TW202346362A - 一種抗trop-2/cd3雙特異性抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及抗體藥物技術領域，具體地，涉及一種抗TROP-2/CD3雙特異性抗體。本發明的抗TROP-2/CD3雙特異性抗體包含第一抗原結合結構域D1和第二抗原結合結構域D2，其中D1為抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，D2為抗CD3抗體或其抗原結合片段。本發明的抗TROP-2/CD3雙特異性抗體可用於實現T細胞介導的免疫反應，特別是有效促進針對表達TROP-2的腫瘤細胞的T細胞介導的殺傷，從而有效地抑制腫瘤。

Description

一種抗TROP-2/CD3雙特異性抗體
本發明涉及抗體藥物技術領域，具體地，涉及一種抗TROP-2/CD3雙特異性抗體。
人滋養層細胞表面抗原2 (human trophoblast cell surface antigen 2, TROP-2)是由TACSTD2基因編碼表達的細胞表面醣蛋白。TROP-2為單次跨膜的I型膜蛋白，由323個胺基酸構成，其中訊息肽26個胺基酸，胞外區248個胺基酸，跨膜區23個胺基酸，胞內區26個胺基酸。截至目前，TROP-2的配體蛋白還沒有鑒定到，因此對其生理生化功能還不是十分明確。但是大量的臨床研究和文獻報導，TROP-2蛋白在各種人類上皮癌中高表達並且與患者的預後不良和癌細胞轉移密切相關，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、***癌和子宮頸癌等。美國FDA已經批准TROP-2抗體偶聯藥物賽妥珠單抗-格衛替康(sacituzumab govitecan)用於轉移性三陰性乳腺癌的治療。
分化簇3(cluster of differentiation 3, CD3)是T細胞表面重要的分化抗原，CD3分子與T細胞受體(T cell recptor, TCR)形成TCR-CD3複合體，TCRαβ亞基識別胞外信號並將胞外信號傳遞給CD3，CD3分子依靠免疫受體酪胺酸活化模體(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)將信號向胞內傳遞。抗CD3抗體可激發或阻斷T細胞活化信號，清除效應T細胞或誘導調節T細胞產生。
雙特異性抗體(bispecific antibody, BsAb)也稱為雙功能抗體，是同時靶向兩種不同抗原或相同抗原不同表位的特異性藥物。BsAb可將免疫細胞和病毒分子等作用於腫瘤細胞，增強對靶細胞的殺傷作用，也可以同時結合腫瘤細胞的不同抗原，增強其結合特異性並降低脫靶效應。雙特異性抗體拓寬了抗體藥物的應用領域，為腫瘤免疫提供了新的研究思路。
然而，目前本領域尚缺乏令人滿意的針對TROP-2和CD3的雙特異性抗體。因此，本領域亟待開發一種新的抗TROP-2和CD3的雙特異性抗體。
鑒於以上該現有技術的缺點，本發明的目的在於提供一種抗TROP-2/CD3雙特異性抗體，用於解決現有技術中的問題。
本發明的目的在於提供一種新的抗TROP-2和CD3的雙特異性抗體，該雙特異性抗體能同時與TROP-2及CD3特異結合，從而啟動T細胞靶向性殺傷TROP-2陽性表達的腫瘤細胞。本發明的目的還在於提供編碼該雙特異性抗體的多核苷酸分子；提供包含該分子的表達載體；提供包含該表達載體的宿主細胞；提供該雙特異性抗體的製備方法；提供包含該雙特異性抗體的藥物組合物；提供包含該雙特異性抗體的免疫偶聯物；提供該雙特異性抗體或該藥物組合物在製備治療癌症或腫瘤的藥物中的應用；提供該融合蛋白、該藥物組合物或該免疫偶聯物治療癌症或腫瘤的方法。
為了達到上述目的，本發明提供了以下技術方案： 本發明的第一個方面提供了一種雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含第一抗原結合結構域D1和第二抗原結合結構域D2，該D1為抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，該D2為抗CD3抗體或其抗原結合片段，該抗TROP-2抗體或抗CD3抗體或各自的抗原結合片段包含重鏈互補決定區HCDR1-3和輕鏈互補決定區LCDR1-3。
在另一優選例中，該雙特異性抗體包含單體或單體形成的二聚體或多聚體。該二聚體可以是同源的或異源的，該單體從N端到C端包含選自以下任一組的結構： 其中， VLA代表抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區； VHA代表抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區； VLB代表抗CD3抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區； VHB代表抗CD3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區； CH代表重鏈恆定區； CL代表輕鏈恆定區； L1、L2和L3各自獨立地為鍵或連接子； “～”代表二硫鍵或共價鍵； “-”代表肽鍵。
在另一優選例中，該雙特異性抗體包含選自以下任一組的結構： a) 結構I的單體形成的同源二聚體； b) 結構II的單體形成的同源二聚體。
在另一優選例中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段包含重鏈互補決定區HCDR1-3和輕鏈互補決定區LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示；和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含重鏈互補決定區HCDR1-3和輕鏈互補決定區LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示。
在另一優選例中，該互補決定區包含至少一個胺基酸突變。
在另一優選例中，該突變用於提高雙特異性抗體的表達水準。
在另一優選例中，該突變用於降低雙特異性抗體對人CD3的親和力。
在另一優選例中，該突變選自以下任一項或多項： a) 抗CD3抗體或其抗原結合片段的HCDR1：X1X2AMN， b) 抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1：X3YWLG， c) 抗CD3抗體或其抗原結合片段的LCDR2：X4TNKRAP， 其中，X1不為T、X2不為Y、X3不為I、X4不為G。
在另一優選例中，該胺基酸突變選自X1為G、X2為S、H或G、X3為D或E、X4為A的組。
在另一優選例中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段包含重鏈互補決定區HCDR1-3和輕鏈互補決定區LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示；和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含重鏈互補決定區HCDR1-3和輕鏈互補決定區LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 13或SEQ ID NO. 14，SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示。
在另一優選例中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X1X2AMN，其中X1為G，X2為S，胺基酸序列如SEQ ID NO. 16所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示；和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X3YWLG，其中X3為D，胺基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示。
在另一優選例中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X1X2AMN，其中X1為G，X2為H，胺基酸序列如SEQ ID NO. 17所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示；和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X3YWLG，其中X3為D，胺基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示。
在另一優選例中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X1X2AMN，其中X1為G，X2為G，胺基酸序列如SEQ ID NO. 18所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示；和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X3YWLG，其中X3為D，胺基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示。
在另一優選例中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段的LCDR2為X4TNKRAP，其中X4為A，胺基酸序列如SEQ ID NO. 19所示；LCDR1、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12所示，HCDR1、HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示；和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X3YWLG，其中X3為D，胺基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示。
在另一優選例中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 22所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 23所示；和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 20所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 21所示。
在另一優選例中，該可變區包含至少一個胺基酸突變。
在另一優選例中，該可變區包含選自以下任一項或多項的胺基酸突變： 1) 該SEQ ID NO. 20具有第31位的胺基酸突變； 2) 該SEQ ID NO. 22具有第30位的胺基酸突變； 3) 該SEQ ID NO. 22具有第31位的胺基酸突變； 4) 該SEQ ID NO. 22具有第32位的胺基酸突變； 5) 該SEQ ID NO. 23具有第50位的胺基酸突變。
優選地，該雙特異性抗體的可變區包含1) 、3) 和 4)所示的突變；
優選地，該雙特異性抗體的可變區包含1) 、2)、 3)和 4)所示的突變；
優選地，該雙特異性抗體的可變區包含1 )和 5)所示的突變。
在另一優選例中，該可變區包含選自以下任一項或多項的胺基酸突變： a) 該SEQ ID NO. 20具有I31D； b) 該SEQ ID NO. 20具有I31E； c) 該SEQ ID NO. 22具有N30S； d) 該SEQ ID NO. 22具有T31G； e) 該SEQ ID NO. 22具有Y32S、Y32H、Y32G； f) 該SEQ ID NO. 23具有G50A。
優選地，該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32S和a)中該I31D，或該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32S和b)中該I31E突變。相應的，該抗CD3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 26所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 23所示；和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 24和SEQ ID NO. 25所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 21所示。
優選地，該雙特異性抗體的可變區包含c)中該N30S、d)中該T31G、e)中該Y32S和a)中該I31D突變，該雙特異性抗體的可變區包含c)中該N30S、d)中該T31G、e)中該Y32S和或b)中該I31E突變；
優選地，該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32H和a)中該I31D突變，或該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32H和b)中該I31E突變；
優選地，該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32G和a)中該I31D突變，或該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32G和b)中該I31E突變；
