CN105164160A

CN105164160A - 特异性结合her2的抗体

Info

Publication number: CN105164160A
Application number: CN201480024152.3A
Authority: CN
Inventors: 李钟瑞; 金奎兑; 李英河; 李叔妍; 黄寅式; 高凤国
Original assignee: AbClon Inc
Current assignee: AbClon Inc
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2034-05-14
Also published as: JP2018008954A; CA2910407A1; CA2910407C; BR112015027400B1; WO2014185704A1; ES2710707T3; JP6487968B2; US20160053011A1; BR112015027400A2; RU2015146664A; CN105164160B; AU2014266118B2; EP2998319B1; JP6234548B2; EP2998319A1; HK1217500A1; JP2016518368A; EP2998319A4; MX2015015110A; US10174116B2

Abstract

本发明涉及用于预防或治疗癌症的用来联合施用的新HER2抗体。本发明抗体特异性结合癌细胞(特别是乳腺癌细胞和胃癌细胞)中过表达的HER2，并且与不同于曲妥珠单抗所结合表位的表位结合。本发明抗体具有独特的序列，因为其与已知的HER2靶向抗体的CDR序列相比具有非常低的同源性。当与曲妥珠单抗联合施用时，本发明抗体以明显提高的癌细胞杀伤能力杀伤癌细胞，因此对于预防或治疗癌症(特别是乳腺癌和胃癌)非常有用。不希望受理论约束，认为联合施用本发明抗体的明显功效是由于本发明抗体与HER2之不同于曲妥珠单抗所结合表位的表位结合，因此与曲妥珠单抗协作地抑制HER2。

Description

特异性结合HER2的抗体

技术领域

本发明是由AbClon，Inc于2011年11月1日至2014年10月1日在基金1415118385下在韩国技术进步研究所的支持下进行的，并且由KIAT名为InternationalCooperationTechnologyDevelopmentWorksandInnovativeEpitopeDiscoveryPlatformTechnology-BasedGlobalAntibodyNewDrugDevelopment的国际合作支持团队管理。

本申请要求于2013年5月16日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2013-0055912的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

本发明涉及HER2(人表皮生长因子受体2，HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2)抗体来预防或治疗HER2相关疾病，特别是癌症。

背景技术

HER2/neu(ErbB2)基因编码185kDa的跨膜糖蛋白，其为一种EGFR(表皮生长因子受体)家族成员。HER2蛋白由具有620个氨基酸残基的胞外结构域、具有23个氨基酸残基的跨膜结构域和具有490个氨基酸残基的有酪氨酸激酶活性的胞内结构域组成(AkiyamaT等，Science，232(4758)：1644-1646(1986))。

此外，许多论文中报道了具有多种特征的HER2抗体：Tagliabue等，Iht.J.Cancer47：933-937(1991)；McKenzie等，Oncogene4：543-548(1989)；Maier等，CancerRes.51：5361-5369(1991)；Bacus等，MolecularCarcinogenesis3：350-362(1990)；Stancovski等，PNAS(USA)88：8691-8695(1991)；Bacus等，CancerResearch52：2580-2589(1992)；Xu等，Int.J.Cancer53：401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等，CancerResearch52：2771-2776(1992)；Hancock等，CancerResearch.51：4575-4580(1991)；Shawver等，CancerRes.54：1367-1373(1994)；Arteaga等，CancerRes.54：3758-3765(1994)；Harwerth等，J.Biol.Chem.267：15160-15167(1992)；美国专利No.5,783,186；Kao等，美国公开No.2009/0285837(2009)；Ross等，TheOncologist8：307-325(2003)以及Klapper等，Oncogene14：2099-2109(1997)。

在HER2抗体中，曲妥珠单抗(trastuzumab)作为商业上最成功的抗体(商业化为Herceptin^TM，美国专利No.5,821,337)已经被进行了大量的研究：Sapino，A.，等，AnnalsofOncology(2007)18：1963-1968；Bussolati，G，等，BritishJournalofCancer(2005)92，1261-1267；和GlazyrinA，等，JHistology&Cytochemistry(2007)55(1)：25-33。

尽管曲妥珠单抗在商业上是成功的，但是这种抗体可能仅在15％的过表达HER2的乳腺癌患者中表现出治疗功效。因此，在增强曲妥珠单抗功效的程度或范围的情况下，已经尝试通过组合疗法改善对曲妥珠单抗无响应或不良响应的癌症患者的预后。

例如，美国专利申请公开No.2011-0086004公开了与曲妥珠单抗和IL-21的组合癌症疗法。美国专利申请公开No.2012-0107270描述了与和IL-2缀合的靶向生腱蛋白之抗体组合的曲妥珠单抗。

美国专利申请公开No.2005-0101618公开了用曲妥珠单抗和erbB2配体的癌症疗法。欧洲专利申请公开No.2134364公开了通过与端粒酶抑制剂组合的曲妥珠单抗抑制癌细胞增殖。WO2008/031531描述了与帕妥珠单抗(pertuzumab)组合的曲妥珠单抗可阻抑癌症转移。

贯穿本申请，引用了多个专利和出版物，并且将引用提供在括号中。这些专利和出版物的公开内容以其整体在此通过引用并入本申请中，以更完整地描述本发明以及本发明所属领域的状态。

待解决的技术问题

本发明人进行了大量的研究来开发能够预防或治疗HER2相关疾病(特别是癌症(更特别地，乳腺癌和胃癌))的抗体。特别地，本发明人进行了大量的研究来开发与曲妥珠单抗组合的抗体，其能够克服与作为单一药剂的曲妥珠单抗治疗相关的抗癌功效的局限性。结果，本发明人开发了本身具有显著抗癌功效并且与曲妥珠单抗组合具有高得多的功效的新抗体，其用于预防或治疗癌症(特别是乳腺癌和胃癌，更特别地是表达HER2的乳腺癌和胃癌)。

因此，本发明的一个目的是提供人表皮生长因子受体2(HER2)的抗体或其抗原结合片段。

本发明的另一个目的是提供编码本发明的HER2抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

本发明的另一个目的是提供携带所述核酸分子的重组载体。

本发明的另一个目的是提供感染有所述重组载体的宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗癌症的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供用于诱导凋亡的药物组合物。通过以下发明详述并结合所附权利要求和附图，本发明的其他目的和优点将变得明显。

发明详述

在本发明的第一个方面，提供了人表皮生长因子受体2(HER2)的抗体或其抗原结合片段，其包含：

(a)重链可变区，其包含SEQIDNO：1的互补决定区(CDR)H1、SEQIDNO：2的CDRH2和下式1所示的CDRH3：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Phe-Asp-Tyr(1)

其中X1表示His、Asn、Ser或Ala；X2表示Leu、Phe、Tyr、His、Met、Trp、Asn、Ile或Ala；X3表示Gly或Cys；X4表示Gly或Ser；X5表示Thr、Met或Ala；X6表示Ala、Ser、Gly或Thr；并且X7表示Ser、Ala、Cys或Thr；以及

(b)轻链可变区。

本发明抗体对HER2具有特异性结合能力。特别地，本发明抗体与HER2上不同于曲妥珠单抗所结合表位的表位结合。

本文使用的术语“曲妥珠单抗”是指美国专利No.5,821,337中公开的抗体。

本发明抗体对多种表达HER2的癌细胞表现出细胞毒性作用或增殖抑制作用。与癌细胞结合时，术语“细胞毒性”和“增殖抑制”之间没有预期的差异，并且这些术语在本文中可互换使用。

本文使用的术语“抗体”是指HER2特异性抗体，包括全抗体以及抗体的任意抗原结合片段。

全抗体包括两个全长轻链和两个全长重链，并且每个轻链通过二硫键与重链连接。重链恒定区包括5种不同的同种型(y、μ、α、δ和ε)，其被归类为γ1、γ2、γ3、γ4、α1和α2亚组。轻链恒定区包括两个不同的同种型(κ和λ)(CellularandMolecularImmunology，Wonsiewicz，M.J.，编辑，第45章，第41-50页，W.B.SaundersCo.Philadelphia，PA(1991)；Nisonoff，A.，IntroductiontoMolecularImmunology，第2版，第4章，第45-65页，sinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1984))。

抗原结合片段是指任何能够与抗原结合的抗体片段，包括Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv等。Fab具有一个抗原结合位点，其由抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域、轻链恒定结构域和重链第一恒定结构域(CH₁)构成。Fab'不同于Fab在于在重链CH₁结构域的C末端具有包含一个或更多个半胱氨酸残基的铰链区。通过在Fab′铰链区的半胱氨酸残基之间形成二硫键来产生F(ab’)₂抗体。Fv是由重链可变区和轻链可变区构成的最小抗体片段，并且制备Fv片段的重组技术公开于PCTWO88/10649、WO88/106630、WO88/07085、WO88/07086和WO88/09344中。在双链中，重链和轻链的可变区通过非共价键连接，而在单链Fv中，重链和轻链的可变区通常经由肽接头通过共价键连接，或者在C末端彼此直接连接形成二聚体(例如双链Fv)。可使用蛋白水解酶获得这样的抗体片段(例如，用木瓜蛋白酶消化全抗体以产生Fab片段，而胃蛋白酶处理导致产生F(ab’)₂片段)，并且可以通过遗传重组技术来制备这样的抗体片段。

根据一个实施方案，本发明抗体包括Fab抗体和全抗体。此外，重链恒定区选自由γ、μ、α、δ或ε组成的同种型。优选地，重链恒定区包括γ1、γ3和γ4同种型，最优选γ1同种型。轻链恒定区可以是κ和λ同种型，优选κ同种型。因此，本发明抗体的一个优选实施方案是包含κ轻链和γ1重链的Fab或IgG1抗体。

本文使用的术语“重链”是指全长重链及其一部分二者，其包含含有用于特异性结合抗原之可变区序列的氨基酸序列的可变结构域(V_H)和三个恒定结构域(C_H1、C_H2和C_H3)。本文使用的术语“轻链”是指全长轻链及其一部分二者，其包含含有用于特异性结合抗原之可变区序列的氨基酸序列的可变结构域(V_L)和恒定结构域(C_L)。

本文使用的术语“CDR(互补决定区，complementaritydeterminingregion)”是指免疫球蛋白的重链超变区和轻链超变区的氨基酸序列(Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第4版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NationalInstitutesofHealth(1987))。每个重链和轻链包含三个CDR(重链(CDRH1、CDRH2和CDRH3)以及轻链(CDRL1、CDRL2和CDRL3))。CDR提供了在抗体与抗原或表位结合中具有重要作用的接触残基。

