KR20200098831A

KR20200098831A - 신규한 부위-특이적 항체 절편 플랫폼

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Publication number: KR20200098831A
Application number: KR1020190016424A
Authority: KR
Inventors: 원형식; 김찬길; 심대원; 김영필; 현재원; 김나영; 김보람; 이승현; 김경민; 왕채연; 조규성; 김지훈; 이성희; 류기성
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2019-02-13
Filing date: 2019-02-13
Publication date: 2020-08-21

Abstract

본 발명은 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)에 특이적으로 결합하는 Fab 절편에 관한 것으로서, (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H); (b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(C_H1); (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L); 및 (d) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 부위-특이적 경쇄 불변 영역(sC_L)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신규한 부위-특이적 항체 절편 플랫폼은 기존 항체 약물을 대체할 수 있는 부위-특이적 1가(mono-valent) 또는 2가(di-valent) Fab 절편을 대장균을 통해 대량 생산 및 균질하게 제조할 수 있고, HER2에 대한 결합 친화도가 허셉틴(트라스투즈맙) 대비 유사하거나 우수하여 의학 및 약학 분야에서 항체-약물 접합체 생산용 기술로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 부위-특이적 항체 절편 플랫폼{Novel site-specific antibody fragment platform}

본 발명은 신규한 부위-특이적 항체 절편 플랫폼에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 HER2에 특이적으로 결합하는 항원 결합 결정 부위인 Fab(fragment antigen-binding)의 경쇄 불변 영역(C_L)에 다양한 분자 접합에 유용한 시스테인 잔기가 부위-특이적(site-specific)으로 치환된 1가(mono-valent) 항체 절편 또는 2가(di-valent) 항체 절편의 생산을 위한 플랫폼에 관한 것이다.

항체 요법은 암, 면역질환 및 혈관 신생 장애가 있는 환자의 표적 치료를 위해 확립되었다[Carter, P., (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357]. 세포 독성제 또는 세포 증식 억제제에 대한 국소 전달을 위한 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)는 면역 접합체로서 암의 치료에서 종양 세포를 죽이거나 억제하는 약물의 사용으로 종양에 약물 부분(moiety)을 전달하고, 이를 종양 세포 내 축적시키는 것을 목표로 한다[Junutula, et al., 2008b Nature Biotech. 26(8):925-932; Dornan, et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249; McDonagh, (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299-307; Doronina, et al., (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson, et al., (2006) Cancer Res. 66(8):1-8; Sanderson, et al., (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey, et al., (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett, et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070].

항체-약물 접합체에서 세포 독성 약물은 전형적으로 활성화된 천연 시스테인 설프하이드릴기(sulfhydryl group)를 제공하기 위해 리신 측쇄를 통한 비-부위-특이적 방식으로 또는 항체에 존재하는 사슬간 이황화 결합(disulfide bond, -S-S-)을 환원시킴으로써 항체에 접합된다. 약물-항체 비율(drug antibody ratio, DAR) 및 부착 부위에 관하여, 높은 균질성 및 회분식(batch-to-batch) 일관성을 항체-약물 접합체 개체군에 제공하기 위해 항체에 대한 약물의 부위-특이적 접합이 고려되었다. 부위-특이적 부착은 전형적으로 항체 내의 천연 아미노산을 시스테인과 같은 아미노산으로 치환함으로써 이루어지는데, 여기에 약물 부분이 접합될 수 있다[Stimmel, et al., (2000) JBC, 275(39):30445-30450, conjugation of an IgG S442C variant with bromoacetyl-TMT; Junutula, et al., Nature Biotechnology 26(8):925-932 참조]. 또한, 상기 선행문헌[Jujuntula, et al.]에서는 항체 서열로 조작된 특정 시스테인 잔기에 약물 부분이 부착된 부위-특이적 항체-약물 접합체가 비특이적으로 접합된 항체-약물 접합체와 비교하여 유사한 효능을 나타내며 전신 독성을 감소시킨다고 보고하였다.

항체의 구성은 항원 결합 부위인 Fab(antigen binding fragment)와 효과 부위 F_C(crystallizable fragment, effector function)로 구성되어 하나의 Fab가 이량체로 효과부와 결합되어 있게 구성되어 2가(di-valent)의 항원 결합 부위를 가지는 구조로 되어 있다. 이량체의 장점으로 안정성을 가지는 것을 기본으로 하나, 효과부의 당쇄 구조로 대장균이 아닌 포유류 세포에서 생산되어 사용되고 있다. 그러므로, 우선적으로 당쇄 구조 및 보체와의 결합이 필요하지 않는 항체는 Fc 부위를 제거한 항원 결합부(Fab)만을 필요로 할 경우 이러한 Fab의 효율성 및 안정성을 증대하기 위하여 2개의 Fab가 연결된 (Fab)₂를 생산할 수 있는 기술 개발이 필요하다.

인간 표피 성장인자 수용체(HER/EGFR/ERBB) 패밀리 중에 세포 외 신호를 받는 부위로 Human EGFR2(HER2)는 HER2/neu 혹은 ErbB2로 알려져 있으며, 세포내 신호 전달을 하는 부위로 티로신 인산화효소 수용체(tyrosine kinase receptor)를 가지고 있으며. 다른 3종의 EGFR 패밀리(HER1, HER3, HER4)와 매우 높은 구조적 유사율을 보인다. HER2와 결합하는 신호를 보내는 리간드는 아직 알려진 것이 없지만, 리간드와 결합을 하는 다른 HER 수용체들과 파트너를 이루며 이형이량체(heterodimer)를 이루어 다양한 신호전달을 통해 세포 주기 증가, 세포 증식 조절 그리고 분화 및 생존에 관여하는 것으로 알려져 있다.

EGFR 패밀리 HER2(Human epidermal growth factor receptor-2)는 유방암과 밀접한 관계를 갖는다. 유방암 환자의 약 25 %가 암세포 증식에 따라 HER2 유전자가 증식 및 과발현되는 현상이 있고, 이는 HER2-양성 암(HER2-positive cancer)으로 분류되며, HER2-음성 암(HER2-negative cancer)의 형태보다 재발이나 사망의 위험이 현저히 높다고 보고되고 있다. HER2-양성 유방암에서 과발현된 HER2에 의해 티로신 인산화효소(tyrosine kianse)가 이합체(dimer)를 형성함으로써 암 성장을 촉진시키는 세포 신호 과정이 밝혀져 있다.

