CN110709419B - Erbb2抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了包含能特异性结合受体酪氨酸蛋白激酶ErbB‑2(ErbB2)的抗原结合片段的结合蛋白、编码所述结合蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述结合蛋白的药物组合物以及使用所述结合蛋白的方法。所述结合蛋白可被用于治疗其中ErbB2活性是有害的疾病或病症，或与另一种ErbB2抗体(如曲妥珠单抗)协同作用抑制ErbB2阳性细胞或肿瘤的生长。所述结合蛋白还可被用于增强试剂或另一种ErbB2抗体(例如曲妥珠单抗)内化至ErbB2阳性细胞内。

Description

ERBB2抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年1月6日递交的美国临时申请第62/443,078号的优先权，其全部公开内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文中。
发明领域
本发明总体上涉及ErbB2抗体及其单独或与其他ErbB2抗体(例如，曲妥珠单抗)组合在例如人类癌症治疗中的用途。
发明背景
受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-2(ErbB2)是表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员，所述表皮生长因子受体(EGFR)家族还包括EGFR、ErbB3和ErbB4(Akiyama等人,Arch BiochemBiophys 245,531-6(1986)；Rubin和Yarden,Ann Oncol.12Suppl 1:S3-82001(2001))。ErbB2也经常被称为人表皮生长因子受体2(HER2)，并且在科学文献中可互换使用。这四种受体中的每种都含有胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其包含酪氨酸激酶结构域，并且其C端与大量信号传导分子相互作用，并且展现出配体依赖性的和配体非依赖性的生物活性(Marmor等人,Int J Radiat Oncol Biol Phys 58,903-13(2004))。HER2与任何EGFR成员(即EGFR、ErbB3和ErbB4)异源二聚化，并且被认为是其他ErbB受体的优选二聚化配偶体。在被反式激活后，ErbB2激活几个下游信号传导级联放大(包括Ras-丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和PI3K-mTOR级联放大)，以促进细胞增殖和逃避细胞凋亡(在Citri等人,Nat Rev Mol Cell Biol 7:505-16(2006)中有综述)。ErbB2在正常成人组织中适度表达，其中它调节细胞生长和分化。已在20％-30％的乳腺癌、胃癌和卵巢癌中报道了ErbB2蛋白的基因扩增和过表达(King等人,Cancer Res 49:4185-91(1989)；Slamon等人,Science235:177-82(1987)；Koeppen等人,Histopathology 38,96-104(2001))。通常，erbB2基因扩增与更大的转移潜力和不良预后相关。由于它在正常组织中的表达水平相对低，因此ErbB2是靶向治疗的有吸引力的靶标(Drebin等人,Proc Natl Acad Sci USA 83:9129-33(1986))。
曲妥珠单抗(CAS 180288-69-1，Genentech)是鼠HER2抗体的重组人源化的单克隆抗体形式，其在基于细胞的测定中以高亲和力(Kd＝5nM)与人ErbB2胞外结构域选择性结合的(Carter等人,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9(1992))。在体外测定和小鼠异种移植肿瘤模型中均已显示曲妥珠单抗抑制过表达ErbB2的人肿瘤细胞的增殖(Hudziak等人,Mol Cell Biol 9,1165-1172(1989)；Lewis等人,Immunol Immunother 37,255-263(1993))。除了对肿瘤细胞的直接影响外，还提出了几种作用机制，包括免疫机制，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)(在Ben-Kasus等人,Mol Cell Biol 9,1165-1172(2007)中有综述)。曲妥珠单抗于1998年被批准用于治疗在大量的先前抗癌疗法后已经发展的ErbB2过表达(也被称为HER2阳性的或HER2阳性转移性乳腺癌(MBC))的患者(Baselga等人,J Clin Oncol 14,737-744(1996)；Slamon等人,N Engl J Med 344,783-792(2001))。然而，患者对曲妥珠单抗单一疗法的应答相对低(大约15％)并且为短暂的(中值持续时间为9个月)(Cobleigh等人,Clin Oncol17:2639-48(1999))。另一方面，曲妥珠单抗当与化学疗法组合时似乎展现出协同效应，可能是由于ErbB2驱动的存活通路的中断(Arteaga等人,Cancer Res 54:3758-65(1994))。尽管曲妥珠单抗为HER2阳性肿瘤患者提供了明显优于单独化学疗法的结果，但是几乎所有经治疗的患者最终将会在可用的疗法上发展。对于过表达HER2的癌症患者，仍然有机会改善结果。
一种抗体靶向治疗的方法是利用抗体将细胞毒性药物特异性地递送至表达抗原的癌症细胞。由与曲妥珠单抗连接的美登木素DM1组成的抗体-药物缀合物(ADC)(可被称为“免疫毒素类”)在HER2过表达的和曲妥珠单抗敏感的或曲妥珠单抗抗性的肿瘤细胞系以及人乳腺癌的异种移植模型中显示出有效的抗肿瘤活性。曲妥珠单抗-MCC-DM1(T-DM1)被批准用于其疾病对HER2定向疗法难以治疗的患者(Beeram等人,Cancer 118,5733-5740(2007))。然而，当被用作HER2+转移性乳腺癌(MBC)患者的一线疗法时，T-DM1未显示优于曲妥珠单抗的优势。
一种可选的方法是组合疗法，其具有以下优势：(i)降低发展抗性的频率，(ii)降低具有非重叠毒性和类似治疗特征的药物剂量，并因此增大治疗指数，(iii)通过使用另一种的药物来使细胞对一种药物敏感，以及(iv)通过利用两种药物对生物活性的加性或协同作用来实现增强的功效(Pegram等人,Oncogene 18:2241-2251(1999)；Konecny等人，Breast Cancer Res.and Treatment 67:223-233(2001)；Pegram等人,J.of theNat.Cancer Inst.96(10):739-749(2004))。
已经报道了用于针对癌症的组合疗法的HER2二聚化抑制剂抗体和EGFR抑制剂(US2007/0020261)。已经证明单独的帕妥珠单抗在MBC患者中具有治疗活性。另外，已表明帕妥珠单抗用于与曲妥珠单抗和多西他赛组合，用于治疗未接受过针对转移性疾病的先前的抗ErbB2疗法或化学疗法的HER2阳性转移性乳腺癌(MBC)患者(Baselga等人,J Clin Oncol 28,1138-1144,(2010))。
仍然需要当单独使用或与诸如曲妥珠单抗的其他治疗剂组合使用(优选协同性地)时，对HER2阳性肿瘤细胞具有治疗效应的新的ErbB2抗体。
发明概述
本发明涉及5种抗HER2抗体(4C9、4H2、4G6、5H12和5G9)及相关的结合蛋白、多核苷酸、载体和药物组合物，以及它们的用途。术语“ErbB2抗体”、“HER2抗体”、“抗ErbB2抗体”和“抗HER2抗体”在本文中可互换使用，并且是指与ErbB2或HER2特异性结合的抗体。
提供了结合蛋白。所述结合蛋白包含与受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-2(ErbB2)特异性结合的抗原结合片段。所述抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:17-51和56-160的至少一种氨基酸序列。
抗原结合片段可包含至少一个由选自SEQ ID NO:17-51的氨基酸序列组成的可变结构域。
抗原结合片段可包含选自以下的两个可变结构域：SEQ ID NO:17和18；SEQ IDNO:19和20；SEQ ID NO:21和22；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:25和26；SEQ ID NO:27和32；SEQ ID NO:27和33；SEQ ID NO:27和34；SEQ ID NO:27和35；SEQ ID NO:27和36；SEQ IDNO:27和37；SEQ ID NO:27和38；SEQ ID NO:28和32；SEQ ID NO:28和33；SEQ ID NO:28和34；SEQ ID NO:28和35；SEQ ID NO:28和36；SEQ ID NO:28和37；SEQ ID NO:28和38；SEQ IDNO:29和32；SEQ ID NO:29和33；SEQ ID NO:29和34；SEQ ID NO:29和35；SEQ ID NO:29和36；SEQ ID NO:29和37；SEQ ID NO:29和38；SEQ ID NO:30和32；SEQ ID NO:30和33；SEQ IDNO:30和34；SEQ ID NO:30和35；SEQ ID NO:30和36；SEQ ID NO:30和37；SEQ ID NO:30和38；SEQ ID NO:31和32；SEQ ID NO:31和33；SEQ ID NO:31和34；SEQ ID NO:31和35；SEQ IDNO:31和36；SEQ ID NO:31和37；SEQ ID NO:31和38；SEQ ID NO:39和45；SEQ ID NO:39和46；SEQ ID NO:39和47；SEQ ID NO:39和48；SEQ ID NO:39和49；SEQ ID NO:39和50；SEQ IDNO:39和51；SEQ ID NO:40和45；SEQ ID NO:40和46；SEQ ID NO:40和47；SEQ ID NO:40和48；SEQ ID NO:40和49；SEQ ID NO:40和50；SEQ ID NO:40和51；SEQ ID NO:41和45；SEQ IDNO:41和46；SEQ ID NO:41和47；SEQ ID NO:41和48；SEQ ID NO:41和49；SEQ ID NO:41和50；SEQ ID NO:41和51；SEQ ID NO:42和45；SEQ ID NO:42和46；SEQ ID NO:42和47；SEQ IDNO:42和48；SEQ ID NO:42和49；SEQ ID NO:42和50；SEQ ID NO:42和51；SEQ ID NO:43和45；SEQ ID NO:43和46；SEQ ID NO:43和47；SEQ ID NO:43和48；SEQ ID NO:43和49；SEQ IDNO:43和50；SEQ ID NO:43和51；SEQ ID NO:44和45；SEQ ID NO:44和46；SEQ ID NO:44和47；SEQ ID NO:44和48；SEQ ID NO:44和49；SEQ ID NO:44和50；以及SEQ ID NO:44和51。
抗原结合片段可包含至少一个由选自SEQ ID NO:56-160的氨基酸序列组成的互补决定区(CDR)。
抗原结合片段可包含至少一个3个CDR的集合，其中至少一个CDR集合选自4C9 VH集合、4C9 VL集合、4H2 VH集合、4H2 VL集合、4G6VH集合、4G6 VL集合、5F12 VH集合、5F12VL集合、5G9 VH集合、5G9 VL集合、5F12.VH.V1集合、5F12.VH.1集合、5F12.VH.2集合、5F12.VH.3集合、5F12.VH.4集合、5F12.VL.V1集合、5F12.VL.1集合、5F12.VL.2集合、5F12.VL.3集合、5F12.VL.4集合、5F12.VL.5集合、5F12.VL.6集合、5G9.VH.V1集合、5G9.VH.1集合、5G9.VH.2集合、5G9.VH.3集合、5G9.VH.4集合、5G9.VH.5集合、5G9.VL.V1集合、5G9.VL.1集合、5G9.VL.2集合、5G9.VL.3集合、5G9.VL.4集合、5G9.VL.5集合和5G9.VL.6集合。
抗原结合片段可包含两个3个CDR的CDR集合，并且其中两个CDR集合选自：4C9 VH集合和4C9 VL集合；4H2 VH集合和4H2 VL集合；4G6 VH集合和4G6 VL集合；5F12 VH集合和5F12 VL集合；5G9 VH集合和5G9 VL集合；5F12.VH.V1集合和5F12.VL.V1集合；5F12.VH.1集合和5F12.VL.V1集合；5F12.VH.2集合和5F12.VL.V1集合；5F12.VH.3集合和5F12.VL.V1集合；5F12.VH.4集合和5F12.VL.V1集合；5F12.VH.V1集合和5F12.VL.1集合；5F12.VH.1集合和5F12.VL.1集合；5F12.VH.2集合和5F12.VL.1集合；5F12.VH.3集合和5F12.VL.1集合；5F12.VH.4集合和5F12.VL.1集合；5F12.VH.V1集合和5F12.VL.2集合；5F12.VH.1集合和5F12.VL.2集合；5F12.VH.2集合和5F12.VL.2集合；5F12.VH.3集合和5F12.VL.2集合；5F12.VH.4集合和5F12.VL.2集合；5F12.VH.V1集合和5F12.VL.3集合；5F12.VH.1集合和5F12.VL.3集合；5F12.VH.2集合和5F12.VL.3集合；5F12.VH.3集合和5F12.VL.3集合；5F12.VH.4集合和5F12.VL.3集合；5F12.VH.V1集合和5F12.VL.4集合；5F12.VH.1集合和5F12.VL.4集合；5F12.VH.2集合和5F12.VL.4集合；5F12.VH.3集合和5F12.VL.4集合；5F12.VH.4集合和5F12.VL.4集合；5F12.VH.V1集合和5F12.VL.5集合；5F12.VH.1集合和5F12.VL.5集合；5F12.VH.2集合和5F12.VL.5集合；5F12.VH.3集合和5F12.VL.5集合；5F12.VH.4集合和5F12.VL.5集合；5F12.VH.V1集合和5F12.VL.6集合；5F12.VH.1集合和5F12.VL.6集合；5F12.VH.2集合和5F12.VL.6集合；5F12.VH.3集合和5F12.VL.6集合；5F12.VH.4集合和5F12.VL.6集合；5G9.VH.V1集合和5G9.VL.V1集合；5G9.VH.1集合和5G9.VL.V1集合；5G9.VH.2集合和5G9.VL.V1集合；5G9.VH.3集合和5G9.VL.V1集合；5G9.VH.4集合和5G9.VL.V1集合；5G9.VH.5集合和5G9.VL.V1集合；5G9.VH.V1集合和5G9.VL.1集合；5G9.VH.1集合和5G9.VL.1集合；5G9.VH.2集合和5G9.VL.1集合；5G9.VH.3集合和5G9.VL.1集合；5G9.VH.4集合和5G9.VL.1集合；5G9.VH.5集合和5G9.VL.1集合；5G9.VH.V1集合和5G9.VL.2集合；5G9.VH.1集合和5G9.VL.2集合；5G9.VH.2集合和5G9.VL.2集合；5G9.VH.3集合和5G9.VL.2集合；5G9.VH.4集合和5G9.VL.2集合；5G9.VH.5集合和5G9.VL.2集合；5G9.VH.V1集合和5G9.VL.3集合；5G9.VH.1集合和5G9.VL.3集合；5G9.VH.2集合和5G9.VL.3集合；5G9.VH.3集合和5G9.VL.3集合；5G9.VH.4集合和5G9.VL.3集合；5G9.VH.5集合和5G9.VL.3集合；5G9.VH.V1集合和5G9.VL.4集合；5G9.VH.1集合和5G9.VL.4集合；5G9.VH.2集合和5G9.VL.4集合；5G9.VH.3集合和5G9.VL.4集合；5G9.VH.4集合和5G9.VL.4集合；5G9.VH.5集合和5G9.VL.4集合；5G9.VH.V1集合和5G9.VL.5集合；5G9.VH.1集合和5G9.VL.5集合；5G9.VH.2集合和5G9.VL.5集合；5G9.VH.3集合和5G9.VL.5集合；5G9.VH.4集合和5G9.VL.5集合；5G9.VH.5集合和5G9.VL.5集合；5G9.VH.V1集合和5G9.VL.6集合；5G9.VH.1集合和5G9.VL.6集合；5G9.VH.2集合和5G9.VL.6集合；5G9.VH.3集合和5G9.VL.6集合；5G9.VH.4集合和5G9.VL.6集合；以及5G9.VH.5集合和5G9.VL.6集合。
抗原结合片段可包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1选自：SEQ ID NO:56、62、68、74、80、86、89、92、95、98、122、125、128、131、134和137；CDR-H2选自：SEQ ID NO:57、63、69、75、81、87、90、93、96、99、123、126、129、132、135和138；CDR-H3选自：SEQ ID NO:58、64、70、76、82、88、91、94、97、100、124、127、130、133、136和139；CDR-L1选自：SEQ ID NO:59、65、71、77、83、101、104、107、110、113、116、119、140、143、146、149、152、155和158；CDR-L2选自：SEQ ID NO:60、66、72、78、84、102、105、108、111、114、117、120、141、144、147、150、153、156和159；并且CDR-L3选自：SEQ ID NO:61、67、73、79、85、103、106、109、112、115、118、121、142、145、148、151、154、157和160。
结合蛋白还可包含人受体框架序列。所述人受体框架序列可包含选自SEQ ID NO:3-10的氨基酸序列。人受体框架序列可包含选自SEQ ID NO:3-10和161-166的氨基酸序列。人受体框架序列在关键残基处可包含至少一个框架区氨基酸取代，并且所述关键残基选自：与CDR相邻的残基；糖基化位点残基；稀有残基；能够与人ErbB2相互作用的残基；能够与CDR相互作用的残基；典型残基；重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；游标区内的残基；以及在Chothia限定的可变重链CDR1和Kabat限定的第一重链框架之间重叠区域内的残基。
当结合蛋白包含在关键残基处含有至少一个框架区氨基酸取代的人受体框架序列时，所述结合蛋白还可包含共有人可变结构域序列。
当人受体框架包含至少一个框架区氨基酸取代时，人受体框架可由与人种系受体框架的序列至少约65％相同的氨基酸序列组成，并且包含与人种系受体框架相同的至少70个氨基酸残基。所述结合蛋白可选自：免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR接枝的抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、单结构域抗体、双链抗体(diabody)、多特异性的抗体、双重特异性抗体(a dual specific antibody)和双特异性抗体。
结合蛋白可以是抗体。抗体可选自单克隆抗体、全长四聚免疫球蛋白、IgG分子、lgG1分子、嵌合抗体、CDR接枝的抗体、人源化的抗体和亲和力成熟的抗体。在一个实施方案中，结合蛋白是人源化的抗体。在另一实施方案中，抗体是单克隆抗体。
术语“ErbB2介导的生物活性”和“ErbB2活性”在本文中可互换使用，并且是指在诸如细胞、组织、器官或对象或样品的生物***中由ErbB2引起或干扰的生物活性。在过表达ErbB2的细胞中，ErbB2介导的生物活性或ErbB2活性可能被上调。ErbB2介导的生物活性的实例包括其自身的同源二聚化、与EGFR或ErbB3或ErbB4的异源二聚化、受ErbB2调控的信号传导通路和ErbB2依赖性的细胞生长。样品可获自对象。细胞可在对象内。
