CN105164255B - D‑阿洛酮糖3‑表异构酶突变体、重组载体和微生物、生产d‑阿洛酮糖的方法和反应器 - Google Patents

D‑阿洛酮糖3‑表异构酶突变体、重组载体和微生物、生产d‑阿洛酮糖的方法和反应器 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种D‑阿洛酮糖3‑表异构酶突变体、多核苷酸、重组载体和微生物、生产D‑阿洛酮糖的方法和反应器。D‑阿洛酮糖3‑表异构酶突变体包括如下氨基酸序列，其中衍生自根癌土壤杆菌的野生型D‑阿洛酮糖3‑表异构酶的氨基酸序列的位置77处的谷氨酸经脯氨酸取代。本发明的D‑阿洛酮糖3‑表异构酶突变体具有显著改良的热稳定性同时维持酶活性。

Description

D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体、重组载体和微生物、生产D-阿 洛酮糖的方法和反应器
技术领域
本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体；一种重组载体，其包含编码所述突变体的基因；以及一种微生物，其包含所述突变体。此外，本发明涉及一种使用所述酶突变体或所述微生物来制备D-阿洛酮糖的方法。
背景技术
D-阿洛酮糖(D-psicose)是一种已知为稀有糖(rare sugar)的单糖，因为其很少见于天然材料中或少量存在。D-阿洛酮糖具有超低能量和类似于糖的甜味，并且因此广泛用作功能性甜味剂。
D-阿洛酮糖是D-果糖(D-fructose)的差向异构体，并且具有极类似于D-果糖的甜度和味道。不同于D-果糖，D-阿洛酮糖几乎不在体内代谢，并且具有几乎零卡路里。D-阿洛酮糖可以用作减肥食品的高效成分，因为D-阿洛酮糖能够抑制参与脂质合成的酶的活性并且减少腹部肥胖。此外，广泛用作糖替代物的如木糖醇等的糖醇当大量食用时可能具有副作用，如造成腹泻。相反，D-阿洛酮糖已知实质上不具有副作用。
出于这种原因，D-阿洛酮糖吸引了作为节食甜味剂的高度关注，并且在食品工业中日益需要一种高效生产D-阿洛酮糖的方法。因此，随着开发D-阿洛酮糖的需要增加，已经作出各种尝试，以便使用现有生物方法从D-果糖生产D-阿洛酮糖。作为能够将D-果糖转化成D-阿洛酮糖的酶，已知衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的D-阿洛酮糖3-表异构酶(D-psicose 3-epimerase，DPE)和衍生自菊苣假单胞菌(Pseudomonascichorii)或类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的塔格糖表异构酶。已知D-阿洛酮糖3-表异构酶具有比塔格糖表异构酶更高的活性。
在生产D-阿洛酮糖时，随着反应温度升高，生产更多D-阿洛酮糖。然而，在野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶用于生产D-阿洛酮糖的情况下，酶在约50℃或更高的反应温度下变性，这降低酶活性，由此造成生产的D-阿洛酮糖量减少的问题。因此，为了以高效用高效生产D-阿洛酮糖，迫切需要一种具有改良的耐热性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。
发明内容
技术问题
本发明人知道了衍生自根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-表异构酶归因于低热稳定性尽管有高活性而具有不良效用的问题，因此开发一种具有改良的热稳定性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，以及使用这种突变体连续生产D-阿洛酮糖的方法，以便当前作为重要食品添加剂吸引了关注的D-阿洛酮糖工业上大规模地生产。
具体来说，本发明旨在提供一种具有改良的热稳定性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，其通过取代野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的特定位置处的氨基酸进行。
另外，本发明旨在提供一种多核苷酸，其编码具有改良的热稳定性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。
此外，本发明旨在提供一种重组载体，其包含编码D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因。
此外，本发明旨在提供一种重组微生物，其经转型以生产D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。
此外，本发明旨在提供一种使用D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或经转型以生产D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的重组微生物来从D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法。
技术解决方案
本发明提供一种具有改良的热稳定性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，以高效生产D-阿洛酮糖，其通过取代野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的特定位置处的氨基酸进行。
具体来说，本发明提供一种D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，其包含如下氨基酸序列，其中衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置77处的谷氨酸经脯氨酸取代。
所述突变体可以包含如下氨基酸序列，其中野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置33处的异亮氨酸进一步经由以下所构成的族群中选出的氨基酸取代：亮氨酸、半胱氨酸以及缬氨酸，和/或野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置213处的丝氨酸进一步经半胱氨酸取代。