HER2 이합체화 억제제인 페르제타[Perjeta(페르투주맙, Pertuzumab)], HER2 표적 항암제인 허셉틴[Herceptin(트라스투즈맙, Trastuzumab)], HER2 양성 전이성 유방암 2차 치료제인 케사일라[Kadcyla(트라스투주맙 엠탄신, Trastuzumab emtansine) 등의 치료제와 카페시타빈(Capecitabine)과 함께 병행하여 사용되고 HER2-양성 유방암에서만 작용되는 라파티닙(Lapatinib) 병행 치료제가 등장하여 HER2-양성 유방암 치료용으로 승인을 받아 사용되고 있다. 또한, 유방암뿐만 아니라 대장암, 담낭암, 담관암종, 방광암, 난소암, 자궁암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 비인두암, 후두암, 결장암, 흑색종, 자궁내막암, 자궁경부암, 간암, 폐암, 두경부암, 식도암 및 위암 등에서 HER2 유전자의 과발현이 관찰됨에 따라, 최근에는 폐암과 위암에서도 HER2 관련 항암 치료제를 병행하여 사용하거나 이와 관련된 치료제 연구가 진행 중이다.

HER2 양성 항암제로써 허셉틴(트라스투즈맙)은 HER2 단백질의 세포외 도메인(extracellular domain) 부위를 표적으로 하는 재조합 인간화 치료용 인간화 단일클론 항체이다. 허셉틴(트라스투즈맙)은 유전자 단백질인 HER2 수용체 양성인 경우에만 효과가 있는데, 재발성·과전이성 유방암뿐 아니라 초기 유방암에서도 1년간 투여했을 때 재발률이 50 %, 사망률은 30 % 낮아지는 것으로 보고되어 유방암 치료제의 개발에 중요한 약물로 평가된다.

항체 치료제의 항암제로서의 주된 작용기전은 크게 두 가지로, ① 항원 결합에 의한 항원 기능 억제(antigen neutralization) ② 효과 기능(effector function, 예를 들어, 항체-의존적 세포독성 및 보체-의존적 세포독성 등의 기능)을 통한 면역 체계 활성화로 알려져 있다. 그러나, 허셉틴(트라스투즈맙)의 경우에는 그 항원에 해당하는 인간 HER2 억제를 통해 항암 활성을 나타내며 효과 기능은 중요하게 작용하지 않으므로 항체의 효과 기능을 매개하는 Fc 지역을 제거하여도 동일한 효과를 기대할 수 있기에, HER2에 대한 결합력을 유지한다면, 허셉틴(트라스투즈맙)의 절편에서도 유사한 항암 효능을 나타낼 수 있다.

이에 Fab 형태의 절편들은 대장균을 이용한 생산이 확립되어 허셉틴(트라스투즈맙)을 대체할 수 있는 경제적 효과를 기대할 수 있고, 인간 HER2에 결합하여 HER2의 이량체를 저해한다는 동일한 기전으로 작동하므로 효능 차원에서 동일한 효능을 가질 수 있다. 또한, 항체를 절편화하여 개량된 항체 절편은 온전한 항체에 비해 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아 시스템을 이용한 저비용 생산이 가능하다는 장점이 있다. 단, 항체 절편은 온전 항체에 비해 Fc가 없고 적은 분자량을 가지므로, 항체 리사이클링의 저해, 신장 배출 증가 등의 이유로 혈액 내 반감기가 짧아질 수 있는 단점이 있지만, 기능성 펩타이드 퓨전 및 PEG화(pegylation) 등을 비롯한 다양한 바이오의약품 안정화 기술들이 개발되고 있으며, FDA에 승인된 심지아(Cimzia)의 경우가 이에 해당한다. 또한, 현재 시판중인 항체-약물 접합체 약물로는 젬투주맙 오조가미신(Gemtuzumab ozogamicin), 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin), 트라스투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine)이 있지만, 위 약물들은 모두 항체 절편(Fab)이 아닌 항체 전체 부위를 기반으로 개발된 약물이다. 이에 항체 절편(Fab) 기반의 약물을 개발할 수 있는 항체-약물 접합체 생산을 위한 기술의 개발이 필요하다.

한국 등록특허 제10-1453462호 (2014.10.15) 한국 공개특허 제10-2018-0039919호 (2018.04.19) 한국 공개특허 제10-2016-0127317호 (2016.11.03) 한국 공개특허 제10-2015-0112385호 (2015.10.07)

본 발명의 발명자들은 항체-약물 접합체의 안전성 및 효능을 증진시킬 수 있는 항체 절편 기반의 항체-약물 접합체 생산을 위하여 연구하던 중, 시스테인 잔기가 도입된 1가(mono-valent)- 또는 2가-(di-valent)성 부위-특이적 점돌연변이체를 생산함으로써, 신규한 부위-특이적 Fab 플랫폼을 대장균을 통하여 대량 생산이 가능하고, 균질한 형태로 생산할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 신규한 부위-특이적 1가- 또는 2가-성 Fab 절편이 결합 친화도가 우수하여 HER2에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 신규한 부위-특이적 항체 절편 플랫폼을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따라, HER2(human epidermal growth factor receptor 2)에 특이적으로 결합하며 다음의 영역을 포함하는 Fab(Fragment antigen-binding) 절편이 제공된다: (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H); (b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(C_H1); (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L); 및 (d) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 부위-특이적 경쇄 불변 영역(sC_L).

일 구현예에서, 상기 Fab 절편이 1가(mono-valent) 항체 절편 또는 2가(di-valent) 항체 절편일 수 있다.

일 구현예에서, 2가(di-valent) 항체 절편이 경쇄 불변 영역(C_L)의 C-말단에 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 링커 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 SARAH 도메인을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 2가(di-valent) 항체 절편이 SARAH 도메인간의 소수성 결합을 통해 재결합되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따라, HER2(human epidermal growth factor receptor 2)에 특이적으로 결합하는 Fab 절편을 제조하기 위한 다음을 포함하는 발현 컨스트럭트가 제공된다: (a) 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)-코딩 핵산 분자 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(C_H1)-코딩 핵산 분자를 포함하는 중쇄-발현 컨스트럭트; 및 (b) 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)-코딩 핵산 분자 및 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 부위-특이적 경쇄 불변 영역(sC_L)-코딩 핵산 분자를 포함하는 경쇄-발현 컨스트럭트.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포가 제공된다.

