细胞免疫应答发现，对比野生型痘苗病毒，重组病毒VACV-OVA、VACV-ΔB8R-OVA、VACV-ΔA47L-OVA和VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP均可成功诱导针对OVA的特异性细胞免疫应答(图7)；单独去除B8R或A47L后，相比VACV-OVA，外源抗原OVA诱发的免疫应答显著增强，；而VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP诱导的细胞免疫应答中，针对B8R和A47L的免疫应答被完全消除，但针对OVA的细胞免疫应答较VACV-ΔB8R-OVA和VACV-ΔA47L-OVA更加增强，应答强度居首位。在初次免疫6周后给予免疫加强，VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP诱发的针对OVA的再次应答明显高于其他病毒(图8)。结果显示，去除B8R和A47L可显著降低痘苗病毒自身的免疫优势，使原本在免疫优势梯度中居于次要表位的外源性抗原OVA成为显性表位，可成功诱导较强的初次免疫应答并具有更好的免疫记忆效应，且抗原性明显增强。
六、小鼠感染体征及神经行为测评
从病毒感染后第6天开始，部分小鼠出现感染体征和行为障碍，但去除B8R的重组病毒(VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP和VACV-ΔB8R-OVA)感染的小鼠感染体征和行为障碍较感染其他病毒(包括野生型痘苗病毒和VACV-ΔA47L-OVA)的小鼠明显轻微(图9)，且恢复正常的时间明显较短。体重变化曲线也显示，前者体重下降程度明显较后者为轻，而与未感染对照小鼠的体重变化接近(图10)。提示去除B8R可降低痘苗病毒的毒力，提高活痘苗病毒在体内应用的安全性。
综上所述，B8R和A47L缺失对痘苗病毒的生物学特性无明显影响，在B8R和A47L区段导入OVA等外源基因同样不会影响痘苗病毒的感染和复制能力；去除B8R或A47L均可显著提高外源性目的抗原的免疫原性；而同时去除B8R和A47L后，外源性OVA更是成为第一显性表位，针对OVA的细胞免疫应答和免疫记忆效应较之不去除或单独去除一个表位更为增强。去除B8R还可显著降低痘苗病毒的毒力。本发明提供的同时去除B8R和A47L表位的重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP，可为疫苗和其他基因治疗的研发，提供更为有效和安全的载体。

Claims (10)

1.去除B8R和A47L的重组痘苗病毒，其特征在于，对痘苗病毒进行重组改造，去除B8R和A47L，其中B8R和A47L的碱基序列分别见序列表1和2。
2.去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1，构建质粒pB8R-OVA和pA47L-EGFP；
步骤2，将质粒pB8R-OVA在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组，获得中间产物重组病毒VACV-ΔB8R-OVA；然后质粒pA47L-EGFP在CV-1细胞中与VACV-ΔB8R-OVA病毒重组，获得终产物重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP；
步骤3，筛选纯化重组痘苗病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP。
3.根据权利要求2所述的去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法，其特征在于，步骤1的具体步骤如下：
S11、取冻存的野生型痘苗病毒VACV-WR和VACV-OVA病毒，使用Biomiga病毒基因组提取试剂盒，提取基因组DNA；
S12、根据OVA基因序列，设计引物，以VACV-OVA病毒基因组为模板，PCR获得OVA基因片段；根据野生型痘苗病毒的B8R基因及其侧翼序列，设计引物，以VACV-WR病毒基因组为模板，PCR获得B8R基因的左右臂同源序列B8RL和B8RR；通过酶切连接将获得的OVA基因***pSC11质粒的P7.5启动子后，得到质粒pSC11-OVA，然后将B8RL和B8RR分别克隆替换质粒的TKL和TKR，得到重组质粒pB8R-OVA；