所述突变体可以包含如下氨基酸序列，其中野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置33处的异亮氨酸进一步经亮氨酸取代，并且野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置213处的丝氨酸进一步经半胱氨酸取代。
本发明还涉及一种多核苷酸，其编码根据本发明的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。
本发明还涉及一种重组载体，其包含编码根据本发明的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因。
本发明涉及一种重组微生物，其经转型以生产所述D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。
本发明还涉及一种生产D-阿洛酮糖的方法，其包含：提供给D-果糖以本发明的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或经转型以生产所述D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的重组微生物，由此引起酶反应；和
提纯所得酶反应物质以获得D-阿洛酮糖。
本发明还涉及一种用于生产D-阿洛酮糖的固定反应器，其包含填充有载体的管柱，根据本发明的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或经转型以生产所述突变体的重组微生物固定到所述载体。
本发明进一步涉及一种生产D-阿洛酮糖的方法，其通过将D-果糖溶液引入到所述固定反应器中来进行。
有利效果
本发明提供一种具有显著改良的热稳定性同时维持酶活性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，其中野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的特定位置处的氨基酸经取代，由此允许当前作为食品原料吸引了关注的D-阿洛酮糖更高效地并且工业上大规模地生产。
具体来说，与野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶或其目前已知的突变体相比，根据本发明的一个实施例的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体在酶反应温度下具有显著延长的半衰期，由此允许所制备的D-阿洛酮糖3-表异构酶长时间用于生产D-阿洛酮糖。因此，根据本发明的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体可以减少生产时间和成本，由此改良生产效率。
此外，根据本发明的另一个实施例，D-阿洛酮糖可以使用包含编码所述D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因的重组载体或经转型以生产所述D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的重组微生物来大规模地高效生产。
附图说明
图1描绘衍生自根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的分子模型。
图2是描绘实例1的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体与比较例1的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶相比的热稳定性的图。
图3是描绘实例2的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体(133L/E77P/S213C)与比较例2的常规D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体(133L/S213C)相比的热稳定性的图。
具体实施方式
在下文中，将对本发明进行更详细描述。本文中将省略对为在此技术领域或相关领域中具有通常知识的本领域技术人员所显而易知的细节的描述。
本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体(下文称为E77P突变体)，其包含如下氨基酸序列，其中衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置77处的谷氨酸经脯氨酸取代。酶突变体的氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:2中。
根癌土壤杆菌是一种已知菌株，并且更详细地说，可以使用根癌土壤杆菌ATCC33970。
衍生自根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的构形在2006年发现，并且目前其构形信息公开于蛋白质数据库(Protein Data Bank，下文称为“PDB”)中。D-阿洛酮糖3-表异构酶(PDB ID:2HK1)由309个氨基酸组成，并且已知可形成复合物，即由四个单体(monomer)组成的四聚体(tetramer)。野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶具有如下结构，其中α-螺旋(α-helix)和β-链(β-strand)反复连接以形成活性位点(active site)，作为底物的D-果糖能够结合到所述活性位点。
衍生自根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶包含阐述于SEQ ID NO:1中的氨基酸序列或其功能片段。如本文所用，术语“功能片段”可以指包含归因于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的一些氨基酸的取代、***或缺失的突变并且具有将D-果糖转化成D-阿洛酮糖的活性的片段。
E77P突变体可以包含如下氨基酸序列，其中野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置33处的异亮氨酸进一步经由以下所构成的族群中选出的氨基酸取代：亮氨酸、半胱氨酸以及缬氨酸，和/或野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置213处的丝氨酸进一步经半胱氨酸取代。