일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 대장균인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, (ⅰ) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; (ⅱ) 상기 배양된 숙주 세포에서 부위-특이적 경쇄 불변 영역(sC_L)을 포함하는 Fab 절편을 발현시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 발현된 Fab 절편을 재결합시키는 단계를 포함하는, HER2에 특이적으로 결합하는 Fab 절편의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 Fab 절편을 포함하는 암 치료용 약학 조성물이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 암은 유방암, 대장암, 담낭암, 담관암종, 방광암, 난소암, 자궁암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 비인두암, 후두암, 결장암, 흑색종, 자궁내막암, 자궁경부암, 간암, 폐암, 두경부암, 식도암 및 위암으로 이루어지는 군에서 선택된 1종일 수 있다.

본 발명에 의해, 부위-특이적 Fab 절편이 HER2에 특이적으로 결합하는 것으로서, 1개 Fab 절편(1가 항체 절편) 또는 SARAH 도메인을 통해 결합한 2개의 Fab 절편(2가 항체 절편)일 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 부위-특이적 Fab 절편은 대장균을 통해 균질하게 제조할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명에 따른 부위-특이적 Fab 절편은 HER2에 대한 결합 친화도가 허셉틴(트라스투즈맙) 대비 유사하거나 우수하여 유방암의 진단, 예방 및 치료에 유용하다.

따라서, 본 발명의 신규한 부위-특이적 항체 절편 플랫폼은 의학 및 약학 분야에서 항체-약물 접합체 생산용 기술로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 부위-특이적(a) 및 자리-비특이적(b) 항체 절편 모식도이다.
도 2는 본 발명의 부위-특이적 항체 절편 도메인별 컨스트럭트(construct)이다.
도 3은 본 발명의 재결합(re-constitution)된 부위-특이적 항체 절편 컨스트럭트에 대한 모식도이다.
도 4는 대장균 내 부위-특이적 항체 절편의 발현 양상에 대한 결과이다.
도 5는 대장균 내 생산된 항체 절편의 봉입체에 대한 변성(denaturation)을 나타낸 결과이다.
도 6은 부위-특이적 항체 절편의 재결합을 통한 정제 결과이다.
도 7은 부위-특이적 항체 절편[(a) APm914, (b) APd924, (c) APm208 및 (d) APd208]의 균질성을 확인한 결과이다.
도 8은 부위-특이적 항체 절편의 실제 DBCO-말레이미드 기(maleimide group)와의 결합에 대한 결과이다.
도 9는 대조약물인 허셉틴(트라스투즈맙)과 부위-특이적 항체 절편의 항원(HER2)에 대한 결합 친화력을 비교한 결과이다.

본 발명은 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)에 특이적으로 결합하며 다음의 영역을 포함하는 Fab(Fragment antigen-binding) 절편을 제공한다: (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H); (b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(C_H1); (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L); 및 (d) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 부위-특이적 경쇄 불변 영역(sC_L).

"Fab 절편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 절편을 의미하며, 중쇄 가변 영역(V_H), 중쇄 불변 영역 1(C_H1), 경쇄 가변 영역(V_L) 및 경쇄 불변 영역(C_L)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. 이러한 Fab 절편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고[예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 절편을 얻을 수 있다], 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

"중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3를 포함하는 전체 길이 중쇄 및 이의 절편을 모두 의미한다. 본 발명에서의Fab 절편은 상기 V_H 및 C_H1으로 구성된 중쇄를 포함하는 Fab 절편이다.

"경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전체 길이 경쇄 및 이의 절편을 모두 의미한다. 본 발명에서의 Fab 절편은 상기 V_L 및 C_L로 구성된 경쇄에 부위-특이적 접합에 필요한 부위인 20번째 아미노산 세린(Ser)이 시스테인(Cys)으로 치환된 부위-특이적 Fab 절편이다.

본 발명의 부위-특이적 Fab 절편은 HER2에 특이적으로 결합할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, Fab 절편의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 Fab 절편의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 Fab 절편의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다. 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathy index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61 ％의 상동성, 보다 바람직하게는 70 ％의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80 ％의 상동성, 가장 바람직하게는 90 ％의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.

얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 선행문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet, et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang, et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) 및 Pearson, et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)]에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990)]은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 HER2에 특이적으로 결합하는 부위-특이적 Fab 절편은 중쇄 및 경쇄의 단량체(monomer) 또는 이형이량체(heterodimer)이다.

또한, 본 발명은 Fab 절편을 1개 또는 2개를 포함하며, 상기 부위-특이적 Fab 절편은 단량체인 1가(mono-valent) 항체 절편 및 SARAH 도메인간의 소수성 결합을 통해 이량체가 형성되는 것을 특징으로 하는 2가(di-valent) 항체 절편에 대한 것이다. SARAH 도메인에 의해, 2개의 Fab 절편은 서로 역방향으로 중합체를 형성하고, 경쇄 불변 영역(C_L) 도메인의 아미노산 'EC' 서열을 삽입하지 않고, 그 말단에 링커(GGGS, 서열번호 17) 및 SARAH 도메인(서열번호 18)을 삽입하여, 접힘에 대한 항원 결합의 영향을 최소화할 수 있다.

상기 SARAH 도메인은 2개의 단량체(monomer)에 의한 이중화(dimerization)를 형성할 수 있다.　각각의 SARAH 도메인은 두개의 헬릭스를 포함하고 있으며, 역평형(antiparallel) 헬릭스 이합체를 형성하면서, 헤드 투 테일(head-to-tail) 상호작용을 하여 이합체가 형성된다. 이합체 인터페이스는 소수성 상호작용을 통해 안정화된다.

또한, 본 발명은 HER2에 특이적으로 결합하는 Fab 절편을 제조하기 위한 다음을 포함하는 발현 컨스트럭트를 제공한다: (a) 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)-코딩 핵산 분자 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(C_H1)-코딩 핵산 분자를 포함하는 중쇄-발현 컨스트럭트; 및 (b) 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)-코딩 핵산 분자 및 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 부위-특이적 경쇄 불변 영역(sC_L)-코딩 핵산 분자를 포함하는 경쇄-발현 컨스트럭트.

2가(di-valent) 부위-특이적 항체 절편을 제조하기 위하여 링커-코딩 핵산 분자는 서열번호 19로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, SARAH 도메인-코딩 핵산 분자는 서열번호 20으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다[Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)].