对象可以是哺乳动物，例如，人类。对象可患有疾病或病症，其中ErbB2活性是有害的。如本文中所使用的术语“有害的”是指与未患疾病或病症的对照对象中的ErbB2活性相比，患有疾病或病症的对象中的ErbB2活性的改变。当在患有疾病或病症的对象中ErbB2活性为有害的时，ErbB2活性可能比未患疾病或病症的对照对象中的ErbB2活性高，例如，高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
结合蛋白可调节ErbB2介导的生物活性。如本文中所使用的“调节”是指增加或减少ErbB2介导的生物活性。当ErbB2介导的生物活性被改变时，结合蛋白可中和改变的ErbB2介导的生物活性。当ErbB2介导的生物活性被上调时，结合蛋白可以减少、抑制、阻断或拮抗上调的ErbB2介导的生物活性。结合蛋白可调节例如样品或细胞中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的ErbB2介导的生物活性。对于此类结合蛋白，提供了调节样品或细胞中的ErbB2介导的生物活性的方法。所述方法包括向具有ErbB2介导的生物活性的样品或细胞施用有效量的结合蛋白，由此调节ErbB2介导的生物活性，例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。提供了调节例如，样品、细胞或对象中的ErbB2介导的生物活性的药物。所述药物可包含有效量的结合蛋白和药学上可接受的载体。提供了制造药物的方法。制造方法包括将结合蛋白与药学上可接受的载体混合。
结合蛋白在与细胞接触后可被内化至ErbB2阳性细胞内。如本文所所用的术语“ErbB2阳性细胞”是指表达ErbB2的细胞。在一个实施方案中，ErbB2阳性细胞过表达ErbB2。此类结合蛋白可被用于抗体-药物缀合物(ADC)应用中。结合蛋白可具有至少约5％、10％、15％、20％、30％或50％的内化率。结合蛋白可以通过胞吞作用被内化。结合蛋白可以在与ErbB2的复合物中被内化。对于此类结合蛋白，提供了将结合蛋白内化至ErbB2阳性细胞中的方法。所述方法包括将细胞与有效量的结合蛋白接触，由此将结合蛋白内化至细胞内。细胞可在对象内。提供了用于将结合蛋白内化至ErbB2阳性细胞内的药物。所述药物可包含有效量的结合蛋白和药学上可接受的载体。提供了制造药物的方法。所述制造方法包括将结合蛋白与药学上可接受的载体混合。
结合蛋白在与细胞接触后，可以同时地或依次地一起增强另外的试剂内化至ErbB2阳性细胞内。所述增强可以为在预定时间段(例如在接触后约0.5、1、2、4、6、8、10、12、16或24小时)内的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。所述另外的试剂可以为能够结合ErbB2但不同于结合蛋白的抗体或其抗原结合片段。ErbB2可以为人ErbB2。所述另外的试剂可以包含曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合。结合蛋白可以在接触后2小时内将曲妥珠单抗内化至ErbB2细胞内增强至少约20％。
结合蛋白可以抑制ErbB2阳性细胞的生长。ErbB2细胞的生长可被抑制至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。ErbB2阳性细胞可以为BT474细胞。结合蛋白可以将BT474细胞的生长抑制至少约70％。
结合蛋白可以抑制ErbB2阳性肿瘤的生长，任选地与另外的ErbB2抗体协同作用。ErbB2阳性肿瘤的生长可被抑制至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。肿瘤可能对另外的ErbB2抗体具有抗性。结合蛋白和一起使用(同时地或依次地)的另外的ErbB2抗体对肿瘤生长的协同抑制可以比单独使用结合蛋白和另外的ErbB2抗体时的加性抑制多至少约5％、10％、20％、30％、40％或50％。另外的ErbB2抗体可以为曲妥珠单抗。结合蛋白当与曲妥珠单抗一起使用时可以将ErbB2阳性和曲妥珠单抗抗性的肿瘤的生长抑制至少约70％。
还提供了结合蛋白构建体。所述结合蛋白构建体包含本发明的结合蛋白和接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。免疫球蛋白恒定结构域可以为选自以下的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG4恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。免疫球蛋白恒定结构域可包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和它们的组合。在结合蛋白构建体中，结合蛋白可具有人糖基化模式。
还提供了结合蛋白缀合物。所述结合蛋白缀合物包含本发明的结合蛋白构建体和选自以下的试剂：显像剂、治疗剂、细胞毒素剂和免疫黏附分子。所述显像剂可选自：放射性同位素标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。所述试剂可选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝***剂、蒽环类药物、毒素和凋亡剂。在结合蛋白缀合物中，结合蛋白可具有人糖基化模式。结合蛋白缀合物可以为抗体缀合物。
结合蛋白缀合物在与细胞接触后可被内化至ErbB2阳性细胞内。结合蛋白缀合物可通过胞吞作用被内化。结合蛋白缀合物可在与ErbB2的复合物中被内化。对于此类结合蛋白缀合物，提供了将结合蛋白缀合物内化至ErbB2阳性细胞中的方法。所述方法包括使细胞与有效量的结合蛋白缀合物接触，由此将所述结合蛋白缀合物内化至细胞内。所述细胞可在对象内。提供了用于将结合蛋白缀合物内化至ErbB2阳性细胞内的药物。所述药物可包含有效量的结合蛋白缀合物和药学上可接受的载体。提供了制造药物的方法。所述制造方法包括将结合蛋白缀合物与药学上可接受的载体混合。
结合蛋白可作为晶体存在。所述晶体为无载体的药物控释晶体。结合蛋白晶体可具有比结合蛋白的可溶性对应物更大的体内半衰期。结合蛋白晶体可保留结合蛋白的非晶体形式的生物活性。
结合蛋白构建体可作为晶体存在。所述晶体为无载体的药物控释晶体。结合蛋白构建体晶体可具有比结合蛋白构建体的可溶性对应物更大的体内半衰期。结合蛋白构建体晶体可保留结合蛋白构建体的非晶体形式的生物活性。
结合蛋白缀合物可作为晶体存在。所述晶体为无载体的药物控释晶体。结合蛋白缀合物晶体可具有比结合蛋白缀合物的可溶性对应物更大的体内半衰期。结合蛋白缀合物晶体可保留结合蛋白缀合物的非晶体形式的生物活性。
对于本发明的每种结合蛋白，提供了编码所述结合蛋白的多核苷酸。还提供了包含所述多核苷酸的载体。所述载体可选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、NV和pBJ。
提供了包含本发明的载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核细胞。所述宿主细胞可以是大肠杆菌(Escherichia coli)。所述宿主细胞可以是真核细胞。所述真核细胞可以选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。所述动物细胞可以选自：哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞。所述哺乳动物细胞可以是CHO细胞或COS细胞。所述真菌细胞可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。所述昆虫细胞可以是Sf9细胞。
提供了产生本发明的结合蛋白的方法。所述方法包括在足以产生结合蛋白的条件下，于培养基中培养宿主细胞。所述宿主细胞包含含有编码结合蛋白的多核苷酸的载体。提供了根据该方法产生的结合蛋白。
提供了用于释放本发明的结合蛋白的释放组合物。所述组合物包含制剂和至少一种聚合物载体。所述制剂包含结晶的结合蛋白和成分。所述聚合物载体可以为选自以下的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(缩肽)、聚(酯类)、聚(乳酸)、聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)或PLGA、聚(b-羟基丁酸)、聚(己内酯)、聚(对二氧环己酮)、聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯类)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、马来酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、普朗尼克多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、低聚糖类、糖胺聚糖类(glycaminoglycans)、硫酸化多糖类，它们的混合物和共聚物。所述成分可选自：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。提供了用于在哺乳动物中从释放组合物中释放结合蛋白的方法。所述方法包括向哺乳动物施用有效量的释放组合物，由此在哺乳动物中释放结合蛋白。提供了制造释放组合物的方法。所述制造方法包括将制剂与至少一种聚合物载体混合。
包含本发明的结合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。所述药物组合物还可包含用于治疗病症的至少一种另外的试剂，其中ErbB2活性是有害的。所述另外的试剂可选自：治疗剂；显像剂；抗肿瘤剂；化学治疗剂；血管生成抑制剂；抗VEGF抗体；抗EGFR抗体；抗cMet抗体；抗ErbB3抗体；抗ErbB2抗体；抗CD20抗体；阿柏西普；激酶抑制剂；共刺激分子阻滞剂；抗B7.2抗体；CTLA4-Ig；黏附分子阻滞剂；抗E选择素抗体；抗L选择素抗体；抗细胞因子抗体或其功能片段；抗IL-18抗体；抗TNF抗体；抗IL-6抗体；甲氨蝶呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；DNA烷化剂；顺铂；卡铂；抗微管蛋白剂；紫杉醇；多西他赛；阿霉素；吉西他滨；健择；蒽环类药物；亚德里亚霉素；拓扑异构酶I抑制剂(topoisiomersase Iinhibitor)；拓扑异构酶II抑制剂；5-氟尿嘧啶(5-FU)；亚叶酸；伊立替康；受体酪氨酸激酶抑制剂、细胞凋亡抑制剂；Bcl2/Bclx抑制剂；厄洛替尼、吉非替尼、COX-2抑制剂、塞来昔布、环孢菌素；雷帕霉素；可检测的标记或受体分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉松弛剂；***(narcotic)；镇痛剂；麻醉剂；镇静剂；局部麻醉剂；神经肌肉阻滞剂；抗微生物剂；抗银屑病剂；皮质类固醇；合成代谢类固醇；***；免疫；免疫球蛋白；免疫抑制剂；生长激素；激素替代药；放射性药物；抗抑郁剂；抗精神病药；***；哮喘药物；β激动剂；吸入性类固醇；肾上腺素；肾上腺素类似物；细胞因子；以及细胞因子拮抗剂。
提供了用于治疗对象的疾病或病症的方法。ErbB2活性在所述疾病或病症中是有害的。治疗方法包括向对象施用有效量的本发明的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物，由此调节对象中的ErbB2活性。所述疾病或病症可以选自：乳腺癌、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌(stomach cancer)、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、泌尿道癌、女性生殖道癌、男性生殖道癌、内分泌腺癌、皮肤癌、血管瘤、黑色素瘤、肉瘤、脑肿瘤、神经癌、眼部肿瘤、脑膜癌、来自造血***恶性肿瘤的实体瘤、肿瘤转移、眼部新血管形成、水肿、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化斑块、克罗恩病、炎性肠病、难治性腹水、银屑病、结节病、动脉性动脉粥样硬化、败血症、消化性溃疡、烧伤、胰腺炎、多囊性卵巢疾病(POD)、子宫内膜异位、子宫肌瘤、良性***肥大、T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、具有皮质下梗塞和脑白质病的脑常染色体显性动脉病(CADA-SIL)、多发性硬化(MS)、法洛四联症(TOF)、Alagille综合征(AS)、黄斑变性和年龄相关的黄斑变性疾病，以及以异常ErbB2活性为特征的其他的血管生成非依赖性的和依赖性的疾病。疾病或病症可以为原发性癌症和转移性癌症。疾病或病症可以为乳腺癌。女性生殖道癌选自：***、子宫癌、卵巢癌、绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病。女性生殖道癌可以为卵巢癌。疾病或病症可以为胃癌。疾病或病症可以为肺癌。脑膜癌可以选自：星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、神经鞘瘤和脑膜瘤。来自造血***恶性肿瘤的实体瘤可以为白血病、霍奇金氏白血病、非霍奇金氏白血病、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。眼部新血管形成可以选自：糖尿病失明、视网膜病变、年龄相关的黄斑变性和虹膜发红。当疾病或病症为肿瘤时，治疗方法还可包括将对象中肿瘤的生长抑制例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。肿瘤可以为ErbB2阳性的。
根据治疗方法，可以通过选自以下的至少一种模式向对象施用结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物：肠胃外的、皮下的、肌内的、静脉内的、动脉内的、关节内的、支气管内的、腹内的、囊内的、软骨内的、腔内的、体腔内的、小脑内的、脑室内的、大肠内的、颈管内的、胃内的、肝内的、心肌内的、骨内的、骨盆内的、心包内的、腹膜内的、胸膜内的、***内的、肺内的、直肠内的、肾内的、视网膜内的、脊柱内的、滑膜内的、胸廓内的、子宫内的、膀胱内的、弹丸式的、***的、直肠的、口腔的、舌下的、鼻内的和经皮的。
治疗方法还可包括同时地或依次地施用一种或多种另外的试剂。所述另外的试剂可以为能够结合ErbB2但不同于所述结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物的抗体或其抗原结合片段。ErbB2可以为人ErbB2。所述一种或多种另外的试剂可包含曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合。所述方法还可包括与一种或多种另外的试剂协同调节对象中的ErbB2活性。结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物以及一起同时地或依次地使用的一种或多种另外的试剂的协同效应，可能比单独使用的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物和一种或多种另外的试剂的加性效应多至少约5％、10％、20％、30％、40％或50％。
治疗方法还包括同时地或依次地施用治疗有效量的第二试剂。所述第二试剂可以选自：甲氨蝶呤；能够结合人TNF的抗体或其片段；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；非甾体抗炎剂(NSAID)；放射治疗剂；抗肿瘤剂；化学治疗剂；DNA烷化剂；顺铂；卡铂；抗微管蛋白剂；紫杉醇；多西他赛；他克唑；阿霉素；吉西他滨；健择；蒽环类药物；亚德里亚霉素；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；5-氟尿嘧啶(5-FU)；亚叶酸；伊立替康；受体酪氨酸激酶抑制剂；厄洛替尼；吉非替尼；COX-2抑制剂；塞来昔布；激酶抑制剂；血管生成抑制剂；抗VEGF抗体；阿柏西普；共刺激分子阻滞剂；抗B7.1抗体；抗B7.2抗体；CTLA4-Ig；抗CD20抗体；黏附分子阻滞剂；抗LFA-1抗体；抗E选择素抗体；以及抗L选择素抗体；小分子抑制剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；抗IL-18抗体；抗TNF抗体；抗IL-6抗体；抗细胞因子受体抗体；可检测的标记或受体；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉松弛剂；***；镇痛剂；麻醉剂；镇静剂；局部麻醉剂；神经肌肉阻滞剂；抗微生物剂；抗银屑病药；皮质类固醇；合成代谢类固醇；***；免疫；免疫球蛋白；免疫抑制剂；生长激素；激素替代药；放射性药物；抗抑郁剂；抗精神病药；***；哮喘药物；β激动剂；吸入性类固醇；肾上腺素；肾上腺素类似物；细胞因子；以及细胞因子拮抗剂。
对于每种治疗方法，提供了治疗对象的疾病或病症的药物。在所述疾病或病症中ErbB2活性是有害的。药物可包含有效量的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物，以及药学上可接受的载体。药物还可包含一种或多种另外的试剂和/或第二试剂。提供了制造药物的方法。所述制造方法包括将结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物与药学上可接受的载体和任选地一种或多种另外的试剂和/或第二试剂混合。
提供了抑制ErbB2阳性细胞生长的方法。所述抑制方法包括将细胞与有效量的本发明的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物接触。ErbB2细胞的生长可被抑制至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。ErbB2阳性细胞可以是BT474细胞。结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物可将BT474细胞的生长抑制至少70％。所述抑制方法还可包括使细胞与一种或多种另外的试剂接触。所述另外的试剂可以为能够结合ErbB2但不同于结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物的抗体或其抗原结合片段。结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物、以及一种或多种另外的试剂可协同抑制细胞的生长。一起同时地或依次地使用的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物和另外的ErbB2抗体对ErbB2阳性细胞生长的协同抑制，可以比单独使用的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物以及另外的ErbB2抗体的加性抑制多至少约5％、10％、20％、30％、40％或50％。所述一种或多种另外的试剂可包含曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合。细胞可在对象内。对象可患有疾病或病症，其中ErbB2活性是有害的。对象可以为哺乳动物，例如人类。对于每种抑制方法，提供了抑制对象中ErbB2阳性细胞生长的药物。所述药物可包含有效量的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物以及药学上可接受的载体。所述药物还可包含一种或多种另外的试剂。提供了制造药物的方法。制造方法包括将结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物与药学上可接受的载体、以及任选地一种或多种另外的试剂混合。