优选地，E77P突变体包含如下氨基酸序列，其中野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置33处的异亮氨酸进一步经亮氨酸取代，并且野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置213处的丝氨酸进一步经半胱氨酸取代(此突变体可以称为I33L/E77P/S213C突变体)。I33L/E77P/S213C突变体的氨基酸与阐述于SEQ ID NO:3中的氨基酸相同。
因此，本发明提供一种与野生型表异构酶或常规表异构酶突变体相比具有改良的热稳定性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，其通过取代野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列中的特定位置处的氨基酸，即位置77处的氨基酸，另外位置33处的氨基酸和/或位置213处的氨基酸，由此实现使用所述突变体高效生产D-阿洛酮糖。
本发明还涉及一种多核苷酸，其编码E77P突变体。多核苷酸可以是编码如下突变体的多核苷酸，其中除了用脯氨酸取代氨基酸序列的位置77处的谷氨酸之外，氨基酸序列的位置33处的异亮氨酸进一步经由以下所构成的族群中选出的氨基酸取代：亮氨酸、半胱氨酸以及缬氨酸，和/或氨基酸序列的位置213处的丝氨酸进一步经半胱氨酸取代。更优选地，多核苷酸是编码I33L/E77P/S213C突变体的多核苷酸。
本发明还涉及一种重组载体，其包含编码公开于本发明中的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因。用以构筑重组载体的载体不受特定限制，并且可以使用典型地用于本领域中的任何载体。载体的实例优选包含质粒载体。优选地，质粒可以是pUC质粒，但不限于此。此外，如下文阐述，可以使用衍生自属于大肠杆菌、重组大肠杆菌、芽孢杆菌属、酵母、棒状杆菌属或土壤杆菌属的微生物的穿梭载体以使上文提及的微生物转型。具体来说，可以使用衍生自属于棒状杆菌属或土壤杆菌属的微生物的穿梭载体。
本发明还涉及一种重组微生物，其经转型以生产D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。重组微生物可以包含例如经包含编码本发明的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因的重组载体转型的微生物。微生物的实例可以包含大肠杆菌、重组大肠杆菌、芽孢杆菌属、酵母、棒状杆菌属或土壤杆菌属。特别地说，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)可以用于本发明。
具体来说，棒状杆菌属的菌株公认为普遍认为安全(Generally Recognized AsSafe)菌株，并且具有容易大规模用于基因工程和培育的性质。此外，棒状杆菌属菌株在各种工艺条件下具有高稳定性和与其它细菌相比相对强的细胞膜结构。出于这些原因，菌株具有细菌细胞在由于高糖浓度等的高渗透压下以稳定状态存在的生物性质。
本发明还涉及经包含编码本发明的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因的重组载体转型的谷氨酸棒状杆菌CJ KY(KCCM11403P)。重组菌株谷氨酸棒状杆菌CJ KY根据布达佩斯条约的规定，在2013年3月28日以保藏编号KCCM11403P保藏于韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)，弘济1洞，西大门区，首尔，韩国，其是国际保藏所。
本发明还涉及一种使用本发明的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或微生物从D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法。
方法可以包含：提供给D-果糖以本发明的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或经转型以生产D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的重组微生物，由此引起酶反应；和
在提纯酶反应产物后回收D-阿洛酮糖。
在制备D-阿洛酮糖的方法中，可以取决于所要目的适合地调节反应条件，如浓度、反应温度、反应时间、pH、D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或微生物的D-果糖的浓度。
举例来说，酶反应的温度可以是20℃到60℃，并且反应时间可以在1分钟到2小时范围内。D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或微生物对D-果糖的重量比可以在约1:10到10:1范围内。优选地，反应温度在30℃到55℃范围内，反应时间在10分钟到90分钟范围内，并且重量比可以在约1:5到约5:1范围内。
在酶反应中可以进一步添加金属离子。
具体来说，酶反应可以在金属存在下进行。D-阿洛酮糖3-表异构酶是一种金属酶(metalloenzyme)，其活化受金属离子调节，并且因此具有酶活性在金属离子存在下会增加的优势。
所用金属的类型可以包含锰、镍、铜等。优选地，有可能使用锰。金属浓度优选可以是0.01mM到5mM，更优选0.1mM到5mM，更优选0.5mM到3mM。在此范围内，本发明具有如下优势，D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的活性可以经适当调节，由此提高D-阿洛酮糖的生产效率。
在生产D-阿洛酮糖时，用于提高D-阿洛酮糖的生产效率的反应可以优选在约5到9的pH下进行。
此外，本发明涉及一种用于生产D-阿洛酮糖的固定反应器，其包含填充有载体的管柱，D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或经转型以生产所述突变体的重组微生物固定到所述载体。本发明涉及一种生产D-阿洛酮糖的方法，其通过提供给固定反应器以D-果糖溶液进行。
术语固定反应器是指如下反应器，其中生产D-阿洛酮糖的反应通过固定于载体上的菌株或通过酶或通过固定于载体上的菌株或通过填充有酶的管柱进行。即，固定的意思是，提供生物活性的物质被固定于载体，在此情况下所述提供生物活性的物质为D-阿洛酮糖3-表异构酶或包含其的菌株。
用于固定酶突变体或重组微生物的载体不受特定限制，并且可以使用此技术领域或相关领域中适用于固定酶或微生物的任何载体。优选地，使用海藻酸钠。