본 발명의 Fab 절편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 한하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80 ％의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90 ％의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95 ％의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명에서 제작되는 발현 컨스트럭트는 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현할 수 있도록 구축된다. 일반적으로, 상기 발현 컨스트럭트의 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)에 각각 작동적으로 결합된 프로모터 및 터미네이터가 위치한다. "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 재조합 벡터에서 목적 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사 조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

또한, 본 발명은 상기 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 선행문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)]에 개시되어 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, T7 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터 및 trp 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열(터미네이터, 예컨대, T7 터미네이터, ADH1 터미네이터, T3 터미네이터 및 TonB 터미네이터 등)을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균이 이용되는 경우, 대장균 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위[Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)] 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pL λ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pACYCDuet-1, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λλλλΔ및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 (ⅰ) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; (ⅱ) 상기 배양된 숙주 세포에서 부위-특이적 경쇄 불변 영역(sC_L)을 포함하는 Fab 절편을 발현시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 발현된 Fab 절편을 재결합시키는 단계를 포함하는, HER2에 특이적으로 결합하는 Fab 절편의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli C43(DE3), E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 형질전환하는 법은, 열쇼크 방법, CaCl₂ 방법[Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)], 하나한 방법[Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)] 및 전기 천공 방법[Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)] 등에 의해 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 Fab 항체 절편을 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 부위-특이적 Fab 절편이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001 ㎍/kg - 1000 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

1. HER2 표적 항체 절편 컨스트럭트 제작

HER2-양성 유방암에 대한 치료제 및 진단제를 개발하기 위하여, 항체 절편인 Fab의 컨스트럭트를 제작하였다. 총 4종류의 후보물질 컨스트럭트를 대장균에서 발현할 수 있도록 아미노산 서열을 결정하였으며, 이를 토대로 DNA 염기서열을 코스모진텍에 의뢰하여 합성을 진행하였다. 합성된 DNA 염기서열을 이용하여 클로닝을 실시하여 후보물질 컨스트럭트를 제작하였다.

1) APm201 및 APm202 컨스트럭트(APm201: V _H , C _H1 +6His, APm202: V _L , C _L )

(1) APm201은 항체를 구성하는 도메인 중 V_H(heavy chain variable region: 중쇄 가변 영역) 및 C_H1(heavy chain constant region 1: 중쇄 불변 영역 1)을 포함하는 도메인이고, 도메인 내에 존재하는 이황화결합(intra-chain disulfide bond)은 각 도메인의 구조를 안정화시킨다. 힌지 도메인(hinge domain)에 존재하는 2개의 시스테인(cysteine)이 각 도메인의 이황화결합을 형성하여 각 도메인의 이형체(dimer)를 형성하는데 중요한 역할을 수행하나, 힌지 도메인이 결실되면 Fab 절편을 형성하게 되고 1가(mono-valent) Fab를 생산할 수 있다. 또한, Fab 절편의 C_L 도메인에 대한 아미노산 'EC' 서열과 C_H1 도메인에 대한 아미노산 'CDK' 서열에서 시스테인이 연결되어 Fab를 형성하는 데 중요한 역할을 수행할 수 있다. 그러나, 시스테인은 약물 및 진단제가 결합된 치료제 및 진단제를 생산하기 위하여 말레이미드기(maleimide group)와 시스테인(cysteine) 간의 결합에 있어 약물 및 진단제 결합의 특이적-부위 결합에 방해를 줄 수 있으므로, 이를 제거하여 컨스트럭트를 제작하였다(도 1 및 표 2 내지 표 6 참조). 이러한, 시스테인을 제거한 V_H+C_H1 및 V_L+C_L은 각각 대장균에서 생산시 세포질에서 봉입체(inclusion body)로 생산되어 각각의 도메인을 1개의 세포에 주입하여 발현시킴으로 대량의 단백질을 얻을 수 있도록 하였다.

(2) 항체 절편 플랫폼인 단가 Fab를 APm이라 명명하고 Fab의 V_H+C_H1 및 V_L+C_L 도메인을 각각 클로닝하기 위해 트라스투주맙(Trastuzumab)의 아미노산 서열(표 1 참조)을 근거로 하여 V_H+C_H1 및 V_L+C_L의 아미노산 서열(표 2 및 표 3 참조)에 대한 DNA 염기서열을 코스모진텍에 의뢰하여 합성을 진행하였다. 표 1 내지 표 6의 서열 중 밑줄 부분은 가변 영역을 나타낸다. 이를 이용하여 V_H+C_H1 및 V_L+C_L 도메인에 해당하는 부위에 PCR 프라이머(표 7 참조)를 제작하고, V_H+C_H1 및 V_L+C_L을 각각 발현되도록 유전자를 클로닝하였으며, 이를 제한 효소 처리하여 대장균 발현(expression) 벡터인 pET21-a 벡터(Novagen)에 클로닝하였다.

<대조약(트라스투즈맙, Trastuzumab)의 아미노산 서열 및 염기 서열>

2) APm204 컨스트럭트(APm204: V _L , C _L +GGGS+SARAH)의 제조

(1) APm204는 항체 구성 도메인 중 V_L-C_L(light chain constant region: 경쇄 불변 영역) 도메인에 이중체화 도메인인 SARAH 도메인을 C-말단에 삽입하여 이황화결합에 의한 가변적 이중화(dimerization)를 탈피한 안정적인 동형이량체(homodimer)이다. 또한, 상기 컨스트럭트는 안정성 뿐만 아니라 동시에 역방향으로 이중화하여 서로 항원에 대한 결합력을 저해시키지 않는 2가(di-valent) Fab용 컨스트럭트이다. SARAH 도메인에 의한 역방향 중합체을 형성하기 위하여 C_L 도메인의 아미노산 'EC' 서열을 삽입하지 않고, 말단에 'GGGS(4개의 아미노산)' 서열을 삽입하고, 그뒤에 SARAH 도메인을 삽입하여, 접힘(folding)에 대한 항원 결합의 영향을 최소화하려 하였다(표 4 참조).