S13、利用EGFP引物EGFP-F1和EGFP-R1从质粒pEGFP-N1中获得EGFP基因片段；根据VACV-WR的A47L基因及其上下游序列，设计引物，以VACV-WR基因组DNA为模板，PCR获得A47L基因的上下游同源序列臂A47LL和A47LR；通过酶切连接将获得的EGFP基因替换pSC11质粒中的LacZ，连于P11启动子后，将获得的上下游同源臂A47LL和A47LR通过酶切连接的方法分别替代质粒的TKL和TKR，获得重组质粒pA47L-EGFP。
4.根据权利要求3所述的去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法，其特征在于，S12中质粒pSC11-OVA的构建具体操作如下：
S12中OVA基因片段的获得是从病毒VACV-OVA中获得所需的OVA编码基因，并在其两端添加构建重组质粒所需的酶切位点，具体操作如下：
1)取-80℃冻存的VACV-OVA病毒200μl，解冻后加入等体积的PLYbuffe混匀，室温放置15分钟，加入0.5倍体积的无水乙醇，转移裂解液至吸附柱中，离心后将过滤柱转移至一个新的收集管中，650μlWashbuffer清洗过滤柱2次，离心弃废液，将过滤柱放入新的收集管中，加入30-50μlDEPC水洗脱DNA，将病毒基因组DNA放置于-20℃备用；
2)利用OVA引物OVA-F1和OVA-R1从VACV-OVA基因组DNA中获得带有相应酶切位点的OVA基因片段；
OVA-F1的碱基序列为：5’-CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG
OVA-R1的碱基序列为：5’-TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3’；
PCR扩增体系为：DNA1μl，dNTPmix(10mM)1μl,引物OVA-F1(10μM)2.5μl，OVA-R1(10μM)2.5μl，5×Q5buffer10μl，Q5酶0.5μl，加DEPC水至总体积50μl；
PCR扩增条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸40秒，循环30次；72℃延伸2分钟，最后置于4℃；
PCR扩增结果：PCR产物上样电泳，OVA基因片段为1200bp；
3)S12中pSC11-OVA的构建是用限制性内切酶NcoI和XmaI对OVA基因片段进行双酶切，与经同样双酶切的质粒pSC11的大片段进行连接，将OVA基因连接到pSC11质粒的启动子P7.5之后，获得重组质粒，酶切和测序鉴定无误后，得到质粒pSC11-OVA；
具体步骤如下：
A.酶切体系：1μg相应质粒或基因片段，2μL10xTbuffer，2μLBSA，5U相应的限制性内切酶，ddH2O定容至20μL，酶切条件37℃，3小时；
B.酶切产物上样电泳，切胶回收线性条带；将目的条带与载体连接；
C.连接反应体系：3μL目的片段，1μL线性质粒，1μLDNA连接酶，1μL10xbuffer，定容至10μL，16℃连接过夜；
D.向冰上解冻的感受态DH5a中加入上述连接产物5μL，混匀后冰上静置30分钟；42℃热击1分钟；冰上放置5分钟后，加入500μL预热的LB培养基，摇床培养40分钟；3000rpm离心5分钟，弃上清；
E.重新加入30μL新鲜LB培养基，混匀后涂布含Amp的LB固体平板；37℃培养12小时；
F.挑取单克隆细菌接种到含Amp的液体培养基，摇床培养，180rpm，14小时，同时对挑取的单克隆细菌培养物进行菌落PCR，验证外源基因是否有效***。
5.根据权利要求4所述的去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法，其特征在于，S12中质粒pB8R-OVA的构建具体操作如下：
1)取-80℃冻存的野生型痘苗病毒VACV-WR200μl，解冻后加入等体积的PLYbuffe混匀，室温放置15分钟，加入0.5倍体积的无水乙醇，转移裂解液至吸附柱中，离心后将过滤柱转移至一个新的收集管中，650μlWashbuffer清洗过滤柱2次，离心弃废液，将过滤柱放入新的收集管中，加入30-50μlDEPC水洗脱DNA，将野生型痘苗病毒VACV-WR基因组DNA放置于-20℃备用；
2)根据野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列设计并合成如下两对引物：
扩增B8R上游同源臂B8RL的引物对：
B8RL-F1：5’-CCCAAGCTTATGTTTCTGTAAGCGTTGGC-3’；
B8RL-R1：5’-GGGGTACCAATGAACAAAACTGCGAG-3’；