海藻酸钠是海藻的细胞膜中富有的天然胶质多糖，并且由甘露糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，所述酸通过贝塔-1,4-键结、甘露糖醛酸和葡萄糖醛酸数目任意地连接。海藻酸钠可以用于稳定固定菌株或酶。
在下文中，将参考以下实例和实验实例更详细地描述本发明。应理解，这些实例和实验实例仅为了说明而提供，并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实例1
准备D-阿洛酮糖3-表异构酶的E77P突变体
(1)待取代的氨基酸序列的位点选择
在使用通用蛋白质结构分析程序PyMol分析野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的结构(图1)之后，将野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置77处的氨基酸选择为用于取代的氨基酸，引起改良酶的耐热性而不影响酶活性。
在图1中，指示氨基酸序列的位置77处的谷氨酸的位置。
(2)制备E77P突变体
衍生自根癌土壤杆菌ATCC33970的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置77处的谷氨酸(Glu，E)通过定点诱变(site-directed mutagenesis)经脯氨酸取代。为了过度表达经取代的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，将编码D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因***到pUC_HCE载体中以构筑重组载体，然后将其使用热休克方法***到大肠杆菌K12G(E.coli K12G)中。
将含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基用经转型的E.coli K12G接种，接着在37℃下培养6小时。从培养物溶液获取一部分，将其转移到含有50μg/ml氨苄青霉素和0.1mMIPTG(异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷；Isopropyl-beta-thiogalactopyranoside)的培养基中，并且然后在37℃下培养6小时以诱导D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的表达。接着，将培养的溶液在60℃下热处理5分钟，接着以15mM的最终浓度添加D-果糖，由此使得在55℃下反应30分钟。使用常规果糖分析试剂盒(fructose assay kit)，测量D-果糖的残余量。作为测量的结果，证实本发明的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体E77P在55℃的反应温度下展现高半衰期。
如本文所用，术语“半衰期”是指当假定酶或酶突变体的初始酶反应的相对活性为100时，酶或酶突变体的初始酶反应的相对活性降低到50所消耗的时间段。
实例2
制备D-阿洛酮糖3-表异构酶的I33L/E77P/S213C复合突变体
为了过度表达衍生自根癌土壤杆菌ATCC33970的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶，将编码酶的基因***到pUC_HCE载体中以构筑重组载体。通过定点诱变制备I33L/E77P/S213C突变体。将E.coli K12G用重组载体转型，接着培养菌株以允许酶突变体过度表达。
实例3
构筑包含编码D-阿洛酮糖3-表异构酶的I33L/E77P/S213C复合突变体的基因的重组载体和使用其使属于棒状杆菌属的菌株转型
(1)构筑重组载体和使用其使菌株转型
将编码D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因通过聚合酶链反应扩增，其中根据实例2的I33L/E77P/S213C突变体的DNA用作模板并且包含PstI和XbaI限制酶识别序列的寡核苷酸用作引物。为了大规模地表达由扩增的基因编码的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，通过以下方式构造重组表达载体：用限制酶KpnI和XbaI消化衍生自属于棒状杆菌属(Corynebacterium)的细菌的穿梭载体pCJ-1(2004年11月6日保藏于国际保藏所，韩国微生物培养中心，保藏编号KCCM-10611)；和将衍生自谷氨酸棒状杆菌的lysC(NCg10247)启动子和扩增的PCR产物与消化的穿梭载体连接。将重组表达载体通过使用电穿孔进行转型而引入到谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中，以制备能够表达编码D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体(I33L/E77P/S213C)的基因的重组菌株。重组菌株谷氨酸棒状杆菌CJ KY根据布达佩斯条约的规定，在2013年3月28日以保藏编号KCCM11403P保藏于韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)，其是国际保藏所。
(2)培养重组菌株
将含有10μg/ml卡那霉素(10g/l细菌-胰蛋白胨(Bacto-tryptone)，5g/l细菌-酵母提取物(Bacto-yeast extract)，5g/l NaCl，5g/l大豆蛋白胨(Soytone))的MB培养基用在以上(1)中获得的重组菌株以OD600＝0.1的初始浓度接种，接着在30℃下培养24小时以诱导D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的表达。将获得的培养物溶液在OD600＝0.6下添加到以含有10μg/ml卡那霉素的经调整培养基(8g/l葡萄糖，20g/l大豆蛋白胨，10g/l(NH4)2SO4，1.2g/l KH2PO4，1.4g/l MgSO4)馈入的发酵器中，并且在30℃下培养20小时。
比较例1
以与实例1相同的方式，制备载体和经所述载体转型的属于棒状杆菌属的菌株，不同之处在于使用编码衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的基因代替实例1中的E77P突变体。
比较例2