在本发明抗体中，CDRH3如式1所示。

在式1中，X1表示His、Asn、Ser或Ala；特别地为His、Asn或Ser；更特别地为His或Asn；更特别地为His。

在式1中，X2表示Leu、Phe、Tyr、His、Met、Trp、Asn、Ile或Ala；特别地为Leu、Phe、Tyr、His、Met、Trp、Asn或Ile；更特别地为Leu、Phe或Tyr；更特别地为Leu。

在式1中，X3表示Gly或Cys；特别地为Gly。

在式1中，X4表示Gly或Ser；特别地为Gly。

在式1中，X5表示Thr、Met或Ala；特别地为Thr。

在式1中，X6表示Ala、Ser、Gly或Thr；特别地为Ala。

在式1中，X7表示Ser、Ala、Cys或Thr；特别地为Ser。

根据一个实施方案，X1表示His、Asn或Ser；X2表示Leu、Phe或Tyr；X3表示Gly；X4表示Gly；X5表示Thr、Met或Ala；X6表示Ala、Ser、Gly或Thr；并且X7表示Ser、Ala、Cys或Thr。

更特别地，X1表示His、Asn或Ser；X2表示Leu、Phe或Tyr；X3表示Gly；X4表示Gly；X5表示Thr；X6表示Ala；并且X7表示Ser。

更特别地，CDRH3包含选自SEQIDNO：3、27-28、32和39-86的氨基酸序列；更特别地，CDRH3包含SEQIDNO：3、43、64、67、71、76、83、84或85的氨基酸序列；最特别地，SEQIDNO：3。

根据一个实施方案，轻链可变区包含SEQIDNO：4的CDRL1、SEQIDNO：5的CDRL2和下式2所示的CDRL3：

Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Pro-Trp-Thr(2)

其中，Y1表示Gln、Asp或Ala；Y2表示Gln、Asn、Glu或Ala；Y3表示Leu、Met、Asn、Ile、Ser、Thr、Ala或Lys；Y4表示Tyr、Ala、Ser、Arg、Val、Gly、Met或Phe；Y5表示Ser、Phe、Tyr、Arg、Ile、Gly、Lys、Asn、Val或Ala；并且Y6表示Thr、Ser、Val、Ile、Ala、Gly、Asn、Glu、Phe或Leu。

在式2中，Y1表示Gln、Asp或Ala；特别地为Gln或Asp；更特别地为Gln。

在式2中，Y2表示Gln、Asn、Glu或Ala；特别地为Gln、Asn或Glu；更特别地为Gln。

在式2中，Y3表示Leu、Met、Asn、Ile、Ser、Thr、Ala或Lys；特别地为Leu、Met、Asn、Ile、Ser或Thr；更特别地为Leu、Met、Asn或Ile；更特别地为Leu或Met；更特别地为Leu。

在式2中，Y4表示Tyr、Ala、Ser、Arg、Val、Gly、Met或Phe；特别地为Tyr或Ala。

在式2中，Y5表示Ser、Phe、Tyr、Arg、Ile、Gly、Lys、Asn、Val或Ala；特别地为Ser、Phe、Tyr、Arg或Ile；更特别地为Ser、Phe或Tyr。

在式2中，Y6表示Thr、Ser、Val、Ile、Ala、Gly、Asn、Glu、Phe或Leu；特别地为Thr、Ser、Val、Ile、Ala、Gly或Asn；更特别地为Thr、Ser或Ala。

根据一个实施方案，Y1表示Gln或Asp；Y2表示Gln；Y3表示Leu、Met、Asn、Ile、Ser或Thr；Y4表示Tyr、Ala、Ser、Arg、Val、Gly、Met或Phe；Y5表示Ser、Phe、Tyr、Arg或Ile；并且Y6表示Thr、Ser、Val、Ile、Ala、Gly或Asn。

更特别地，CDRL3包含SEQIDNO：6、33-38或87-245的氨基酸序列；更特别地，CDRL3包含SEQIDNO：6、88、109、131、155、156、157、178、218、220、222或239的氨基酸序列；最特别地，SEQIDNO：6、88(hz1E11-3)、218(hz1E11-133)或239(hz1E11-154)。

根据一个实施方案，重链可变区包含SEQIDNO：8(1E11)或24(hz1E11)的氨基酸序列。

根据一个实施方案，轻链可变区包含SEQIDNO：10(1E11)、26(hz1E11)、247(hz1E11-3)、249(hz1E11-133)或251(hz1E11-154)的氨基酸序列。

如实施例中所证明的，尽管本发明抗体特异性地结合HER2胞外结构域(ECD)中的亚结构域4，然而本发明抗体结合亚结构域4上不同于曲妥珠单抗之表位的表位。

本发明HER2抗体或其抗原结合片段包含所附序列表中给出的氨基酸序列的变体，只要其能够特异性识别HER2即可。例如，可以改变抗体的氨基酸序列以提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学特征。例如，这样的改变包括抗体氨基酸残基的缺失、***和/或替换。

这样的氨基酸变化可以基于氨基酸侧链的相对相似性(如疏水性、亲水性、电荷和大小)来提供。通过分析氨基酸侧链的大小、形状和类型，明显精氨酸、赖氨酸和组氨酸残基全都具有正电荷；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有类似大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有类似形状。因此，基于这些可考虑的因素，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可以被认为在生物学上是功能等同的。

为了引入变化，可以考虑氨基酸的亲水指数。基于疏水性和电荷，给出了每个氨基酸的亲水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

为了提供蛋白质的相互作用生物学功能，氨基酸的亲水指数非常重要。本领域技术人员公知的是，只有用具有类似亲水指数的氨基酸替代蛋白质时，变体才能够具有类似的生物学活性。当基于亲水指数引入变化时，替换优选地在亲水指数值的差异不超过±2、更优选±1内、更优选±0.5内的氨基酸残基之间进行。

对于本领域技术人员来说还明显的是，将氨基酸替换成具有类似亲水性值的其他氨基酸可导致产生具有生物学等同活性的变体。如美国专利No.4,554,101中公开的，给每个氨基酸残基分配了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

当意在基于亲水性值引入变化时，替换优选地在亲水性值的差异不超过±2、更优选±1内、更优选±0.5内的氨基酸残基之间进行。

在基本上不损害蛋白质活性的情况下改变氨基酸残基是本领域技术人员公知的(H.Neurath，R.L.Hill，TheProteins，AcademicPress，NewYork，1979)。这样的氨基酸改变包括以下替换：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，但不限于此。

考虑到前述变化具有生物学等同活性，可以理解的是本发明的抗体或编码所述抗体的核酸包含与所附序列表中给出的序列基本上相同的序列。基本上相同的序列是指如使用一种常规使用的序列比较算法测量，那些序列示出与所附序列表的序列优选至少61％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选地至少90％的核苷酸相似性。用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。多种程序和比对算法描述于以下文献中：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)；Needleman和Wunsch，J.Mol.Bio.48：443(1970)；Pearson和Lipman，MethodsinMol.Biol.24：307-31(1988)；Higgins和Sharp，Gene73：237-44(1988)；Higgins和Sharp，CABIOS5：151-3(1989)；Corpet等，Nuc.AcidsRes.16：10881-90(1988)；Huang等，Comp.Appl.BioSci.8：155-65(1992)；以及Pearson等，Meth.Mol.Biol.24：307-31(1994)。NCBI基于局部比对的搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool，BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-10(1990))可从多种来源获得，包括国家生物技术信息中心(NBCI，Bethesda，Md.)和互联网上，以用于结合blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx的序列分析程序使用。其可以从http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/访问。如何使用该程序来确定序列同一性的描述可从http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BI-AST/blasthelp.html获得。

本发明抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFV)和抗独特型(抗Id)抗体及其表位结合片段。

本发明抗体的CDR序列表现为与公众已知的抗体的CDR低的相似性，使得CDR序列是独特的。例如，美国专利No7,329,737和7,993,646中所公开的与BLAST搜索(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的本发明抗体具有最高相似性的抗体示出与亲本抗体1E11抗体的CDR序列小于50％的相似性，而且其还与hK-1结合，hK-1不同于本发明抗体的靶标。

因此，可以认为本发明抗体的氨基酸序列是新的和独特的。

在本发明的另一个方面，提供了编码本发明抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

本文中使用的术语“核酸分子”概括地指DNA(gDNA和cDNA)或RNA分子，并且核酸分子的基本核苷酸还包括具有经修饰的糖或碱基以及天然核苷酸的类似物(Scheit，NucleotideAnalogs，JohnWiley，NewYork(1980)；Uhlman和Peyman，ChemicalReviews，90：543-584(1990))。编码重链可变区和轻链可变区的本发明核酸分子的序列可以被修饰。这样的修饰包括核苷酸的添加、缺失或者非保守替换或保守替换。

根据一个实施方案，编码重链可变区的核酸分子包含SEQIDNO：7或23的核苷酸序列。

根据一个实施方案，编码轻链可变区的核酸分子包含SEQIDNO：9、25、246、248或250的核苷酸序列。

编码本发明HER2抗体的核酸分子还包含与上述核苷酸序列具有基本同源性的核苷酸序列。基本同源性意指通过使用本发明核苷酸序列和其他随机序列之间的最大比对以及本领域技术人员通常已知的算法进行的序列比对分析，核苷酸序列具有至少80％、更优选90％和最优选95％的同源性。

在本发明的另一个方面，提供了包含本发明上述核酸分子的重组载体。

本文使用过的术语“载体”是用于在宿主细胞表达靶基因的工具，包括质粒载体、黏粒载体和病毒载体(例如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体)。

根据一个实施方案，编码轻链可变区和重链可变区的核酸分子与启动子有效连接。

本文使用的术语“有效连接”是指核酸表达控制序列(例如，启动子、信号序列或转录因子结合位点的阵列)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列影响对应于第二序列之核酸的转录和/或翻译。

本发明的重组载体可以通过本领域技术人员已知的多种方法来构建，并且其实践方法描述在Sambrook等，MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)中，其通过引用并入本文。

通常，本发明载体可以被构建成克隆载体或表达载体。另外，本发明载体可以使用原核细胞或真核细胞作为宿主细胞来构建。

例如，当构建用于真核宿主细胞的表达载体时，可以使用来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子和人肌肉肌酸启动子)或哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒启动子、EB病毒(EBV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子)。载体通常含有作为转录终止子的多腺苷酸化序列。