提供了抑制ErbB2阳性肿瘤生长的方法。所述抑制方法包括将肿瘤与有效量的本发明的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物接触。肿瘤的生长可被抑制至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。抑制方法还可包括将肿瘤与一种或多种另外的试剂接触。所述另外的试剂可以为能够结合ErbB2但不同于结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物的抗体或其抗原结合片段。结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物、以及一种或多种另外的试剂可协同抑制肿瘤的生长。一起同时地或依次地使用的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物以及另外的ErbB2抗体对肿瘤生长的协同抑制，可以比单独使用的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物以及另外的ErbB2抗体的加性抑制多至少约5％、10％、20％、30％、40％或50％。所述一种或多种另外的试剂可包含曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合。肿瘤可以为曲妥珠单抗抗性的。在另外的ErbB2抗体为曲妥珠单抗，并且肿瘤为曲妥珠单抗抗性的情况下，当与曲妥珠单抗组合使用时，肿瘤的生长可被结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物抑制至少约70％。肿瘤可在对象内。对象可患有疾病或病症，其中ErbB2活性是有害的。对象可以是哺乳动物，例如人类。对于每种抑制方法，提供了抑制对象中ErbB2阳性细胞生长的药物。所述药物可包含有效量的结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物以及药学上可接受的载体。所述药物还可包含一种或多种另外的试剂。提供了制造药物的方法。所述制造方法包括将结合蛋白、结合蛋白构建体或结合蛋白缀合物与药学上可接受的载体，以及任选地一种或多种另外的试剂混合。
附图简述
图1描绘了通过本发明分离的还原的IgG分子的SDS-PAGE分析。注意：泳道1-分子量标志物；泳道2–IgG 4C9；泳道3–IgG 4H2；泳道4–IgG 4G6；泳道5–IgG 5F12；泳道6–IgG5G9。
图2A-2E显示了本发明的5种抗体及组合对BT474乳腺癌细胞系的细胞生长的抑制的剂量反应曲线。BT474细胞被接种于96孔板中并允许贴附过夜。实验在含有10％胎牛血清的培养基中进行。添加抗ErbB2抗体、抗体混合物或对照IgG，并将细胞在37℃下孵育144小时。已经添加50μl的CellTiter-Glo(PROMEGA,G7573)10min，根据制造商的说明书测量发光信号。样品集合包括hIgG+mIgG(×)、hIgG+曲妥珠单抗(□)、hIgG+帕妥珠单抗(○)、曲妥珠单抗+帕妥珠单抗曲妥珠单抗+本发明的mAb(▲)，以及hIgG+本发明的mAb/>“本发明的mAb”表示4C9、4H2、4G6、5F12或5G9。注意：T-mAb表示曲妥珠单抗，P-mAb表示帕妥珠单抗。
图3A-3B描绘了BT474乳腺癌异种移植模型中PBS(◆)、仅曲妥珠单抗(■)、曲妥珠单抗/4C9(▲)、曲妥珠单抗/4H2(×)、曲妥珠单抗/4G6曲妥珠单抗/5F12(●)和曲妥珠单抗/5G9/>以及曲妥珠单抗/帕妥珠单抗(–)治疗的治疗应答。注意：T-mAb表示曲妥珠单抗，P-mAb表示帕妥珠单抗。
图4A-4B描绘了PDX曲妥珠单抗抗性的胃模型中PBS(◆)、仅曲妥珠单抗(■)、曲妥珠单抗+帕妥珠单抗(▲)、曲妥珠单抗+5F12(●)和曲妥珠单抗+5G9以及曲妥珠单抗/帕妥珠单抗(–)治疗的治疗应答。注意：T-mAb表示曲妥珠单抗，P-mAb表示帕妥珠单抗。
发明详述
本发明提供了与人ErbB2特异性结合且任选地协同增强曲妥珠单抗的抗肿瘤功效(例如，抑制、拮抗、调节ErbB2表达、活性和/或信号传导)的结合蛋白。本发明是基于通过使用基于细胞的功能测定从大规模的基于曲妥珠单抗的协同功效筛选鉴定的5种新抗体的发现，当与曲妥珠单抗一起使用时具有比帕妥珠单抗更强的协同功效。具体而言，与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合治疗相比，曲妥珠单抗与这些抗体中的任一种的组合提供了抑制ErbB2阳性细胞或肿瘤(例如ErbB2阳性和曲妥珠单抗抗性肿瘤)生长的显著更高的功效结果。
提供了与ErbB2特异性结合的结合蛋白，包括抗ErbB2抗体4C9、4H2、4G6、5H12和5G9，以及它们的嵌合的和人源化的变体。在一个实施方案中，结合蛋白包含这些抗体中的任一种的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一实施方案中，提供了包含这些抗体中的任一种的重链可变区序列和轻链可变区序列的结合蛋白。在另一实施方案中，提供了包含与这些抗体中的任一种的重链可变区序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列和与这些抗体中的任一种的轻链可变区序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列的结合蛋白。
提供了具有编码本发明的结合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。还提供了包含此类多核苷酸的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。
提供了产生本发明的结合蛋白的方法。
提供了包含曲妥珠单抗和本发明的结合蛋白的组合物。结合蛋白可结合不同于曲妥珠单抗或帕妥珠单抗结合的表位的独特的表位。结合蛋白可与另外的ErbB2抗体(如曲妥珠单抗)协同地显著提高另外的ErbB2抗体(如曲妥珠单抗)的内化，和/或调节ErbB2介导的生物活性(例如下游信号传导通路的磷酸化和细胞增殖)。
提供了包含本发明的结合蛋白和抗癌剂的结合蛋白缀合物。结合蛋白缀合物可以是免疫毒性的。还提供了包含结合蛋白缀合物和另一种ErbB2抗体(如曲妥珠单抗)的组合物以及结合蛋白缀合物，其可以为免疫毒性的。
治疗对象的疾病或病症的方法，其包括向对象施用有效量的本发明的结合蛋白或组合物。对象可以为哺乳动物，例如人类。所述方法还可包括向对象施用另一种ErbB2抗体(如曲妥珠单抗)。还提供了包含结合蛋白以及任选地另一种ErbB2抗体(如曲妥珠单抗)的药物，以用于治疗对象(例如，人)的疾病或病症(例如，癌症)。
提供了增强另一种ErbB2抗体(如曲妥珠单抗)内化至ErbB2阳性中的方法。所述方法包括使细胞与本发明的结合蛋白或组合物接触。
A.定义
以最广泛含义使用术语“抗体”，其包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与抗原免疫特异性结合的抗原结合位点并且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的分子。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)为具有相同的结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现出对特定靶标的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和其他的抗体样分子，其缺少靶标特异性。天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，其后为多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，并且在其另一端具有恒定结构域。此外，术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(mAb)意在包括能够与蛋白特异性结合的完整的分子以及抗体片段(诸如例如，Fab和F(ab')2片段)。Fab和F(ab')2片段缺少完整抗体的Fc片段，更快地从动物或植物的循环中清除，并且相比完整的抗体可以具有更少的非特异性组织结合(Wahl等人,J Nucl Med 24:316(1983))。
以其最广义含义“嵌合抗体”是指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他的抗体的一个或多个区域的抗体。如本文中所用的，“嵌合抗体”通常是部分为人来源且部分为非人来源(即部分来源于如小鼠或大鼠的非人动物)的抗体。生产嵌合抗体的方法在本领域是已知的。参见例如，Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi等人,BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等人,J Immunol Methods 125:191(1989)。
术语“Kabat编号”是指对比抗体或者其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更多变(即高变的)的氨基酸残基进行编号的***(Kabat等人,Ann.NYAcad.Sci,190:382-391(1971)和Kabat等人Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242(1991))。对于重链可变区(VH)，高变区的范围为氨基酸位置31至35的CDR1，氨基酸位置50至66的CDR2，和氨基酸位置95至102的CDR3。对于轻链可变区(VL)，高变区的范围为氨基酸位置24至34的CDR1，氨基酸位置50至56的CDR2，和氨基酸位置89至97的CDR3。
术语“CDR接枝的抗体”是指包含来自一种物种的重链和轻链可变区序列，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另外的物种的CDR序列取代的抗体，如具有鼠重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDR(例如，CDR3)被人CDR序列取代。
术语“人源化的抗体”是指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列，但其中至少一部分的VH和/或VL序列已被改变为更“人样的”(即更相似于人种系可变序列)抗体。“人源化的抗体”是抗体或其变体、衍生物、类似物或其片段，其与目标抗原特异性结合并且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文中所用的，术语“基本上”在CDR的上下文中是指具有与非人抗体CDR的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％相同的氨基酸序列的CDR。
如本文中所用的，术语“受体”和“受体抗体”是指提供或编码一个或多个框架区(FR)的氨基酸序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的抗体或核酸序列。在一些实施方案中，术语“受体”是指提供或编码恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另一实施方案中，术语“受体”是指提供或编码一个或多个框架区和恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在具体的实施方案中，术语“受体”是指提供或编码一个或多个框架区的氨基酸序列的至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的人抗体氨基酸或核酸序列。根据本实施方案，受体可含有在人抗体的一个或多个特定位置处并不存在的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个氨基酸残基。受体框架区和/或受体恒定区可以例如，来源于或获自种系抗体基因、成熟的抗体基因、功能抗体(例如，本领域众所周知的抗体、开发中的抗体或可商购获得的抗体)。
术语“可变的”是指这样的事实，即可变结构域的某些部分在抗体间的序列上存在广泛差异，并且被用于针对其特定抗原的每种特定抗体的结合和特异性。然而，可变性并非均匀地分布在抗体的整个可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中的被称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接(其形成环连接)，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，且与来自另一条链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是展现出各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中。
术语“高变区”当在本文中使用时是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是除本文中所限定的高变区残基外的那些可变结构域残基。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(被称为“Fab”片段每个具有单个抗原结合位点)和残留的“Fc”片段(其名称反映了它易于晶体的能力)。胃蛋白酶处理产生F(ab′)2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区由紧密、非共价缔合的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体组成。以该构型，每个可变结构域的三个高变区相互作用以限定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个高变区集体赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含特异性针对抗原的三个高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力比整个结合位点低。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1结构域的羧基端处添加了一些残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对于Fab'的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有至少一个游离巯基。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对的Fab'片段产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
可基于它们恒定结构域的氨基酸序列，将来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”分配至两种明显不同类型中的一种，被称为κ和λ。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单多肽链中。优选地，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，其使得scFv能够形成所期望的用于抗原结合的结构。对于scFv的综述参见Plückthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。ErbB2抗体scFv片段被描述于WO93/16185；美国专利第5,571,894号；以及美国专利第5,587,458号中。
术语“免疫球蛋白”通常被用作血液或血清中发现的抗体混合物的集体名称，但也可被用于命名来源于其他来源的抗体混合物。
术语“同源VH和VL编码对”描述了包含在产生相同的抗体的细胞内或来源于产生相同抗体的细胞的原始VH和VL编码序列对。因此，同源VH和VL对代表最初存在于此类细胞所源自的供体中的VH和VL配对。术语“从VH和VL编码对表达的抗体”表示从含有VH和VL编码序列的载体、质粒或其他多核苷酸产生而来抗体或抗体片段。当表达同源VH和VL编码对时，无论是作为完整抗体还是作为其稳定片段，它们都保留了最初从它们所源自的细胞表达的抗体的结合亲和力和特异性。同源对的文库也被称为同源对的全集或集合，并且可以单独或合并保存。
术语“重组抗体”是指从用包含抗体的编码序列的表达载体(或可能多于一种表达载体，通常是两种表达载体)转染的细胞或细胞系表达的抗体，其中所述编码序列与细胞天然不相关。
如本文中所用的，术语“典型”残基是指限定如通过Chothia等人(J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992))所限定的特定典型CDR结构的CDR或框架中的残基。根据Chothia等人，许多抗体的CDRs的关键部分具有近似相同的肽骨架确认，尽管在氨基酸序列水平上存在大的多样性。每种典型结构主要指定了形成环的连续的氨基酸残基区段的一组肽骨架扭转角。
如本文中所用的，术语“框架”或“框架序列”是指可变区减去CDRs的剩余序列。因为可以通过不同的***(例如，参见上文)确定CDR序列的准确定义，所以对框架序列的意义进行相应不同的解释。6个CDR(轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3以及重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)在每条链上也将轻链和重链上的框架区分成了4个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，并且CDR3位于FR3和FR4之间。不将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他人所提及的框架区代表了单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区中的组合的FR。如本文中所用地，FR代表了4种亚区中的一种，并且FRs代表了构成框架区的4种亚区中的两种或更多种。
人重链和轻链框架(FR)序列为本领域已知，其可被用作使用本领域已知的技术将非人抗体人源化的重链和轻链“受体”框架序列(或简称为“受体”序列)。在本发明的实施方案中，人重链和轻链受体序列选自可公开获取的数据库如V-base(超文本传送协议://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或信息***(超文本传送协议://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)中列出的框架序列。下表2提供了本领域已知的人重链受体序列的实例的非限制性列表。下表3提供了本领域已知的人轻链受体序列的实例的非限制性列表。在本发明的实施方案中，人重链和轻链受体序列选自下表2和表3中所描述的氨基酸序列，然而，表2和表3中未列出的其他的人重链和轻链受体序列也可被用于将根据本发明的抗体人源化。
在一个实施方案中，来自表2的用于产生根据本发明的结合ErbB2的人源化的抗体的重链人受体框架序列包括：由hIGHV1-69 FR1、hIGHV1-69 FR2、hIGHV1-69 FR3和hIGHJ4FR4受体序列组成的集合；由hIGHV1-46 FR1、hIGHV1-46 FR2、hIGHV1-46 FR3和hIGHJ4 FR4受体序列组成的集合。
在另一实施方案中，来自表3的用于产生根据本发明的结合ErbB2的人源化的抗体的轻链人受体框架序列包括：由hIGKV1-33 FR1、hIGKV1-33 FR2、hIGKV1-33 FR3和hIGKJ1FR4受体序列组成的集合，以及由hIGKV1-27 FR1、hIGKV1-27 FR2、hIGKV1-27 FR3,和hIGKJ1 FR4受体序列组成的集合。