이로써, 약물 또는 진단제를 접합(conjugation)하여 치료제 또는 진단제를 생산하기 위하여 말레이미드기(maleimide group)와 시스테인의 결합 반응에서 비-특이적 부위 결합을 이룰 수 있는 잔기를 제거하여 컨스트럭트를 제작하였다. 컨스트럭트를 클로닝하기 위해 대장균 발현할 수 있는 코돈으로 변환하여 DNA 염기서열(표 4 참조)를 코스모진텍에 의뢰하여 합성을 진행하였다. 이를 주형으로 해당 부위 PCR 프라이머(표 7 참조)를 제작하고, SARAH 도메인을 삽입한 V_L+C_L-SARAH는 대장균에서 생산시 세포질에서 봉입체(inclusion body)로 발현되도록 각각을 클로닝하였다. 각각의 컨스트럭트를 1개의 세포에 주입하여 발현시킴으로 대량의 단백질을 얻을 수 있도록 하였다.

3) APm904 및 APm909 컨스트럭트(APm904: APm202-S127C, APm909: APm204-S127C)의 제조

(1) APm904(단량체, mono-valent, 표 5 참조) 및 APm909(이량체, di-valent, 표 6 참조)는 부위-특이적 접합을 위한 컨스트럭트 제작을 위하여, 지금까지 알려진 허셉틴(트라스투즈맙) 항체 절편의 분자 구조를 바탕으로 경쇄(light-chain)의 127번째 세린 잔기를 이황화결합에 필요한 시스테인 잔기로 치환한 V_L-C_L 도메인의 점돌연변이체이다. 이를 제작하기 위하여, APm202 및 APm204를 주형으로 점돌연변이체 제작용 프라이머(표 7 참조)를 사용하여 생산하였다.

컨스트럭트 프라이머	서열(5' → 3')
APm201_F(Nde1):	ggaattcCATATGGAAGTTCAGCTGGTTGAATC
APm201_R(Xho1):	ccgCTCGAGGCTTTTCGGCG
APm202_F(Nde1)	ggaattcCATATGGATATTCAGATGACCCAGAGCC
APm202_R(stop-Xho1)	ccgCTCGAGCTAGCCGCGGTTAAAGC
APm204_Lc_F(Nde1)	ggaattcCATATGGATATTCAGATGACCCAGAGCC
APm204_Sarah_R(stop-Xho1)	ccgCTCGAGCTATTTAGCGTCCATCG
APm904_F (Mutant)	GAGCGATGAACAGCTGAAATGCGGCACCGCGAGCGTGGTGTGC
APm904_R (Mutant)	GCACACCACGCTCGCGGTGCCGCATTTCAGCTGTTCATCGCTC

2. 각 컨스트럭트(APm201, APm202, APm204, APm904 및 APm909)의 대장균 발현 확인

각각의 컨스트럭트 유전자의 단백질 발현을 확인하기 위해 대장균 발현세포주인 BL21(DE3, pLysS) 세포에 42 ℃ 열 충격(heat shock)을 통해 형질 전환시켰다. LB배지에 1개 콜로니(single colony)를 접종하여 37 ℃에서 7시간 동안 배양한 후 0.5 mM IPTG를 처리하여 37 ℃에서 4시간 추가 배양 후 12 % SDS-PAGE를 통해 발현을 확인하였다.

발현 결과 모든 컨스트럭트가 각각 과발현됨을 확인하였다(도 4 참조).

3. 항체 절편의 배양 및 정제

1) APm201, APm202, APm204, APm904 및 APm909 항체 절편의 배양 및 정제

항체 절편의 정제를 위한 숙주세포는 T7 폴리머라제 과발현 재조합 단백질용 대장균인 BL21(DE3, pLysS)을 이용하였으며, 플라스미드는 pET21 벡터를 사용하여 각각의 도메인을 각각 발현하도록 하였고, 세포질에서 각각 봉입체(inclusion body) 형태로 항체 절편이 생성되도록 하였다.

각각의 단백질을 생산하기 위하여 씨드(seed) 배양에 사용한 배지는 Lysogeny Broth(LB)이며, 1개 콜로니(single colony)를 암피실린이 들어 있는 LB 배지에 접종하여 37 ℃에서 진탕 배양기를 이용하여 150 rpm에서 밤새 배양하였다. 이후 새로운 암피실린이 들어있는 1L TB 배지(Gellix)에 대략 0.5 ~ 2 %의 세포 배양 배지를 접종하여 150 rpm, 5시간 진탕 배양 후 OD₆₀₀ 값이 1 ~ 2사이에 도달했을 때 0.2 mM IPTG를 처리하여 37 ℃, 150 rpm에서 5시간 추가 배양하였다. 배양이 종료된 후 배양액은 4 ℃, 6000 rpm으로 원심 분리하여 침전물(pellet)을 얻었다. 이렇게 회수된 세포는 -80 ℃에 저장하여 사용하였다. 항체 절편이 발현된 세포에 배양 배지 1L 당 약 80 ㎖의 세포 용해 완충액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤, pH 7.4]을 첨가하여 세포와 혼합하였다. 이후 초음파 파쇄기를 이용하여 10분 동안(pulse on 1초, pulse off 1초) 세포를 용해하였다. 봉입체 상의 항체 절편 및 단백질들과 세포를 분리하기 위하여 원심분리기를 이용하여 4 ℃, 10,000 rpm의 속도로 40분 동안 원심분리를 실시하였다.

원심분리로 분리된 봉입체를 세척하기 위하여 배양 배지 기준으로 1L 당 150 ㎖의 완충액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.05 % Triton X-100]으로 1회 현탁하고 다시 침전물을 얻기 위하여 원심분리기를 이용하여 4 ℃, 10,000 rpm의 속도로 40분 동안 원심분리를 실시하였다. 이렇게 얻어진 항체 절편이 포함된 봉입체를 용융하기 위하여 세포 1L 당 용융 버퍼[8 M 우레아(urea) pH 8.0]를 이용하여 용융시킨 후 55 ℃에서 40분간 반응(incubation)시켜 안정화시킨 후 다시 용융되지 않은 물질을 제거하기 위하여 4 ℃, 10,000 rpm의 속도로 40분 동안 추가 원심분리를 실시하였다. 8 M 우레아에서 용융된 상태로 얻어진 항체절편 중에서 APm202, APm904 및 APm909는 8 M 우레아에 용융된 상태로 V_H-C_H1 도메인과의 재결합에 이용하였고, APm201은 정제 과정을 거친 후 V_L-C_L과 재결합에 이용하였다.