本发明载体可与其他序列融合以纯化表达的抗体。例如，待融合序列包括谷胱甘肽-S-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)和6×His(六组氨酸；Quiagen，USA)等。

由于本发明载体表达的蛋白质是抗体，因此也可以通过蛋白A柱以简单的方式来纯化表达的抗体，而不需要添加用于纯化的序列。

本发明的表达载体包含本领域普通技术人员已知的抗生素抗性基因作为选择标志物，例如，抗氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素的抗性基因。

在本发明的另一个方面，提供了用上述重组载体转化的宿主细胞。

本发明载体在其中稳定并且成功地克隆和表达的宿主细胞还利用本领域技术人员已知的任何细胞，例如合适的真核宿主细胞，包括COS7细胞(猴肾细胞)、NSO细胞、SP2/0、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、W138、BHK(幼仓鼠肾)细胞、MDCK、骨髓瘤细胞系、HuT78细胞和HEK-293细胞，但是不限于此。

在本发明的另一个方面，提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含：(a)药学有效量的本发明的HER2抗体或其抗原结合片段；和(b)可药用载体。

由于本发明药物组合物包含本发明的HER2抗体或其抗原结合片段作为活性成分，因此省略了对于其之间的共同描述以避免过度冗余而导致说明书复杂。

如实施例中描述的，本发明的HER2抗体与曲妥珠单抗组合来以显著增强的细胞毒性杀伤癌细胞(特别地，乳腺癌细胞，更特别地，表达HER2的乳腺癌细胞)，因此在治疗癌症(特别地，乳腺癌和胃癌，更特别地，表达HER2的乳腺癌和胃癌)中非常有效。根据一个实施方案，所述药物组合物还包含曲妥珠单抗。

待通过本发明组合物预防或治疗的癌症包括本领域技术人员已知的多种癌症，例如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、结肠癌、***、脑癌、***癌、骨癌、头颈癌、皮肤癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌或输尿管癌。

特别地，待通过所述组合物预防或治疗的癌症是表达HER2的癌症，更特别地是表达HER2的乳腺癌或胃癌。

在本发明的另一个方面，提供了用于诱导凋亡的药物组合物，其包含(a)药学有效量的本发明的HER2抗体或其抗原结合片段；和(b)可药用载体。

根据一个实施方案，所述药物组合物诱导凋亡以预防或治疗过度增殖性疾病，其中所述过度增殖性疾病是癌症、增生、瘢痕疙瘩、库欣综合征(Cushingsyndrome)、原发性醛固酮增多症、粘膜红斑、真性红细胞增多症、粘膜白斑病、增生性瘢痕、扁平苔藓、着色斑病、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄或狭窄。

可药用载体可以是用于制剂的常规可药用载体，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、***胶、磷酸钾、藻酸盐明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。根据本发明的药物组合物还可以包含润滑剂、保湿剂、甜味剂、矫味剂、乳化剂、助悬剂和防腐剂。合适的可药用载体和制剂的细节可以在Remington′sPharmaceuticalSciences(第19版，1995)中找到，其通过引用并入本文。

根据本发明的药物组合物可以肠胃外施用，例如，通过静脉内、皮下、肌内、腹膜内、局部、鼻、肺或直肠施用。

本发明药物组合物的合适剂量可以根据药物配制方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、疾病的严重程度、饮食、施用时间、施用途径、***率和对药物组合物的敏感性来改变。优选地，以0.0001-100mg/kg(体重)的每日剂量施用本发明的药物组合物。术语“药学有效量”是指适合预防或治疗癌症的量。

根据本领域技术人员已知的常规技术，所述药物组合物可以与可药用载体和/或赋形剂配制，最终提供多种形式，包括单位剂量形式和多剂量形式。制剂可以是油或水介质、重悬液或乳液、提取物、粉末、栓剂、颗粒、片剂或胶囊剂，并且还包含分散剂或稳定剂。

本发明的抗体可以用于诊断表达HER2的相关病症、疾病或状况(condition)。

在本发明的另一个方面，提供了用于诊断表达HER2的相关病症、疾病或状况的试剂盒，其包含本发明的HER2抗体或其抗原结合片段。

表达HER2的相关病症、疾病或状况特别是癌症，例如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、结肠癌、***、脑癌、***癌、骨癌、头颈癌、皮肤癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌或输尿管癌。特别地，本发明的诊断试剂盒用于诊断表达HER2的癌症，更特别地为表达HER2的乳腺癌或胃癌。

本发明抗体可用于分析本发明抗体在患者中的药物响应性。

在本发明的另一个方面，提供了用于分析药物响应性的试剂盒，其包含本发明抗体。

本发明的分析试剂盒用于评估本发明抗体在患者中的药物响应性。例如，当用本发明抗体孵育从患者获得的癌细胞并且发现抗体与所述细胞结合时，确定所述患者具有对本发明抗体的药物响应性。

由于本发明试剂盒包含抗体，因此其可以被制造成用于免疫测定或免疫染色。所述免疫测定或免疫染色形式包括但不限于放射免疫测定、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、捕获-ELISA、抑制或竞争测定、夹心法测定、流式细胞术、免疫荧光染色和免疫亲和纯化，但不限于此。免疫测定或免疫染色程序可以在以下文献中找到：EnzymeImmunoassay，E.T.Maggio编辑，CRCPress，BocaRaton，Florida，1980；Gaastra，W.，Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)，inMethodsinMolecularBiology，第1卷，Walker，J.M.编辑，HumanaPress，NJ，1984；以及EdHarlow和DavidLane，UsingAntibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1999，其通过引用并入本文。

例如，根据放射免疫测定方法，可使用放射性同位素(例如，C¹⁴、I¹²⁵、P³²和S³⁵)标记的抗体来鉴定癌细胞表面上的HER2。根据ELISA方法，本发明方法的特定实例可包括以下步骤：(i)用待分析的生物样品包被固体基底的表面；(ii)用本发明的HER2抗体作为一抗孵育所述生物样品；(iii)用与酶缀合的二抗孵育步骤(ii)的所得物；以及(iv)测量所述酶的活性。

固体基底可以是烃聚合物(例如，聚苯乙烯和聚丙烯)、玻璃、金属或凝胶。最优选地，固体基底是微量滴定板。

与二抗缀合的酶包括催化比色、荧光、发光或红外反应的酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶和细胞色素P₄₅₀。当使用碱性磷酸酶时，可使用溴氯吲哚磷酸(BCIP)、硝基四氮唑蓝(NBT)、萘酚-AS-B1-磷酸盐和ECF(增强的化学荧光)作为底物；在使用辣根过氧化物酶的情况下，可使用氯萘酚、氨乙基咔唑、二氨基联苯胺、D-荧光素、光泽精(双-N-甲基吖啶硝酸盐)、试卤灵二苄醚、鲁米诺、AmplexRed试剂(10-乙酰基-3，7-二羟基吩嗪，Pierce)、HYR(对苯二胺-HCl和邻苯二酚)、TMB(3，3，5，5-四甲基联苯胺)、ABTS(2，2-吖嗪-二[3-乙基苯并噻唑啉磺酸])、邻苯二胺(OPD)和萘酚/焦宁、葡萄糖氧化酶和t-NBT(硝基四氮唑蓝)以及m-PMS(吩嗪硫酸甲酯)作为底物。

根据捕获-ELISA方法，本发明方法的特定实例可包括以下步骤：(i)用HER2抗体作为捕获抗体包被固体基底的表面；(ii)用待分析的生物样品孵育所述捕获抗体；(iii)用与产生可检测信号的标签缀合的HER2抗体作为检测抗体来孵育步骤(ii)的所得物；以及(iv)测量所述标签产生的信号。

检测抗体具有产生可检测信号的标签。所述标签包括但不限于化学标签(例如，生物素)、酶促标签(例如，碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶和细胞色素P₄₅₀)、放射性标签(例如，C¹⁴、I¹²⁵、P³²和S³⁵)、荧光标签(例如，荧光素)、发光标签、化学发光标签和FRET(荧光共振能量转移)标签。多种标签和用于标记抗体的方法可以在以下文献中找到：EdHarlow和DavidLane，UsingAntibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1999。

ELISA和捕获-ELISA中酶活性或信号的测量可以通过本领域中公知的多种方法来进行。当使用生物素作为标签时，可以使用链霉亲和素进行检测。当使用荧光素酶时，可以使用荧光素进行检测。

适用于本发明试剂盒的生物样品包括但不限于细胞、组织、来源于组织的提取物、裂解物或纯化产物、血液、血浆、血清、淋巴和腹水。

本发明抗体可用于体内或体外成像。在本发明的另一个方面，提供了成像组合物，其包含本发明的抗体和与所述抗体缀合的产生信号的标签。

产生信号的标签包括但限于T1造影剂(例如，Gd螯合物化合物)、T2造影剂(例如，超顺磁材料，(例如，磁铁矿、Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃、锰铁氧体、钴铁氧体和镍铁氧体))、放射性同位素(例如，¹¹C、¹⁵O、¹³N、P³²、S³⁵、⁴⁴Sc、⁴⁵Ti、¹¹⁸I、¹³⁶La、¹⁹⁸Tl、²⁰⁰Ti、²⁰⁵Bi和²⁰⁶Bi)、荧光材料(例如，荧光素、藻红蛋白、罗丹明、丽丝胺、Cy3和Cy5)、化学发光材料、磁性颗粒、质量标签和电子致密颗粒。