優選地，該雙特異性抗體的可變區包含f)中該G50A和a)中該I31D突變，或該雙特異性抗體的可變區包含f)中該G50A和b)中該I31E突變。
在另一優選例中，該抗TROP-2或抗CD3抗原結合片段選自Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(scFv)；該抗TROP-2或抗CD3抗體為IgG抗體。
在另一優選例中，該抗TROP-2或抗CD3抗體選自嵌合抗體（例如為人鼠嵌合抗體）、鼠源抗體或人源化抗體。
在另一優選例中，該抗TROP-2抗體是低內吞抗體，更有利於持續發揮作用。
在另一優選例中，該IgG抗體包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區；更優選地，該重鏈恆定區選自人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4，該輕鏈恆定區選自人κ(Kappa)或人λ(Lambda)。
在另一優選例中，該IgG抗體包含胺基酸序列如SEQ ID NO. 51所示的IgG1重鏈恆定區。
在另一優選例中，該IgG抗體包含胺基酸序列如SEQ ID NO. 52所示的人κ(Kappa)輕鏈恆定區。
在另一優選例中，該IgG抗體的恆定區包含至少一個胺基酸突變。
在另一優選例中，該胺基酸突變是可促進兩條重鏈異源二聚化的杵臼結構 (knob-in-hole, KIH)突變；更優選地，該突變位於恆定區CH3區。
在另一優選例中，該D1為IgG抗體，該D2為scFv；更優選地，該D2連接至D1的N末端或C末端，或連接至D1的CH1和CH2之間；進一步更優選地，該D2連接至D1的重鏈。
在另一優選例中，該D2包含一個、兩個、三個或多個抗CD3的scFv。
在另一優選例中，該scFv從N端到C端包含VH-L1-VL結構或VL-L1-VH結構。
在另一優選例中，該抗TROP-2抗體選自抗TROP-2-VH-I31D單抗和抗TROP-2-VH-I31E單抗。
在另一優選例中，該抗CD3抗原結合片段選自CD3-scFv和CD3-scFv-VH-T31G-Y32S。
上述連接是指通過連接子或通過肽鍵直接相連。
在另一優選例中，該連接子L1、L2、L3的胺基酸序列獨立地為(G4S)n或4G，n選自1、2、3、4、5、6。
在另一優選例中，該連接子L1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 27所示。
在另一優選例中，該連接子L2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 28所示。
在另一優選例中，該連接子L3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 29所示。
在另一優選例中，該雙特異性抗體為同源二聚體或異源二聚體。
在如圖1A所示的優選例中，該雙特異性抗體為同源二聚體，包含抗TROP-2的IgG抗體和兩個抗CD3的scFv，其中每個scFv包含可變區VH和可變區VL，VH與VL通過連接子L1連接，每個抗CD3的scFv通過連接子L2和L3，連接到抗TROP-2的免疫球蛋白抗體IgG的CH1和CH2之間。
在如圖1B所示的優選例中，該雙特異性抗體為同源二聚體，包含抗TROP-2的IgG抗體和兩個抗CD3的scFv，其中每個scFv包含可變區VH和可變區VL，VH與VL通過連接子L1連接，每個抗TROP-2的scFv通過連接子L2和抗TROP-2的免疫球蛋白抗體IgG重鏈的N端串聯。
在另一優選例中，該雙特異性抗體為異源二聚體，包含抗TROP-2的IgG抗體和一個抗CD3的scFv，其中scFv包含可變區VH和可變區VL，VH與VL通過連接子L1連接，抗CD3的scFv通過連接子L2與任一抗TROP-2的免疫球蛋白抗體IgG重鏈的N端串聯。
在另一優選例中，該雙特異性抗體包含重鏈和輕鏈，該重鏈和輕鏈的胺基酸序列選自以下任一： a) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 36所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； b) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 37所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； c) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 38所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； d) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 39所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； e) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 40所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； f) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 41所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； g) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 42所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； 或， h) 將a)至g)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同時抗TROP-2活性和抗CD3活性的由a)至g)衍生的多肽。
在另一優選例中，該雙特異性抗體包括該雙特異性抗體的活性片段和/或衍生物，其中，該活性片段和/或該衍生物保留了該雙特異性抗體的70-100%(如70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%)的抗TROP-2活性和70-100%的抗CD3活性。
在另一優選例中，該雙特異性抗體的衍生物是該雙特異性抗體經過一個或幾個胺基酸突變(胺基酸缺失、***和/或取代後)並保持至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性的多肽。
在另一優選例中，該胺基酸突變為保守性胺基酸取代。
在另一優選例中，該胺基酸突變位於框架區或恆定區。
本發明的第二個方面提供了一種多核苷酸分子，該多核苷酸分子編碼所述的雙特異性抗體。
在另一優選例中，該多核苷酸分子包含編碼該雙特異性抗體重鏈的多核苷酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO. 44或SEQ ID NO. 45所示；和，編碼該雙特異性抗體的輕鏈的多核苷酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO. 50所示。
在另一優選例中，該多核苷酸分子包含編碼該雙特異性抗體重鏈的多核苷酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO. 46、SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48或SEQ ID NO. 49所示；和，編碼該雙特異性抗體的輕鏈的多核苷酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO. 50所示。
本發明的第三個方面提供了一種表達載體，該表達載體含有所述的多核苷酸分子。
在另一優選例中，該表達載體為病毒或質粒，較佳地為噬菌體或者噬菌粒。
在另一優選例中，該表達載體選自下組：pcDNA3.4、pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR、pTT5、pDHFF、pGM-CSF或pCHO 1.0，較佳地為pcDNA3.4。
本發明的第四個方面提供了一種細胞，該細胞含有所述的表達載體。
在另一優選例中，該細胞選自以下任一：COS、CHO、293F、293E、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，較佳地為E.coli TG1、BL21(DE3)細胞(表達單鏈抗體或Fab抗體)或者CHO-K1細胞(表達全長IgG抗體)。
本發明的第五個方面提供了上述雙特異性抗體的製備方法，該製備方法包括以下步驟： a) 在表達條件下，培養所述的細胞，從而表達雙特異性抗體； b) 分離並純化步驟a) 所述的雙特異性抗體。
本發明的第六個方面提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含有效量的上述的雙特異性抗體和一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑等。
在另一優選例中，該藥物組合物包含上述的雙特異性抗體、醋酸鹽、海藻糖、鹽酸精氨酸或吐溫(Tween)等。
在另一優選例中，該藥物組合物的劑型包括胃腸給藥劑型或胃腸外給藥劑型。
在另一優選例中，所述的胃腸外給藥劑型包括玻璃體注射、靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射、顱內注射或腔內注射等。
本發明的第七個方面提供了上述的雙特異性抗體或藥物組合物在製備癌症或腫瘤的藥物中的用途。
在另一優選例中，該癌症或腫瘤為TROP-2陽性癌症或腫瘤。
在另一優選例中，該癌症或腫瘤選自：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、***癌、皮膚癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子子宮頸癌、***癌、外陰癌、直腸癌、結腸癌、肛門區癌、乳腺癌、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、尿道癌、陰莖癌、***癌、胰腺癌、腦癌、睾丸癌、淋巴癌、移行細胞癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、軟組織肉瘤、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、中樞神經系統腫瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、慢性、急性白血病或其組合。
本發明的第八個方面提供了一種免疫偶聯物，該免疫偶聯物包含： a) 上述的雙特異性抗體；和 b) 選自以下任一種或多種的偶聯物部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因數、放射性核素或酶等。
在另一優選例中，該偶聯物部分選自：螢光或發光標記物、放射性標記物、磁共振成像或電子電腦X射線斷層掃描技術的造影劑，或能夠產生可檢測產物的酶、放射性核素、生物毒素或細胞因數等。
在另一優選例中，所述的免疫偶聯物包括抗體-藥物偶聯物。
在另一優選例中，所述的免疫偶聯物用於製備治療腫瘤或癌症的藥物組合物。
在本發明的第九個方面提供了一種治療癌症或腫瘤的方法，該方法包括向有需要的受試者施用本發明的第一方面所述的雙特異性抗體、本發明的第六方面所述的藥物組合物、或本發明的第八方面所述的免疫偶聯物。
在另一優選例中，該方法還包括和其他的抗腫瘤藥聯合給藥。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
本發明的抗TROP-2/CD3雙特異性抗體的積極進步效果在於：(1)可以通過結合T細胞調節T細胞免疫活性，並特異性結合表達TROP-2的腫瘤細胞，從而誘導免疫細胞靶向殺傷TROP-2陽性的腫瘤細胞。特別地，其腫瘤細胞殺傷效果及激發免疫細胞釋放IL-2細胞因數的能力均優於對照抗CD3單抗；(2)特異性高、安全性好；(3)表達量高；(4)結構穩定。
本發明人經過廣泛而深入地研究，獲得一種新的靶向腫瘤細胞表面分子TROP-2和CD3的雙特異性抗體，其能夠保持兩端抗體的活性，能同時結合TROP-2和CD3抗原。本發明的雙特異性抗體可用於實現T細胞介導的免疫反應，特別是有效促進針對表達TROP-2的腫瘤細胞的T細胞介導的殺傷，從而有效地抑制腫瘤。意料不到的是，其腫瘤細胞殺傷效果及激發免疫細胞釋放IL-2細胞因數的能力均優於對照抗CD3單抗，且安全性好。因此，本發明的雙特異性抗體可以被開發為一種療效優越的抗腫瘤藥物。在此基礎上完成了本發明。
術語
為了可以更容易地理解本公開，首先定義某些術語。如本申請中所使用的，除非本文另有明確規定，否則以下術語中的每一個應具有下面給出的含義。
術語“約”可以是指在本領域普通技術人員確定的特定值或組成的可接受誤差範圍內的值或組成，其將部分地取決於如何測量或測定值或組成。