8 M 우레아에서 용융된 APm201 수용액에서 항체 절편만을 정제하기 위하여 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 개방형 컬럼(open column)에 APm201의 C-말단에 있는 6his와 결합할 수 있는 NI-NTA 레진을 충진하고, 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤]의 5 CV(5배의 column volume)로 평형 상태가 되도록 하였다. APm201 수용액을 흘려줌으로써 레진과 항체 절편이 결합하도록 한 후, 5 CV의 세척 완충액(8 M 우레아 pH 8.0)을 흘려준 후 다시 5 CV의 4 M 우레아 세척 완충액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 4 M 우레아, 70 mM 이미다졸]을 흘려주어 비특이적으로 결합한 불순물들을 제거하고 우레아 농도를 낮췄다. Ni-NTA 레진으로부터 APm201 항체 절편을 분리하기 위해 용출 완충액[elution buffer; 50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 4 M 우레아, 500 mM 이미다졸]을 흘려주었다. 실험 결과에서와 같이 APm201, APm904 및 APm909 컨스트럭트를 pET21 벡터에서 발현한 결과, 항체 절편은 봉입체 형태로 발현됨을 확인하였다(도 5 참조).

2) APm201 및 APm202의 재결합을 통한 APm208의 생산

우레아에 용융된 항체 절편의 재결합을 위하여 APm201(V_H+C_H1) 및 APm202(V_L+C_L)을 각각 3 : 1 비율로 혼합한 후 최종 우레아의 농도가 0.5 M 이하가 되도록 희석 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤]으로 현탁한 후 APm201(V_H+C_H1)과 APm202(V_L+C_L)의 소수성 결합을 유도할 수 있도록 3일 동안 4 ℃에서 100 rpm 상에서 반응시켰다.

APm201(V_H+C_H1) 및 APm202(V_L+C_L)을 반응시킨 용액의 침전물을 제거하기 위하여 4 ℃, 10,000 rpm의 속도로 20분 동안 원심분리를 실시하여 침전물을 제거하였다. 또한, 수용성의 APm208을 생산하기 위하여 재결합되지 않은 부분을 제거하기 위하여 APm201의 C-말단에 있는 6his와 결합할 수 있는 NI-NTA 레진을 충진하고 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤]의 5 CV로 평형을 이룬 후 APm201(V_H+C_H1) 및 APm202(V_L+C_L)을 반응시킨 용액을 흘려줌으로써 레진과 APm201이 결합하도록 한 후, 5 CV의 세척 완충액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 70 mM 이미다졸]을 흘려주어 APm201에 결합하지 않은 APm202를 제거하였다. Ni-NTA 레진으로부터 APm201 및 APm208의 항체 절편을 분리하기 위해 용출 완충액[elution buffer; 50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 500 mM 이미다졸]을 흘려주었다. 실험결과에서 알 수 있듯이, APm201 및 APm202의 용액에서 소수성 결합을 통하여 APm208이 재결합됨을 확인하였다(도 6 참조)

3) APm201 및 APm204의 재결합을 통한 APd212의 생산

우레아에 용융된 항체 절편의 재결합을 위하여 APm201(V_H+C_H1) 및 APm204(V_L+C_L+SARAH)을 각각 1 : 3 비율로 혼합한 후 최종 우레아의 농도가 0.5 M 이하가 되도록 희석 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤]으로 현탁한 후 APm201(V_H+C_H1)과 APm204(V_L+C_L+SARAH)의 소수성 결합을 유도할 수 있도록 3일 동안 4 ℃에서 100 rpm 상에서 반응시켰다.

APm201(V_H+C_H1) 및 APm204(V_L+C_L+SARAH)을 반응시킨 용액의 침전물을 제거하기 위하여 4 ℃, 10,000 rpm의 속도로 20분 동안 원심분리를 실시하여 침전물을 제거하였다. 또한, 수용성의 APd212를 생산하기 위하여 재결합되지 않은 부분을 제거하기 위하여 APm201(V_H+C_H1)의 C-말단에 있는 6his와 결합할 수 있는 NI-NTA 레진을 충진하고, 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤]의 5 CV로 평형을 이룬 후 APm201(V_H+C_H1) 및 APm204(V_L+C_L+SARAH)을 반응시킨 용액을 흘려줌으로써 레진과 APm204이 결합하도록 한 후, 5 CV의 세척 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 70 mM 이미다졸]을 흘려주어 APm201에 결합하지 않은 APm204를 제거하였다. Ni-NTA 레진으로부터 APm201 및 APd212의 항체절편을 분리하기 위해 용출 완충액[elution buffer; 50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 500 mM 이미다졸)을 흘려주었다. 실험결과에서 알 수 있듯이, APm201 및 APm204의 용액에서 소수성 결합을 통하여 APd212가 재결합됨을 확인하였다(도 6 참조).

4) APm201 및 APm904의 재결합을 통한 부위-특이적 1가 항체 절편 APm914의 생산

우레아에 용융된 항체 절편의 재결합을 위하여 APm201(V_H+C_H1) 및 APm904(V_L+sC_L)을 각각 1 : 3 비율로 혼합한 후 최종 우레아의 농도가 0.5 M 이하가 되도록 희석 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤]으로 현탁한 후 APm201(V_H+C_H1)과 APm904(V_L+sC_L)의 소수성 결합을 유도할 수 있도록 3일 동안 4 ℃에서 100 rpm 상에서 반응시켰다.

APm201(V_H+C_H1) 및 APm904(V_L+sC_L)을 반응시킨 용액의 침전물을 제거하기 위하여 4 ℃, 10,000 rpm의 속도로 20분 동안 원심분리를 실시하여 침전물을 제거하였다. 또한, 수용성의 APm914를 생산하기 위하여 재결합되지 않은 부분을 제거하기 위하여 APm201의 C-말단에 있는 6his와 결합할 수 있는 NI-NTA 레진을 충진하고 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤]의 5 CV로 평형을 이룬 후 APm201(V_H+C_H1) 및 APm904(V_L+sC_L)을 반응시킨 용액을 흘려줌으로써 레진과 APm201이 결합하도록 한 후, 5 CV의 세척 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 70 mM 이미다졸]을 흘려주었다. Ni-NTA 레진으로부터 APm201(V_H+C_H1) 및 APm914의 항체 절편을 분리하기 위해 용출 완충액[elution buffer; 50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 500 mM 이미다졸]을 흘려주었다. 실험결과에서 알 수 있듯이, APm201(V_H+C_H1) 및 APm904(V_L+sC_L)의 용액에서 소수성 결합을 통하여 부위-특이적 1가성 항체 절편 APm914가 재결합됨을 확인하였다(도 6 참조).