尽管本发明抗体单独可用于癌症治疗，但是其可以通过与其他药物缀合)来以ADC(抗体药物缀合物)的形式提供，因为所述抗体能够靶向表达HER2的细胞。

因此，在本发明的另一个方面，提供了ADC(抗体药物缀合物)，其包含本发明抗体和与所述抗体缀合的药物。

与所述抗体缀合的药物包括但不限于化学物质、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、毒素、生物试剂和酶抑制剂，特别地，抗癌药物如下：阿西维辛、阿柔比星、阿可达唑、山油柑碱、阿多来新、丙氨菌素、阿地白介素、别嘌醇钠、六甲蜜胺、氨鲁米特、氨萘非特、聚肌胞、安吖啶、雄激素、蛇形菌素、艾菲地可宁甘氨酸盐、阿沙立天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、卡介苗(BCG)、贝氏抗叶酸药、β-2′-脱氧硫代鸟嘌呤、盐酸必桑郡、硫酸博莱霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜亚胺、BWA773U82、BW502U83/HCl、BW7U85甲磺酸盐、神经酰胺卡比替膜、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氯喹喔啉-磺酰胺、氯脲霉素、色霉素A3、顺铂、克拉屈滨、皮质类固醇、短小棒状杆菌菌苗、CPT-11、克雷斯托、环胞苷、环磷酰胺、阿糖胞苷、色他巴、马来酸、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸柔红霉素、脱氮尿苷、右雷佐生、二去水卫矛醇、地吖醌、二溴卫矛醇、二乙基二硫代氨基甲酸钠、肌苷二醛、二氢-5-氮杂胞苷、阿霉素、棘霉素、依达曲沙、依地福新、依洛尼塞、埃利奥溶液、依沙芦星、表柔比星、依索比星、磷酸雌莫司汀、***、依他硝唑、氨磷汀、依托泊苷、法曲唑、法扎拉滨、维甲酰酚胺、非格司亭、非那雄胺、黄酮醋酸、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、Fluosol^TM、氟他胺、硝酸镓、吉西他滨、醋酸性瑞林、庚磺胺、六亚甲基双乙酰胺、高三尖杉酯碱、硫酸肼、4-羟基雄甾烯二酮、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、4-甘薯黑疤霉醇、异丙铂、异维甲酸、甲酰四氢叶酸钙、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、脂质体柔红霉素、脂质体包封的多柔比星、洛莫司汀、氯尼达明、美登素、盐酸氮芥、美法仑、美洛格瑞、巴龙、6-巯基嘌呤、美司钠、卡介苗的甲醇提取残余物、甲氨蝶呤、N-甲基甲酰胺、米非司酮、丙米腙、丝裂霉素C、米托坦、盐酸米托蒽醌、单核细胞/巨噬细胞集落刺激因子、纳比隆、萘福昔定、新制癌菌素、醋酸奥曲肽、奥马铂、奥沙利铂、泰素、磷乙天冬氨酸、喷司他丁、哌嗪二酮、哌泊溴烷、吡柔比星、吡曲克辛、盐酸必散特隆、PIXY-321、普卡霉素、卟吩姆钠、松龙苯芥、丙卡巴肼、孕酮、吡唑呋喃菌素、丙亚胺、沙格司亭、司莫司汀、螺旋锗、螺旋氮芥、链黑霉素、链脲霉素、磺氯苯脲、苏拉明钠、他莫西芬、泰索帝、喃氟啶、替尼泊苷、对苯二甲酸脒、台罗西隆、硫鸟嘌呤、噻替哌、胸苷注射剂、噻唑呋林、拓扑替康、托瑞米芬、维甲酸、盐酸三氟拉嗪、三氟尿苷、曲麦克特、TNF(肿瘤坏死因子)、尿嘧啶氮芥、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、长春烯碱、长春氮芥、Yoshi864、佐柔比星、胞嘧啶***糖苷、依托泊苷、美法仑、泰索帝和紫杉醇。

发明效果

本发明的特征和优点总结如下：

(a)本发明抗体特异性结合癌细胞(特别是乳腺癌和胃癌细胞)中过表达的HER2，特别结合于HER2上不同于曲妥珠单抗之表位的表位。

(b)本发明抗体的CDR序列示出与公众已知的HER2抗体的CDR序列的低相似性，使得所述CDR序列是独特的。

(c)本发明抗体与曲妥珠单抗组合以显著增强的细胞毒性杀伤癌细胞，因此在治疗癌症(特别是乳腺癌和胃癌)中特别有效。

(d)不受理论的约束，组合疗法增强的功效如下实现：本发明抗体与HER2上不同于曲妥珠单抗之表位的表位结合，并且与曲妥珠单抗以协作方式抑制HER2。

(e)能够诱导凋亡的本发明抗体可用于预防或治疗过度增殖性疾病。

(f)本发明还可用于癌症诊断、药物响应性分析、成像和ADC(抗体药物缀合物)以及癌症治疗。

附图简述

图1示出了pcDNA3.3-IgG重载体和pOptiVEC-IgGκ载体的遗传图。

图2A和2B是这样的图，其分别示出了针对NCI-N87癌细胞系和BT-474癌细胞系的1E11抗体的单一处理以及1E11抗体与曲妥珠单抗的组合处理的增殖抑制作用。TRA、PER和hIgG分别表示曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和人IgG(阴性对照)。

图3A和3B示出了1E11抗体与HER2亚结构域的不同于曲妥珠单抗之结合结构域的结构域结合。图3A和3B分别示出了SPR分析和ELISA分析的结果。

图4A示出了ELISA分析的结果，以检查1E11抗体是否与HER2所属的ErbB家族蛋白中的HER2特异性结合。使用西妥昔单抗(Cetuximab，CET)作为针对EGFR蛋白的对照抗体。

图4B示出了ELISA分析的结果，以检查1E11抗体是否与人以外的HER2结合。

图5A示出了当用单独1E11抗体或曲妥珠单抗或者其组合处理NCI-N87细胞时对发生凋亡的癌细胞的百分比的分析结果。

图5B示出了当用单独1E11抗体或曲妥珠单抗或者其组合处理BT-474细胞时对发生凋亡的癌细胞的百分比的分析结果。

图5C示出了用单独1E11抗体或曲妥珠单抗或者其组合处理NCI-N87细胞后24小时和48小时细胞生存力分析的结果。对照组显示仅用PBS(抗体的溶剂)处理的细胞的生存力。

图5D示出了用单独1E11抗体或曲妥珠单抗或者其组合处理NCI-N87细胞后24小时胱天蛋白酶-3/7活性的分析结果。对照组示出了仅用PBS(抗体的溶剂)处理的细胞的生存力。

图6A示出了western印记分析的结果，说明了通过单独1E11抗体或曲妥珠单抗或者其组合处理的HER2下游信号转导的减少。

图6B是示出了单独1E11抗体或曲妥珠单抗或者其组合处理对异源二聚化诱导的细胞增殖的抑制作用。阴性对照(Negativectrl)示出了不用配体或抗体处理的细胞的生存力，而阳性对照(Positivectrl)示出了仅用配体处理而不用抗体处理的细胞的生存力。

图7A至7C示出了单独1E11抗体或曲妥珠单抗或者其组合处理对NCI-N87异种移植动物模型中肿瘤细胞生长的抑制作用。图7A示出了说明肿瘤体积变化的图，图7B示出了说明肿瘤重量变化的图，而图7C示出了说明肿瘤组织之染色结果的图。对照Ab是帕利珠单抗。

图8A和8B是这样的图，其分别示出了hz1E11抗体(一种人源化抗体)的单一处理以及hz1E11抗体与曲妥珠单抗的组合处理对NCI-N87癌细胞系和OE-19癌细胞系的增殖抑制作用。

图9示出了单独hz1E11抗体或曲妥珠单抗或者其组合处理对NCI-N87异种移植动物模型中肿瘤细胞生长的抑制作用。对照Ab是帕利珠单抗。

图10A和10B分别示出了hz1E11抗体之CDRH3和DRL3的丙氨酸扫描结果。

图11A至11F示出了hz1E11-3、hz1E11-133和hz1E11-154抗体(其均为亲和力提高的人源化抗体)的单一处理以及其与曲妥珠单抗组合处理对NCI-N87、OE-19和BT-474癌细胞系的增殖抑制作用。

现在通过实施例进一步描述本发明。对于本领域技术人员来说明显的是，这些实施例意在更具体地举例说明，并且所附权利要求中给出的本发明的范围不限于实施例。

实施例

实施例1：HER2抗体的开发

为了制备抗体，使用动物细胞产生HER2蛋白的胞外结构域(ECD)，然后使用其作为抗原。使用HindIII和BamHI限制性酶克隆这样的DNA，其中人IgG1的铰链区和Fc部分(CH2-CH3)结合于ECD的C末端。然后，使用聚乙烯亚胺(PolyscienceInc.，Cat.No.23966)将克隆的载体瞬时转染到FreeStyleTM293F(Invitrogen，Cat.No.R790-07)细胞中，使用蛋白ACeramicHyperDF树脂(PALL，CatNo.20078-028)从细胞培养物中纯化HER2-ECDFc融合蛋白。使用蛋白质测定染料(Bio-Rad，Cat.No.500-0006)量化纯化的蛋白质，进行SDS-PAGE，并且通过考马斯染色确认其浓度和纯度。将100μg纯化的蛋白质抗原与弗氏佐剂(Sigma，Cat.No.F5506)混合然后经腹膜内注射到BALB/c小鼠(DBLCo.，Ltd.，Korea)中。两星期中，将100μg抗原用PBS稀释并且再次注射，在此之后3天，取出小鼠的脾并且从其中分离淋巴细胞。将分离的淋巴细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14(ATCC，Cat.No.CRL-1581)以5∶1的比混合，并且使用PEG-1500(Roche，Cat.No.783641)融合。将融合的细胞培养在含有HAT补充剂(Sigma，Cat.No.H0262)的培养基中，并且选择性地选出融合的细胞(杂交瘤)并且培养。

通过ELISA测定检查由此获得的杂交瘤细胞以确定其是否是产生与抗原结合之抗体的细胞。在室温下将HER2-ECD-Fc或ChromPure人IgG(hIgG，JacksonImmunoresearchLab.Inc.，Cat.No.009-000-003)以1μg/mL的浓度固定在Costar96孔板(Corning，Cat.No.3590)上1小时。将所得物用TBS-T(0.05％TritonX-100)洗涤3次，然后在室温下用300μLTBS-T/SM(2％脱脂乳)封闭30分钟。将封闭的板洗涤3次并且添加杂交瘤培养液，并且允许其与抗体在37℃下结合1小时。在洗涤所得物3次后，将作为二抗的抗小鼠IgG-HRP(Pierce，Cat.No.31439)在TBS-T/SM中以1∶5,000的比稀释，并且允许其在37℃下结合1小时。在洗涤所得物3次后，向其中添加TMB(SurModics，Cat.No.TMBC-1000-01)并且允许在室温下显色5分钟，并且添加1N硫酸(DukSan，Cat.No.254)以终止显色。使用VictorX3(PerkinElmer，Cat.No.2030-0030)在450nm下测量吸光度，并且选择与HER2-ECD-Fc特异性结合的抗体。