本發明中，術語“抗體(Antibody，Ab)”和“免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)”是有相同結構特徵的異四聚醣蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型(isotype)的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區，重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2、以及CH3構成。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區，輕鏈恆定區包括一個結構域CL；輕鏈的恆定區與重鏈恆定區的CH1結構域配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)等。重鏈恆定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型；輕鏈恆定區包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗體的重鏈和輕鏈通過重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間的二硫鍵共價連接在一起，抗體的兩條重鏈通過鉸鏈區之間形成的多肽間二硫鍵共價連接在一起。
本發明所述的“免疫球蛋白抗體IgG”約150kDa，由四條肽鏈構成，含有兩條相同的約50kDa的γ重鏈，和兩條相同的約25kDa的輕鏈，從而具有四聚體四級結構。兩條重鏈通過二硫鍵相互連接，並各自與一條輕鏈連接。所成的四聚體具有相同的兩半，二者形成叉型或者類似Y的形狀，叉的每一端含有一個相同的抗原結合位點。IgG抗體可以基於重鏈的恆定區中胺基酸序列的微小差異而分為多個亞類(例如IgG1、2、3、4)。
本發明中，術語“雙特異性抗體(或雙抗)”是指能同時特異性結合兩種抗原(靶點)或兩種表位的抗體分子。根據對稱性，雙特異性抗體可以分為結構對稱的和不對稱的分子。根據結合位元點的多少，雙特異性抗體可以分為二價、三價、四價和多價分子。
本發明中，術語“單克隆抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對單個抗原位點。而且，與常規多克隆抗體製劑(通常是具有針對不同抗原決定簇的不同抗體的混合物)不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在於它們可以通過雜交瘤培養來合成，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
如本文所用，術語“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段或單一Fv片段等。抗原結合片段的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii) Fv片段；或(iv)單鏈Fv(scFv)。如本文所用，表述“抗原結合片段”內部也涵蓋其他工程化分子，如結構域特異性抗體、單結構域抗體、結構域缺失抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體、微型抗體、奈米體(例如單價奈米體和雙價奈米體等)、小模組免疫藥物和鯊魚可變IgNAR域等。
本發明中，術語“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可將抗體裂解為兩個完全相同的Fab段和一個Fc段。Fab段由抗體的重鏈的VH和CH1以及輕鏈的VL和CL結構域組成。Fc段即可結晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗體的CH2和CH3結構域組成。Fc段無抗原結合活性，是抗體與效應分子或細胞相互作用的部位。術語“F(ab')2”片段抗體是由胃蛋白酶消化整個 IgG 抗體，去除大部分 Fc 區同時完整保留一些鉸鏈區後得到的，具有通過二硫鍵連接在一起的兩個抗原結合 F(ab') 部分。
本發明中，術語“scFv”或“單鏈可變區片段scFv”為單鏈抗體(single chain antibody fragment，scFv)，是指包含免疫球蛋白重鏈VH和輕鏈VL可變區的融合蛋白，VH與VL通過含有15-25個胺基酸的連接子(linker)相連，其中該融合蛋白保留了完整免疫球蛋白相同的抗原特異性。
本發明中，術語“Fv片段”或“Fv抗體”含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位元點的最小抗體片段。一般的，Fv片段還包含VH和VL結構域之間的多肽連接子，且能夠形成抗原結合所需的結構。
本發明中，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分佈在整個抗體可變區中。它集中於重鏈可變區和輕鏈可變區中稱為互補決定區(complementarity-determining region，CDR)或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為框架區(frame region，FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR通過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見 Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁(1991))。
如本文所用，術語“框架區FR”指***CDR間的胺基酸序列，即指在單一物種中不同的免疫球蛋白間相對保守的免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各具有四個FR，分別稱為FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相應地，輕鏈可變結構域可因此稱作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重鏈可變結構域可因此表示為(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)- (CDR3-H)-(FR4-H)。優選地，本發明的FR是人抗體FR或其衍生物，該人抗體FR的衍生物與天然存在的人抗體FR基本相同，即序列同一性達到85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。獲知CDR的胺基酸序列，本領域的技術人員可輕易確定框架區FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。如本文所用，術語“人框架區”是與天然存在的人抗體的框架區基本相同的(約85%或更多，具體地90%、95%、97%、99%或100%)框架區。
如本文所用，術語“連接子”是指***免疫球蛋白結構域中為輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的可動性以折疊成交換雙重可變區免疫球蛋白的一個或多個胺基酸殘基。在本發明中，優選的連接子是指連接子L1、L2和L3，其中L1連接單鏈抗體(scFv)的VH和VL，L2和L3將scFv連接到抗體重鏈的CH1和CH2之間，或直接通過L2連接到抗體的重鏈上(如抗體重鏈的N末端或C末端)。合適的連接子實例包括單甘氨酸(Gly)或絲氨酸(Ser)殘基，連接子中胺基酸殘基的標識和序列可隨著連接子中需要實現的次級結構要素的類型而變化。
本發明中，術語“抗”、“結合”、“特異性結合”是指兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。通常，抗體以小於大約10-7M，例如小於大約10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更小的平衡解離常數(KD)結合該抗原。本發明中，術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。例如，使用表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)在BIACORE儀中測定抗體與抗原的結合親和力或使用ELISA測定抗體與抗原結合的相對親和力。
本發明中，術語“表位”是指與抗體特異性結合的多肽決定簇或是抗原中被抗體結合的區域。
雙特異性抗體
本發明的雙特異性抗體為一種能與TROP-2和CD3特異結合的雙特異性抗體，其包含抗CD3抗體部分和抗TROP-2抗體部分。
本發明的雙特異性抗體可以為二聚體、三聚體或多聚體，優選為同源或異源二聚體。本發明的雙特異性抗體中抗CD3或抗TROP-2的抗體部分可以包括一個或多個抗體或其抗原結合片段，較佳地，1、2、3、4、5或6個。
本發明的雙特異性抗體還包括其保守性變異體，指與本發明的雙特異性抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成的多肽。這些保守性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。
表A
最初的殘基 代表性的取代 優選的取代
Ile (I) Asp；Glu；Leu； Val； Met Asp
Thr (T) Gly； Ser； Trp； Lys Gly
Tyr (Y) Ser； Cys； Val Ser
本發明序列採用Kabat系統編號規則。
在構建本發明的雙特異性抗體時，與該雙特異性抗體的化學和物理穩定性相關的問題也得到了解決，諸如表達物理穩定的分子、增加熱和鹽依賴的穩定性、降低聚集、增加在高濃度下的溶解度以及維持分別針對兩種抗原TROP-2和CD3的親和力等。
編碼核酸和表達載體
本發明另一方面提供了一種多核苷酸分子，該多核苷酸分子編碼上述所述的雙特異性抗體。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
本發明該多核苷酸分子的製備方法為本領域常規的製備方法，較佳地包括以下製備方法：通過基因克隆技術例如PCR方法等，獲得編碼上述單克隆抗體的多核苷酸分子，或者通過人工全序列合成的方法得到編碼上述單克隆抗體的多核苷酸分子。
本領域技術人員知曉，編碼上述雙特異性抗體的胺基酸序列的核苷酸序列可以適當引入替換、缺失、改變、***或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以通過對編碼該雙特異性抗體基因的一個或多個堿基在保持抗體活性範圍內進行替換、缺失或增加來製得。
本發明另一方面提供了一種表達載體，該表達載體含有上述的多核苷酸分子。
這些載體可以用於轉化到適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。其中該表達載體為本領域常規的表達載體，是指包含適當的調控序列，例如啟動子序列、終止子序列、多腺苷醯化序列、增強子序列、標記基因和/或序列以及其他適當的序列的表達載體。該表達載體可以是病毒或質粒，如適當的噬菌體或者噬菌粒，更多技術細節請參見例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Sambrook等編著。許多用於核酸操作的已知技術和方案請參見例如Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等編著。本發明該表達載體較佳地為pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.4、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR、pTT5、pDHFF、pGM-CSF或pCHO 1.0，更佳地為pcDNA3.4。
本發明另外提供了一種細胞，該細胞含有上述的表達載體。
本發明所述的細胞為將該表達載體轉化至宿主細胞中獲得。宿主細胞為本領域常規的各種宿主細胞，只要能滿足使上述重組表達載體穩定地自行複製，且所攜帶所述的核苷酸可被有效表達即可。其中該宿主細胞包括原核表達細胞和真核表達細胞，該宿主細胞較佳地包括：COS、CHO(中國倉鼠卵巢，Chinese H amster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地為E.coli TG1、BL21(DE3)細胞(表達單鏈抗體或Fab抗體)或者CHO-K1細胞(表達全長IgG抗體)。將前述表達載體轉化至宿主細胞中，可獲得本發明優選的重組表達轉化體。其中該轉化方法為本領域常規轉化方法，較佳地為化學轉化法，熱激法或電轉法。
製備方法
本發明所述的細胞的培養方法、該抗體的分離和純化方法為本領域常規方法，具體操作方法請參考相應的細胞培養技術手冊以及抗體分離純化技術手冊。本發明中公開的抗TROP-2/CD3雙特異性抗體的製備方法包括：在表達條件下，培養上述的細胞，從而表達能與TROP-2和CD3特異結合的雙特異性抗體；及分離和純化所述的抗TROP-2/CD3雙特異性抗體。利用上述方法，可以將重組蛋白純化為基本均一的物質。
可以利用親和層析的方法對本發明公開的抗TROP-2/CD3雙特異性抗體進行分離純化，根據所利用的親和柱的特性，可以使用常規的方法例如高鹽緩衝液、改變PH等方法洗脫結合在親和柱上的抗TROP-2/CD3雙特異性抗體。本發明的發明人對所得抗TROP-2/CD3雙特異性抗體進行了檢測實驗，實驗結果表明該抗TROP-2/CD3雙特異性抗體能很好地與靶細胞和抗原結合，具有較高的親和力。
藥物組合物
本發明的另一方面提供了一種組合物，優選地，所述的組合物是藥物組合物。
本發明中，術語“藥物組合物”是指本發明的雙特異性抗體可以和藥學上可以接受的載體一起組成藥物製劑組合物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明公開的雙特異性抗體的胺基酸核心序列的構象完整性，同時還保護蛋白質的多官能團防止其降解(包括但不限於凝聚、脫氨或氧化)。