在另一实施方案中，用于产生根据本发明的结合ErbB2的人源化的抗体的人受体框架序列的集合包含选自以下的受体框架序列的一个或多个(例如，每种结合域的任意1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个)：
重链框架-1(H-FR1)：Q-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-K-K-P-G-S-S-V-K-V-S-C-K-X24-S-G-G-T-F-X30(SEQ ID NO:52)，其中X24为A或T，X30为S或T；
重链框架-2(H-FR2)：W-V-R-Q-A-P-G-Q-G-L-E-W-M-G(SEQ ID NO:4)；
重链框架-3(H-FR3)：R-X67-T-I-T-A-D-X73-S-T-X76-T-A-Y-M-E-L-S-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-A-R(SEQ ID NO:53)，其中X67为A或V，X73为K或Q，X76为S或N
重链框架-4(H-FR4)：W-G-Q-G-T-L-V-T-V-S-S(SEQ ID NO:6)
轻链框架-1(L-FR1)：D-I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-T-C(SEQID NO:7)；
轻链框架-2(L-FR2)：W-Y-Q-X38-K-P-G-K-G-P-K-L-L-I-X49(SEQ ID NO:54)，其中X38为Q或H，X49为Y或H，
轻链框架-3(L-FR3)：G-X58-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-X69-D-X71-T-X73-T-I-S-S-L-Q-P-E-D-F-A-T-Y-Y-C(SEQ ID NO:55)，其中X58为I或V，X69为K、T或R，X71为Y或F，X73为L或F；
轻链框架-4(L-FR4)：F-G-Q-G-T-K-V-E-I-K(SEQ ID NO:10)。
在优选的实施方案中，使用由上述H-FR1、H-FR2、H-FR3、H-FR-4、L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4受体序列组成的人受体序列的集合将根据本发明的结合ErbB2的抗体人源化。
术语“抗体的组合”或“抗体组合”或“抗体混合物”是指具有不同CDR序列的至少两种独特的抗体。
如本文所用的术语“协同的”是指抗体组合，其比两种或更多种单克隆抗体的加性效应更有效。Chou(Pharmacol Rev 58:621–681,2006)描述了药物组合的协同作用的实验设计。已经在几种测定***中评估了本发明提供的组合，并且可以利用标准程序分析数据，以定量抗癌症剂之间的协同作用、加性作用和拮抗作用。组合疗法可提供“协同作用”并证明“协同”，即当一起使用(同时地或依次地)活性成分时，达到的效果大于单独使用化合物所产生的效果的总和。当对两种或更多种抗体进行如下处理时可获得协同效应：(1)在组合制剂中共配制并同时施用或递送；(2)通过作为单独的制剂交替递送；或(3)通过如双特异性IgG形式的一些其他的方案。
术语“中和”是指当抗体特异性结合抗原时抵消抗原的生物活性。在实施方案中，中和抗体结合抗原并将其生物活性中和至少约20％、40％、60％、80％、85％、90％、95％或更多。
术语“独特的表位”是指这样的事实，即当本发明的两种不同的抗体结合独特的表位时，优选少于80％的抗原结合竞争，更优选少于50％的抗原结合竞争，且最优选尽可能少的竞争，如少于约25％的抗原结合竞争。能够彼此竞争结合相同抗原的抗体可结合相同或重叠的表位，或者可以具有彼此紧密邻近的结合位点，使得竞争主要由位阻引起，因此，术语“相同表位”是指这样的事实，即当本发明的两种不同的抗体结合相同的表位时，优选多于80％的抗原结合竞争，更优选多于85％的抗原结合竞争，更优选多于90％的抗原结合竞争，并且最优选95％的抗原结合竞争。可通过本领域已知的方法进行抗体对的“独特的表位”或“相同表位”的分析，例如，经由使用针对表达ErbB2的细胞和个别荧光标记的抗体的FACS(荧光活化的细胞分选)或其他流式细胞术分析在饱和抗体条件下的结合实验，或通过使用流动细胞表面捕获或缀合的ErbB2抗原的表面等离子体共振(SPR)的方式。在实施例中描述了使用SPR确定抗体之间的竞争的方法。
术语“抗体缀合物”是指与第二化学部分(如治疗剂或细胞毒素剂)化学连接的抗体。术语“试剂”在本文中被用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。优选地，治疗剂或细胞毒素剂包括但不限于：百日咳毒素、他克唑、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌光神霉素、放线菌素D、1-去氢***、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***和嘌呤霉素，以及它们的类似物或同系物。
B.曲妥珠单抗协同的抗ErbB2抗体的产生
本发明的一个方面提供了结合ErbB2的分离的小鼠单克隆抗体，其具有曲妥珠单抗协同的中和能力。本发明的另一方面提供了结合ErbB2的嵌合抗体。本发明的另一方面提供了结合ErbB2的CDR接枝的抗体或其抗原结合部分。本发明的另一方面提供了结合ErbB2的人源化的抗体或其抗原结合部分。在实施方案中，抗体或其部分为分离的抗体或其分离的其部分。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分为中和抗ErbB2的抗体。有利地，此类结合ErbB2的抗体或其抗原结合部分可用作可作为个体(人或其他哺乳动物)施用的曲妥珠单抗功能性协同配偶体。优选地，本发明的抗体或其抗原结合部分当与曲妥珠单抗组合时协同地抑制ErbB2阳性癌细胞的生长。
接下来描述关于产生根据本发明使用的抗体的示例性技术。用于产生抗体的ErbB2抗原可以是可溶形式的ErbB2的胞外结构域。可选地，可以使用在它们的细胞表面表达ErbB2的细胞(例如，如SKBR3细胞的癌细胞系，参见Stancovski等人PNAS(USA)88:8691–8695(1991))来产生抗体。
(i)使用杂交瘤技术的抗ErbB2单克隆抗体
可使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或它们的组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，包括本领域已知的和例如Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,第二版(冷泉港实验室出版社,冷泉港,1988)中教导的那些技术。
在用ErbB2抗原或ErbB2过表达的癌细胞免疫小鼠后，可从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。通过出血或处死动物从动物获得含抗ErbB2抗体的血清。可以使用从动物获得的血清，或者可以从血清中纯化抗ErbB2抗体。
一旦在小鼠血清中检测到免疫应答(例如，特异性针对抗原ErbB2的抗体)，就收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞融合至任何合适的骨髓瘤细胞，例如来自从美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection(ATCC),马纳萨斯,Va.,US)可获得的细胞系SP2/0的细胞。然后通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆的分泌能够结合ErbB2的抗体的细胞。通过有限稀释选择和克隆阳性杂交瘤。可以通过用阳性杂交瘤克隆接种小鼠来产生通常含有高水平的抗体的腹水。
(ii)筛选具有曲妥珠单抗协同抗肿瘤生物活性的抗体
上文已经描述了用于产生抗体的技术。本发明还提供了分离含有协同生物活性(如细胞增殖抑制活性)的抗体组合的方法。本发明的抗体组合含有至少两种或更多种具有下列所期望性质的单克隆抗体：<1>它们与ErbB2上存在的独特的非重叠表位结合；<2>它们是新的抗体或组合的一部分是新的抗体；<3>抗体组合(本发明的任何抗体+曲妥珠单抗)的功效比每种单独组分的功效或每个单独功效的总和更有效。优选地，本发明已经提供了两种单克隆抗体(本发明的5种单克隆抗体中的一种和另一种曲妥珠单抗)的协同组合。此类两抗体组合的抗肿瘤活性比任一组分的抗肿瘤活性或每个单独功效的总和更有效。
优选地，为了鉴定在抑制ErbB2阳性细胞的细胞生长方面能够与曲妥珠单抗协同作用的抗体，可以遵循以下程序：(a)进行ELISA或基于细胞的结合以确认目标抗体的特异性ErbB2结合活性。可以测定抗体与重组人ErbB2和表达人ErbB2的细胞结合的能力。(b)进行基于曲妥珠单抗的协同抑制细胞增殖的筛选。例如，可以使用如以下实施例4中所描述的基于BT474的细胞增殖抑制测定进行单独抗ErbB2抗体和/或抗体组合对BT474细胞生长的抑制。可以向每个孔添加抗ErbB2单克隆抗体或抗体组合，并孵育约144小时。可以制备剂量应答曲线并计算目标抗体或目标抗体组合的IC50值。在一个实施方案中，在约0.5-20μg/ml的浓度下，生长抑制性抗体组合能够抑制BT474细胞的生长比每种单独抗体抑制BT474细胞的生长高约20％–80％。
此类优良的协同抗肿瘤活性的假设机制可以是但不限于以下可能性之一：(a)通过阻断靶标(例如，ErbB2)的两个或更多个功能性表位的协同***叉增强，和/或(b)两种或更多种单克隆抗体对靶标(例如，ErbB2)的亲合力或协同结合亲和力远高于单一单克隆抗体的亲和力，和/或(c)与单一单克隆抗体的抗体-抗原三聚体形成不同，由两种或更多种具有独特表位的单克隆抗体介导的抗体-抗原聚合体的形成对于免疫***检测清除和/或细胞内吞作用可能大得多和容易得多。基于上述机制或上述所有的组合或其他可能的机制之一，抗ErbB2协同性抗体组合可被用于预防或治疗ErbB2阳性癌症。优选地，本发明的抗体可以被作为与曲妥珠单抗的组合来使用以治疗ErbB2阳性癌症或曲妥珠单抗抗性ErbB2阳性癌症。
(iii)重组ErbB2抗体的产生
可以通过本领域已知的许多技术中的任何一种产生本发明的抗体。例如，来自宿主细胞的表达，其中通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常被用于将外源DNA引入真核宿主细胞中的多种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。用于表达本发明的重组抗体的示例性的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，被描述于Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980)，与DHFR可选标记一起使用，例如，如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.,159:1-621(1982)中描述的、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达，或者更优选地将抗体分泌至其中培养宿主细胞的培养基中的一段时间来产生抗体。可以使用标准的蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
也可以将宿主细胞用于产生功能性抗体片段，如Fab片段或scFv分子。应该理解，基于上述程序的变化属于本发明的范围内。例如，用编码本发明的抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞可能是可取的。重组DNA技术也可被用于去除编码对于结合目标抗原不是必需的轻链或重链或二者的DNA中的一些或全部。从此类截短的DNA分子表达的分子也被涵盖在本发明的抗体中。另外，可以通过以标准化学交联方法将本发明的抗体与第二抗体交联来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体(即，结合人ErbB2)，而另一条重链和轻链是特异性针对除人ErbB2外的抗原的。
在本发明的抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选***中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经用载体转染的CHO细胞。培养选择的转化子宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并从培养基中回收完整的抗体。使用标准的分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化子、培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。本发明还提供了通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至合成本发明的重组抗体来合成本发明的重组抗体的方法。所述方法还可以包括从培养基中分离重组抗体。
1.抗ErbB2抗体.
在表12中显示了克隆4C9、4H2、4G6、5F12和5G9的分离的结合人ErbB2的小鼠单克隆抗体的VH和VL区的氨基酸序列(参见下面的实施例)。本文中所描述的分离的抗ErbB2抗体CDR序列建立了根据本发明分离的且包含包括由其衍生的CDR序列的多肽的ErbB2抗体家族。单克隆抗体及其人源化抗体衍生物的可变区和CDR的序列列于表12、16和19中。为了产生和选择根据本发明的具有关于人ErbB2的优选的ErbB2结合和/或中和活性的抗体的CDR，可以使用本领域已知的用于产生本发明的抗体和评估那些抗体的ErbB2结合和/或中和特征的标准方法，包括但不限于本文中具体描述的那些方法。
基于本文中描述的抗ErbB2抗体克隆的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的CDR的氨基酸序列的比对，本发明提供了包含能够结合人ErbB2的抗原结合结构域的ErbB2抗体，所述抗原结合结构域包含以下限定的6种CDR(即CDR-Hl、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDRL-3)中的至少一种或多种：
CDR-H1选自：
X1-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO:11)，其中：
X1为S
X2为Y
X3为T或Y
X4为M或I
X5为H
4C9 CDR-H1(SEQ ID NO:17)的残基31-35
4H2 CDR-H1(SEQ ID NO:19)的残基31-35
4G6 CDR-H1(SEQ ID NO:21)的残基31-35
5F12 CDR-H1(SEQ ID NO:23)的残基31-35
4G9 CDR-H1(SEQ ID NO:25)的残基31-35
5F12 CDR-H2VH.V1(SEQ ID NO:27)的残基31-35
5F12 CDR-H1 VH.1(SEQ ID NO:28)的残基31-35
5F12 CDR-H1 VH.2(SEQ ID NO:29)的残基31-35
5F12 CDR-H1 VH.3(SEQ ID NO:30)的残基31-35
5F12 CDR-H1 VH.4(SEQ ID NO:31)的残基31-35
5G9 CDR-H1 VH.V1(SEQ ID NO:39)的残基31-35
5G9 CDR-H1 VH.1(SEQ ID NO:40)的残基31-35
5G9 CDR-H1 VH.2(SEQ ID NO:41)的残基31-35
5G9 CDR-H1 VH.3(SEQ ID NO:42)的残基31-35
5G9 CDR-H1 VH.4(SEQ ID NO:43)的残基31-35
5G9 CDR-H1 VH.5(SEQ ID NO:44)的残基31-35
CDR-H2选自：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO:12)，其中：
X1为Y
X2为I
X3为N
X4为P
X5为S
X6为S
X7为S或D
X8为Y
X9为T
X10为A或N
X11为Y
X12为N
X13为Q
X14为K或N
X15为F
X16为K或R
X17为D
4C9 CDR-H2(SEQ ID NO:17)的残基50-66
4H2 CDR-H2(SEQ ID NO:19)的残基50-66
4G6 CDR-H2(SEQ ID NO:21)的残基50-66
5F12 CDR-H2(SEQ ID NO:23)的残基50-66
4G9 CDR-H2(SEQ ID NO:25)的残基50-66
5F12 CDR-H2VH.V1(SEQ ID NO:27)的残基50-66
5F12 CDR-H2VH.1(SEQ ID NO:28)的残基50-66
5F12 CDR-H2VH.2(SEQ ID NO:29)的残基50-66
5F12 CDR-H2VH.3(SEQ ID NO:30)的残基50-66
5F12 CDR-H2VH.4(SEQ ID NO:31)的残基50-66
5G9 CDR-H1 VH.V1(SEQ ID NO:39)的残基50-66
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5G9 CDR-H2VH.2(SEQ ID NO:41)的残基50-66
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5G9 CDR-H2VH.4(SEQ ID NO:43)的残基50-66
5G9 CDR-H2VH.5(SEQ ID NO:44)的残基50-66
并且
CDR-H3选自：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:13)，其中：
X1为A
X2为S
X3为A或S
X4为F
X5为S
X6为L
X7为D
X8为F
X9为W
4C9 CDR-H3(SEQ ID NO:17)的残基95-103
4H2 CDR-H3(SEQ ID NO:19)的残基95-103
4G6 CDR-H3(SEQ ID NO:21)的残基95-103
5F12 CDR-H3(SEQ ID NO:23)的残基95-103
4G9 CDR-H3(SEQ ID NO:25)的残基95-103
5F12 CDR-H3VH.V1(SEQ ID NO:27)的残基95-103
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5G9 CDR-H3VH.5(SEQ ID NO:44)的残基95-103
CDR-L1选自：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:14)，其中：
X1为K
X2为A
X3为S
X4为H或Q
X5为D
X6为I
X7为N
X8为K
X9为Y
X10为I
X11为A
4C9 CDR-L1(SEQ ID NO:18)的残基24-34
4H2 CDR-L1(SEQ ID NO:20)的残基24-34
4G6 CDR-L1(SEQ ID NO:22)的残基24-34
5F12 CDR-L1(SEQ ID NO:24)的残基24-34
4G9 CDR-L1(SEQ ID NO:26)的残基24-34
5F12 CDR-L1VL.V1(SEQ ID NO:32)的残基24-34
5F12 CDR-L1VL.1(SEQ ID NO:33)的残基24-34
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5F12 CDR-L1VL.3(SEQ ID NO:35)的残基24-34
5F12 CDR-L1VL.4(SEQ ID NO:36)的残基24-34
5F12 CDR-L1VL.5(SEQ ID NO:37)的残基24-34
5F12 CDR-L1VL.6(SEQ ID NO:38)的残基24-34
5G9 CDR-L1VL.V1(SEQ ID NO:45)的残基24-34