由于HER2是表达在细胞表面上的蛋白质，因此通过基于细胞的ELISA测定检查开发的抗体是否与过表达HER2的细胞结合。将过表达HER2的卵巢癌细胞系SKOV-3(KoreanCellLineBank(KCLB)，Cat.No.30077)以10,000个细胞/孔的浓度等分到Costar96孔细胞培养板(Corning，Cat.No.3595)中并且培养24小时。第二天，在除去细胞培养物上清液后，将所得物用PBS洗涤3次，添加杂交瘤培养液，并且在37℃下再培养2小时。再将所得物用TBS-T洗涤3次后，向其中添加作为二抗之在PBS/FBS(3％FBS)中以1∶5,000的比稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP，并且在室温下处理1小时。在将所得物用TBS-T洗涤3次后，允许将其用TMB显色。选择61个表现出比作为阴性对照的SP2/0细胞培养物之吸光度更高吸光度的克隆。

实施例2：比较开发的抗体对乳腺癌细胞的生长的抑制作用

为了进行细胞生存力测定以确认对乳腺癌细胞增殖的抑制作用，从杂交瘤培养液中纯化抗体。将杂交瘤培养在含有3％FBS的培养基中，并且使用蛋白A树脂纯化IgG形式的抗体。通过BCA测定(Pierce，Cat.No.23227)量化经纯化的抗体，进行SDS-PAGE，通过考马斯染色确认其浓度和纯度。

通过单一处理或与曲妥珠单抗一起的组合处理来对过表达HER2的BT-474(代表性乳腺癌细胞系)和NCI-N87细胞系(代表性胃癌细胞系)进行细胞生存力测定。对于组合处理，使用以1∶1的比(重量比)混合之开发的抗体与曲妥珠单抗的混合物。将BT-474(ATCC，Cat.No.HTB-20，10,000个细胞/孔)和NCI-N87(ATCC，CatNo.CRL-5822，10,000个细胞/孔)等分到96孔板中并且培养24小时。将纯化的抗体分别处理到5μg/mL的浓度，并且将BT-474和NCI-N87细胞系进一步培养4天。对于细胞生存力测定，添加CCK-8(Dojindo，Cat.No.CK-04-13)至10％的终浓度，在37℃下处理3小时，并且测量其吸光度。相对于未用抗体处理之孔的吸光度(将其设定为100％)来计算相对生存力。基于以上，选择1E11抗体。

实施例3：抗体序列的分析

对于抗体序列测定，使用各自的杂交瘤RNA构建噬菌体Fab抗体文库，并且进行三步淘选以获得与HER2-ECD-Fc结合的噬菌体(Phagedisplay：alaboratorymanual，CarlosBarbasIII，等，ColdSpringHarborLaboratoryPress)。在培养杂交瘤后，使用SVTotalRNAIsolationSystem(Promega，Cat.No.Z3100)分离RNA并且由其合成cDNA。使用已知引物组(参见：Phagedisplay：alaboratorymanual，CarlosBarbasIII，等，ColdSpringHarborLaboratoryPress)扩增抗体的可变区，并且在与人Ck和CH1连接后使用SfiI限制性酶克隆到pComb3X载体(Barbaslaboratory，TheScrippsResearchInstitute)中，然后将其转化到ER2537细菌(NewEnglandBiolabs，Cat.No.801-N)中。用VCSM13辅助噬菌体(Stratagene，Cat.No.200251)转染经转化的细菌以获得噬菌体，并且使用固定有HER2-ECD-Fc的免疫试管获取与HER2-ECD-Fc结合的克隆。

在每一种抗体的群体中，通过ELISA测定确认与HER2-ECD-Fc结合的抗体。将经转化细菌的群体在37℃下培养直至其在600nm下的吸光度达到0.5，并用IPTG以1mM的终浓度处理，在30℃培养过夜的同时允许表达Fab形式的抗体。在培养后，通过离心收集5mL细胞，悬浮在0.4mL1×TES(50mMTris，1mMEDTA，20％(v/v)蔗糖，pH8.0)中，并在4℃下处理10分钟。向其中添加0.6mL0.2×TES后，将所得物在4℃下处理30分钟，离心并且回收上清液。在用TBS-T将包被有1μg/mL浓度之HER2-ECD-Fc的Costar96孔半面积板(CorningInc.，Cat.No.3690)洗涤3次后，在室温下将其用TBS-T/SM(3％非脱脂乳(non-fatskimmilk)，0.05％TritonX-100)封闭1小时。通过使用TBS-T/SM以1∶3的比将其稀释来处理每一群体的培养液或周质提取物(周质)，并且允许在室温下结合1小时。洗涤3次后，将作为二抗的抗HA-HRP(Roche，Cat.No.120-138-190-01)以1∶5000的比稀释，允许在室温下结合1小时，洗涤3次，并允许使用TMB显色。

细胞培养液或周质提取物中的大部分群体具有0.2或更高的吸光度，并且分析这些克隆的抗体序列。序列分析表明，来自单一杂交瘤的群体表现为具有相同序列。1E11抗体互补决定区(CDR)的氨基酸序列总结在下表1中。

表1

1E11抗体互补决定区(CDR)的氨基酸序列

	轻链	重链
			CDR1	LASQTIGTWLA	SYTMS
CDR2	ATSLAD	YISNGGGSTYYPDTVKG
			CDR3	QQLYSTPWT	HLGGTASFDY

实施例4：嵌合抗体的构建和产生

构建嵌合抗体以制备作为可成药(druggable)形式的本发明抗体。

将完成了核苷酸序列分析的小鼠抗体可变区扩增并且与人恒定区Cκ和CH结合，通过pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen，Cat.No.，K8300-01)载体来TA克隆重链部分，而通过pOptiVEC-TOPO(Invitrogen，Cat.No.，12744-017)载体来TA克隆轻链部分。用于扩增的引物示于下表2和3中。正向引物***有ClaI限制性位点，而反向引物分别添加有用重链的NheI限制性位点和轻链的BsiWI限制性位点。另外，向可变区中的正向引物添加信号序列以使得嵌合抗体可以分泌到细胞培养液中。本发明中使用的Cκ和CH的核苷酸序列和氨基酸序列描述在SEQIDNO：11至14中。

使用上述引物和GoTaqDNA聚合酶(Promega，Cat.No.M3005)进行PCR反应(95℃30秒；58℃30秒；以及72℃30秒)，重复35个循环。在进行1％琼脂糖凝胶电泳后，使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Cat.No.28706)纯化可变区和恒定区的每一扩增的PCR产物。为了连接可变区和恒定区，将等量可变区和恒定区的PCR产物混合，使用可变区的正向引物和恒定区的反向引物进行重叠延伸PCR以获得基因产物，并且以上述相同的方式纯化所述产物。使用引物并且使用GoTaqDNA聚合酶(Promega，Cat.No.M3005)进行重叠延伸PCR(95℃30秒；58℃30秒；以及72℃45秒)，重复35个循环。根据制造商手册，将扩增的基因产物TA克隆到用于重链部分的pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen，Cat.No.，K8300-01)载体中，以及TA克隆到用于轻链部分的pOptiVEC-TOPO(Invitrogen，Cat.No.，12744-017)载体中。

表2

可变区的扩增引物

表3

恒定区的扩增产物

引物	序列
		Ck-F	GGAGCTGAAACGTACGGTGGCTGCACC
Ck-R	CCGCTCGAGTTAACACTCTCCCCTGTTG
		CH-F	CACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCG
CH-R	CCGCTCGAGTCATTTACCCGGGGACAGGGAG

在上表中，黑体字母表示限制性酶的限制性位点，而下划线部分表示信号序列。

最终构建的pcDNA3.3-IgG重载体和pOptiVEC-IgGκ载体的图示于图1中。

然后，使用聚乙烯亚胺(PolyscienceInc.，Cat.No.23966)将克隆的载体瞬时转染到FreeStyleTM293F(Invitrogen，Cat.No.R790-07)动物细胞中，并且使用蛋白ACeramicHyperDF树脂(PALL，CatNo.20078-028)从细胞培养物中纯化嵌合抗体。通过BCA测定(Pierce，Cat.No.23227)量化纯化的亲和抗体，进行SDS-PAGE，并且通过考马斯染色确认其浓度和纯度。

实施例5：比较开发的抗体对乳腺癌和胃癌之生长的抑制作用

为了确认开发的抗体根据其浓度的抗癌作用，对过表达HER2的癌细胞系进行细胞生存力测定，所述癌细胞系例如BT-474(乳腺癌细胞系)和NCI-N87(胃癌细胞系)。将70μL体积的BT-474(10,000个细胞/孔)和NCI-N87(10,000个细胞/孔)等分到96孔板中，并且使其固定在所述板上同时培养24小时。第二天，将30μL抗体添加至培养的细胞。经处理抗体的最终浓度的最大值为20μg/mL每种抗体，并且以1∶4的比连续稀释，并且以5种不同浓度进行测定。当与曲妥珠单抗组合处理时，将开发的抗体与曲妥珠单抗的比设定为1∶1的比(例如，在图2A和2B中，当施用量为1μg/mL时，施用1μg/mL的TRA和1μg/mL的1E11)。在用抗体处理后，将BT-474和NCI-N87细胞另外培养4天，添加CCK-8至10％的终浓度，并且在37℃下处理3小时。然后，使用VictorX-3在450nm下测量经处理细胞的吸光度。将未用抗体处理的细胞的吸光度设定为100％，并且计算其相对生存力(图2A和2B)。

开发的1E11抗体示出对响应于曲妥珠单抗的NCI-N87(图2A)和BT-474(图2B)细胞系之增殖的抑制作用。此外，与单独曲妥珠单抗处理相比，1E11抗体与曲妥珠单抗的组合处理对于NCI-N87和BT-474细胞系的癌细胞增殖表现出更高的抑制活性。有趣地，与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合处理相比，1E11抗体与曲妥珠单抗的组合处理对于NCI-N87细胞系的癌细胞增殖表现出更高的抑制活性(图2A)。

实施例6：确认开发的抗体与曲妥珠单抗组合处理的协同作用

为了确认胃癌中开发的1E11抗体与曲妥珠单抗的组合处理的抗癌作用是否是协同作用，用单独1E11抗体或曲妥珠单抗或者其组合处理NCI-N87细胞并且分析抗癌作用(图2A)。使用分析组合施用至少两种药物之作用的Chou&Talalay方法(Chou等，Adv.Enzyme.Regul.22：27-55(1984))通过CalcuSyn程序(Biosoft)分析根据浓度的抗癌作用(表4)。当两种药物组合施用时，它们变得对抗、叠加或协同。可以使用Chou&Talalay方法根据组合指数(CI)分析药物的相互作用。1或更大的CI值表示对抗作用，而1以及1或更小的CI值分别表示附加作用和协同作用。

表4

在上表中，ED50、ED75和ED90表示有效剂量，其分别示出在50％、75％和90％群中的作用。‘r’表示半数效应曲线图(median-effectplot)的线性相关系数。