以与实例1相同的方式，制备比较例2的I33L/S213C突变体、包含突变体基因的载体和经所述载体转型的属于棒状杆菌属的重组菌株，不同之处在于编码具有如下氨基酸序列的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因，其中衍生自根癌土壤杆菌ATCC33970的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置33处的异亮氨酸经亮氨酸取代，并且位置213处的半胱氨酸在实例1中通过定点诱变(site-directed mutagenesis)经脯氨酸取代。
实验实例1
评估D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的耐热性和酶活性
(1)热处理
将在实例1到实例3、比较例1以及比较例2中制备的每一种重组E.coli K12G菌株引入到以50ml LB培养基馈入的250ml烧瓶中，接着在振荡培育箱中在37℃下培养约12小时。将所得E.coli K12G培养物溶液在7,000×g下在4℃下离心10分钟，接着悬浮于5ml50mM EPPS，pH 8.0缓冲溶液中。随后，将所得悬浮液使用放置在冰上的超声发生器溶解10分钟，接着在13,000×g下在4℃下离心40分钟，由此得到上清液，将其分开储存。
通过布拉德福蛋白质分析测量上清液的蛋白质浓度，并且然后使用50mM EPPS，pH8.0缓冲溶液，将总蛋白质浓度调节到0.1mg/ml。在通过SDS-PAGE鉴别D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的过度表达之后，将突变体在振荡水浴中在50℃和55℃下各自分别热处理1小时、2小时以及4小时。
(2)通过使用D-果糖作为底物进行D-阿洛酮糖生产来测量酶活性
在热处理之后，为了测量酶突变体的酶活性，将每种经热处理的蛋白质溶液以1:1比率与含有40mM D-果糖的50mM EPPS，pH 8.0缓冲溶液混合，接着在50℃下反应10分钟。随后，通过加热到100℃后持续5分钟停止反应。将反应溶液稀释到1/40，并且通过HPLC测量由D-果糖产生的D-阿洛酮糖的量。
因此，发现与野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶(比较例1)相比，E77P突变体(实例1)展现改良4℃或更大的耐热性(参看图2)。
此外，还发现与I33L/S213C突变体(比较例2)相比，I33L/E77P/S213C突变体(实例2)展现改良5℃或更大的耐热性。经确定，在55℃下I33L/E77P/S213C突变体的半衰期大于在50℃下I33L/S213C突变体的半衰期(参看图3)。
酶活性的测量结果分别描绘于图2和图3中。具体来说，图2展示描绘比较例1的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶和实例1的E77P突变体在使野生型酶和酶突变体在两种温度(50℃和55℃)下分别反应1小时、2小时以及4小时之后的相对残余酶活性的图。此外，图3是描绘比较例2的I33L/S213C突变体和实例2的I33L/E77P/S213C突变体在使那些突变体在两种温度(50℃和55℃)下分别反应1小时、2小时以及4小时之后的相对残余酶活性的图。
如图2和图3可见，与目前野生型菌株或目前已知的突变体I33L/S213C相比，根据本发明的酶突变体展现改良的热稳定性。

Claims (13)

1.一种D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，其为衍生自SEQ ID NO:1所示的根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置77处的谷氨酸经脯氨酸取代所衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，其中所述氨基酸序列的位置33处的异亮氨酸经由以下所构成的族群中选出的氨基酸取代：亮氨酸、半胱氨酸以及缬氨酸，或所述氨基酸序列的位置213处的丝氨酸经半胱氨酸取代。
3.根据权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，其中所述氨基酸序列的位置33处的异亮氨酸经亮氨酸取代，并且所述氨基酸序列的位置213处的丝氨酸经半胱氨酸取代。
4.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1到3中任一项所述的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。
5.一种重组载体，其包括编码根据权利要求1到3中任一项所述的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因。
6.一种重组微生物，其经转型以生产根据权利要求1到3中任一项所述的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。
8.一种生产D-阿洛酮糖的方法，其包括：
提供给D-果糖以根据权利要求1到3中任一项所述的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或根据权利要求6到7中任一项所述的经转型以生产所述D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的重组微生物，由此引起酶反应；以及
在提纯所述酶反应的产物后回收D-阿洛酮糖。
9.根据权利要求8所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其中在所述酶反应中进一步添加金属离子。
10.根据权利要求9所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其中所述金属是锰。
11.根据权利要求9所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其中所述金属离子以0.01mM到5mM的浓度添加。
12.一种用于生产D-阿洛酮糖的固定反应器，其包括填充有载体的管柱，根据权利要求1到3中任一项所述的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或根据权利要求6所述的重组微生物固定到所述载体。
13.一种生产D-阿洛酮糖的方法，其通过将D-果糖溶液引入到根据权利要求12所述的用于生产D-阿洛酮糖的固定反应器中来进行。
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