5G9 CDR-L1VL.1(SEQ ID NO:46)的残基24-34
5G9 CDR-L1VL.2(SEQ ID NO:47)的残基24-34
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5G9 CDR-L1VL.4(SEQ ID NO:49)的残基24-34
5G9 CDR-L1VL.5(SEQ ID NO:50)的残基24-34
5G9 CDR-L1VL.6(SEQ ID NO:51)的残基24-34
CDR-L2选自：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO:15)，其中：
X1为Y或S
X2为T
X3为S
X4为T
X5为L
X6为Q或Y
X7为P
4C9 CDR-L2(SEQ ID NO:18)的残基50-56
4H2 CDR-L2(SEQ ID NO:20)的残基50-56
4G6 CDR-L2(SEQ ID NO:22)的残基50-56
5F12 CDR-L2(SEQ ID NO:24)的残基50-56
4G9 CDR-L2(SEQ ID NO:26)的残基50-56
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5F12 CDR-L2VL.2(SEQ ID NO:34)的残基50-56
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5G9 CDR-L2VL.6(SEQ ID NO:51)的残基50-56
并且
CDR-L3选自：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:16)，其中：
X1为L
X2为Q或N
X3为Y
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X7为L
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5G9 CDR-L3VL.6(SEQ ID NO:51)的残基89-97
优选地，ErbB2抗体包含至少一种上述CDR，更优选任意两种上述CDR，更优选任意三种上述CDR，甚至更优选任意四种上述CDR，更优选任意五种上述CDR，且最优选任意六种上述CDR(即，如上所述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。包含三种CDR的特别优选的ErbB2抗体包含如上所述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
2.抗ErbB2嵌合抗体。
嵌合抗体是其中抗体的不同部分来源于不同的动物物种的分子，如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。参见例如，Morrison,Science,2291202-1207(1985)；Oi等人,BioTechniques,4:214(1986)；Gillies等人,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)美国专利第5,807,715号；第4,816,567号；和第4,816,397号。另外，可以使用针对通过剪接来自具有合适的抗原特异性的小鼠抗体分子的基因连同来自具有合适的生物活性的人抗体分子的基因产生“嵌合抗体”开发的技术。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)；Neuberger等人,Nature,312:604-608(1984)；Takeda等人,Nature,314:452-454(1985)。
3.抗ErbB2 CDR接枝的抗体。
本发明的分离的抗ErbB2抗体CDR序列可被用于制备CDR接枝的抗体，以调节原始抗体的性质。此类性质包括但不限于：结合动力学、亲和力、生物活性、物种交叉反应性、分子交叉反应性、表位、物理化学性质、药代动力学性质、药效学性质或药理学性质。CDR接枝的抗体包含来自人抗体或非人的灵长类动物抗体的重链和轻链可变区序列，其中VH和/或VL的一个或多个CDR区被原始抗ErbB2抗体的CDR序列取代。来自任何人或非人的灵长类动物抗体的框架序列可用作CDR接枝的模板。然而，直链替换到此类框架上经常导致对抗原的一些结合亲和力的损失。人或其他物种抗体与原始的人抗体的同源性越高，将CDR与新的人框架或非人的灵长类动物框架组合在CDR中引入可能降低亲和力或其他性质的畸变的可能性越小。因此，优选的是，选择用于替换除CDR之外的人可变区框架的可变框架与人抗体可变区框架具有至少30％的序列同一性。更优选的是，选择用于替换除CDR之外的人可变区框架的可变区框架与人抗体可变区框架具有至少40％的序列同一性。更优选的是，选择用于替换除CDR之外的人可变框架的可变区框架与人抗体可变区框架具有至少50％的序列同一性。更优选的是，选择用于替换除CDR之外的人可变框架的可变区框架与人抗体可变区框架具有至少60％的序列同一性。更优选的是，除CDR之外的新的人或非人的灵长类动物与原始的人可变区框架具有至少70％的序列同一性。甚至更优选的是，除CDR之外的新的人或非人的灵长类动物与原始的人可变区框架具有至少75％的序列同一性。最优选的是，除CDR之外的新的人或非人灵长类动物与原始的人的可变区框架具有至少80％的序列同一性。即使使用高度同源性的人或非人的灵长类动物框架来接枝原始的人抗ErbB2抗体的CDR，产生的接枝的抗体仍然可能丧失相同程度的与抗原的结合亲和力。在该情况下，为了重新获得亲和力，必须向新接枝抗体的相应位置处纳入原始抗体的至少一个或多个关键框架残基取代。此类关键残基可选自：
与CDR相邻的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能够与人ErbB2相互作用的残基
典型残基；
重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
游标区内的残基；和
Chothia限定的可变重链CDR1和Kabat限定的第一重链框架之间重叠区域中的残基。
4.抗ErbB2人源化抗体。
虽然本发明的组合物消除了对制备人源化抗体的需求，但可以使用本发明的组合物制备人源化的ErbB2抗体。人源化抗体是来自结合所期望的抗原的非人物种抗体的抗体分子，其具有来自非人的物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。经由万维网(www.)可获取的网站上公开了已知的人Ig序列，例如，ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；atcc.org/phage/hdb.html；sciquest.com/；abcam.com/；antibodyresource.com/onlinecomp.html；public.iastate.eduLabout.pedro-/research_tools.html；mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html；whfreeman.com/immunology-/CH05/kuby05.htm；library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；hhmi.org/grants/lectures/l996/vlab/；path.-cam.ac.uk/.about.mrcV/mikeimages.html；antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks-/Immunology.html；immunologylink.com/；pathbox.wustl.eduLabout.hcenter/index.html；bio-tech.ufl.edu/.about.hcl/；pebio.com/pa/340913-/340913.html；nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html；biodesign.com/table.asp；icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html；biotech.ufl.edu-/.about.fccl/protocol.html；isac-net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html；ibt.unam.mx/-virN_mice.html；imgt.cnusc.fr:8104/；biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；anyi-body.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；unizh.ch/.about.honegger/AHO-seminar/Slide01.html；cryst.bbk.ac.uk/about.ubcgOVs/；nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；path.cam.ac.uk/.about.mrcV/humanisation/TAHHP.html；ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.-html；biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Webpages-/Pept/spottech.html；jerini.de/frroducts.htm；patents.ibm.com/ibm.html。Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)。如本领域所知的，此类输入的序列可被用于减少免疫原性，或者减少、增强或修改结合、亲和力、结合率(on-rate)、解离率、亲合力、特异性、半衰期或任何其他合适的特征。
可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代人框架区中的框架残基，以改变，优选地提高抗原结合。通过本领域众所周知的方法(例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模)来确定框架取代，以鉴定对抗原结合和序列比较重要的框架残基，从而鉴定特定位置处的异常框架残基。(参见，例如，美国专利第5,585,089号(Queen等人)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988))。三维免疫球蛋白模型通常为可获取的，且为本领域技术人员所熟悉。说明和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序为可获取的。检查这些展示允许分析候选免疫球蛋白序列起作用时残基的可能作用，即分析影响与它的抗原结合的候选免疫球蛋白的能力的残基。以这种方式，可以从共有和输入序列选择FR残基并组合，以便实现所期望的抗体特征(如增加的对靶标抗原的亲和力)。通常，CDR残基直接且最大程度上参与影响抗原结合。可以使用本领域已知的各种技术将抗体人源化，诸如但不限于以下文献中描述的那些：Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)；Sims等人,J.Immunol.,151:2296-2308(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289(1992)；Presta等人,J.Immunol,151:2623-2632(1993)；Padlan,Molecular Immunology,28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等人ProteinEngineering,7(6):805-814(1994)；Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:969-973(1994)；PCT公开第WO 91/09967号、第WO 99/06834(PCT/US98/16280)号、第WO97/20032(PCT/US96/18978)号、第WO 92/11272(PCT/US91/09630)号、第WO 92/03461(PCT/US91/05939)号、第WO 94/18219(PCT/US94/01234)号、第WO 92/01047(PCT/GB91/01134)号、第WO93/06213(PCT/GB92/01755)号、第WO90/14443号、第WO90/14424号和第WO90/14430号；欧洲公开第EP 0 592 106号、第EP 0 519 596号和第EP 0 239 400号；美国专利第5,565,332号；第5,723,323号；第5,976,862号；第5,824,514号；第5,817,483号；第5,814,476号；第5,763,192号；第5,723,323号；第5,766,886号；第5,714,352号；第6,204,023号；第6,180,370号；第5,693,762号；第5,530,101号；第5,585,089号；第5,225,539号；和第4,816,567号。
C.抗体和产抗体细胞系的产生
优选地，本发明的抗ErbB2抗体当与曲妥珠单抗组合时，展现出高的抑制ErbB2阳性肿瘤生长活性的能力，例如，如通过本领域已知的几种体外和体内测定中的任一种所评估的。例如，在体外细胞增殖抑制测定中(表11)和/或在体内肿瘤模型(表23)中，曲妥珠单抗加本发明的这些抗体中的任一种的组合的IC50为每种单独抗体的IC50的约50％，并且在相同的体外基于细胞的生物测定中，曲妥珠单抗加本发明的这些抗体中的任一种的组合的最大抑制能力范围为81％至95％，相反，每种单独抗体的最大抑制能力范围为13％至70％。
在某些实施方案中，抗体包含重链恒定区，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区为IgGl重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可以包含轻链恒定区(κ轻链恒定区或者是λ轻链恒定区)。优选地，抗体包含κ轻链恒定区。可选地，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。
一个实施方案提供了标记的抗体，其中本发明的抗体或抗体部分是衍生化的或被连接至另外的功能性分子(例如，另外的肽或蛋白)。例如，可以通过将本发明的抗体或抗体部分功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或以其他方式)至一种或多种其他的分子实体来衍生出本发明的标记的抗体，所述其他的分子实体如另外的抗体(例如，双特异性抗体或双链抗体)、可检测的试剂、细胞毒素剂、药剂，和/或可以介导抗体或抗体部分与另外的分子(如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽。
可用于衍生本发明的抗体或抗体部分的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。也可以用可检测的酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等)对抗体进行衍生化。当用可检测的酶对抗体进行衍生化时，其可以通过添加酶使用产生可检测的反应产物的另外的试剂来检测。例如，当存在可检测的试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺会产生可检测的有色反应产物。也可以用生物素对抗体进行衍生化，并通过间接测量亲和素或链霉亲和素结合来检测。
D.ErbB2抗体的用途
(i)单克隆抗体
鉴于它们结合人ErbB2的能力，使用本领域已知的任何常规免疫测定法(如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学法)，可将本文中所述的ErbB2抗体(包括抗体及其部分)用于检测或测量样品中(例如，在混合物、溶液或生物样品如血液、血清或血浆中)的ErbB2。
本发明提供了用于检测样品中的人ErbB2的方法，包括使样品与ErbB2抗体接触并检测与人ErbB2结合的ErbB2抗体或未结合的抗体，从而检测样品中的人ErbB2。可以用可检测的物质直接或间接地标记本文中所描述的ErbB2抗体，以便于检测结合的或未结合的ErbB2抗体。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、P-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；以及合适的放射性物质的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
可以测定ErbB2的生物样品包括尿液、粪便、血液、血清、血浆、汗液、唾液、口腔拭子(脸颊、舌头、喉咙)、***拭子、直肠拭子、真皮拭子、皮肤刮拭(dermal scrape)、组织活检，以及可通过本领域可获取的方法获得的任何其他的组织样品。
对于标记抗体可选的是，可以通过利用用可检测物质标记的重组人(rh)ErbB2(rhErbB2)标准物和本文中所描述的未标记的ErbB2抗体的竞争免疫测定法测定生物体液中的人ErbB2。在该测定中，将生物样品、标记的(rhErbB2)标准物和ErbB2抗体组合，并测定与未标记的抗体结合的标记的rhErbB2标准物的量。生物样品中人ErbB2的量与标记的与ErbB2抗体结合的rhERBB2标准物的量成反比。类似地，还可以通过利用用可检测的物质标记的rhErbB2标准物和本文中所描述的未标记的ErbB2抗体的竞争免疫测定法测定生物体液中的人ErbB2。
本发明的ErbB2抗体优选能够在体外和体内中和ErbB2活性，特别是人ErbB2活性。因此，本发明的此类抗体可被用于抑制ErbB2活性，例如，在含有ErbB2的细胞培养物中、在表达与本发明的抗体交叉反应的ErbB2的人类对象或其他哺乳动物对象中。在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制ErbB2活性的方法，其包括使ErbB2与本发明的ErbB2抗体或抗体部分接触，从而抑制ErbB2活性。例如，在含有或怀疑含有ErbB2的细胞培养物中，可以向培养基中加入本发明的抗体或抗体部分以抑制培养物中的ErbB2活性。
在另一实施方案中，本发明提供了用于中和对象中ErbB2活性的方法，所述ErbB2活性有利地来自患有疾病或病症的对象，其中ErbB2或ErbB2活性是有害的。本发明提供了用于中和患有此类疾病或病症的对象中ErbB2或ErbB2活性的方法，所述方法包括向对象施用本发明的ErbB2抗体，使得对象中的ErbB2或ErbB2活性被中和。优选地，ErbB2是人ErbB2，并且对象是人类对象。可选地，对象可以是表达本发明的ErbB2抗体能够与之结合的ErbB2的哺乳动物。此外，对象可以是已经引入(例如，通过施用ErbB2或通过表达ErbB2转基因)了ErbB2的哺乳动物。可以将本发明的抗体或其他ErbB2抗体施用至人类对象以用于治疗目的。此外，可以将本发明的ErbB2抗体施用至表达能够与抗体结合的ErbB2的非人类哺乳动物，以用于兽医学目的或作为人类疾病的动物模型。关于后者，此类动物模型可用于评估本发明的抗体和其他ErbB2抗体的治疗功效(例如，测试施用的剂量和时间进程)。
(ii)双特异性抗体