在图2A和表4中可以看出，在两种药物曲妥珠单抗和1E11克隆组合处理时的CI值小于1，因此确认当组合施用时这两种抗体具有协同作用。

实施例7：开发的抗体和曲妥珠单抗之间表位的比较

已知HER2的抗体曲妥珠单抗与HER2ECD之4个结构域中的结构域4结合。为了确认开发的抗体在HER2上的表位是否与曲妥珠单抗的表位重叠，使用Biacore3000(GEHealthcare)通过表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance，SPR)进行表位竞争(epitopebinning)。使用ECD/NHS通过胺偶联法将约1,000RU(响应单位，responseunit)的曲妥珠单抗固定化在CM5传感器芯片(GEHealthcare，Cat.No.BR-1000-12)。使用HBS-P缓冲液(10mMHEPES，150mMNaCl，1mMEDTA，0.005％Tween-20，pH7.4)来使HER2-ECD-His蛋白以320nM的浓度在固定了曲妥珠单抗的传感器芯片上结合4分钟，然后仅使缓冲液在其上流动5分钟以稳定曲妥珠单抗与HER2-ECD之间的结合。然后，允许二抗以1μg/mL的浓度在其上结合4分钟，并且使缓冲液在其上流动。在所有实验中，将流量设定为50μL/分钟。如果第二结合抗体也与结合有曲妥珠单抗的HER2-ECD蛋白结合，则其为不与曲妥珠单抗具有共同表位的抗体。

从图3A中可以看出，用作二抗的hIgG不与HER2结合，因此没有额外结合，并且由于曲妥珠单抗具有相同表位，因此其不进一步结合。相比之下，1E11抗体额外地与结合有曲妥珠单抗的HER2-ECD结合，因此可以确认其具有不同于曲妥珠单抗之表位的表位。

为了确认1E11克隆所结合的结构域区域，使用动物细胞单独产生与人IgG1的铰链区和Fc区结合的构成HER2蛋白之胞外结构域的4个亚结构域(结构域1至4)，并且使用蛋白A纯化。通过ELISA测定确认1E11克隆、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗与由此产生的重组蛋白的结合。由图3B可以看出，1E11克隆表现出与亚结构域4结合，如曲妥珠单抗的情况一样。

从以上结果，确认1E11克隆与HER2蛋白之ECD的亚结构域4结合，但是其与不同于曲妥珠单抗之表位的表位结合(图3)。

实施例8：开发的抗体对HER2的特异性

通过ELISA测定确认开发的1E11抗体是否与ErbB家族蛋白(HER2属于所述家族)中的HER2特异性结合，以及其是否与人以外物种的HER2结合。为了确认开发的1E11抗体是否与ErbB家族蛋白中的HER2特异性结合，通过ELISA测定检查属于ErbB家族的EGFR、HER2、HER3和HER4的胞外结构域。以与HER2-ECD-Fc相同的方式产生EGFR的胞外结构域(EGFR-ECD-Fc)，并且购买HER3的胞外结构域(R&DSystems，#348-RB-050)和HER4的胞外结构域(R&DSystems，#1131-ER-050)。为了确认开发的抗体是否对不同物种的HER2蛋白表现出种间交叉反应性，使用人、恒河猴、食蟹猴、小鼠和大鼠的HER2胞外结构域并且通过ELISA测定来确认。以与人HER2-ECD-Fc相同的方式产生食蟹猴的胞外结构域，并且购买恒河猴的HER2胞外结构域(SinoBiologicalInc.，#90020-K08H)、小鼠的HER2胞外结构域(SinoBiologicalInc.，#50714-M08H)和大鼠的HER2胞外结构域(SinoBiologicalInc.，#80079-R08H)。

从图4A和4B中可以看出，确认了开发的1E11抗体特异性结合人ErbB家族蛋白中的HER2，并且与恒河猴和食蟹猴的HER2蛋白具有种间交叉反应性。

实施例9：HER2抗体的凋亡分析

我们分析了HER2抗体的凋亡诱导能力，以说明与曲妥珠单抗共施用的1E11抗体之抗癌作用背后的分子机制。为了研究凋亡诱导能力，用10μg/mL1E11抗体、曲妥珠单抗或其组合处理NCI-N87和BT-474细胞48小时(对于组合施用，10μg/mL1E11和10μg/mL曲妥珠单抗)。在抗体处理后，用胰蛋白酶使细胞分离并且使用ApoScreenAnnexinV凋亡试剂盒(SouthernBiotech，#10010-02)通过流式细胞术分析(CytomicsFC500，BeckmanCoulterInc.)分析500,000个细胞(图5a和5b)。

为了测量在凋亡中具有重要作用的胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7的活性，分析随着处理时间的1E11抗体、曲妥珠单抗或其组合的抗癌功效。用10μg/mL抗体处理NCI-N87细胞。处理24小时和48小时后，使用Caspase-Glo(Promega，#G7571)进行细胞生存力测定(图5c)。其表明，在处理24小时后，细胞生存力急剧下降。基于这样的结果，在处理24小时后测量胱天蛋白酶-3/7的活性。用10μg/mL抗体处理NCI-N87细胞24小时。使用Caspase-Glo3/7测定(Promega，#G8091)测量胱天蛋白酶-3/7的活性(图5d)。

如图5a和5b中表示的，单独1E11抗体表现出对过表达HER2的胃癌(NCI-N87细胞)和乳腺癌(BT-474细胞)具有凋亡活性，这一点不同于曲妥珠单抗。与曲妥珠单抗组合处理时，1E11抗体的凋亡活性进一步提高。分析1E11与曲妥珠单抗组合处理时凋亡活性的提高是由于在凋亡中具有重要作用的胱天蛋白酶-3/7活性的提高(图5d)。

实施例10：抗体对HER2细胞信号转导的抑制

为了阐明与曲妥珠单抗组合的1E11对于过表达HER2的胃癌和乳腺癌的抗癌机制，我们分析了细胞中的HER2信号转导活性。用10μg/mL抗体处理NCI-N87细胞24小时。然后用细胞裂解溶液[50mMTris，pH7.4，150mMNaCl，1％NP-40，0.1％十二烷基硫酸钠，1mMNaF，1mMNa3VO4，1mMPMSF和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)]裂解细胞以获得细胞裂解物。对所述细胞裂解物进行Western印迹分析。HER2(#4290)、pHER2(#2243)、pHER3(#4791)、EGFR(#4267)、pEGFR(#3777)、AKT(#4691)、pAKT(#4060)、ERK(#4695)和pERK(#4370)抗体购自CellSignalingTechnology。HER3(sc-285)抗体购自SantaCruzBiotechnology，而作为负载对照的GAPDH(AbC-1001)抗体购自AbClon。辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠(AbC-5001)和抗大鼠(AbC-5003)抗体也购自AbClon。使用AbSignal(AbClon，AbC-3001)使带可视化。

我们进一步检查了1E11与曲妥珠单抗的组合处理是否抑制HER2与EGFR或作为另一ErbB家族蛋白质的HER3之间的异源二聚化。将NCI-N87细胞用EGF处理以诱导HER2与EGFR之间的异源二聚化，以及用HRG处理以诱导HER2与HER3之间的异源二聚化。将NCI-N87细胞等分到补充有0.1％FBR的细胞培养基中并且孵育24小时。然后，将细胞用10μg/mL抗体处理1小时，然后用200ng/mL的EGF(R&DSystems，#236-EG-200)或HRG(R&DSystems，#377-HB/CF)处理。三天后，测试细胞生存力。

如图6a中所示，1E11与曲妥珠单抗的组合处理有助于降低HER2蛋白的水平。在HER2蛋白的水平降低后，磷酸化的HER2蛋白也减少。我们观察到磷酸化的HER3和EGFR水平降低，而总蛋白质水平不变。这样的结果证明，1E11与曲妥珠单抗的组合处理能够控制HER2、HER3和EGFR的活性。通过这样的活性控制，公知的HER2下游因子AKT和ERK的活性也改变，而总蛋白质水平不变。

已经表明，1E11与曲妥珠单抗的组合处理导致通过HER2和EGFR(或HER3)之间的异源二聚化降低细胞增殖(如6b)。1E11与曲妥珠单抗的组合处理通过能够诱导HER2与EGFR之间的异源二聚化的EGF以及通过能够诱导HER2与HER3之间的异源二聚化的HRG使NCI-N87细胞增殖降低至类似于已知抑制HER2与其他受体结合之帕妥珠单抗的水平。

这些结果表明，1E11与曲妥珠单抗的组合处理通过HER2与EGFR(或HER3)之间的异源二聚化阻抑了细胞信号转导。

实施例11：动物模型中抗体的抗癌功效

使用动物模型评估1E11抗体的抗癌功效。向无胸腺裸雌性小鼠(DaehanBiolink，Korea)皮下注射5×10⁶个NCI-N87细胞以制备异种移植模型。允许肿瘤生长至约200mm³大小，然后将小鼠随机化分为4组。4个组的动物分别每周两次接受腹膜内施用的10mg/kg帕利珠单抗(作为曲妥珠单抗的同种型对照(MedImmuneLLC.))、1E11、曲妥珠单抗以及1E11与曲妥珠单抗的组合。对于组合施用，每种抗体以10mg/kg的剂量施用。随时间测量肿瘤体积。在第22天，处死动物并且分离肿瘤。使用公式(L＊W＊W)/2计算肿瘤体积，其中“L”表示较大的肿瘤直径，“W”表示最小的肿瘤直径。对分离的肿瘤称重并且制备以用于免疫组织化学分析。将肿瘤异种移植组织处理为***固定并且石蜡包埋的试样切片。通过苏木精(DAKO，#CS700)和伊红(DAKO，#CS701)(H&E)染色来检查这些切片，并且使用HER2抗体(CellSignalingTechnology，#4290)染色HER2蛋白。

单独1E11抑制肿瘤生长至类似于曲妥珠单抗的程度(图7a)。与每种单一抗体处理相比，与曲妥珠单抗组合的1E11示出急剧提高的抗肿瘤活性。在实验后还通过分析提取的肿瘤块来确认抗肿瘤活性(图7b)。在免疫组织化学染色中，观察到1E11与曲妥珠单抗的组合处理使表达HER2的细胞减少(图7c)，其符合Western印迹的结合(图6a)。这些结果表明，与单一抗体处理相比，与曲妥珠单抗组合的1E11明显抑制肿瘤生长，这是由于阻抑了HER2蛋白的表达。