5) APm201 및 APm909의 재결합을 통한 부위-특이적 2가 항체 절편 APd924의 생산

우레아에 용융된 항체 절편의 재결합을 위하여 APm201(V_H+C_H1) 및 APm909(V_L+sC_L+SARAH)를 각각 1 : 3 비율로 혼합한 후 최종 우레아의 농도가 0.5 M 이하가 되도록 희석 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤]으로 현탁한 후 APm201(V_H+C_H1)과 APm909(V_L+sC_L+SARAH)의 소수성 결합을 유도할 수 있도록 3일 동안 4 ℃에서 100 rpm 상에서 반응시켰다.

APm201(V_H+C_H1) 및 APm909(V_L+sC_L+SARAH)를 반응시킨 용액의 침전물을 제거하기 위하여 4 ℃, 10,000 rpm의 속도로 20분 동안 원심분리를 실시하여 침전물을 제거하였다. 또한, 수용상의 APd924를 생산하기 위하여 재결합되지 않은 부분을 제거하기 위하여 APm201의 C-말단에 있는 6his와 결합할 수 있는 NI-NTA 레진을 충진하고 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤]의 5 CV로 평형을 이룬 후 APm201(V_H+C_H1) 및 APm909(V_L+sC_L+SARAH)를 반응시킨 용액을 흘려줌으로써 레진과 APm201이 결합하도록 한 후, 5 CV의 세척 완충용액[50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 70 mM 이미다졸]을 흘려주었다. Ni-NTA 레진으로부터 APm201(V_H+C_H1) 및 APd924의 항체 절편을 분리하기 위해 용출 완충액[elution buffer; 50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 500 mM 이미다졸)을 흘려주었다. 실험결과에서 알 수 있듯이, APm201(V_H+C_H1) 및 APm909(V_L+sC_L+SARAH)의 용액에서 소수성 결합을 통하여 부위-특이적 2가성 항체절편 APd924이 재결합됨을 확인하였다(도 6 참조).

4. APm208, APd212 APm914 및 APd924의 균질성 확인

재접힘 및 재조합 항체 절편 APm208, APd212 APm914 및 APd924의 균질성을 확인하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. AKTA 프라임 FPLC 시스템에 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 컬럼(GE Healthcare)을 연결하고 평형 완충액(PBS pH 7.2)을 흘려주어 평형상태가 되도록 하였다. 재조합 과정에서 용출된 항체 절편 수용액을 컬럼에 흘려주었고, 보유 용량(retention volume)은 1가 절편 APm208 및 APm914는 약 85 ㎖, 2가 절편 APd212 및 APd924는 약 68 ㎖로 측정되었다. 크로마토그램에서 항체 절편을 나타내는 280 ㎚ 흡광도 및 SDS-PAGE 실험 결과로 미루어 보아, 항체 절편의 균질성이 매우 높은 것으로 확인되었다(도 7 참조).

5. 부위-특이적 항체 절편에 대한 DBCO-말레이미드(maleimide) 결합 확인

PBS에 녹여진 부위-특이적 항체 절편 APm914(mono-valent)와 APd924(di-valent) 및 대조군 항체절편 APm208(mono-valent)과 APd212(di-valent)을 각각 100 μM로 준비하였다. DBCO-말레이미드를 DBCO(dibenzocyclooctyne) 용매에 녹인 저장액(stock solution)을 준비하였다. 단백질 대비 DBCO-말레이미드 저장액을 몰랄 농도 1 : 4 비율로 혼합한 후, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 부위-특이적 항체 절편 APm914 및 APd924에 대한 DBCO-말레이미드의 결합 여부를 확인하기 위하여, 상기의 반응물에 DMSO에 녹아있는 5/6-카복실로다민 110-PEG3-아자이드(5/6-Carboxylrhodamine 110-PEG3-Azide) 저장액을, 단백질 몰랄 농도 대비 1 : 4 비율로 혼합한 다음 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 12 % 아크릴아마이드 젤에 로딩하여 SDS-PAGE로 내린 후, 형광판으로 부위-특이적 항체 절편-DBCO_말레이미드-5/6-카복실로다민 110-PEG3-아자이드 복합체를 확인하고, 쿠마시 염색으로 단백질 밴드를 추가 확인하였다.

그 결과, 부위-특이적 자유-시스테인 잔기가 삽입된 APm914 및 PAd924의 경쇄 영역(V_L-sC_L)의 밴드에서만 형광을 나타내는 것으로 알 수 있듯이, DBCO-말레이미드 기와 1가 및 2가성 부위-특이적 항체 절편의 접합이 이루어졌음을 확인하였다(도 8 참조).

6. 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용한 sHER2-결합 친화도 측정

96-웰 ELISA 플레이트에 항원 sHER2(exrecellular domain) 100 ng/웰을 넣고 4 ℃에서 밤새 반응시켜 플레이트 표면에 항원을 고정화시킨 다음, 상층액을 제거하고 블로킹 용액(Sigma, B6429-500ML) 200 ㎕를 각 웰에 분주하여 4 ℃에서 밤새 블로킹하였다. 검정곡선을 얻기 위한 표준물질인 트라스투주맙과 정제된 항체 절편을 0 - 125 ng/㎖의 농도가 되도록 PBS를 이용하여 희석하였다. 이를 각각 100 ㎕씩 분주한 뒤 실온에서 1시간 동안 반응하여 항원과 결합하도록 하고, 반응이 끝난 후 PBST(PBS, 0.05 % tween 20, pH 7.4)로 3회 세척하였다. 항-인간 IgG(Sigma, I5260)를 1/1,000 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 상층액을 제거하고 PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체 항-고트 IgG-퍼옥시다제(Sigma, A5420)를 1/3,000 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상층액을 제거하고 PBST로 3회 세척한 후, TMB 발색시약을 100 ㎕씩 분주하였다. 발색된 웰에 1 M의 H₂SO₄를 100 ㎕씩 넣어 반응을 중지시키고, 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 450 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정한 결과를 도 9에 나타내었다.

트라스투주맙 대비 결합 친화도를 백분율로 환산한 결과, 부위-특이적 1가 APm914가 104 % 및 2가 APd924가 94.3 %인 것으로 확인되었으며, 이는 HER2에 대한 부위-특이적 항체 절편의 활성이 충분히 유지됨을 뜻한다.