双特异性抗体是具有针对至少两种不同的表位的结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可结合ErbB2蛋白的两种不同的表位。其他的此类抗体可组合EGFR、ErbB3和/或ErbB4的ErbB2结合位点。可选地，抗ErbB2臂可与结合白血胞上的触发分子(如T细胞受体分子(例如，CD2或CD3)、或IgG的Fc受体(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂组合，以便将细胞防御机制聚焦于表达ErbB2的细胞。双特异性抗体也可被用于将细胞毒素剂定位至表达ErbB2的细胞。这些抗体拥有ErbB2结合臂和结合细胞毒素剂(例如，肥皂草素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。WO96/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体，且美国专利第5,837,234号公开了双特异性的抗ErbB2/抗FcγRI抗体。在WO 98/02463中显示了双特异性抗ErbB2/Fcα抗体。美国专利第5,821,337号教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统产生是基于两条免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等人,Nature,305:537–539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四价体瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，并且产物产率低。类似的程序被公开于WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.,10:3655–3659(1991)中。
根据不同的方法，将具有所期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合优选地用免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含至少一部分铰链区、CH2区和CH3区。优选的是具有存在于至少一种融合物中第一重链恒定区(CH1)，其含有轻链结合所需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物，并且如果期望，编码免疫球蛋白轻链的DNA***单独的表达载体中，并共转染至合适的宿主生物体中。当在构建中使用的不等比例的三种多肽链提供最佳产率时，这在实施方案中提供了调整三种多肽片段的相互比例的很大的灵活性。然而，当以相等比例表达至少两种多肽链导致高产率或当比率并非特别重要时，在一个表达载体中***两种或所有三种多肽链的编码序列是可能的。
在该方法的优选实施方案中，双特异性抗体由在一条臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称结构有利于从不需要的免疫球蛋白链组合中分离所期望的双特异性化合物，因为仅在一半的双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供了一种容易的分离方式。在WO94/04690中公开了该方法。关于产生双特异性抗体的其他细节参见例如，Suresh等人,Methods in Enzymology,121:210(1986)。根据美国专利第5,731,168号中所描述的另外的方法，可以将一对抗体分子之间的界面进行工程化以将从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一条或多条小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换较大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生了与大侧链相同或类似大小的补偿性“腔”。这提供了用于增加异源二聚体相比其他不需要的终产物(如同源二聚体)的产率的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以与亲和素偶联，另一种与生物素偶联。例如，已提出将此类抗体用于将免疫***细胞靶向不需要的细胞(美国专利第4,676,980号)，以及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合物抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且在美国专利第4,676,980号中与许多交联技术一起公开。
用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，可以使用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等人,Science,229:81(1985)描述了一种程序，其中完整的抗体被蛋白水解切割以产生F(ab′)2片段。在二巯基络合剂***存在下还原这些片段，以稳定邻位二巯基并防止分子间二硫化物形成。然后将产生的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将Fab'-TNB衍生物中的一种再转化为Fab'-硫醇巯基，并与等摩尔量的其它Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可被用作酶的选择性固定化试剂。
最近的进展促进了大肠杆菌(E.coli)的Fab'-SH片段的直接回收，其可以化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人,J.Exp.Med.,175:217–225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。单独从大肠杆菌中分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够与过表达ErbB2受体和正常人T细胞的细胞结合，并引发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。
用于直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术已有描述。例如，已使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547–1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接至两种不同抗体的Fab′部分。抗体同源二聚体在铰链区处被还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异源二聚体。该方法也可被用于产生抗体同源二聚体。Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444–6448(1993)描述的“双链抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的可选机制。所述片段包含通过太短以允许相同链上的两个结构域之间配对的接头将重链可变结构域(VH)连接至轻链可变结构域(VL)。因此，一条片段的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补的VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。也已经报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚物制备双特异性抗体片段的另外的策略。参见Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994)。
包括具有多于两个价态的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)。
(iii)免疫缀合物
本发明的抗体和组合物的治疗用途的另一选择是免疫缀合物的形式，即缀合至一种或多种抗癌剂的抗体。特别地，在包含两种或更多种本发明的结合独特的ErbB2表位的单独抗体的组合物的情况下，预期这可以在细胞表面上产生交联的抗体-受体晶格，从而与使用单种单克隆抗体相比，潜在地导致受体内化水平的增加。因此，此类组合物的一种或多种单独的抗体与一种或多种抗癌剂的缀合具有特异性地和有效地将缀合的抗癌剂递送至肿瘤细胞内部的潜力，从而增强本发明的抗ErbB2抗体提供改善的肿瘤细胞杀伤活性的作用。
可以将各种类型的抗癌剂与本发明的抗体缀合，所述抗癌剂包括细胞毒素剂(包括常规的化学治疗剂和其他小分子抗癌药物)、细胞因子(在这种情况下，缀合物可被称为“免疫细胞因子”)、毒素(在这种情况下，缀合物可被称为“免疫毒素”)和放射性核素，并且一些免疫缀合物已被批准用于临床使用。这些包括(/>缀合至90Y的鼠抗CD20抗体)、/>(/>缀合至131I的鼠抗CD20抗体)和/>(缀合至卡奇霉素的人源化的抗CD33抗体)。已在临床试验中测试的其他免疫缀合物包括缀合至例如，阿霉素或美登素(maytansinoid)化合物的抗体。已在临床试验中测试的免疫毒素包括缀合至截短的假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A的几种抗体。已测试了包含缀合至IL-2的人源化EpCAM抗体的免疫细胞因子。
在本发明的缀合至细胞毒素剂的抗体的情况下，这些可以例如，属于主要类型的化学治疗药物中的任一种，包括烷化剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨)、蒽环类药物(例如，博来霉素、阿霉素、丝裂霉素-C)和植物生物碱类(例如，紫杉烷如多西他赛和紫杉醇，以及长春花生物碱如长春花碱、长春新碱和长春瑞滨)。因为使用的免疫缀合物将抗癌剂特异性地导向肿瘤，并且特别是在内化后导向肿瘤细胞的内部，基于本发明的抗ErbB2抗体的免疫缀合物可有利地基于高细胞毒性的试剂(如卡奇霉素或美登素衍生物)，或基于毒素(如细菌毒素，例如，假单胞菌外毒素A、白喉毒素；或植物毒素，例如，蓖麻毒素)。
通常通过在血清中相对稳定但当免疫缀合物被内化至靶细胞中时允许释放试剂的易变接头的方式将免疫缀合物中缀合的抗癌剂与抗体连接。合适的接头包括例如在血清中于中性pH下稳定但是在内化后于溶酶体内的温和酸性条件下发生加酸水解的化学接头、被细胞内巯基切割的二硫化物接头，以及在血清中稳定但是在细胞内隔室中发生酶促切割的肽接头。
在含有两种或更多种本发明的抗体的组合物中可以预期各种缀合排列。例如，用两种抗体，将抗体与两种或更多种不同的抗癌药缀合，或者将一种抗体与通过诸如与其他抗体缀合的酶的试剂激活的前药缀合是可能的。对于单克隆抗体，已经描述了抗体导向酶前药疗法(ADEPT)的一般概念，其中前药被通过mAB-酶缀合物靶向肿瘤的酶激活，但本发明可提供根据特定条件定制该方法的机会。因此，特异性地增加肿瘤细胞杀伤同时避免或减少对正常组织的损伤是可能的。
对于有关抗癌免疫缀合物的其他信息，参见Wu等人(2005)Nature Biotechnology23(9):1137-1146；Schrama等人(2006)Nature Reviews/Drug Discovery 5:147-159；以及Rohrer(2009)chimica oggi/Chemistry Today27(5):56-60。
(ivi)施用的剂量和途径
本发明的抗体和组合物将以有效量施用以用于治疗目标病况，即以达到所期望的结果所必需的剂量和时间段。可根据以下因素改变治疗有效量：诸如所治疗的特定病况、患者的年龄、性别和体重，以及抗ErbB2抗体是否作为独立治疗施用或与一种或多种另外的抗癌治疗组合施用。
可以通过其稳定患者的疾病进展和/或改善患者的症状，以及优选地例如通过减小肿瘤大小而逆转疾病进展的能力来测量用于肿瘤治疗的有效量。可以通过体外测定(例如，如实施例中所描述的)，以及在预测人肿瘤功效的合适的动物模型中来评估本发明的抗体或组合物抑制癌症的能力。将选择合适的剂量方案以便提供每种特定情况下的最佳治疗应答(例如，作为单一弹丸或作为连续输注施用)，并且可以根据每种情况下的紧急情况所指示的对剂量进行可能的调整。
虽然根据本发明的抗体的具体剂量尚未确定，但是可以通过与已批准用于治疗用途的类似产品(抗ErbB2单克隆抗体)进行比较来确定某些剂量考虑因素。因此预期本发明的抗体组合物的合适剂量将类似于抗ErbB2单克隆抗体曲妥珠单抗的推荐剂量。根据特定情况，以4mg/kg的初始剂量和随后2mg/kg的每周剂量，或8mg/kg的初始剂量和随后每三周6mg/kg的剂量来施用曲妥珠单抗(通过输注的方式)以用于治疗乳腺癌。
预期本发明的抗体组合物的合适剂量范围将为约0.1-100mg/kg、0.5-50mg/kg或1-20mg/kg。可以以至少0.25、0.5、1、1.5、2、3、4或5mg/kg；和/或至多约50、30、20或15mg/kg的剂量来施用抗体组合物。通常以适当的间隔重复施用，例如，每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次，并且只要主管医生认为合适，其可以在必要时任选地增加或减少剂量。
预期三种不同的递送方法用于递送本发明的抗体。常规的静脉内递送可能是针对大多数肿瘤的标准递送技术。然而，关于腹膜腔中的肿瘤(如卵巢、胆管、其它导管等的肿瘤)，腹膜内施用可证明有利于在肿瘤处获得高剂量的抗体并使抗体清除最小化。类似地，某些实体瘤具有适合于局部灌注的脉管***。局部灌注可以允许在肿瘤位点处获得高剂量的抗体，并使抗体的短期清除最小化。
与任何基于蛋白质或抗体输注的治疗产品一样，安全性问题主要涉及：(i)细胞因子释放综合征，即低血压、发热、发抖、发冷，(ii)对蛋白质的免疫原性应答的发展(即，由患者的人类抗体开发为重组抗体产品)，和(iii)对表达ErbB2受体的正常细胞(例如，许多上皮细胞)的毒性。利用标准测试和后续程序以监控任何此类安全问题。
当提及测量值(如量、百分比等)时，本文中所用的术语“约”意在涵盖与给定值±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，且更优选±0.1％的变化，只要此类变化是合适的。
实施例
实施例1.使用杂交瘤技术产生小鼠抗ErbB2单克隆抗体
根据本领域已知的方法(例如，E Harlow,D.Lane,Antibody:A LaboratoryManual,(冷泉港实验室出版社,冷泉港实验室,N.Y.,1998)免疫小鼠。
将人HER2阳性细胞系BT474以及重组人ErbB2胞外结构域(ErbB2-ECD)蛋白用作免疫原。将表达高水平人ErbB2(SK-BR3细胞)或低水平人ErbB2(MCF7)的人细胞系用于测定抗血清效价和筛选分泌抗原特异性抗体的杂交瘤。
对初次免疫接种和加强免疫接种，免疫剂量均含有1x106个BT474细胞/只小鼠/注射。为了增加对小鼠ErbB2的免疫应答，用具有不完全弗氏佐剂(Sigma,St.Louis,Mo.,US)的乳剂形式的重组小鼠ErbB2-ECD进一步加强小鼠。简而言之，通过使用涡旋将佐剂在小瓶中轻轻混合来制备佐剂-抗原混合物。从小瓶中移出所期望量的佐剂，并放入高压灭菌的1.5mL微量离心管中。在PBS或盐水中以0.5-1.0mg/ml的浓度范围制备抗原。然后将计算量的抗原加入到具有佐剂的微量离心管中，并通过轻轻涡旋2分钟来混合溶液以产生油包水乳剂。然后将佐剂-抗原溶液吸入合适的注射器中用于动物注射。以50-100ul的体积注射总共50μg的抗原。对每只动物进行免疫，然后根据其效价加强2至3次。
在融合前用表达人ErbB2的BT474或25μg的重组人ErbB2-ECD向具有良好效价(大于30,000倍稀释)的动物给予最终皮下加强。
杂交瘤融合和ELISA筛选
培养SP2/0细胞(ATCC CRL-1581)至刚好在融合之前达到对数期阶段。根据本领域已知的方法(例如，Kohler G和Milstein C,"Continuous cultures of fused cellsecreting antibody of predefined specificity,"Nature,256:495-497(1975))，在无菌下制备免疫的小鼠脾细胞并与SP2/0细胞融合。随后在DMEM/20％FCS/HAT培养基中将融合的“杂交细胞”分配至96孔板中。融合后7-10天在显微镜下观察存活的杂交瘤克隆，并于随后根据以下程序使用ELISA格式对来自每个孔的上清液进行杂交瘤筛选：<1>4℃下用50ul的人ErbB2(2.0μg/ml，在PBS中)包被ELISA板过夜；<2>用250ul PBS/0.5％吐温20将板洗涤3次，并用200ul封闭缓冲液(2％BSA，在具有0.5％吐温20的PBS中)封闭；<3>将稀释的血清或杂交瘤上清液(100ul)加入每个孔中，并在室温下孵育1小时；<4>然后用PBS/0.5％吐温20将板洗涤3次，将山羊抗小鼠IgG-HRP用于检测，并在450nm处观察结合OD。然后选择分泌与重组人ErbB2-ECD结合的抗体的阳性杂交瘤，并转移至新的96孔板用于随后的基于细胞的结合筛选。本发明的融合产生约30000～40000个HAT抗性的存活杂交瘤，产生1415个与重组人ErbB2-ECD蛋白特异性结合的阳性杂交瘤。此类杂交瘤筛一个选板如下表4所示，其中阳性杂交瘤划有下划线并为斜体。
实施例2.具有针对细胞膜ErbB2的高比例的差异结合活性的抗体的基于细胞的筛选
在完成实施例1中的ELISA筛选后，将ErbB阳性杂交瘤转移至新的69孔板，并用无HAT选择的新鲜的DMEM培养基饲养，3-5天后，对杂交瘤培养基进行细胞结合筛选。简而言之，以1～5x105个细胞/孔将SK-BR3细胞(ATCC#HTB-30，高水平ErbB2)或MCF7细胞(ATCC#HTB-30，低水平ErbB2)分配至96孔(圆底)板中，并在4℃下与杂交瘤上清液(50ul)孵育1小时。然后用FACS缓冲液(具有2％FBS的PBS，pH 7.2)将细胞洗涤3次，并重悬于100ul山羊抗小鼠IgG-F(ab)2-Alexa(JIR#:115-545-006)中。在4℃下孵育1小时后，然后用FACS缓冲液(具有2％FBS的PBS，pH 7.2)将细胞洗涤3次，然后重悬于FACS缓冲液中，随后通过FACS仪器(FACSCaliburTM流式细胞分析仪,BD Biosciences)进行结合信号收集和分析。计算相同的杂交瘤上清液与SK-BR3细胞以及与MCF7细胞的结合信号，并进一步计算SK-BR3结合/MCF7结合的比率。在来自上述ELISA筛选的1415个阳性杂交瘤中，分离了具有更高SK-BR3结合/MCF7结合克隆比率(如克隆A2、克隆A7、克隆A11、克隆B2、克隆B5、克隆B7、克隆B9等)的前672个杂交瘤作为阳性克隆，以用于细胞建库和随后的功能筛选。此类细胞结合筛选的一个板如下表5所示。
在完成基于细胞的筛选后，将具有高等级的SK-BR3/MCF7比率的前672个杂交瘤转移至新的96孔板。在培养3～5天后，收集每个孔的杂交瘤培养基以用于随后的表位分组和基于细胞的功能筛选，并将对应的细胞冷冻在液氮中用于长期储存。
实施例3.基于与曲妥珠单抗竞争的杂交瘤上清液的表位分组
基于实施例2中的来自细胞结合筛选的阳性杂交瘤细胞，用基于基准抗体(例如，曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗)的表位分组进一步评估每种细胞系的杂交瘤上清液，以将本发明的抗体分成两个类别：基准竞争组和基准非竞争组。简而言之，用重组人ErbB2-ECD(0.1ug/ml)包被96孔ELISA板，并在4℃下孵育过夜。通过丢弃和在滤纸上轻拍来去除包被溶液，并添加200ul/孔的封闭缓冲液，37℃下孵育2h。加入50ul目标抗体，并在37℃下孵育30分钟，然后加入50ul 0.03ug/ml生物素标记的基准抗体(例如，生物素-曲妥珠单抗或生物素-帕妥珠单抗)，并在37℃下另外孵育30分钟，然后用PBST将板洗涤3次。加入100ul/孔的链霉亲和素-HRP(1:5000)，在37℃下孵育30分钟。用PBST洗涤3次。加入100ul/孔的TMB底物，并在室温下孵育15分钟。加入50ul/孔的1N HCl以终止反应。用微孔板读数仪在450nm波长处对板读数。下表6示出了曲妥珠单抗竞争性ELISA结果。在表6中，F7孔是正常人IgG(作为对照)，G7孔是正常小鼠IgG(作为对照)，H7孔是基准对照(即曲妥珠单抗，5ug/ml)。如表6中所示的，曲妥珠单抗而非人IgG或小鼠IgG阻断生物素-曲妥珠单抗的ErbB2-ECD结合能力。类似地，样品C6、C7、D2、D3、D4和H1～H6(加粗的、斜体的且有下划线的)显示某些抑制活性，表明它们结合与曲妥珠单抗表位相同或重叠的表位。该板中剩余的样品(如A1～A7)未抑制曲妥珠单抗对重组人ErbB2-ECD的结合活性，表明这些抗体结合不同于曲妥珠单抗表位的表位。基于曲妥珠单抗表位竞争性分组，本发明成功地鉴定了结合不同于曲妥珠单抗结合表位的表位的ErbB2抗体。