实施例12：人源化抗体的开发及其作用的确认

使用CDR移植方法开发在实施例4中开发之嵌合1E11抗体的人源化抗体。对于接受开发的抗体之CDR的人抗体，使用IMGT/V-QUEST(Brochet，X.等，NuclAcidsRes.36：503-508(2008))选择具有高基于核苷酸序列之同源性的人种系抗体基因的V和J基因。对于重链的V基因和J基因，分别选择IGHV3-48＊03基因和IGHJ4＊01基因，其序列同源性分别为85.07％和87.23％。此外，对于轻链的V基因和J基因，分别选择IGKV1-39＊01基因和IGKJI＊01基因，其序列同源性分别为81.36％和81.08％。考虑到移植CDR仅降低亲和力的报道，将重链上对应于可以影响整个抗体结构的Vernier区之基于Kabat编号的H49替换成丙氨酸而非人种系基因上的丝氨酸。使用FreeStyleTM293F细胞系以IgG的形式产生开发的人源化抗体hz1E11。开发的hz1E11的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别描述在SEQIDNO：24和26中。

通过表面等离子体共振(SPR)测定来测量开发的1E11的人源化抗体hz1E11对于HER2的亲和力。使用Biacore3000进行所有实验。首先，通过胺偶联法将人IgG的山羊抗体以1000RU的浓度固定在CM5传感器芯片上。将曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和hz1E11分别用HBS-P缓冲液稀释到2.84μM、5.68μM和7.1μM。在与HER2-ECD-His蛋白结合之前，使每种抗体以50μL/分钟的速率结合180秒，并且为了稳定的目的允许缓冲液从其上流过。然后，允许HER2-ECD-His蛋白以640nM、320nM、160nM、80nM、40nM、20nM和0nM的浓度结合4分钟，并且允许缓冲液在其上流动15分钟。通过允许10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)缓冲液在其上流动来再循环传感器芯片。使用BIAevaluation软件通过1∶1交互作用模型分析所有传感图数据。抗体的亲和力总结在下表5中。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的亲和力分别为1.94nM和1.89nM，而开发的抗体1E11的亲和力为16.0nM。1E11人源化抗体的亲和力为10.4nM，表明几乎与现有的1E11抗体没有差异。

表5

抗体	Ka(M-1s-1)	Kd(s-1)	KD(nM)
				曲妥珠单抗	3.9E+04	7.6E-05	1.94
帕妥珠单抗	3.6E+04	6.8E-05	1.89
				1E11	3.0E+04	4.7E-04	16.0
hz1E11	4.9E+04	5.1E-04	10.4

在过表达HER2的人胃癌细胞系NCI-N87和OE-19中确认开发的1E11人源化抗体hz1E11的抗癌作用(图8)。NCI-N87细胞中hz1E11的单一处理示出癌症生存率的降低类似于曲妥珠单抗的处理，而与任一种抗体的单一处理相比，hz1E11与曲妥珠单抗的组合处理示出癌症生存率显著更高的降低(图8A)。另外，与任一种抗体的单一处理相比，一种不同的胃癌细胞系OE-19中hz1E11与曲妥珠单抗的组合处理示出癌症生存率显著更高的降低(图8B)。另外，与1E11与曲妥珠单抗的组合处理(图2A)相比，hz1E11与曲妥珠单抗的组合处理示出对癌细胞增殖更高一些的抑制作用(图8A)。与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合处理相比，hz1E11与曲妥珠单抗的组合处理在NCI-N87和OE-19细胞系中示出对癌细胞增殖更高的抑制作用。

以上结果表明，与常规1E11相比，开发的1E11的人源化抗体hz1E11具有相等的结合能力和更高一些的抗癌作用。

在使用NCI-N87的异种移植模型中确认开发的1E11的人源化抗体hz1E11与曲妥珠单抗的组合处理的抗癌作用。向具有通过NCI-N87移植形成之癌症的小鼠中分别每周两次腹膜内注射开发的抗体和曲妥珠单抗的同种型对照组、hz1E11、曲妥珠单抗以及hz1E11与曲妥珠单抗的组合。同种型对照组和曲妥珠单抗以10mg/kg的剂量施用。在组合处理的情况下，hz1E11与曲妥珠单抗以1∶1的比混合，并且基于每种抗体以1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的剂量施用。hz1E11与曲妥珠单抗的组合处理示出癌症生长以剂量依赖的方式降低(图9)。通过施用10mg/kg曲妥珠单抗观察的抗癌作用也通过施用hz1E11与曲妥珠单抗各自1mg/kg观察到。以大于5mg/kg的剂量施用hz1E11和曲妥珠单抗示出不仅抑制癌症的生长，而且降低已形成的癌症。

实施例13：确认开发的抗体的结合区

为了确认开发的抗体用于抗原结合的重要区域，进行了丙氨酸扫描测定，其通过进行改变对应于重链和轻链之CDR3的氨基酸来检查结合能力。使用QuikChangeSite-directedMutagenesis试剂盒(Stratagene，#200518)将对应于根据Kabat编号的95、96、97、98、99和100a的重链CDR3区中的组氨酸(H)、亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)和丝氨酸(S)以及对应于根据Kabat编号的89、90、91、92、93和94的轻链CDR3区中的谷氨酰胺(Q)、谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)、酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)变化成丙氨酸。在重链的CDR3中，从测定中排除A100，因为开发的抗体具有丙氨酸。在细菌中表达每种经修饰的抗体后，从中获得周质提取物后通过斑点印迹确认其表达，并且通过ELISA测定分析对于HER2-ECD的结合能力(参见图10)。

表6

从表6以及图10A和10B中可以看出，经修饰的抗体以类似水平表达，而重链的G98A示出其结合能力完全丧失，并且重链的G97A示出其结合能力的明显降低。其他区域中的变化并不对抗原-抗体结合表现出任何明显影响。

实施例14：提高开发的抗体的亲和力

为了提高开发的抗体的亲和力，开发具有轻链和重链随机化CDR3的文库。将对应于根据Kabat编号的F100b、D101和Y102的重链CDR3中的F、D和Y，以及对应于根据Kabat编号的P95、W96和T97的轻链CDR3中的P、W和T从随机化中排除，因为它们是人抗体中通常发现的氨基酸。开发具有重链和轻链CDR3氨基酸的20个随机氨基酸的噬菌体抗体文库，排除上述技术中描述的氨基酸(Phagedisplay：alaboratorymanual，CarlosBarbasIII，等，ColdSpringHarborLaboratoryPress)。特别地，上文使用的引物涉及对应于重链和轻链CDR3的区域，并且被合成以使得腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)以相等的比混合从而随机***到对应于待随机化之氨基酸的密码子的第一位置和第二位置，并且鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)以相等的比混合从而***到第三位置。

为了从开发的文库中选择具有提高的亲和力的克隆，使用EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotinylation试剂盒(ThermoScientific，#21435)对HER2-ECD-His蛋白进行生物素化并且将其用作选择抗体的抗原。允许开发的噬菌体抗体文库和生物素-HER2-ECD-His蛋白在室温下结合2小时，并且使用50μL的DynabeadsM-270链霉亲和素(Invitrogen，#653.06)分离与抗原结合的噬菌体。将上述选择过程进行4次，使用化周质提取物通过ELISA测定从由此选择的群体中选择表达与HER2-ECD结合之抗体的群体，并且通过核苷酸分析确认所选择群体中表达的抗体的序列。与HER2-ECD结合的抗体的重链和轻链CDR3的氨基酸序列总结在下表7和8中。每个表中的编号1表示hz1E11的重链和轻链CDR3的氨基酸序列。

表7

从提高亲和力的过程中选择的突变体的CDRH3序列

1	HLGGTASFDY	14	HLGGMSSFDY	27	HWGGTASFDY	40	PLGGTASFDY
								2	AFGGTASFDY	15	HLGGMTSFDY	28	HYGGTASFDY	41	QLAGTASFDY
3	DLGGTASFDY	16	HLGGSSSFDY	29	NNGGTASFDY	42	SFGGTASFDY
								4	FWGGTASFDY	17	HLGGTACFDY	30	NFGGTASFDY	43	SHGGTASFDY
5	HCGGTASFDY	18	HLGGTGAFDY	31	NHGGMASFDY	44	SLGGTASFDY
								6	HFGGTASFDY	19	HLGGTGSFDY	32	NHGGTASFDY	45	SMGGTASFDY
7	HHGGTASFDY	20	HLGGTSTFDY	33	NIGGTASFDY	46	SNGGTASFDY
								8	HIGGTASFDY	21	HLGGTTSFDY	34	NLGGTASFDY	47	SWGGTASFDY
9	HLCSTASFDY	22	HLGSTASFDY	35	NMGGTASFDY	48	SYGGTASFDY
								10	HLCVTASFDY	23	HLYRTASFDY	36	NNGGTASFDY	49	YYGGTASFDY
11	HLGGAASFDY	24	HMGGTASFDY	37	NWGGTASFDY
								12	HLGGLPSFDY	25	HRGGTASFDY	38	NYGGAASFDY
13	HLGGMASFDY	26	HVGGTASFDY	39	NYGGTASFDY

表8

从提高亲和力的过程中选择的突变体的CDRL3序列

1	QQLYSTPWT	41	QQLAYEPWT	81	QQMAFVPWT	121	QQMVRTPWT
								2	DQLYGTPWT	42	QQLAYSPWT	82	QQMAFYPWT	122	QQMVRVPWT
3	DQMYSTPWT	43	QQLAYTPWT	83	QQMAGFPWT	123	QQMVSIPWT
								4	HQLAFTPWT	44	QQLAYVPWT	84	QQMASVPWT	124	QQMYGTPWT
5	IQHNEFPWT	45	QQLGFAPWT	85	QQMAYGPWT	125	QQMYKTPWT
								6	QDMSRTPWT	46	QQLGFIPWT	86	QQMAYSPWT	126	QQMYRTPWT
7	QELSTTPWT	47	QQLGFSPWT	87	QQMAYTPWT	127	QQNAFEPWT
								8	QEMMRTPWT	48	QQLGFVPWT	88	QQMDFTPWT	128	QQNAFGPWT
9	QNLAYSPWT	49	QQLGYAPWT	89	QQMEHTPWT	129	QQNAFIPWT
								10	QNMYGTPWT	50	QQLGYSPWT	90	QQMFAIPWT	130	QQNAFSPWT