<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> Novel site-specific antibody fragment platform <130> P190127 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HER2 Light chain <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 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Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 3 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HER2 Light chain <400> 3 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcca ggatgtgaac accgcggtgg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactgct gatttatagc gcgagctttc tgtatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagccgcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcag cattatacca ccccgccgac ccttggccag 300 ggcaccaaag tggaaattaa acgcaccgtg gcggcgccga gcgtgtttat ttttccgccg 360 agcgatgaac agctgaaaag cggcaccgcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420 ccgcgcgaag cgaaagtgca gtggaaagtg gataacgcgc tgcagagcgg caacagccag 480 gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctata gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcagggc 600 ctgagcagcc cggtgaccaa aagctttaac cgcggcgaat gc 642 <210> 4 <211> 1352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HER2 Heavy chain <400> 4 gaagttcagc tggttgaatc tggcggcggt ctggttcaac cgggcggttc cctgcgcctg 60 tcttgcgcag cgtcaggctt taacatcaaa gatacctaca tccactgggt tcgccaggcg 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggtggctcgc atctacccga ccaacggcta tacccgttat 180 gctgacagcg ttaaaggccg cttcaccatt agcgcggata ccagtaaaaa tacggcatac 240 ctgcaaatga actcgttacg cgcggaagac accgcggtgt actactgctc ccgctggggc 300 ggggatggct tctacgcaat ggattactgg ggtcagggca cgctggtcac agtctccagc 360 gcctcgacaa aaggcccgag cgtgttcccg ctggcgcctt ccagcaaaag cacctcaggg 420 ggcacagctg cgctgggttg cctggtgaaa gactacttcc cggaaccggt taccgtttcc 480 tggaacagcg gtgctctgac cagcggcgtt cacaccttcc cggctgttct gcaaagttcc 540 ggcctgtact ctctgagctc tgtggtgacc gtgccgtctt cttctctggg gacccagact 600 tacatttgca acgtgaacca caaaccgtca aacaccaaag ttgataaaaa agtggagccg 660 ccgaaaagct gcgataaaac ccatacctgc ccgccgtgcc cgggccggaa ctgctgggcg 720 gcccgagcgt gtttctgttt ccgccgaaac cgaaagatac cctgatgatt agccgcaccc 780 cggaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtga gccatgaaga tccggaagtg aaatttaact 840 ggtatgtgga tggcgtggaa gtgcataacg cgaaaaccaa accgcgcgaa gaacagtata 900 acagcaccta tcgcgtggtg agcgtgctga ccgtgctgca tcaggattgg ctgaacggca 960 aagaatataa atgcaaagtg agcaacaaag cgctgccggc gccgattgaa aaaaccatta 1020 gcaaagcgaa aggccagccg cgcgaaccgc aggtgtatac cctgccgccg agccgcgatg 1080 aactgaccaa aaaccaggtg agcctgacct gcctggtgaa aggcttttat ccgagcgata 1140 ttgcggtgga atgggaaagc aacggccagc cggaaaacaa ctataaaacc accccgccgg 1200 tgctggatag cgatggcagc ttttttctgt atagcaaact gaccgtggat aaaagccgct 1260 ggcagcaggg caacgtgttt agctgcagcg tgatgcatga agcgctgcat 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cacctcaggg 60 ggcacagctg cgctgggttg cctggtgaaa gactacttcc cggaaccggt taccgtttcc 120 tggaacagcg gtgctctgac cagcggcgtt cacaccttcc cggctgttct gcaaagttcc 180 ggcctgtact ctctgagctc tgtggtgacc gtgccgtctt cttctctggg gacccagact 240 tacatttgca acgtgaacca caaaccgtca aacaccaaag ttgataaaaa agtggagccg 300 ccgaaaagc 309 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal <400> 10 ctcgagcacc accaccacca ccac 24 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Leu Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 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<210> 20 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARAH <400> 20 gattttgact tcctgaaaaa cctgagttta gaagaactgc agatgcgtct gaaagcactg 60 gacccgatga tggaacgtga aatcgaagag ctgcgtcagc gttacaccgc caaacgtcag 120 ccgattctgg acgcgatgga cgctaaa 147

Claims

HER2(human epidermal growth factor receptor 2)에 특이적으로 결합하며 다음의 영역을 포함하는 Fab(Fragment antigen-binding) 절편:
(a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H);
(b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(C_H1);
(c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L); 및
(d) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 부위-특이적 경쇄 불변 영역(sC_L).
제1항에 있어서, 상기 Fab 절편이 1가(mono-valent) 항체 절편 또는 2가(di-valent) 항체 절편인 것을 특징으로 하는 Fab 절편.
제2항에 있어서, 상기 2가(di-valent) 항체 절편이 경쇄 불변 영역(C_L)의 C-말단에 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 링커 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 SARAH 도메인을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 Fab 절편.
제2항에 있어서, 상기 2가(di-valent) 항체 절편이 SARAH 도메인간의 소수성 결합을 통해 재결합되는 것을 특징으로 하는 Fab 절편.
HER2(human epidermal growth factor receptor 2)에 특이적으로 결합하는 Fab 절편을 제조하기 위한 다음을 포함하는 발현 컨스트럭트:
(a) 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)-코딩 핵산 분자 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(C_H1)-코딩 핵산 분자를 포함하는 중쇄-발현 컨스트럭트; 및
(b) 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)-코딩 핵산 분자 및 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 부위-특이적 경쇄 불변 영역(sC_L)-코딩 핵산 분자를 포함하는 경쇄-발현 컨스트럭트.
제5항의 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터.
제6항의 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
제7항에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
(ⅰ) 상기 제7항의 숙주 세포를 배양하는 단계;
(ⅱ) 상기 배양된 숙주 세포에서 부위-특이적 경쇄 불변 영역(sC_L)을 포함하는 Fab 절편을 발현시키는 단계; 및
(ⅲ) 상기 발현된 Fab 절편을 재결합시키는 단계
를 포함하는, HER2(human epidermal growth factor receptor 2)에 특이적으로 결합하는 Fab 절편의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 Fab 절편을 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
제10항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 담낭암, 담관암종, 방광암, 난소암, 자궁암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 비인두암, 후두암, 결장암, 흑색종, 자궁내막암, 자궁경부암, 간암, 폐암, 두경부암, 식도암 및 위암으로 이루어지는 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.