实施例4.基于曲妥珠单抗的筛选具有协同性生物活性的抗体
与标准方法不同，本发明在早期阶段进行了大规模的基于曲妥珠单抗的协同性生物活性筛选。对于分离自实施例2的抗原阳性杂交瘤，还针对其抑制BT474乳腺癌细胞和/或MDA-MB-VII175细胞的细胞增殖的曲妥珠单抗协同性功效，进一步筛选了每种杂交瘤的细胞培养物上清液。简而言之，以2000个细胞/孔将细胞接种至具有100ul培养基的板中。在细胞接种的第二天，吸取40ul细胞培养基，然后加入60ul包括基准抗体(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗以及曲妥珠单抗+帕妥珠单抗的组合)的抗体样品、来自实施例2的单独杂交瘤上清液，和曲妥珠单抗与来自实施例2的每种单独杂交瘤上清液的组合。继续培养细胞120-144小时。加入CellTiter Glo 10分钟。通过SpectraMax M5板读数仪分析测试细胞培养板。优选地，为了筛选出协同性地促进曲妥珠单抗抑制细胞增殖的杂交瘤上清液，目标样品的集合包括：(a)仅曲妥珠单抗活性组(HOA)；(b)仅帕妥珠单抗活性组(POA)；(c)曲妥珠单抗/帕妥珠单抗(50％曲妥珠单抗/50％帕妥珠单抗)组合组(HPC)；(d)Mab独立性活性组(MIA)：测试中的杂交瘤上清液样品；(e)曲妥珠单抗协同性活性组(HSA)：曲妥珠单抗+测试中的杂交瘤上清液样品；(f)阴性对照组(NC)：人IgG+小鼠IgG。选择曲妥珠单抗协同性候选物的标准是基于如下：在相同的条件下，如果HAS的细胞增殖抑制活性高于HOA或MIA的活性，并且高于HOA+MIA的总和的50％，则测试中的样品在细胞增殖抑制测定中含有曲妥珠单抗协同性生物活性。优选地，在相同的细胞培养条件下，如果HAS的细胞增殖抑制活性高于HPC(曲妥珠单抗/帕妥珠单抗组)的细胞增殖抑制活性，则测试中的样品被认为展现出比帕妥珠单抗的生物活性更高的曲妥珠单抗协同性生物活性。在上述筛选后，对来自实施例2的前672种杂交瘤上清液进行评估，并针对它们细胞增殖抑制的曲妥珠单抗协同性生物活性进行分级，并通过有限稀释对前15种候选物进行亚克隆，以确保每种细胞系的克隆形成能力。其中，将例如5种杂交瘤细胞系(4C9、4H2、4G6、5F12和5G9)用于抗体产生，并针对它们的曲妥珠单抗协同性生物活性，根据上述方案进一步验证对应的纯化的IgGs。结果概括在实施例5地表11中。
实施例5.本发明的抗体的生物化学特征本发明的纯化的IgG的ErbB2结合活性验证
对本发明的5种抗体的对应的纯化IgG进行SDS-PAGE分析，且结果显示在图1中。所有5种抗体同种型为IgG1/κ，其能够与重组ErbB2-ECD和ErbB2阳性细胞结合(参见下表7)。
本发明的抗体的ErbB2结合EC50
还通过捕获ELISA，针对它们对重组人ErbB2的结合活性，评估了本发明的5种抗体对应的纯化IgG。方案简要描述如下：用0.5μg/ml抗ErbB2抗体包被96孔板过夜，37℃下通过在含1％BSA的PBST中封闭1小时。加入以2μg/ml起始以1:5连续稀释的生物素-人ErbB2-ECD的连续稀释样品。用PBST将板洗涤3次，并向每个孔中加入100ul的HRP-链霉亲和素(1:5000)。37℃下另外孵育40min。用PBST将板洗涤3次，并加入100ul/孔的TMB以在RT下发展15min，然后用50ul 1N HCl淬灭。在450nm处读取板的OD值。通过使用Prism软件计算结合EC50，且结果显示在下表8中。
本发明的抗体与来源于不同物种的ErbB2的结合能力
使用实施例1中描述的间接ELISA，检查了本发明的抗体与来源于不同物种(如小鼠、大鼠、恒河猴(Macaca mulatta)、食蟹猴(Macaca fascicularis)和人)的重组ErbB2-ECD的结合活性。简而言之，以100ul/孔用1ug/ml的不同物种的重组ErbB2-ECD包被96孔ELISA板，并在4℃下孵育过夜。通过丢弃和在滤纸上轻拍去除包被溶液。加入200ul/孔的封闭缓冲液，在37℃下孵育1-2小时。加入本发明的纯化的抗体并在37℃下孵育1小时。用PBST将板洗涤3次，加入山羊抗小鼠IgG-HRP(100ul/孔)，在37℃下孵育1小时。用PBST将板洗涤3次，15min后加入100ul/孔的TMB，加入50ul/孔的1N HCl。用微孔板读数仪在450nm波长处对板读数。结果概括在下表9中，表明本发明的5种抗体对来源于恒河猴、食蟹猴的重组ErbB2交叉反应，但不与大鼠和小鼠对应物交叉反应。
本发明的纯化的抗体的表位分组
与实施例3中描述的方法不同，通过竞争性ELISA之后的捕获ELISA评估纯化抗体的表位分组。<1>进行捕获ELISA以测定生物素标记的重组ErbB2-ECD的结合EC80的浓度。简而言之，用0.5μg/ml抗ErbB2抗体包被96孔板过夜，37℃下通过含1％BSA的PBST封闭1小时。用PBST将板洗涤3次，并向每个孔中加入100ul的HRP-链霉亲和素(1:5000)。37℃下另外孵育40分钟。用PBST将板洗涤3次并加入100ul/孔的TMB以在RT下发展15min，然后用50ul 1NHCl进行淬灭。在450nm处读取板的OD值，以获得生物素标记的重组ErbB2-ECD对每种测试抗体的EC80浓度；<2>进行竞争性ELISA以测定两种抗体是否结合不同的表位或相同的表位。两种抗体结合抗原的交叉竞争能力越高，则两种抗体的相同表位越多(或两种测试抗体的表位不同的可能性越低)。简而言之，根据以上相同的程序包被96孔板。向板中加入EC80浓度的ErbB2-ECD-生物素的预孵育混合物和10μg/ml测试抗体，孵育1小时。用PBST将板洗涤3次，并向每个孔中加入100μl的HRP-链霉亲和素(1:5000)。37℃下另外孵育40分钟。根据与以上捕获ELISA相同的程序获得OD450值，并计算交叉竞争能力。当它们的交叉竞争能力不小于80％时，两种抗体被认为结合相同的表位。表10中显示的4C9、4H2、4G6、5F12和5G9在彼此间展现出强的交叉竞争能力，但不与结合ErbB2-ECD的曲妥珠单抗或帕妥珠单抗竞争，表明本发明的抗体结合相同的表位或高度重叠的表位，但不同于曲妥珠单抗表位或帕妥珠单抗表位。
本发明的抗体的曲妥珠单抗协同性生物活性
通过使用实施例4中所描述的方法，通过BT-474细胞增殖抑制测定评估通过本发明分离的纯化抗体(4C9、4H2、4G6、5F12和5G9)的曲妥珠单抗协同性生物活性。结果(参见图2A-2E和表11)证明了本发明的抗体展现出细胞增殖的某些抑制活性，但当与曲妥珠单抗组合时展现出强的协同性抑制活性。曲妥珠单抗加本发明的抗体的细胞增殖抑制活性高于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(临床中使用的已知的组合)的活性。
实施例6.通过DNA克隆和测序推导抗ErbB2单克隆抗体的可变区蛋白序列
使用Trizol试剂(Invitrogen,15596)，采用以下方案从杂交瘤细胞团提取总RNA。加入1ml的Trizol试剂以破坏细胞(在DPBS中制备了约1x107个细胞)，并在室温下孵育5分钟。加入200ul的氯仿。剧烈振荡15秒。在室温下孵育3分钟。4℃下以12,000×g离心15分钟。转移水相至新的1.5ml离心管中。加入500ul的异丙醇。室温下孵育10分钟。4℃下以12,000×g离心10分钟。用1ml 75％乙醇洗涤。4℃下以7500rpm离心5分钟。空气干燥10分钟。重悬于40ul的DEPC处理的水中。55℃下孵育10分钟。在核酸检测仪(Nanodrop)上测量A260。
随后，使用SuperScript III第一链合成超级混合物(SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix，Invitrogen,18080-400)，根据以下方案将2ug的总RNA用于合成第一链cDNA：
在热循环仪中于65℃下孵育5分钟，然后立即置于冰上2分钟。在向冰上的管中加入以下试剂：10μl 2×第一链反应混合物和2μl SuperScriptR III/核糖核酸酶OUTTM酶混合物。通过涡旋混合样品，然后短暂离心。50℃下孵育50分钟。将反应在85℃下终止5分钟。在冰上冷却。然后将产生的cDNA作为PCR扩增可变区抗体的模板。使用第一链cDNA、来自小鼠Ig引物集合的引物(Novagen，目录号69831-3)和Taq DNA高保真聚合酶(Invitrogen,11304)进行PCR。为了扩增重链可变区，PCR样品组合如下：27μl PCR超级混合物+1μl反向引物MuIgG VH3’-2+1μl cDNA+1μl MuIg-5’前导引物。为了扩增轻链可变区，PCR样品组合如下：27μl PCR超级混合物+0.25μl反向引物MuIgK VL3’-1+1μl cDNA+1μlMuIg-5’前导引物。
对于利用前导引物的反应，VH-A、VH-B、VL-A和VL-B使用以下PCR循环：步骤1-变性94℃2min；步骤2-变性94℃30sec；步骤3-退火50℃30sec；步骤4-延伸72℃1min；35个循环，步骤2至4；步骤5-最终延伸72℃5min；步骤6-冷却4℃永远。
对于用前导引物的反应，VH-C至VH-F和VL-C至VL-G使用以下PCR循环：步骤1-变性94℃2min；步骤2-变性94℃30sec；步骤3-退火60℃30sec；步骤4-延伸72℃1min；35个循环，步骤2至4；步骤5-最终延伸72℃5min；步骤6-冷却4℃永远。
在1.2％琼脂糖凝胶上运行PCR产物，并切下预期大小(400-500bp)处迁移的条带用于DNA提取。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAquickGel Extraction Kit Qiagen，目录号28704)，根据以下方案纯化DNA：对凝胶切片称重，向每份凝胶切片中，加入3份体积的缓冲液QG至1份体积的凝胶。将样品在50℃下孵育10分钟直至凝胶切片完全溶解，每2-3分钟进行混合。然后将一份凝胶体积的异丙醇加入到每个样品中并混合。然后将样品施加于QIAquick柱，并以13000rpm离心1分钟。为了洗涤，将750ul的缓冲液PE加入到样品中并在13000rpm下旋转1分钟。然后将柱以13,000rpm离心另外一分钟以完全除去残留的乙醇。通过向每个柱中加入30μl的H20并通过在13,000rpm下旋转1分钟来洗脱DNA。然后对纯化的PCR产物测序以鉴定可变区序列(下表12)。
实施例7.嵌合抗体的产生和表征
将抗ErbB2单克隆抗体的重链和轻链的可变结构域(上表12)分别框内克隆至人IgG1重链和κ轻链恒定区。在捕获ELISA测定中证实了所得嵌合抗体的活性(下表13)，且它们与它们的亲本小鼠单克隆抗体相当。
按照实施例5中所描述的相同方法，检查本发明的嵌合抗体结合来源于不同物种(如小鼠、大鼠、恒河猴、食蟹猴和人)的重组ErbB2-ECD的结合活性。结果显示在下表14中。
验证嵌合抗体的曲妥珠单抗协同性生物活性
按照与实施例5中所描述的相同程序，评估了相应的嵌合抗体的抑制BT474乳腺癌细胞的细胞增殖的曲妥珠单抗协同性效力，。结果概括在表15中。
实施例8.抗ErbB2小鼠单克隆抗体5F12的人源化
将5F12小鼠抗ErbB2抗体(上表12)人源化。基于最同源的人种系将人源化的变体氨基酸序列VH.v1、VH.1、VH.2、VH.3、VH.4、VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5、VL.6(下表16)转化为DNA序列，并进行合成。对于重链变体，使用了人种系重链受体序列hIGHV1-46FR1、hIGHV1-46 FR2、hIGHV1-46 FR3和hIGHJ4 FR4(参见上表2)。对于轻链变体VL.l、VL.la和VL.lb，使用了人种系轻链受体序列hIGKV1-33 FR1、hIGKV1-33 FR2、hIGKV1-33 FR3和hIGKJ1 FR4(参见上表3)。对单独的构建体进行序列验证以检查准确性。然后将阳性变体接种至250mis加氨苄青霉素的LB培养基(Luria broth)中，并在37℃下培养过夜。使用Qiagenmaxi prep试剂盒从变体培养物提取DNA。
通过将VH.v1、VH.1、VH.2、VH.3或VH.4的每种重链变体与VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5和VL.6的每种轻链变体组合来产生人源化的抗体(总共35种变体)(下表17)。
其中，选择11种具有最小回复突变的变体用于抗体生产和纯化，并通过捕获ELISA评估它们的ErbB2结合EC50。结果(参见下表18)表明，与5F12嵌合抗体相比，11种变体中除一种外均展现出等同的ErbB2结合EC50。
实施例9.抗ErbB2小鼠单克隆抗体5G9的人源化
将5G9小鼠抗ErbB2抗体(上表12)人源化。基于最同源的人种系将人源化的变体氨基酸序列VH.v1、VH.1、VH.2、VH.3、VH.4、VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5、VL.6(下表19)转化为DNA序列并进行合成。对于重链变体，使用了人种系重链受体序列hIGHV1-69 FR1、hIGHV1-69 FR2、hIGHV1-69 FR3和hIGHJ1 FR4(参见上表2)。对于轻链变体VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5、VL.6，使用了人种系轻链受体序列hIGKV1-27 FR1、hIGKV1-27 FR2、hIGKV1-27 FR3和hIGHJ1 FR4(参见上表3)。对单独的构建体进行序列验证以检查准确性。然后将阳性变体接种至250ml加氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃下培养过夜。使用Qiagen maxi prep试剂盒从变体培养物提取DNA。
通过将VH.v1、VH.1、VH.2、VH.3、VH.4和VH5的每种重链变体与VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5和VL.6的每种轻链变体组合来产生人源化的抗体(总共42种变体)(下表20)，。
其中，选择具有最小回复突变的12种变体用于抗体产生和纯化，并通过捕获ELISA评估它们的ErbB2结合EC50。结果(参见下表21)表明，与5G9嵌合抗体相比，6/12的变体展现出较低的ErbB2结合EC50。
实施例10.抗ErbB2抗体混合物在BT474异种移植模型中的体内功效
由Crown Bioscience以合同号E0627-T1401商业进行BT474乳腺癌异种移植肿瘤模型的体内研究。本研究检查了以下抗肿瘤活性：(a)用单独的曲妥珠单抗治疗；(b)曲妥珠单抗与通过本发明分离的任一种抗体的组合；(c)曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合。
以12小时光照/12小时黑暗的每日循环、室温21.9-23.8℃、湿度40～45％将雌性NOD/SCID小鼠，年龄6-8周；体重17.7-26.0g(Beijing HFK Bioscience Co.,Ltd.中国)维持在无特定病原的条件下。到达后，将动物关在动物设施的隔离区部分1周，以适应新的环境和用于观察。定期进行连续的健康监测。随意提供膳食(通过放射性同位素60Co辐射)和水。
在有10％FBS的DMEM中培养人乳腺癌细胞系BT474。在细胞生长达到对数期阶段后，收集细胞并用PBS洗涤，随后稀释至合适的浓度。在以1:1体积比与重建的基底膜(Matrigel；Collaborative Research,贝德福德,Mass.)混合后，在小鼠***垫下接种细胞(1×107个细胞/小鼠)。当植入的肿瘤体积达到约151mm3时，将小鼠随机分成8组(6只小鼠/组)，包括：(a)第1组：PBS(媒介物对照)；(b)第2组：PC(仅曲妥珠单抗，3mg/kg)；(c)第3组：曲妥珠单抗+4C9的组合(1.5mg/kg+1.5mg/kg)；(d)第4组：曲妥珠单抗+4H2的组合(1.5mg/kg+1.5mg/kg)；(e)第5组：曲妥珠单抗+4G6的组合(1.5mg/kg+1.5mg/kg)；(f)第6组：曲妥珠单抗+5F12的组合(1.5mg/kg+1.5mg/kg)；(g)第7组：曲妥珠单抗+5G9的组合(1.5mg/kg+1.5mg/kg)；(h)第8组：曲妥珠单抗+帕妥珠单抗的组合(1.5mg/kg+1.5mg/kg)。前两周每周治疗小鼠，然后随后两周每周两次治疗小鼠，总共7次剂量。通过尾静脉注射施用测试抗体。
在本研究中，在治疗开始后第32天媒介物处理的小鼠的平均肿瘤大小达到1064mm3。PC组治疗(仅曲妥珠单抗，3mg/kg)展现出残余的抗肿瘤活性，导致在第32天平均肿瘤大小为65mm3，T/C值为95％，小于，然而根据肿瘤体积，与媒介物对照相比未观察到显著差异(P＝0.24)，表明曲妥珠单抗在3mg/kg的低剂量下具有很小的抗肿瘤活性。相反，在相同的剂量日程下，与媒介物对照相比，曲妥珠单抗与通过本发明分离的抗体中的一种或与帕妥珠单抗的组合显示中等至显著更强的抗肿瘤活性。优选地，在相同的剂量治疗下，曲妥珠单抗+5F12或曲妥珠单抗+5G9的组合极大地抑制肿瘤生长，其T/C值为47％或53％(分别为p<0.03或p<0.001)，证明5F12或5G9能够显著增强曲妥珠单抗治疗的抗肿瘤功效。更优选地，与帕妥珠单抗(当前在临床中使用的一种已知的药物)相比，5F12和5G9证明显著更高的针对曲妥珠单抗介导的抗肿瘤功效的协同性活性(分别为p<0.07和p<0.006)。在图3A-3B和表22中显示了曲妥珠单抗加通过本发明分离的抗体的组合的抗肿瘤功效的结果。
实施例11.抗ErbB2抗体混合物在NCI-N87胃模型中的体内功效(5G9、5F12)
将NCI-N87异种移植模型用于进一步评估与曲妥珠单抗组合的本发明的抗体协同性功效。本研究的程序简要概括如下：<1>将NCI-N87细胞培养至对数期并收集；<2>将NCI-N87细胞重悬于PBS中，调整细胞密度至8×107个细胞/ml，并经皮下将100μl或8×107个细胞注射至无胸腺裸雌性小鼠的左侧腹区域中；<3>在将小鼠随机分组前，允许肿瘤生长至约100～200mm3大小；<4>动物以所示剂量每周两次接受抗体的腹膜内施用，且每周两次测定肿瘤大小以及体重。使用公式TV＝1/2×a×b2计算肿瘤体积(TV)，其中“a”表示较大的肿瘤直径，且“b2”表示最小的肿瘤直径。
表23中显示了曲妥珠单抗与5G9、5F12或帕妥珠单抗的组合对NCI-N87肿瘤生长的体内功效的研究设计。该研究的第一阶段旨在评估不同剂量(5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg)的5G9、5E12及它们与曲妥珠单抗的组合的功效。本研究的第2阶段具体关注两个方面：<1>从第26天开始，与曲妥珠单抗高剂量组(15mg/kg)相比，向低剂量(5mg/kg)的5G9和5F12的单一治疗加入曲妥珠单抗(5mg/kg)是否能够重建协同性功效。<2>从第26天开始，在无进一步治疗的相同的剂量(5mg/kg+5mg/kg)下，与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的抗肿瘤功效相比，曲妥珠单抗与5G9或5E12的组合是否能够维持它的抗肿瘤功效。