通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5.0-8.0，較佳地pH約為6.0-8.0，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射(如腹膜內)、顱內注射或腔內注射。通常情況下，對於液體製劑，通常可以在2-8℃條件下至少一年保持穩定；對於凍幹製劑，通常可以在30℃條件下至少六個月保持穩定。該雙特異性抗體製劑可為製藥領域常用的混懸、水針、凍乾等製劑。
本發明的藥物組合物含有安全有效量(如0.001-99wt%，較佳地0.01-90wt%，更佳地0.1-80wt%)的本發明上述的雙特異性抗體(或其偶聯物)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約10微克/千克體重-50毫克/千克體重。此外，本發明的雙特異性抗體還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的雙特異性抗體或其免疫偶聯物施用於哺乳動物。其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-10毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
應用
本發明另一方面提供了上述能與TROP-2和CD3特異結合的雙特異性抗體、或上述藥物組合物在製備藥物中的應用，該藥物用於治療癌症或腫瘤。
本發明所稱的用於治療癌症或腫瘤的藥物，指具有抑制和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫瘤相關症狀發展的延遲和/或這些症狀嚴重程度的降低，進一步還包括已存在的腫瘤伴隨症狀的減輕並防止其他症狀的出現，還包括減少或防止腫瘤的轉移等。
本發明所述的藥物針對的腫瘤較佳地包括但不限於：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、***癌、皮膚癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子子宮頸癌、***癌、外陰癌、直腸癌、結腸癌、肛門區癌、乳腺癌、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、尿道癌、陰莖癌、***癌、胰腺癌、腦癌、睾丸癌、淋巴癌、移行細胞癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、軟組織肉瘤、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、中樞神經系統腫瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、慢性或急性白血病和該癌的組合。
本發明的雙特異性抗體及其組合物在對包括人在內的動物給藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和種種情況，總給藥劑量不能超過一定範圍。具體講靜脈注射的劑量是1-1800mg/天。
本發明的雙特異性抗體及其組合物還可以和其他的抗腫瘤藥聯合給藥以達到更加有效治療腫瘤的目的，這些抗腫瘤藥包括但不限於：1、細胞毒類藥物：1)作用於核酸化學結構的藥物：烷化劑如氮芥類、亞硝脲類、甲基磺酸酯類；鉑類化合物如順鉑(Cisplatin)、卡鉑 (Carboplatin)和草酸鉑(Oxaliplatin)等；抗生素類如阿黴素(Adriamycin/Doxorubicin)、放線菌素D(Dactinomycin D)、柔紅黴素(Daunorubicin)、表阿黴素(Epirubicin)、光輝黴素(Mithramycin)等；2)影響核酸代謝的藥物：二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨喋呤(Methotrexate)和培美曲塞(Pemetrexed)等；胸腺核苷合成酶抑制劑如氟尿嘧啶類(5-氟尿嘧啶、卡培他濱)等；嘌呤核苷合成酶抑制劑如6-巰基嘌呤等；核苷酸還原酶抑制劑如羥基脲(Hydroxycarbamide)等；DNA多聚酶抑制劑如阿糖胞苷(Cytosinearabinoside)和吉西他濱(Gemcitabine)等；3)作用於微管蛋白的藥物：多西他賽(Docetaxel)、長春花堿(Vincristine)、長春瑞濱(Vinorelbine)、鬼臼鹼類、高三尖杉酯堿等；2、激素類藥物：抗***如他莫昔芬(Tamoxifen)、屈洛昔芬(Droloxifene)、依西美坦(Exemestane)等；芳香化酶抑制劑如氨魯米特(Aminoglutethimide)、福美司坦(Formestane)、來曲唑(Letrozle)、阿那曲唑(Anastrozole)等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激動劑/拮抗劑：諾雷德、依那通等；3、生物反應調節劑類藥物：此類藥物主要通過調節機體免疫功能以到抗腫瘤的效果，如干擾素類(Interferon)、白細胞介素-2(Interleukin-2)、胸腺肽類(Thymosins)等；4、單克隆抗體類藥物：曲妥昔單抗(Trastuzumab)、利妥昔單抗(Rituximab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、貝伐單抗(Bevacizumab)等。本發明公開的雙特異性抗體及其組合物可以和上述的抗腫瘤藥物之一或其組合聯合用藥。
下面結合具體實施例，進一步陳述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。當實施例給出數值範圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值範圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。
以下實施例中使用的實驗材料和來源以及實驗試劑的配製方法具體說明如下。
實驗材料：
勝任細胞：品牌生工，貨號B528412。
293F細胞：品牌GIBCO，貨號R79007。
Colo205細胞：中科院細胞庫，目錄號TCHu102。
MDA-MB-231細胞：中科院細胞庫，目錄號TCHu227。
A549細胞：購自ATCC。
人肺癌細胞NCI-H292：中科院細胞庫，目錄號SCSP-582。
hPBMC：購自澳賽爾斯，貨號FPB004F-C-MLR。
實驗試劑：
無內毒素質粒大提試劑盒：品牌天根，貨號DP117。
DNA 純化回收試劑盒：品牌天根，貨號DP214。
ClonExpressTM II One Step Cloning Kit：品牌諾唯贊，貨號C112。
PrimeSTAR® HS DNA Polymerase：品牌takara，貨號R010B。
塗覆液：碳酸鈉1.59克，碳酸氫鈉 2.93克，加入雙蒸水定容至1L。
PBST：PBS+0.05％Tween 20。
Tween 20：品牌阿拉丁，貨號T104863。
ELISA封閉液：PBST+1%BSA。
BSA：品牌生工，貨號A60332。
TROP-2-HIS蛋白：品牌愷佧，貨號TRP-HM121。
CD3-FC蛋白：品牌愷佧，貨號CD3-HM205。
HRP標記的山羊抗人FC抗體：品牌博奧龍，貨號BF03031。
HRP標記的山羊抗人Fab抗體：品牌賽默飛，貨號A0293。
TMB：品牌BD Biosciences，貨號555214。
終止液：2M硫酸溶液。
0.25%胰酶-EDTA：品牌GIBCO，貨號25200-072。
1640完全培養基：RPMI1640培養基+10%FBS+1% Pen Strep +1%丙酮酸鈉。
RPMI1640培養基：品牌GIBCO，貨號22400089。
FBS：品牌GIBCO，貨號10099-141。
Pen Strep：品牌GIBCO，貨號1514022。
丙酮酸鈉：品牌GIBCO，貨號11360-070。
DMEM完全培養基：DMEM高糖培養基+10%FBS+1% Pen Strep +1% GLUMAX。
DMEM高糖培養基：品牌GIBCO，貨號11965-092。
GlutaMAX：品牌GIBCO，貨號35050-061。
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay：購自Promega，貨號G7572。
Purified Mouse Anti-Human IL-2：購自BD Pharmingen，貨號55051。
Biotin Mouse Anti-Human IL-2：購自BD Pharmingen，貨號555040。
Recombinant Human IL-2：購自BD Pharmingen，貨號554603。
Streptavidin HRP：購自BD Biosciences，貨號554066。
實驗儀器：
Mastercycler nexus PCR儀：購自Eppendorf公司。
Hitrap Mabselect Sure柱：購自Cytiva公司。
HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱：購自Cytiva公司。
SpectraMax i3x酶標儀：購自Molecular Devices公司。
SpectraMaxM5酶標儀：購自Molecular Devices公司。
本申請的序列如下表所示：
表B.
SEQ ID NO. 名稱 序列
1 抗TROP-2單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR1胺基酸序列 IYWLG
2 抗TROP-2單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR2胺基酸序列 NIFPGSAYINYNEKFKG
3 抗TROP-2單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR3胺基酸序列 EGSNSGY
4 抗TROP-2單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR1胺基酸序列 KSSQSLLNSGNQQNYLA
5 抗TROP-2單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR2胺基酸序列 GASTRES
6 抗TROP-2單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR3胺基酸序列 QSDHIYPYT
7 抗CD3單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR1胺基酸序列 TYAMN
8 抗CD3單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR2胺基酸序列 RIRSKYNNYATYYADSVKD
9 抗CD3單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR3胺基酸序列 HGNFGNSYVSWFAY
10 抗CD3單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR1胺基酸序列 RSSTGAVTTSNYAN
11 抗CD3單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR2胺基酸序列 GTNKRAP
12 抗CD3單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR3胺基酸序列 ALWYSNLWV
13 抗TROP-2單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR1-I31D胺基酸序列 DYWLG
14 抗TROP-2單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR1-I31E胺基酸序列 EYWLG
15 抗CD3單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR1-T31G-Y32S胺基酸序列 GSAMN
16 抗CD3單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR1-T31G-Y32S(VH-FR-N30S)胺基酸序列 GSAMN
17 抗CD3單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR1-T31G-Y32H胺基酸序列 GHAMN
18 抗CD3單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR1-T31G-Y32G胺基酸序列 GGAMN
19 抗CD3單抗重鏈可變區VL中互補決定區LCDR2-G50A胺基酸序列 ATNKRAP
20 抗TROP-2單抗重鏈可變區VH胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTIYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSS
21 抗TROP-2單抗輕鏈可變區VL胺基酸序列 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQQNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQSDHIYPYTFGQGTKLEIKR
22 抗CD3單抗重鏈可變區VH胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
23 抗CD3單抗輕鏈可變區VL胺基酸序列 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKR
24 抗TROP-2單抗重鏈可變區VH-I31D胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSS
25 抗TROP-2單抗重鏈可變區VH-I31E胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFT EYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSS
26 抗CD3單抗重鏈可變區VH-T31G-Y32S胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN GSAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
27 肽連接子L1的胺基酸序列 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
28 肽連接子L2的胺基酸序列 GGGGSGGGGSGGGGS
29 肽連接子L3的胺基酸序列 GGGG
30 抗TROP-2單抗重鏈胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTIYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
31 抗TROP-2單抗輕鏈胺基酸序列 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQQNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQSDHIYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
32 抗TROP-2單抗重鏈HC-I31D胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
33 抗TROP-2單抗重鏈HC-I31E胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
34 抗CD3單抗的可變片段scFv的胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKR
35 抗CD3單抗的可變片段scFv-VH-T31G-Y32S的胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGSAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKR
36 抗TROP-2/CD3雙抗a的重鏈胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKRGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
37 抗TROP-2/CD3雙抗b的重鏈胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGSAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKRGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
38 抗TROP-2/CD3雙抗c的重鏈胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
39 抗TROP-2/CD3雙抗b 1的重鏈胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKRGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
40 抗TROP-2/CD3雙抗b 2的重鏈胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGHAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKRGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
41 抗TROP-2/CD3雙抗b 3的重鏈胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGGAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKRGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
42 抗TROP-2/CD3雙抗b 4的重鏈胺基酸序列 QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGATNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKRGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
43 抗TROP-2/CD3雙抗a的重鏈核酸序列 見序列表
44 抗TROP-2/CD3雙抗b的重鏈核酸序列 見序列表
45 抗TROP-2/CD3雙抗c的重鏈核酸序列 見序列表
46 抗TROP-2/CD3雙抗b 1的重鏈核酸序列 見序列表
47 抗TROP-2/CD3雙抗b 2的重鏈核酸序列 見序列表
48 抗TROP-2/CD3雙抗b 3的重鏈核酸序列 見序列表
49 抗TROP-2/CD3雙抗b 4的重鏈核酸序列 見序列表
50 抗TROP-2單抗，雙抗a、b、c、b 1、b 2、b 3和b 4輕鏈核酸序列 見序列表
51 人IgG1重鏈恆定區胺基酸序列 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
52 人kappa鏈恆定區胺基酸序列 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
實施例1.抗TROP-2/CD3雙抗分子的構建
本發明採用了抗TROP-2的單抗IgG和抗CD3單抗scFv串聯的方式，構建了抗TROP-2/CD3雙特異性抗體a、b和c，a和b結構如圖1A所示，c結構如圖1B所示。
其中，抗TROP-2/CD3雙特異性抗體中的抗TROP-2單抗序列來源於US20120237518A1專利中公開的KM4097HV3aLV0人源化單克隆抗體，KM4097HV3aLV0人源化單克隆抗體作為抗TROP-2單抗陽性對照。抗TROP-2/CD3雙特異性抗體中的抗CD3單抗的CDR序列來源於US8236308B2中的SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 4，並對其進行了人源化改造。本發明使用改造後的人源化SP34作為抗CD3單抗陽性對照。
人源化SP34具體構建方法如下：
(1)鼠源抗人CD3單克隆抗體鼠源SP34(mSP34)的CDR區序列的獲取
鼠源抗人CD3單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列分別來自於US8236308B2中的SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 4。
mSP34重鏈可變區胺基酸序列：
EVKLLESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSA
mSP34輕鏈可變區胺基酸序列：
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
對mSP34的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列進行分析，依據Kabat規則分別確定mSP34重鏈和輕鏈的互補決定區CDR和框架區FR。mSP34重鏈CDR的胺基酸序列為HCDR1：TYAMN(SEQ ID NO. 7)、HCDR2：RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO. 8)和HCDR3：HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO. 9)，輕鏈CDR的胺基酸序列為LCDR1：RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO. 10)、LCDR2：GTNKRAP(SEQ ID NO. 11)和LCDR3：ALWYSNLWV(SEQ ID NO. 12)。
(2)SP34單克隆抗體的人源化構建過程
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，將mSP34的重鏈可變區與人IgG胚系序列進行同源性比較，選擇IGHV3-23*04為重鏈CDR移植範本，將mSP34的重鏈CDR移植入IGHV3-23*04骨架區，並在HCDR3之後加入WGQGTLVTVSS作為第四個框架區，獲得CDR移植重鏈可變區序列。同樣地，將mSP34的輕鏈可變區與人IgG胚系序列同源性比較，選擇IGLV7-46*01為輕鏈CDR移植範本，將SP34的輕鏈CDR移植入IGLV7-46*01的骨架區，並在LCDR3之後加入FGQGTKVEIK作為第四個框架區，獲得CDR移植輕鏈可變區序列。在CDR移植可變區的基礎上，對一些胺基酸位點進行突變。在進行突變時，將胺基酸序列進行Kabat編碼，位元點的位置由Kabat碼指示。
優選的，對於CDR移植重鏈可變區，將第49位的S突變為A，將第73位的N突變為D，將第93位的A突變為V，將第94位的K突變為R。對於CDR移植輕鏈可變區，將第36位的F突變為V，第46位的T突變為G，第49位的Y突變為G，第57位的W突變為G，第58位的T突變為V。上述帶有回復突變位點的重鏈和輕鏈可變區分別定義為人源化SP34重鏈和輕鏈可變區(SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 19)。
(3)全長人源化SP34單克隆抗體的構建過程：
將合成的人源化重鏈可變區與人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO. 39)的編碼基因相連，獲得全長的人源化重鏈基因；將人源化輕鏈可變區與人Kappa鏈恆定區(SEQ ID NO. 40)的編碼基因相連，獲得全長的人源化輕鏈基因。
參照實施例2中的表達純化方法最終獲得陽性對照單克隆抗體。
在純化產物蛋白表達量測定的過程中發現，陽性對照抗TROP-2單抗的表達量較低，約為10-20mg/l，而I31E位突變後抗TROP-2單抗蛋白表達量提高至30mg/l以上，I31D位突變後抗TROP-2單抗蛋白表達量提高至70mg/l以上，因此將I31E或I31D位突變運用於抗TROP-2/CD3雙抗中，以提高雙抗的表達量，TROP-2/CD3雙抗的突變具體如下：
對抗TROP-2重鏈可變區VH(SEQ ID NO. 20)的胺基酸I31D位點突變，獲得抗TROP-2重鏈可變區VH-I31D(SEQ ID NO. 24)，從而獲得抗TROP-2重鏈HC-I31D (SEQ ID NO. 32)，抗TROP-2單抗的輕鏈(SEQ ID NO. 31)保持不變，獲得抗TROP-2-VH-I31D單抗。
對抗TROP-2重鏈可變區VH(SEQ ID NO. 20)的胺基酸I31E位點突變，獲得抗TROP-2重鏈可變區VH-I31E(SEQ ID NO. 25)，從而獲得抗TROP-2重鏈HC-I31E (SEQ ID NO. 33)，抗TROP-2單抗的輕鏈(SEQ ID NO. 31)保持不變，獲得抗TROP-2-VH-I31E單抗。
對抗CD3重鏈可變區VH(SEQ ID NO. 22)的胺基酸T31G和Y32S位點突變，獲得抗CD3重鏈可變區VH-T31G-Y32S (SEQ ID NO. 26)。
抗TROP-2/CD3雙特異性抗體a、c中的scFv為VH-L1-VL，是通過L1(SEQ ID NO. 27)連接抗CD3重鏈可變區VH(SEQ ID NO. 22)和抗CD3輕鏈可變區VL(SEQ ID NO. 23)得到的，即CD3-scFv (SEQ ID NO. 34)。
另一種實施方式中，抗TROP-2/CD3雙特異性抗體b中的scFv為VH-T31G-Y32S -L1-VL，是通過L1(SEQ ID NO. 27)連接抗CD3重鏈可變區VH-T31G-Y32S (SEQ ID NO. 26)和抗CD3輕鏈可變區VL(SEQ ID NO. 23)得到的，即CD3-scFv-VH-T31G-Y32S (SEQ ID NO. 35)。
抗TROP-2/CD3雙特異性抗體a和b的CD3-scFv通過L2(SEQ ID NO. 28)和L3(SEQ ID NO. 29)連接到抗TROP-2重鏈HC-I31D (SEQ ID NO. 32)CH1和CH2之間，獲得抗TROP-2/CD3雙抗a的重鏈(SEQ ID NO. 36)和抗TROP-2/CD3雙抗b的重鏈(SEQ ID NO. 37)，抗TROP-2單抗的輕鏈(SEQ ID NO. 31)保持不變。