11	QQAAFSPWT	51	QQLHSTPWT	91	QQMFGSPWT	131	QQNAFTPWT
								12	QQAAYSPWT	52	QQLKNTPWT	92	QQMFRTPWT	132	QQNAFVPWT
13	QQAAYVPWT	53	QQLMRKPWT	93	QQMFSTPWT	133	QQNAYAPWT
								14	QQCTSDPWT	54	QQLRASPWT	94	QQMFSVPWT	134	QQNAYGPWT
15	QQHDVGPWT	55	QQLRNLPWT	95	QQMGFSPWT	135	QQNAYNPWT
								16	QQIAFGPWT	56	QQLRNSPWT	96	QQMGYAPWT	136	QQNAYSPWT
17	QQIAFNPWT	57	QQLRNVPWT	97	QQMGYSPWT	137	QQNFIAPWT
								18	QQIAFSPWT	58	QQLRSAPWT	98	QQMHIFPWT	138	QQNMIVPWT
19	QQIAFTPWT	59	QQLRSSPWT	99	QQMMAVPWT	139	QQNRISPWT
								20	QQIAFVPWT	60	QQLRSVPWT	100	QQMMKSPWT	140	QQNRIWPWT
21	QQIAKTPWT	61	QQLRVIPWT	101	QQMMRTPWT	141	QQNRVIPWT
								22	QQIAYSPWT	62	QQLSFTPWT	102	QQMMRVPWT	142	QQNRVVPWT
23	QQIAYTPWT	63	QQLSFVPWT	103	QQMRKIPWT	143	QQNSYSPWT
								24	QQIAYVPWT	64	QQLSKTPWT	104	QQMRNVPWT	144	QQNVIVPWT
25	QQIFSVPWT	65	QQLSRAPWT	105	QQMRRVPWT	145	QQNVNVPWT
								26	QQIGFSPWT	66	QQLSRSPWT	106	QQMRSTPWT	146	QQNYKLPWT
27	QQIGWTPWT	67	QQLSVTPWT	107	QQMSFSPWT	147	QQSAFVPWT
								28	QQIMTLPWT	68	QQLSYAPWT	108	QQMSHSPWT	148	QQSAYAPWT
29	QQIREIPWT	69	QQLSYSPWT	109	QQMSKIPWT	149	QQSAYIPWT
								30	QQISFMPWT	70	QQLVRIPWT	110	QQMSRVPWT	150	QQSEACPWT
31	QQISFSPWT	71	QQLVRNPWT	111	QQMSYAPWT	151	QQSFNTPWT
								32	QQIYITPWT	72	QQLVRTPWT	112	QQMSYGPWT	152	QQSKTVPWT
33	QQKAYAPWT	73	QQLVRVPWT	113	QQMSYIPWT	153	QQTAFGPWT
								34	QQKKGIPWT	74	QQLYSSPWT	114	QQMSYSPWT	154	QQTAFSPWT
35	QQKMGNPWT	75	QQMAFAPWT	115	QQMSYTPWT	155	QQTAYAPWT
								36	QQKSVAPWT	76	QQMAFGPWT	116	QQMSYVPWT	156	QQTAYSPWT
37	QQLAFAPWT	77	QQMAFIPWT	117	QQMTRVPWT	157	QQTRRTPWT
								38	QQLAFMPWT	78	QQMAFNPWT	118	QQMVIIPWT	158	QQTSFAPWT
39	QQLAFSPWT	79	QQMAFSPWT	119	QQMVREPWT	159	QQVAYSPWT
								40	QQLAFVPWT	80	QQMAFTPWT	120	QQMVRSPWT	160	QQVFAIPWT

为了从选择的克隆中选择具有提高的Koff的克隆，通过Biacore3000(GEHealthcare)对克隆进行分析。使用ECD/NHS通过胺偶联方法将HER2-ECD-His蛋白固定在CM5传感器芯片上。在使用IPTG从每一克隆中表达抗体后，从其中获得周质提取物，并且允许其与HER2-ECD-His结合。通过BIAevaluation软件分析每种抗体的Koff值。基于以上，选择具有提高的Koff值的抗体(参见：表9a)。表9a公开了与hz1E11亲本抗体相比，本发明人开发的克隆中示出类似或提高的Koff值的克隆的代表性实例。

表9a

从表9a中可以看到，与亲本抗体hz1E11的CDRH3和CDRL3相比，由本发明通式1表示的多种CDRH3和通式2表示的多种CDRL3示出类似的或提高的Koff值。

在轻链的随机化CDR3序列中，使用hz1E11-3、hz1E11-133和hz1E11-154进行实验。

hz1E11-3、hz1E11-133和hz1E11-154的重链可变区与hz1Ell的重链可变区相同，并且轻链可变区的氨基酸序列分别描述在SEQIDNO：247、249和251中。

为了确认所选择的3种抗体的亲和力的提高，以IgG的形式产生抗体。通过ECD/NHS法将2000RU浓度的山羊抗人IgG(Invitrogen，#H10500)固定在CM5传感器芯片上。然后，允许抗体以50μL/分钟的速率结合5分钟，并且为了稳定的目的允许缓冲液在其上流动5分钟。用于抗体结合的抗体浓度为曲妥珠单抗(TRA)0.4μg/mL，帕妥珠单抗(PER)0.8μg/mL，以及hz1E11和所选择抗体1μg/mL。在稳定抗体后，允许HER2-ECD-His蛋白在640nM、320nM、160nM、80nM、40nM、20nM和0nM的浓度下以50μL/分钟的速率结合4分钟，并且允许缓冲液在其上流动15分钟用于分离。在分析每个浓度后，使用10mM甘氨酸(pH1.5)再循环并且进行随后的测定。通过BIAevaluation软件分析抗体的亲和力。分析的结果总结在表9b中。

表9b

在上表9b中，ka、kd、Rmax和KD分别表示结合速率常数、解离速率常数、最大结合能力和平衡解离常数。

从表9b中可以看出，与hz1E11相比，hz1E11-133和hz1E11-154示出Koff值(即，kd值)降低8.4倍，而其kon值(即，ka值)稍微提高。总之，对于最终亲和力，hz1E11-133表现为1.5nM，而hz1E11-154表现为1.1nM，与hz1E11相比这提高了15倍和20倍。

实施例15：确认具有提高的亲和力之抗体的抗肿瘤作用

对于过表达HER2的胃癌和乳腺癌来确认具有提高的亲和力之抗体的抗肿瘤作用。当用单独每种抗体的单一处理或与曲妥珠单抗的组合处理来处理过表达HER2的胃癌细胞系NCI-N87和OE-19以及过表达HER2的乳腺癌细胞系BT-474时，根据浓度分析细胞生存率。

从图11A到11F中可以看出，与hz1E11的作用相比，具有提高的亲和力的hz1E11-3、hz1E11-133和hz1E11-154抗体在单一处理和组合处理中均示出提高的作用。

已经描述了本发明的一个优选实施方案，应理解的是，落在本发明精神内的其变化形式和修改对于本领域技术人员可以变得明显，并且本发明的范围由所附权利要求及其等同方案确定。

Claims

1.人表皮生长因子受体2(HER2)的抗体或其抗原结合片段，其包含：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Phe-Asp-Tyr(1)

(b)轻链可变区。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中X2表示Leu、Phe或Tyr。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中X3表示Gly。

4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中X4表示Gly。

5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中X1表示His、Asn或Ser；X2表示Leu、Phe或Tyr；X3表示Gly；X4表示Gly；X5表示Thr、Met或Ala；X6表示Ala、Ser、Gly或Thr；并且X7表示Ser、Ala、Cys或Thr。

6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中X1表示His、Asn或Ser；X2表示Leu、Phe或Tyr；X3表示Gly；X4表示Gly；X5表示Thr；X6表示Ala；并且X7表示Ser。

7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH3包含选自SEQIDNO：3、27至28、32和39至86的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH3包含选自SEQIDNO：3、43、64、67、71、76、83、84或85的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRH3包含SEQIDNO：3的氨基酸序列。

10.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQIDNO：4的CDRL1、SEQIDNO：5的CDRL2和下式2所示的CDRL3：

Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Pro-Trp-Thr(2)

其中，Y1表示Gln、Asp或Ala；Y2表示Gln、Asn、Glu或Ala；Y3表示Leu、Met、Asn、Ile、Ser、Thr、Ala或Lys；Y4表示ryr、Ala、Ser、Arg、Val、Gly、Met或Phe；Y5表示Ser、Phe、Tyr、Arg、Ile、Gly、Lys、Asn、Val或Ala；并且Y6表示Thr、Ser、Val、Ile、Ala、Gly、Asn、Glu、Phe或Leu。

11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中Y2表示Gln。

12.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中Y3表示Leu、Met、Asn、Ile、Ser或Thr。

13.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中Y5表示Ser、Phe、Tyr、Arg或Ile。

14.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中Y6表示Thr、Ser、Val、Ile、Ala、Gly或Asn。

15.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中Y1表示Gln或Asp；Y2表示Gln；Y3表示Leu、Met、Asn、Ile、Ser或Thr；Y4表示Tyr、Ala、Ser、Arg、Val、Gly、Met或Phe；Y5表示Ser、Phe、Tyr、Arg或Ile；并且Y6表示Thr、Ser、Val、Ile、Ala、Gly或Asn。

16.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL3包含SEQIDNO：6、33至38或87至245的氨基酸序列。

17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL3包含SEQIDNO：6、88、109、131、155、156、157、178、218、220、222或239的氨基酸序列。

18.根据权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDRL3包含SEQIDNO：6、88、218或239的氨基酸序列。

19.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQIDNO：8或24的氨基酸序列。

20.根据权利要求18所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQIDNO：10、26、247、249或251的氨基酸序列。

21.用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含：(a)药学有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的HER2抗体或其抗原结合片段；和(b)可药用载体。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述组合物还包含曲妥珠单抗。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、结肠癌、***、脑癌、***癌、骨癌、头颈癌、皮肤癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌或输尿管癌。

24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述癌症是乳腺癌或胃癌。

25.用于诱导凋亡的药物组合物，其包含(a)药学有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的HER2抗体或其抗原结合片段；和(b)可药用载体。

26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述药物组合物诱导凋亡以预防或治疗过度增殖性疾病，其中所述过度增殖性疾病是癌症、增生、瘢痕疙瘩、库欣综合征、原发性醛固酮增多症、粘膜红斑、真性红细胞增多症、粘膜白斑病、增生性瘢痕、扁平苔藓、着色斑病、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄或狭窄。

27.用于诊断癌症的试剂盒，其包含根据权利要求1至20中任一项所述的HER2抗体或其抗原结合片段。