扩增B8R下游同源臂B8RR的引物对：
B8RR-F1：5’-TCCCCCCGGGGTTACCACTTTTCTTAGCATGC-3’；
B8RR-R1：5’-TATGGCGCCTTATAGCGGGGAGACGATC-3’；
3)以野生型痘苗病毒VACV-WR基因组DNA为模板，以B8R上下游同源臂引物对分别进行PCR，获得带有相应酶切位点的B8R的上下游同源臂B8RL和B8RR；
PCR扩增体系为：DNA1μl，dNTPmix(10mM)1μl,正向引物F(10μM)2.5μl，反向引物R(10μM)2.5μl，5×Q5buffer10μl，Q5聚合酶0.5μl，加DEPC水至总体积50μl；
PCR扩增条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸2分钟，最后置于4℃；
PCR扩增结果：PCR产物上样电泳，B8RL为974bp，B8RR为821bp；
4)首先用限制性内切酶HindIII和KpnI对上游同源臂B8RL进行双酶切，与经同样双酶切的pSC11-OVA质粒的大片段进行连接，得到中间质粒pB8Rtemp-OVA，接着用限制性内切酶XmaI和KasI对下游同源臂B8RR进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pB8Rtemp-OVA的大片段进行连接，获得重组质粒，酶切和测序鉴定无误后，得到质粒pB8R-OVA；
具体步骤如下：
A.酶切体系：1μg相应质粒或基因片段，2μL10xTbuffer，2μLBSA，5U相应的限制性内切酶，ddH2O定容至20μL，酶切条件37℃，3小时；
B.酶切产物上样电泳，切胶回收线性条带；将目的条带与载体连接；
C.连接反应体系：3μL目的片段，1μL线性质粒，1μLDNA连接酶，1μL10xbuffer，定容至10μL，16℃连接过夜；
D.向冰上解冻的感受态DH5a中加入上述连接产物5μL，混匀后冰上静置30分钟；42℃热击1分钟；冰上放置5分钟后，加入500μL预热的LB培养基，摇床培养40分钟；3000rpm离心5分钟，弃上清；
E.重新加入30μL新鲜LB培养基，混匀后涂布含Amp的LB固体平板；37℃培养12小时；
F.挑取单克隆细菌接种到含Amp的液体培养基，摇床培养，180rpm，14小时，同时对挑取的单克隆细菌培养物进行菌落PCR，验证外源基因是否有效***。
6.根据权利要求5所述的去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法，其特征在于，S13中EGFP基因片段的获得是从质粒pEGFP-N1中获得所需的EGFP编码基因，并在其两端添加构建重组质粒所需的酶切位点，具体操作如下：
利用EGFP引物EGFP-F1和EGFP-R1从质粒pEGFP-N1中获得带有相应酶切位点的EGFP基因片段；
EGFP-F1：ATACTCGAGTCCACCGGTCGCCACCATG；
EGFP-R1：AACTGCAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC；
PCR扩增体系为：pEGFP-N1质粒DNA1μl，dNTPmix(10mM)1μl,正向引物F(10μM)2.5μl，反向引物R(10μM)2.5μl，5×Q5buffer10μl，Q5聚合酶0.5μl，加DEPC水至总体积50μl；
PCR扩增条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸2分钟，最后置于4℃；
PCR扩增结果：PCR产物上样电泳，EGFP基因片段为745bp。
7.根据权利要求6所述的去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法，其特征在于，S13中pSC11-EGFP的构建是用限制性内切酶XhoI和PstI对EGFP基因片段进行双酶切，与经同样双酶切的质粒pSC11的大片段进行连接，用EGFP基因替代pSC11质粒中的LacZ，连于启动子P11之后，获得重组质粒，酶切和测序鉴定无误后，得到质粒pSC11-EGFP；
具体步骤如下：
A.酶切体系：1μg相应质粒或基因片段，2μL10xTbuffer，2μLBSA，5U相应的限制性内切酶，ddH2O定容至20μL，酶切条件37℃，3小时；
B.酶切产物上样电泳，切胶回收线性条带；将目的条带与载体连接；
C.连接反应体系：3μL目的片段，1μL线性质粒，1μLDNA连接酶，1μL10xbuffer，定容至10μL，16℃连接过夜；