抗TROP-2/CD3雙特異性抗體c的CD3-scFv通過L2(SEQ ID NO. 28)連接到抗TROP-2重鏈HC-I31D (SEQ ID NO. 32)的N末端，獲得抗TROP-2/CD3雙抗c的重鏈(SEQ ID NO. 38)，抗TROP-2單抗的輕鏈(SEQ ID NO. 31)保持不變。
對CD3可變區的胺基酸序列進行進一步的突變：
對抗CD3重鏈可變區VH(SEQ ID NO. 22)的胺基酸N30S、T31G和Y32S位點突變，獲得抗CD3重鏈可變區VH-N30S-T31G-Y32S；
對抗CD3重鏈可變區VH(SEQ ID NO. 22)的胺基酸T31G和Y32H位點突變，獲得抗CD3重鏈可變區VH-T31G-Y32H；
對抗CD3重鏈可變區VH(SEQ ID NO. 22)的胺基酸T31G和Y32G位點突變，獲得抗CD3重鏈可變區VH-T31G-Y32G；
對抗CD3輕鏈可變區VL(SEQ ID NO. 23)的胺基酸G50A位點突變，獲得抗CD3輕鏈可變區VL-G50A。
通過L1(SEQ ID NO. 27)將抗CD3輕鏈可變區VL(SEQ ID NO. 23)分別與抗CD3重鏈可變區VH-N30S-T31G-Y32S、VH-T31G-Y32H和VH-T31G-Y32G連接，得到VH-N30S-T31G-Y32S-L1-VL（CD3-scFv-VH-N30S-T31G-Y32S）、VH-T31G-Y32H-L1-VL（CD3-scFv-VH-T31G-Y32H）和VH-T31G-Y32G-L1-VL（CD3-scFv-VH-T31G-Y32G）；通過L1(SEQ ID NO. 27)將抗CD3重鏈可變區VH(SEQ ID NO. 22)與抗CD3輕鏈可變區VL-G50A連接，得到VH-L1-VL-G50A（CD3-scFv-VL-G50A）。
通過L2(SEQ ID NO. 28)和L3(SEQ ID NO. 29)將CD3-scFv-VH-N30S-T31G-Y32S、CD3-scFv-VH-T31G-Y32H、CD3-scFv-VH-T31G-Y32G和CD3-scFv-VL-G50A依次連接到抗TROP-2重鏈HC-I31D (SEQ ID NO. 32)CH1和CH2之間，獲得抗TROP-2/CD3雙抗b1、b2、b3和b4的重鏈，胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41和SEQ ID NO. 42所示，抗TROP-2單抗的輕鏈(SEQ ID NO. 31)保持不變。
實施例2.抗TROP-2/CD3雙抗的表達與純化
將抗TROP-2/CD3雙特異性抗體的重鏈和輕鏈的DNA片段分別亞克隆到載體pcDNA3.4中，提取重組質粒並共轉染293F細胞和/或CHO細胞。細胞培養5-7天后，將培養液通過高速離心、0.22μm濾膜過濾後上樣至Hitrap Mabselect Sure親和層析柱中，用100mM檸檬酸，pH3.5的洗脫液一步洗脫蛋白，回收目的樣品並透析換液至pH7.4的PBS中，將純化後的蛋白用UPLC-SEC檢測。
抗TROP-2/CD3雙抗a、b、c、b1-b4分子的檢測結果如圖2A、圖2B和圖2C，及圖2D-圖2G所示，其中抗體分子狀態均一，單體純度達到95%以上。
實施例3.酶聯免疫吸附法(ELISA)測定雙抗對抗原的親和力
3.1 檢測抗TROP-2/CD3雙特異性抗體對TROP-2的親和力
塗覆液稀釋重組Human-TROP-2-HIS蛋白至200ng/ml，以100μl/孔加入到酶標板中，常溫放置2小時或者4攝氏度過夜放置。去掉塗覆液(用吸水紙去掉殘留液滴)，以200μl/孔加入封閉液至酶標板中，常溫放置1-2小時。去掉封閉液(用吸水紙去掉殘留液滴)，再用封閉液稀釋TROP-2/CD3雙特異性抗體和抗TROP-2單抗至10μg/ml，四倍稀釋形成12個濃度梯度(最高濃度10μg/ml，最低濃度0.002ng/ml)，以100μl/孔依次加入到封閉過的酶標板中，常溫放置1小時。用PBST洗板3次(用吸水紙去掉殘留液滴)，用封閉液按1:3000稀釋含HRP標記的山羊抗人FC抗體，以100μl/孔加入到酶標板中，常溫放置30分鐘。用PBST洗板3次(用吸水紙去掉殘留液滴)，以100μl/孔加入TMB，室溫避光放置5分鐘，以80μl/孔加入終止液，終止底物顯色反應，用酶標儀讀取450nm處的OD值，用GraphPad對資料進行分析，作圖並計算EC50。
試驗結果如圖3A所示，抗TROP-2/CD3雙特異性抗體分子a、c和陽性對照抗TROP-2單抗與TROP-2-HIS結合的EC50(單位：nM)分別為0.01649、0.01875和0.02606，表明CD3-scFv的嵌入，無論是連接在抗TROP-2單抗重鏈的N末端，還是***到抗TROP-2單抗重鏈的CH1和CH2之間，都不影響雙特異性抗體對TROP-2抗原的結合能力。
3.2 檢測抗TROP-2/CD3雙特異性抗體對CD3的親和力
塗覆液稀釋重組Human-CD3-FC蛋白至200ng/ml，以100μl/孔加入到酶標板中，常溫放置2小時或者4攝氏度過夜放置。去掉塗覆液(用吸水紙去掉殘留液滴)，以200μl/孔加入封閉液至酶標板中，常溫放置1-2小時。去掉封閉液(用吸水紙去掉殘留液滴)，再用封閉液稀釋抗TROP-2/CD3雙特異性抗體和抗CD3單抗至10μg/ml，四倍稀釋形成12個濃度梯度(最高濃度10μg/ml，最低濃度0.002ng/ml)，以100μl/孔依次加入到封閉過的酶標板中，常溫放置1小時。用PBST洗板3次(用吸水紙去掉殘留液滴)，用封閉液按1:3000稀釋含HRP標記的山羊抗人Fab抗體，以100μl/孔加入到酶標板中，常溫放置30分鐘。用PBST洗板3次(用吸水紙去掉殘留液滴)，以100μl/孔加入TMB，室溫避光放置5分鐘，以80μl/孔加入終止液，終止底物顯色反應，用酶標儀讀取450nm處的OD值，用GraphPad對資料進行分析，作圖並計算EC50。
試驗結果如圖3B所示，抗TROP-2/CD3雙特異性抗體分子a、b、c和陽性對照抗CD3單抗與CD3-FC結合的EC50(單位：nM)分別為0.07924、0.6071、0.04141和0.06182。表明CD3-scFv***到抗TROP-2單抗重鏈的CH1和CH2之間，使雙特異性抗體對CD3抗原的結合能力略有降低，在雙抗a的基礎上對抗CD3重鏈可變區VH的胺基酸進行突變後，顯著降低了雙特異性抗體對CD3抗原的結合能力。
同時比較抗TROP-2/CD3雙抗a、b、b1、b2、b3和b4與CD3結合親和力的差異，實驗步驟與反應條件與上述相同。試驗結果如圖3C所示，抗TROP-2/CD3雙體a、b、b1、b2、b3、b4和陽性對照抗CD3單抗與抗原CD3-FC結合的EC50(單位：nM)分別為0.0532、0.3208、0.0939、0.1431、5.4670、0.1273和0.0229。說明對抗CD3重鏈或輕鏈可變區進行突變後，抗體與CD3抗原的親和力均有所下降，其中抗TROP-2/CD3雙體b3的親和力下降最為明顯。
實施例4. Fortibio測定抗TROP-2/CD3雙抗對CD3抗原的親和力
使用Fortebio Octet分子相互作用儀和Octet AR2G Biosensors探針測定抗TROP-2/CD3雙特異性抗體和抗原CD3-Fc結合的動力學參數。用1×HBS-EP緩衝液稀釋TROP-2/CD3雙抗濃度至10nM，2倍稀釋，設置7個濃度梯度；用1×Octet Sodium Acetate緩衝液稀釋抗原CD3-Fc濃度至10ug/ml，將Octet AR2G Biosensors探針活化後，測定抗原抗體結合及解離速率。
抗TROP-2/CD3雙抗和CD3-Fc結合的動力學參數見表1，動力學特徵參數圖譜如圖4所示。結果表明，抗TROP-2/CD3雙抗a、b1和b4與CD3-Fc有較高的親和力，抗TROP-2/CD3雙抗b與CD3-Fc的親和力較弱，抗TROP-2/CD3雙抗b3與CD3-Fc的親和力最弱。
表1 抗TROP-2/CD3雙抗與CD3-Fc抗原結合的動力學參數
樣品名稱 Ka（1/Ms） Kd（1/s） KD(M)
抗TROP-2/CD3雙抗a 9.52E+05 1.96E-04 2.06E-10
抗TROP-2/CD3雙抗b 1.92E+06 2.32E-03 1.21E-09
抗TROP-2/CD3雙抗b 1 3.55E+06 1.06E-03 2.98E-10
抗TROP-2/CD3雙抗b 2 1.57E+06 6.96E-04 4.42E-10
抗TROP-2/CD3雙抗b 3 4.65E+04 2.66E-03 5.73E-08
抗TROP-2/CD3雙抗b 4 1.13E+06 3.12E-04 2.76E-10
KD為親和力常數；ka為抗原抗體結合速率；kd為抗原抗體解離速率；KD=kd/ka。
實施例5.雙抗作用下hPBMC對腫瘤細胞殺傷實驗
取對數期生長的Colo205細胞(人結腸癌細胞)、MDA-MB-231細胞(人乳腺癌細胞)和A549細胞(人肺腺癌細胞)，用完全培養基稀釋細胞至1×105個/ml，以100μl每孔加入到白色透明96孔板中，96孔板邊緣孔不加細胞，只加完全培養基進行封邊處理，放置於37℃並5% CO 2培養箱中培養過夜。
取新鮮的人外周血單個核細胞(Human peripheral blood mononuclear cell，hPBMC)，用完全培養基稀釋細胞至1.2×106個/ml，以50μl每孔加入到白色透明96孔板中，同時設置只加hPBMC細胞無腫瘤細胞的對照孔。
不同腫瘤細胞加入抗體的濃度和稀釋倍數不同：用完全培養基稀釋抗TROP-2/CD3雙抗b至1μg/ml，6倍梯度稀釋形成10個濃度梯度(最高濃度1μg/ml，最低濃度9.92×10-8μg /ml)，以50μl每孔加入到含有Colo205細胞和hPBMC細胞的白色透明96孔板中，放置於37℃並5% CO 2培養箱中培養48小時；用完全培養基稀釋抗TROP-2/CD3雙抗b至20μg/ml，4倍梯度稀釋形成10個濃度梯度(最高濃度20μg/ml，最低濃度7.63×10-5μg/ml)，以50μl每孔加入到含有MDA-MB-231細胞和hPBMC細胞、含有A549細胞和hPBMC細胞的白色透明96孔板中，放置於37℃並5% CO 2培養箱中培養48小時。檢測前，白色透明96孔板底需用白色卡紙密封好，確保板底不透光，每孔吸出上清100μl，剩餘含有細胞的培養基100μl，加入The CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay中的CellTiter-Glo®Reagent，每孔100μl，避光反應10分鐘後，用SoftMax 6.3軟體上機讀數檢測。
為了研究抗TROP-2/CD3雙抗中兩個靶點的協同作用，選擇TROP-2蛋白表達量不同的腫瘤細胞，其中Colo205細胞和MDA-MB-231細胞都可以表達TROP-2蛋白，且Colo205細胞的TROP-2表達量高於MDA-MB-231細胞，A549細胞幾乎不表達TROP-2蛋白。試驗結果如圖5A所示，抗TROP-2/CD3雙抗b對Colo205細胞的殺傷作用最明顯，對MDA-MB-231細胞的殺傷也有一定的作用，對不表達TROP-2蛋白的A549細胞無殺傷作用，說明抗TROP-2/CD3雙抗可以定位於靶細胞發揮作用，確保人體正常組織不會被抗TROP-2/CD3雙抗誘導的T細胞殺傷作用所殺傷。
驗證抗TROP-2/CD3雙抗a、b以及抗CD3單抗對腫瘤細胞殺傷的差異，選用TROP-2表達量相對較高的Colo205細胞作為靶細胞，實驗步驟與反應條件與上述相同，試驗結果如圖5B所示，經過T31G和Y32S位點突變後的抗TROP-2/CD3雙抗b對靶細胞的殺傷作用低於抗TROP-2/CD3雙抗a，但均高於抗CD3單抗。
進一步驗證對抗CD3重鏈或輕鏈可變區進行突變後，抗TROP-2/CD3雙抗對腫瘤細胞的殺傷作用，選用TROP-2表達量相對較高的Colo205細胞作為靶細胞，實驗步驟與反應條件與上述相同，試驗結果如圖5C所示，抗TROP-2/CD3雙抗b1、b2和b4對Colo205細胞的殺傷作用較為明顯，抗TROP-2/CD3雙抗b的殺傷作用居中，抗TROP-2/CD3雙抗b3的殺傷作用相對較弱。
實施例6.雙抗作用下細胞因數釋放實驗
取對數期生長的Colo205細胞，用完全培養基稀釋細胞至1×105個/ml，以100μl每孔加入到白色透明96孔板中，96孔板邊緣孔不加細胞，只加完全培養基進行封邊處理，放置於37℃並5% CO 2培養箱中培養過夜。
取新鮮的hPBMC細胞, 用完全培養基稀釋細胞至1.2×106個/ml，以50μl每孔加入到白色透明96孔板中，同時設置只加hPBMC細胞無腫瘤細胞的對照孔。
用完全培養基稀釋抗CD3單抗和抗TROP-2/CD3雙抗至1μg/ml，6倍梯度稀釋形成10個濃度梯度(最高濃度1μg/ml，最低濃度9.92×10-8μg /ml)，以50μl每孔加入到含有Colo205細胞和hPBMC細胞的白色透明96孔板中，放置於37℃並5% CO 2培養箱中培養48小時。
收集上清液，用ELISA檢測上清液中IL-2、INF-γ和TNF-α的含量。用塗覆液分別稀釋Purified Mouse Anti-Human IL-2、Purified Mouse Anti-Human INF-γ以及Purified Mouse Anti-Human TNF-α至4μg/ml，以50μl/孔加入到96孔酶標板中，於4℃冰箱過夜培養。去掉塗覆液，用吸水紙去除殘留液滴，以200μl/孔加入封閉液(含1% BSA的PBST)，室溫放置2小時。去掉封閉液，用吸水紙去除殘留液滴，用封閉液分別稀釋Recombinant Human IL-2和Recombinant Human TNF-α至50ng ng/ml，3倍梯度稀釋，形成12個濃度梯度，用於製作標準曲線；用封閉液稀釋Recombinant Human INF-γ至100ng/ml，3倍梯度稀釋，形成12個濃度梯度，用於製作標準曲線；用封閉液3倍稀釋上清液，以100μl/孔加入到96孔酶標板中，室溫放置1h。用PBST清洗酶標板3次，用封閉液按照1:1000的比例稀釋Biotin Mouse Anti-Human IL-2、Biotin Mouse Anti-Human INF-γ以及Biotin Mouse Anti-Human TNF-α，以100μl/孔加入到96孔酶標板中，室溫放置1h。用PBST清洗酶標板3次，用封閉液按照1:1000的比例稀釋Streptavidin HRP，以100μl/孔加入到96孔酶標板中，室溫放置1h。用PBST清洗酶標板3次，以100μl/孔加入TMB，室溫避光放置5分鐘，以70μl/孔加入終止液，終止底物顯色反應後，立即用酶標儀在450nm波長處讀取各孔的OD值，並使用SoftMax 6.4軟體繪製標準曲線，換算各孔IL-2細胞因數的濃度，用GraphPad Prism6作圖分析資料。
比較抗TROP-2/CD3雙抗a、b以及抗CD3單抗協同hPBMC對腫瘤細胞殺傷的過程中，激發免疫細胞釋放細胞因數IL-2、INF-γ和TNF-α的含量，實驗結果如圖6A、6B和6C所示，在hPBMC對腫瘤細胞的殺傷過程中，抗TROP-2/CD3雙抗b與雙抗a相比，可激發免疫細胞釋放更少的細胞因數，包括IL-2、INF-γ和TNF-α。同時與圖5B比較發現，幾乎沒有殺傷作用的抗CD3單抗，在濃度累積到一定量時，也會激發免疫細胞釋放少量的細胞因數如INF-γ和TNF-α，說明抗TROP-2/CD3雙抗對腫瘤細胞的殺傷作用和對自身免疫系統的影響要優於抗CD3單抗，且抗TROP-2/CD3雙抗b的殺傷作用優於抗CD3單抗，但相對釋放更少的細胞因數。
比較對抗CD3重鏈或輕鏈可變區突變後，抗TROP-2/CD3雙抗協同hPBMC對腫瘤細胞殺傷的過程中，激發免疫細胞釋放細胞因數INF-γ的含量，實驗結果如圖6D所示，其中抗TROP-2/CD3雙抗b1、b2和b4激發的細胞因數INF-γ含量最多，抗TROP-2/CD3雙抗b激發的細胞因數INF-γ含量相對較少，抗TROP-2/CD3雙抗b3幾乎不激發免疫細胞釋放細胞因數，同時與圖5C對比發現，抗TROP-2/CD3雙抗對腫瘤細胞的殺傷作用與激發的細胞因數的含量成正比。
抗TROP-2/CD3雙抗b誘導IL-2細胞因數釋放的濃度比引起腫瘤細胞殺傷的濃度要高的多。
實施例7.抗TROP-2/CD3雙抗在NCI-H292移植瘤模型上的抗腫瘤作用
7.1 抗TROP-2/CD3雙抗b在NCI-H292移植瘤模型上的抗腫瘤作用
利用人外周血單核細胞hPBMC在NOG小鼠體內重建人源免疫系統，並在此小鼠上建立人肺癌NCI-H292皮下移植瘤模型。具體實施步驟如下：
收集體外培養的NCI-H292細胞(人非小細胞肺癌)，將細胞懸液濃度調整為1×108個/ml，與基質膠以1：1等比例混合。體外復蘇hPBMC並用PBS重懸hPBMC細胞，將hPBMC懸液濃度調整為1×107個/ml。將混合好的腫瘤細胞懸液和hPBMC懸液1：1混合。在無菌條件下，接種200μl細胞混合懸液於NOG小鼠右側上背部皮下。待皮下瘤生長至150mm3時，按照腫瘤體積將小鼠隨機分為3組，每組8只小鼠，包括：空白對照組，僅注射PBS作為對照；抗TROP-2/CD3雙特異性抗體b的1mg/kg和5mg/kg兩個劑量組，腹腔注射給藥，每週給藥三次，連續處理四周。整個實驗過程中，每週2次測量移植瘤直徑，同時稱量小鼠體重，繪製的各組腫瘤隨時間的生長曲線和小鼠體重曲線。
實驗結果如圖7A和7B所示，在NCI-H292細胞混合hPBMC移植瘤模型上，抗TROP-2/CD3雙抗b對腫瘤的抑制作用明顯高於對照組，且1mg/kg和5mg/kg兩個劑量組間無明顯差異，說明1mg/kg的劑量就可以發揮較好的抑制作用；小鼠的體重隨著連續給藥數周後也沒有明顯下降，說明TROP-2/CD3雙抗b對小鼠的毒副作用較小。結果表明，在此移植瘤模型上，抗TROP-2/CD3雙抗b能夠顯著抑制腫瘤生長，且對小鼠無明顯的毒副作用。
7.2 不同抗TROP-2/CD3雙抗在NCI-H292移植瘤模型上的抗腫瘤作用比較
利用人外周血單核細胞hPBMC在NOG小鼠體內重建人源免疫系統，並在此小鼠上建立人肺癌NCI-H292皮下移植瘤模型。具體實施步驟如下：
收集體外培養的人非小細胞肺癌NCI-H292細胞，將細胞懸液濃度調整為1×108個/ml，與基質膠以1：1等比例混合。體外復蘇hPBMC並用PBS重懸hPBMC細胞，將hPBMC懸液濃度調整為1×107個/ml，將混合好的腫瘤細胞懸液和hPBMC懸液1：1混合。將NOG小鼠右上背側剃毛，在無菌條件下，接種200 μl細胞混合懸液於NOG小鼠右側上背部皮下。待皮下瘤平均腫瘤體積約為200mm3時，將小鼠隨機分為5組，每組8只小鼠，包括：空白對照組，僅注射PBS作為對照；抗TROP-2/CD3雙特異性抗體a、b、b2和b3的1mg/kg的劑量組，腹腔注射給藥，每週給藥兩次，連續處理四周。整個實驗過程中，每週2次測量移植瘤直徑，以給藥天數為橫坐標，腫瘤體積為縱坐標繪製各組腫瘤隨時間的生長曲線。
實驗結果如圖7C所示，在NCI-H292細胞混合hPBMC移植瘤模型上，不同的抗TROP-2/CD3雙抗在1 mg/kg劑量下均體現出較強的體內抗腫瘤活性，對腫瘤的抑制作用都明顯高於對照組；抗TROP-2/CD3雙抗間的抗腫瘤活性進行比較，在1 mg/kg 相同劑量下，抗TROP-2/CD3雙抗a的抗腫瘤活性最強，抗TROP-2/CD3雙抗b2的抗腫瘤活性次之， 抗TROP-2/CD3雙抗b和b3的抗腫瘤活性稍弱於b2，但總體上各TROP-2/CD3雙抗的抗腫瘤活性無明顯差異，第17天時抗腫瘤活性均在75%以上。
首次給藥後16個小時後採集小鼠血樣，分離獲得血清，檢測在抗TROP-2/CD3雙抗a、b和b3的作用下，小鼠血清中的細胞因數含量，用Bio-plex Pro Mouse Cytokine Grp 1 Panel 23-Plex試劑盒處理血清樣品，用Bio-PlexTM 200系統平臺對樣品進行檢測，獲得小鼠血清中23種細胞因數的含量，實驗結果如圖7D所示。除IL-1b和IL-12(P40)外，抗TROP-2/CD3雙抗a激發的細胞因數水平均高於抗TROP-2/CD3雙抗b和b3；抗TROP-2/CD3雙抗b和b3之間相比，其中抗TROP-2/CD3雙抗b激發IL-1a、IL-6、G-CSF和MIP-1b細胞因數的水準較高，對其他細胞因數無明顯差異，說明對抗TROP-2/CD3雙抗a突變降低其親和力後，在保持其抗腫瘤活性的情況下，可以顯著降低動物體內細胞因數的產生。
實施例8.抗TROP-2/CD3雙抗a的穩定性研究
本實驗可用於評估在輔料加入情況下蛋白質的穩定性，從而揭示研發最優製劑所需的重要資訊。
抗TROP-2/CD3雙抗a保存在20mM 醋酸鹽+6%海藻糖+1%鹽酸精氨酸+0.1%吐溫80並且pH為5.0的buffer中，分別放置於25℃和37℃的培養箱中28天，HPLC-SEC結果見圖8A和圖8B。
結果表明，抗TROP-2/CD3雙抗a的結構比較穩定，在37℃高溫條件下放置長達28天后，其純度仍然可以保持在95%以上。
討論
由上述實驗可知，本發明提供的雙特異抗體可以同時結合TROP-2和CD3，通過結合CD3調節T細胞的免疫活性功能，並特異性殺傷表達TROP-2蛋白的腫瘤細胞。圖3B和3C結果顯示，雙特異抗體與其單抗相比結合CD3的能力有所下調，但圖5A和5B結果顯示，雙特異抗體與其單抗相比殺傷腫瘤細胞的作用明顯上升，且腫瘤細胞上TROP-2表達量越高，雙特異抗體對腫瘤細胞的殺傷作用越強。比較PBMC殺傷腫瘤細胞和其細胞因數釋放結果發現，雙特異抗體對細胞的殺傷作用越強，釋放的TH1和TH2類的細胞因數越多，成正相關，比較雙特異抗體不同突變對靶細胞的殺傷作用發現，雙特異抗體b的殺傷作用相對較強，同時激發的細胞因數釋放較少，有較大的用藥窗口。在NCI-H292移植瘤模型中，雙特異抗體對腫瘤細胞抑制活性越強，釋放的TH1和TH2類的細胞因數越多，也成正相關，從體內細胞免疫試驗的角度再一次證明了抗TROP-2/CD3雙抗b對腫瘤的殺傷作用和安全性。說明雙特異抗體對CD3的親和力下降，更有助於T細胞發揮免疫作用，且同時含有靶向TROP-2蛋白的功能，可以特異性結合並殺傷表達TROP-2的腫瘤細胞。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附請求項申請專利範圍所限定的範圍。
以上的實施例是為了說明本發明公開的實施方案，並不能理解為對本發明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發明中方法的變化，在不脫離本發明的範圍和精神的前提下對本領域內的技術人員來說是顯而易見的。雖然已結合本發明的多種具體優選實施例對本發明進行了具體的描述，但應當理解，本發明不應僅限於這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領域內的技術人員來說顯而易見的修改來獲取發明都應包括在本發明的範圍內。
圖1A顯示了抗TROP-2/CD3雙抗a和b的結構示意圖。
圖1B顯示了抗TROP-2/CD3雙抗c的結構示意圖。
圖2A顯示了抗TROP-2/CD3雙抗a的UPLC檢測圖譜。
圖2B顯示了抗TROP-2/CD3雙抗b的UPLC檢測圖譜。
圖2C顯示了抗TROP-2/CD3雙抗c的UPLC檢測圖譜。
圖2D顯示了抗TROP-2/CD3雙抗b1的UPLC檢測圖譜。
圖2E顯示了抗TROP-2/CD3雙抗b2的UPLC檢測圖譜。
圖2F顯示了抗TROP-2/CD3雙抗b3的UPLC檢測圖譜。
圖2G顯示了抗TROP-2/CD3雙抗b4的UPLC檢測圖譜。
圖3A顯示了ELISA檢測抗TROP-2/CD3雙抗a和c與TROP-2的結合。
圖3B顯示了ELISA檢測抗TROP-2/CD3雙抗a、b和c與CD3的結合。
圖3C顯示了ELISA檢測抗TROP-2/CD3雙抗不同突變與CD3的結合。
圖4顯示了抗TROP-2/CD3雙抗動力學特徵參數圖譜。
圖5A顯示了在抗TROP-2/CD3雙抗b作用下，hPBMC對不同靶細胞的殺傷作用。
圖5B顯示了在抗TROP-2/CD3雙抗作用下，hPBMC對Colo205細胞的殺傷作用。
圖5C顯示了在抗TROP-2/CD3雙抗不同突變作用下，hPBMC對Colo205細胞的殺傷作用。
圖6A顯示了在抗TROP-2/CD3雙抗作用下，hPBMC殺傷靶細胞過程中釋放的IL-2含量。
圖6B顯示了在抗TROP-2/CD3雙抗作用下，hPBMC殺傷靶細胞過程中釋放的IFN-γ含量。
圖6C顯示了在抗TROP-2/CD3雙抗作用下，hPBMC殺傷靶細胞過程中釋放的TNF-α含量。
圖6D顯示了在抗TROP-2/CD3雙抗不同突變作用下，hPBMC殺傷靶細胞過程中釋放的IFN-γ含量。
圖7A顯示了抗TROP-2/CD3雙抗b在NCI-H292移植瘤模型上的抗腫瘤作用。
圖7B顯示了抗TROP-2/CD3雙抗b在NCI-H292移植瘤模型上對小鼠的毒副作用。
圖7C顯示了抗TROP-2/CD3雙抗不同突變在NCI-H292移植瘤模型上的抗腫瘤作用。
圖7D顯示了抗TROP-2/CD3雙抗作用下小鼠血清中的細胞因數含量。
圖8A顯示了抗TROP-2/CD3雙抗a在25℃條件下處理28天的HPLC檢測圖譜。
圖8B顯示了抗TROP-2/CD3雙抗a在37℃條件下處理28天的HPLC檢測圖譜。
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Claims (15)

  1. 一種雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含： 第一抗原結合結構域D1和第二抗原結合結構域D2， 該第一抗原結合結構域D1為抗TROP-2抗體或其抗原結合片段， 該第二抗原結合結構域D2為抗CD3抗體或其抗原結合片段， 該抗TROP-2抗體或抗CD3抗體或各自的抗原結合片段包含重鏈互補決定區HCDR1-3和輕鏈互補決定區LCDR1-3。
  2. 如請求項1所述的雙特異性抗體，其中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1-3和LCDR1-3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 1-3和SEQ ID NO. 4-6所示；和/或，該抗CD3抗體或其抗原結合片段的 HCDR1-3和LCDR1-3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 7-9和SEQ ID NO. 10-12所示； 優選地，該互補決定區包含至少一個胺基酸突變； 其中，該突變選自以下任一項或多項： a) 抗CD3抗體或其抗原結合片段的HCDR1：X1X2AMN， b) 抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1：X3YWLG， c) 抗CD3抗體或其抗原結合片段的LCDR2：X4TNKRAP， 該胺基酸突變選自X1不為T、X2不為Y、X3不為I、X4不為G的組； 優選地，該胺基酸突變選自X1為G，X2為S、H或G，X3為D或E，X4為A的組。