D.向冰上解冻的感受态DH5a中加入上述连接产物5μL，混匀后冰上静置30分钟；42℃热击1分钟；冰上放置5分钟后，加入500μL预热的LB培养基，摇床培养40分钟；3000rpm离心5分钟，弃上清；
E.重新加入30μL新鲜LB培养基，混匀后涂布含Amp的LB固体平板；37℃培养12小时；
F.挑取单克隆细菌接种到含Amp的液体培养基，摇床培养，180rpm，14小时，同时对挑取的单克隆细菌培养物进行菌落PCR，验证外源基因是否有效***。
8.根据权利要求7所述的去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法，其特征在于，S13中质粒pA47L-EGFP的构建具体操作如下：
1)引物设计与合成
根据野生型痘苗病毒VACV-WR的基因组DNA序列设计并合成如下两对引物：
扩增A47L上游同源臂的引物对：
A47LL-F1：5’-CCCAAGCTTTGATTCCATAGGCAGTCCAG-3’；
A47LL-R1：5’-AACTGCAGATAAGGTGATTGGAATGGG-3’；
扩增A47L下游同源臂的引物对：
A47LR-F1：5’-TCCCCCCGGGGATGGACAGTCTATTTTCCTTAG-3’；
A47LR-R1：5’-TATGGCGCCTATTGATGCGAGTTCGGTATG-3’；
2)以野生型痘苗病毒基因组DNA为模板，以合成的A47L上下游同源臂引物对分别进行PCR，获得带有相应酶切位点的A47L的上下游同源臂A47LL和A47LR；
PCR扩增体系如下：DNA1μl，dNTPmix(10mM)1μl,正向引物F(10μM)2.5μl，反向引物R(10μM)2.5μl，5×Q5buffer10μl，Q5聚合酶0.5μl，加DEPC水至总体积50μl；
PCR扩增条件如下：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸2分钟，最后置于4℃；
PCR扩增结果：PCR产物上样电泳，A47LL为1022bp，A47LR为909bp；
3)首先用限制性内切酶HindIII和PstI对上游同源臂A47LL进行双酶切，与经同样双酶切的pSC11-EGFP质粒的大片段进行连接，得到中间质粒pA47Ltemp-EGFP，接着用限制性内切酶XmaI和KasI对下游同源臂A47LR进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pA47Ltemp-EGFP的大片段进行连接，获得重组质粒，酶切和测序鉴定无误后，得到质粒pA47L-EGFP；
具体步骤如下：
A.酶切体系：1μg相应质粒或基因片段，2μL10xTbuffer，2μLBSA，5U相应的限制性内切酶，ddH2O定容至20μL，酶切条件37℃，3小时；
B.酶切产物上样电泳，切胶回收线性条带；将目的条带与载体连接；
C.连接反应体系：3μL目的片段，1μL线性质粒，1μLDNA连接酶，1μL10xbuffer，定容至10μL，16℃连接过夜；
D.向冰上解冻的感受态DH5a中加入上述连接产物5μL，混匀后冰上静置30分钟；42℃热击1分钟；冰上放置5分钟后，加入500μL预热的LB培养基，摇床培养40分钟；3000rpm离心5分钟，弃上清；
E.重新加入30μL新鲜LB培养基，混匀后涂布含Amp的LB固体平板；37℃培养12小时；
F.挑取单克隆细菌接种到含Amp的液体培养基，摇床培养，180rpm，14小时，同时对挑取的单克隆细菌培养物进行菌落PCR，验证外源基因是否有效***。
9.根据权利要求2所述的去除B8R和A47L的重组痘苗病毒的制备方法，其特征在于，步骤2的具体步骤如下：
S21、在T25培养瓶中培养CV-1单层细胞至80％覆盖，用野生型痘苗病毒感染CV-1细胞，然后采用脂质体法将质粒pB8R-OVA转染至感染细胞，野生型痘苗病毒与pSB8R-OVA在B8R基因左右侧位置发生同源重组，获得中间产物重组病毒VACV-ΔB8R-OVA；
S22、用VACV-ΔB8R-OVA病毒感染CV-1细胞，然后采用脂质体法将质粒pA47L-EGFP转染至感染细胞，VACV-ΔB8R-OVA病毒与pA47L-EGFP在A47L基因左右侧位置发生同源重组，获得终产物重组病毒VACV-ΔB8RΔA47L-EGFP。
10.去除B8R和A47L的重组痘苗病毒作为疫苗和生物技术药物载体的应用。
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