  3. 如請求項2所述的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體選自以下任一： 1） 該抗CD3抗體或其抗原結合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示； 和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 13或SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示； 2） 該抗CD3抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X1X2AMN，其中X1為G，X2為S，胺基酸序列如SEQ ID NO. 16所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示； 和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X3YWLG，其中X3為D，胺基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示； 3） 該抗CD3抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X1X2AMN，其中X1為G，X2為H，胺基酸序列如SEQ ID NO. 17所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示； 和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X3YWLG，其中X3為D，胺基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示； 4） 該抗CD3抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X1X2AMN，其中X1為G，X2為G，胺基酸序列如SEQ ID NO. 18所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12所示； 和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X3YWLG，其中X3為D，胺基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示； 5） 該抗CD3抗體或其抗原結合片段的LCDR2為X4TNKRAP，其中X4為A，胺基酸序列如SEQ ID NO. 19所示；LCDR1、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12所示，HCDR1、HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9所示； 和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的HCDR1為X3YWLG，其中X3為D，胺基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；HCDR2、HCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列分別如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示。
  4. 如請求項1所述的雙特異性抗體，其中，該抗CD3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 22所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 23所示；和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 20所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 21所示； 優選地，該可變區包含至少一個胺基酸突變；更優選地，該胺基酸突變選自以下任一種或多種： 1) 該SEQ ID NO. 20具有第31位的胺基酸突變； 2) 該SEQ ID NO. 22具有第30位的胺基酸突變； 3) 該SEQ ID NO. 22具有第31位的胺基酸突變； 4) 該SEQ ID NO. 22具有第32位的胺基酸突變； 5) 該SEQ ID NO. 23具有第50位的胺基酸突變； 優選地，該雙特異性抗體的可變區包含1) 、3) 和 4)所示的突變； 優選地，該雙特異性抗體的可變區包含1) 、2)、 3)和 4)所示的突變； 優選地，該雙特異性抗體的可變區包含1 )和 5)所示的突變； 其中，該可變區包含選自以下任一項或多項的胺基酸突變： a) 該SEQ ID NO. 20具有I31D的胺基酸突變； b) 該SEQ ID NO. 20具有I31E的胺基酸突變； c) 該SEQ ID NO. 22具有N30S的胺基酸突變； d) 該SEQ ID NO. 22具有T31G的胺基酸突變； e) 該SEQ ID NO. 22具有Y32S、Y32H或Y32G的胺基酸突變； f) 該SEQ ID NO. 23具有G50A的胺基酸突變； 優選地，該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32S和a)中該I31D突變，或該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32S和b)中該I31E突變； 優選地，該雙特異性抗體的可變區包含c)中該N30S、d)中該T31G、e)中該Y32S和a)中該I31D突變，或該雙特異性抗體的可變區包含c)中該N30S、d)中該T31G、e)中該Y32S和b)中該I31E突變； 優選地，該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32H和a)中該I31D突變，或該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32H和b)中該I31E突變； 優選地，該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32G和a)中該I31D突變，或該雙特異性抗體的可變區包含d)中該T31G、e)中該Y32G和b)中該I31E突變； 優選地，該雙特異性抗體的可變區包含f)中該G50A和a)中該I31D突變，或該雙特異性抗體的可變區包含f)中該G50A和b)中該I31E突變。
  5. 如請求項4所述的雙特異性抗體，其特徵在於，該抗CD3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 26所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 23所示；和/或，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 24或SEQ ID NO. 25所示，輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO. 21所示。
  6. 如請求項1所述的雙特異性抗體，其中，該抗TROP-2或抗CD3抗原結合片段選自Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv或scFv；優選地，該抗TROP-2或抗CD3抗體為IgG抗體；其中，該D1為IgG抗體，該D2為scFv；優選地，該D2連接至D1的N端或C端，或連接至D1的CH1和CH2之間；更優選地，該D2連接至D1的重鏈。
  7. 如請求項1所述的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含重鏈和輕鏈，該重鏈和輕鏈的胺基酸序列選自以下任一： a) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 36所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； b) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 37所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； c) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 38所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； d) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 39所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； e) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 40所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； f) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 41所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； g) 該雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 42所示，和該雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 31所示； 或， h) 將a)至g)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同時抗TROP-2活性和抗CD3活性的由a)至g)衍生的多肽。
  8. 一種多核苷酸分子，其中，該多核苷酸分子編碼如請求項1至7中任一項所述的雙特異性抗體。
  9. 一種表達載體，其中，該表達載體含有如請求項8所述的多核苷酸分子。
  10. 一種細胞，其中，該細胞含有如請求項9所述的表達載體。
  11. 一種如請求項1至7中任一項所述的雙特異性抗體的製備方法，其中，該製備方法包括以下步驟： a) 在表達條件下，培養如請求項10所述的細胞，從而表達雙特異性抗體； b) 分離並純化步驟a) 所述的雙特異性抗體。
  12. 一種藥物組合物，其中，該藥物組合物包含有效量的如請求項1至7中任一項所述的雙特異性抗體和一種或多種藥學上可接受的載體或輔料。
  13. 如請求項1至7中任一項所述的雙特異性抗體或如請求項12所述的藥物組合物在製備癌症或腫瘤的藥物中的用途；優選地，該癌症或腫瘤為TROP-2陽性癌症或腫瘤。
  14. 如請求項13所述的用途，其中，該癌症或腫瘤選自：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、***癌、皮膚癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、***癌、外陰癌、直腸癌、結腸癌、肛門區癌、乳腺癌、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、尿道癌、陰莖癌、***癌、胰腺癌、腦癌、睾丸癌、淋巴癌、移行細胞癌、膀胱癌、腎癌、輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、軟組織肉瘤、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、中樞神經系統腫瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、慢性、急性白血病或其組合。
  15. 一種免疫偶聯物，其中，該免疫偶聯物包含： a) 如請求項1至7中任一項所述的雙特異性抗體；和 b) 以下任一種或多種偶聯物：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因數、放射性核素或酶。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9382329B2 (en) * 2012-08-14 2016-07-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
US20150231241A1 (en) * 2012-08-14 2015-08-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
AU2015219495B2 (en) * 2014-02-21 2019-11-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
EP3928790A4 (en) * 2019-02-22 2023-01-11 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. CD3 ANTIGEN-BINDING FRAGMENT AND APPLICATION THEREOF
US20240092931A1 (en) * 2020-08-24 2024-03-21 Janux Therapeutics, Inc. Antibodies targeting trop2 and cd3 and uses thereof

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