在表24中概括了本研究的第一阶段结果。研究结论概括如下：<1>5mg/kg剂量的曲妥珠单抗治疗展现出强的抗肿瘤活性，导致在第22天平均肿瘤大小为227mm3，TGI值(即，TGI＝(1–治疗的肿瘤的平均体积/对照肿瘤的平均体积)×100％)为43.59％，根据肿瘤体积，当与媒介物对照相比时观察到统计上显著的差异(第2组相对于第1组，P<0.01)。然而，曲妥珠单抗治疗的3倍增加(15mg/kg)不能够显著增强其功效(第3组相对于第2组，P>0.05)，证明曲妥珠单抗的抗肿瘤功效在达到一定剂量(如5mg/kg)后将不会提高；<2>然而，曲妥珠单抗与5G9或5F12在较低剂量(5mg/kg+5mg/kg)的组合显示出比高剂量(15mg/kg)的5G9、5F12或曲妥珠单抗的单一治疗高得多的抗肿瘤功效。根据肿瘤体积，在第22天观察到组合治疗(第8组、第10组)与单一治疗(第5组、第7组和第3组)之间的极显著的差异(第8组或第10组相对于第5组、第7组或第3组，P<0.01)，提供了曲妥珠单抗与5G9或5F12的组合展现出强的协同性抗肿瘤功效的证据；<3>在相同的剂量治疗(5mg/kg+5mg/kg或15mg/kg+15mg/kg)下，曲妥珠单抗与5G9的组合显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的抗肿瘤活性高得多的抗肿瘤活性，导致在第22天平均肿瘤大小为8.75mm3或7.23mm3，TGI值为98.31％或98.61％。当与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗对照组的组合相比时，观察到极显著差异(在第22天为46.83mm3或21.41mm3，TGI值为90.97％或95.87％，P<0.05或P<0.01)。这些结果表明，与帕妥珠单抗不同，5G9当与曲妥珠单抗组合时具有独特的协同性活性；<3>在相同的剂量治疗(15+15mg/kg)下，曲妥珠单抗与5G12的组合显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的抗肿瘤活性高得多的抗肿瘤活性，导致在第22天平均肿瘤大小为1.45mm3，TGI值为99.72％。当与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗对照组的组合相比时，观察到极显著的差异(在第22天为21.41mm3，TGI值为95.87％，P<0.01)。该结果证明，与帕妥珠单抗不同，5F12当与曲妥珠单抗组合时具有独特的协同性活性。
为了研究向现有的单一的5G9或5F12治疗中加入曲妥珠单抗是否会重建协同功效，在第一阶段研究后至第二阶段结束，将5G9(5mg/kg)或5F12(5mg/kg)的单一治疗与5mg/kg的曲妥珠单抗剂量进一步组合。如表25中所示的，尽管，5mg/kg剂量的5G9或5F12的单一治疗展现出比15mg/kg剂量的曲妥珠单抗的抗肿瘤活性显著更低的抗肿瘤活性，在第26天平均肿瘤大小分别为424.57mm3或386.92mm3，且TGI至分别为54.23％或25.41％，而在第26天15mg/kg剂量的曲妥珠单抗治疗的平均肿瘤大小为190.75mm3，且TGI值为63.23％(第4组或第6组相对于第3组，P＝0.003<0.01或P＝0.012<0.05)。然而，在从第26天开始向甚至5mg/kg+5mg/kg剂量的5G9或5F12的单一治疗加入曲妥珠单抗后，组合治疗能够重建协同性抗肿瘤功效，以赶上仅曲妥珠单抗高剂量治疗的功效，导致在第57天最终平均肿瘤大小为1305.11mm3或879.9mm3，TGI值为39.11％或58.95％，与15mg/kg剂量的曲妥珠单抗治疗的那些(在第57天平均肿瘤大小为888.57mm3，TGI值为58.55％)无显著差异(第4组或第6组相对于第3组，分别为P＝0.165>0.05或P＝0.491>0.05)。类似地，5mg/kg+5mg/kg剂量的5G9+曲妥珠单抗或5F12+曲妥珠单抗的组合治疗的肿瘤体积进展速率比15mg/kg的高剂量的曲妥珠单抗治疗的肿瘤体积进展速率低得多，导致5G9/曲妥珠单抗组合或5F12/曲妥珠单抗组合为192.60％或130.97％，相对于仅曲妥珠单抗治疗的292.92％，同时，5mg/kg+5mg/kg剂量的5G9+曲妥珠单抗或5F12+曲妥珠单抗的组合治疗的TGI的进展速率比15mg/kg的高剂量的曲妥珠单抗治疗的进展速率高得多，导致5G9/曲妥珠单抗组合或5F12/曲妥珠单抗组合为39.93％或53.52％，相对于仅曲妥珠单抗治疗的-7.71。总之，结果表明5G9或5F12与曲妥珠单抗的组合展现出强的协同性抗肿瘤功效。
为了研究曲妥珠单抗与5G9或5E12的组合是否能够比曲妥珠单抗/帕妥珠单抗组合维持更佳的抗肿瘤功效，对该评估使用了较低剂量(5mg/kg+5mg/kg)的处理，因为所有3种组合(曲妥珠单抗/5G9、曲妥珠单抗/5F12和曲妥珠单抗/帕妥珠单抗)的高剂量处理到第22天时均导致几乎完全的肿瘤去除。如表26中所示的，在停止治疗后，曲妥珠单抗/5G9组或曲妥珠单抗/5F12组中的肿瘤进展相当缓慢，对于曲妥珠单抗/5G9组或曲妥珠单抗/5F12组，肿瘤进展速率分别为93.55％或125.81％，但对于曲妥珠单抗/帕妥珠单抗组为351.85％。根据肿瘤体积，在第26天相对于第57天，对于曲妥珠单抗/5G9组(P＝0.278>0.05)或曲妥珠单抗/5F12组(P＝0.064>0.05)，未观察到统计上显著的差异。相反，根据肿瘤体积，在第26天相对于第57天，对于曲妥珠单抗/帕妥珠单抗治疗组观察到统计上显著的差异(P＝0.03<0.05)。另外，在第26天至第57天之间，曲妥珠单抗/5G9组或曲妥珠单抗/5F12组的TGI保持高度不变，但在曲妥珠单抗/帕妥珠单抗组中轻微下降。总之，这些结果表明曲妥珠单抗/5G9或曲妥珠单抗/5F12的组合治疗比曲妥珠单抗/帕妥珠单抗组具有显著更佳的功效。
实施例12.本发明的抗体及其组合的基于细胞的内化率
为了检查两种抗体组合对它们的内化率的协同性效应，进行了基于细胞的内吞作用测定。简要程序如下：<1>用PBS洗涤SKBR3细胞，然后在37℃下用胰蛋白酶消化～2min。将细胞重悬于冷的FACS缓冲液中，并调节至3×106个细胞/ml；<2>向FACS管中加入1ml的细胞悬浮液，其中加入了终浓度为2ug/ml的FITC缀合的或APC缀合的抗体(曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或本发明的抗体)或它们的组合。在冰上将细胞孵育1小时。然后在4℃下以1000rpm将细胞离心5min；并轻轻倒出上清液。然后用FACS缓冲液将细胞洗涤两次，并重悬于1ml FACS缓冲液中。将2×200ul的细胞悬浮液当作对照，并分别在0min时取样。将余下的细胞在4℃下以1000rpm离心5min，以去除上清液；<3>将细胞重悬于培养基(DMEM+10％FBS+PS)中，并在37℃下孵育以用于内化。然后，分别在30min和2小时时取200ul的样品。将样品在冰上冷却5min，并在4℃下以1000rpm离心5min以去除上清液，然后用FACS缓冲液洗涤1次；<4>向细胞中加入250ul条带(strip)缓冲液，并在RT下孵育7min。然后将细胞在4℃下以1000rpm离心5min以去除上清液，并用FACS缓冲液洗涤两次；<5>向细胞中加入200ul固定缓冲液，并在4℃下孵育至少30min。然后通过流式细胞仪分析细胞；<6>对于0min时在步骤2中采集的对照和样品，一个用固定缓冲液直接固定(步骤5)，另一个用步骤4和步骤5处理(使用条带缓冲液和固定缓冲液)；<7>抗体或抗体组合的内化率计算为：平均百分比变化＝[内化组(MFI-MFI空白)]/[结合亲和力组(MFI-MFI空白)]。
如表27中所示的，在SKBR3细胞中所有测试抗体(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、4C9、4H2、4G6、5F12和4G9)显示抗原-抗体内化现象。与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗不同，本发明的每种单独抗体(4C9、4H2、4G6、5F12和4G9)显示出比曲妥珠单抗或帕妥珠单抗高得多的内化率。其中，4C9和5F12显示出比曲妥珠单抗极显著的更高的内化率(P<0.05)，支持了本发明的抗体(特别是4C9、5F12和4G9)能够成为抗体-药物缀合物应用的更佳候选物。
如表28中所示的，当与本发明的抗体组合时，曲妥珠单抗的内化率比仅曲妥珠单抗极显著更高(P<0.01)，证明了本发明的抗体能够显著增强曲妥珠单抗的内化率，并因此可能能够提高曲妥珠单抗-药物缀合物(即T-DM1)治疗功效。
实施例13.PDX赫赛汀抗性胃模型胃癌异种移植模型中抗ErbB2抗体组合的体内功效
作为Crown Bioscience(北京)(公司中已建立并验证的PDX模型，选择来源于69岁亚洲女性患者的胃癌异种移植模型GA0060用于该功效研究。由CrownBioscience公司(北京)按照合同号E0627-T1501/T1502进行抗ErbB2抗体组合在治疗Balb/c裸小鼠中的/>胃癌异种移植模型GA0060中的体内功效研究。简而言之，收获来自接种了选择的原发性的人胃癌组织的原种小鼠的肿瘤片段，并用于接种至BALB/c裸小鼠中。每只小鼠在右侧腹经皮下接种原发性的人胃癌模型GA0060片段(P7，2-4mm直径)以用于肿瘤发展。当平均肿瘤大小达到约200mm3时开始治疗。根据它们的肿瘤大小将小鼠随机分配至12个实验组，每组6只小鼠。这天指定为第0天。根据下表29中所示出的预定的方案，从第0天至第28天向荷瘤的小鼠施用测试品。
在表30和图4A-4B中概括了该研究的结果。在治疗开始后第35天媒介物治疗的小鼠的平均肿瘤大小达到1201.1mm3。在相同的测试下：<1>仅曲妥珠单抗治疗展现出微小的抗肿瘤活性，导致在第35天平均肿瘤大小为932.7mm3，T/C值为77.7％，根据肿瘤体积，与媒介物对照相比，未观察到显著差异(P＝0.161>0.05)；<2>与仅曲妥珠单抗治疗相比，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗治疗的组合展现出甚至更小的抗肿瘤功效，导致在第35天平均肿瘤大小未994.6mm3，T/C值为82.8％，与媒介物对照相比，未观察到显著差异(P＝0.217>0.05)；<3>曲妥珠单抗和5F12治疗的组合显示出比仅曲妥珠单抗治疗更强的功效，导致在第35天平均肿瘤大小为691.6mm3，T/C值为57.6％，根据肿瘤体积，与媒介物对照相比，观察到极显著的差异(P＝0.004<0.01)；<4>曲妥珠单抗和5G9处理的组合展现出比仅曲妥珠单抗治疗更强的功效，导致在第35天平均肿瘤大小为608.8mm3，T/C值为50.7％，根据肿瘤体积，与媒介物对照相比，观察到极显著的差异(P＝0.004<0.01)。
本文中引用的所有文件、书籍、手册、论文、专利、发表的专利申请、指南、摘要和/或其他的参考文献均通过引用整体并入本文中。考虑本文中公开的本发明的说明书和实施方式，本发明的其他实施方案对本领域技术人员将会是显而易见的。旨在说明书和实施例被认为仅是示例性的，本发明的真实范围和精神通过以下权利要求指示。
表1.人IgG重链和轻链恒定区的序列
表2.重链受体序列
SEQ ID 蛋白区/最接近种系家族 氨基酸序列
1234567890123456789012345678901234567890
3 hIGHV1-46 FR1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
4 hIGHV1-46 FR2 WVRQAPGQGLEWMG
5 hIGHV1-46 FR3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
6 hIGHJ4 FR4 WGQGTLVIVSS
161 hIGHV1-69 FR1 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS
162 hIGHV1-69 FR2 WVRQARGQGLEWMG
163 hIGHV1-69 FR3 RVTTTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
表3.轻链受体序列
SEQ ID 蛋白区/最接近种系家族 氨基酸序列
1234567890123456789012345678901234567890
7 hIGKV1-33 FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
8 hIGKV1-33 FR2 WYQQKPGKGPKLLIY
9 hIGKV1-33 FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
10 hIGKJ1 FR4 FGQGTKVEIK
164 hIGKV1-27 FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
165 hIGKV1-27 FR2 WYQQKPGKGPKLLIY
166 hIGKV1-27 FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAITYYC
表4.抗ErbB2杂交瘤筛选(间接ELISA)——一个实例(在实施例1中)
注意：H11：阴性对照-PBS，H12：阳性对照(多克隆血清)
表5.杂交瘤上清液的基于细胞的结合筛选——一个实例
注意：H11：正常小鼠血清，H12：阳性对照(融合血清)，剩余的孔：杂交瘤上清液。比值大于2的样品被认为是阳性克隆，比例越高，选择用于进一步评估的优先性越高。
表6.杂交瘤上清液的表位分组(曲妥珠单抗竞争性ELISA)
注意：F7：hIgG 5ug/ml，G7：mIgG 5ug/ml，H11：曲妥珠单抗5ug/ml，其他孔：杂交瘤上清液
表7.通过本发明分离的单克隆抗体
表8.本发明的抗体的ErbB2-ECD结合
表9.通过本发明分离的抗体的跨种结合
注意：“+”指示结合活性；“－”指示无结合活性
表10.本发明的纯化的抗体的表位分组
注意：“－”指示由于结合“相同的”表位而产生的竞争性关系；“+”指示由于结合不同的表位而产生的非竞争性关系。
表11.本发明的抗体的细胞增殖抑制的功效
注意：*指示至少两个实验的范围
表12.本发明的小鼠抗ErbB2单克隆抗体的VH和VL氨基酸序列
表12.(续)
表13.嵌合抗体的重组ErbB2-ECD结合EC50
嵌合抗体 ELISA EC50(nM)
4C9嵌合体 0.114
4H2嵌合体 0.118
4G6嵌合体 0.020
5F12嵌合体 0.024
5G9嵌合体 0.049
曲妥珠单抗 0.013
帕妥珠单抗 0.021
表14.通过本发明分离的嵌合抗体的跨种结合
注意：“+”指示结合活性；“－”指示无结合活性
表15.嵌合抗体的BT474细胞增殖抑制的功效
注意：*“c”：指示嵌合抗体
表16.人源化形式的小鼠抗ERBB2单克隆抗体5F12的VH和VL氨基酸序列
表16.(续)
表17.产生的人源化的5F12抗体和回复突变的概述
/>
表18.人源化的5F12变体的重组ErbB2-ECD结合活性
*“-”：指示无结合活性
表19.人源化形式的小鼠抗ErbB2抗体5G9的VH和VL氨基酸序列
表19.(续)
表20.产生的人源化的5G9抗体和回复突变的概述
名称 VH/VL组合 VH/VL的回复突变
1 5G9.v1 VH.v1/VL.v1 0/0
2 5G9.v2 VH.v1/VL.1 0/H38Q
3 5G9.v3 VH.v1/VL.2 0/G43V
4 5G9.v4 VH.v1/VL.3 0/H49Y
5 5G9.v5 VH.v1/VL.4 0/I58V
6 5G9.v6 VH.v1/VL.5 0/R69T
7 5G9.v7 VH.v1/VL.6 0/Y71F
8 5G9.v8 VH.1/VL.v1 A67V/0
9 5G9.v9 VH.2/LV.v1 L69I/0
10 5G9.v10 VH.3/VL.v1 Q73K/0
11 5G9.v11 VH.4/VL.v1 N76S/0
12 5G9.v12 VH.5/VL.v1 I48M/0
13 5G9.v13 VH.1/VL.1 A67V/H38Q
14 5G9.v14 VH.1/VL.2 A67V/G43V
15 5G9.v15 VH.1/VL.3 A67V/H49Y
16 5G9.v16 VH.1/VL.4 A67V/I58V
17 5G9.v17 VH.1/VL.5 A67V/R69T
18 5G9.v18 VH.1/VL.6 A67V/Y71F
19 5G9.v19 VH.2/VL.1 L69I/H38Q
20 5G9.v20 VH.2/VL.2 L69I/G43V
21 5G9.v21 VH.2/VL.3 L69I/H49Y
22 5G9.v22 VH.2/VL.4 L69I/I58V
23 5G9.v23 VH.2/VL.5 L69I/R69T
24 5G9.v24 VH.2/VL.6 L69I/Y71F
25 5G9.v25 VH.3/VL.1 Q73K/H38Q
26 5G9.v26 VH.3/VL.2 Q73K/G43V
27 5G9.v27 VH.3/VL.3 Q73K/H49Y
98 5G9.v28 VH.3/VL.4 Q73K/I58V
29 5G9.v29 VH.3/VL.5 Q73K/R69T
30 5G9.v30 VH.3/LV.6 Q73K/Y71F
31 5G9.v31 VH.4/VL.1 N76S/H38Q
32 5G9.v32 VH.4/VL.2 N76S/G43V
33 5G9.v33 VH.4/VL.3 N76S/H49Y
34 5G9.v34 VH.4/VL.4 N76S/I58V
35 5G9.v35 VH.4/VL.5 N76S/R69T
36 5G9.v36 VH.4/VL.6 N76S/Y71F
37 5G9.v37 VH.5/VL.1 I48M/H38Q
38 5G9.v38 VH.5/VL.2 I48M/G43V
39 5G9.v39 VH.5/VL.3 I48M/H49Y
40 5G9.v40 VH.5/VL.4 I48M/I58V
41 5G9.v41 VH.5/VL.5 I48M/R69T
42 5G9.v42 VH.5/VL.6 I48M/Y71F
表21.人源化的5G9变体的重组ErbB2-ECD结合活性
表22.组合在BT474乳腺癌异种移植模型中的抗肿瘤活性
注意：a.T/C％＝T/C x 100％，其中T和C分别是治疗组和对照组在第35天的平均肿瘤体积；b.通过单因素方差分析与媒介物对照的肿瘤体积比较，然后利用Games-Howell方法进行多重比较方案；*P<0.05和**P<0.01相比媒介物对照。
表23.NCI-N87胃异种移植模型中的抗肿瘤功效的研究设计
注意：T-mAb表示曲妥珠单抗；P-mAb表示帕妥珠单抗。
表24.NCI-N87胃异种移植模型(第一阶段)的结果概述
注意：肿瘤生长抑制(TGI)指数＝(1–治疗的肿瘤的平均体积/对照肿瘤的平均体积)×100％
表25.NCI-N87胃异种移植模型(第二阶段)的结果概述
注意：T-mAb：曲妥珠单抗；进展速率＝(第57天-第26天)/第26天x100。
表26.NCI-N87胃异种抑制模型(第二阶段)的癌症进展速率
5注意：恢复速率＝(第57天-第26天)/第26天×100；TV：肿瘤体积
表27.本发明的ErbB2抗体的内化速率
FITC信号 2小时 p值
曲妥珠单抗FITC 12.20±2.32
帕妥珠单抗FITC 8.87±0.51 0.105
4C9 FITC 23.79±2.20 *0.0055
4H2 FITC 17.72±3.20 0.105
4G6 FITC 18.51±3.51 0.089
5F12 FITC 22.55±2.39 *0.0104
4G9 FITC 20.61±2.38 *0.022
表28.本发明的ErbB2抗体组合的内化速率
APC信号 2小时 p值
曲妥珠单抗APC 13.54±1.38
曲妥珠单抗APC+帕妥珠单抗FITC 15.30±1.30 0.22
曲妥珠单抗APC+4C9 FITC 39.34±5.08 *0.0043
曲妥珠单抗APC+4H2 FITC 37.71±3.82 *0.002
曲妥珠单抗APC+4G6 FITC 44.41±11.84 *0.03
曲妥珠单抗APC+5F12 FITC 35.53±1.17 *0.00013
曲妥珠单抗APC+4G9 FITC 39.40±2.97 *0.00069
表29.胃癌异种移植模型的研究设计
注意：N：每组的动物数；将所有测试化合物的给药频率从每周BIW调整至QW，直至第14天(第0天、第3天、第7天、第14天)，并从第21天开始(第21天、第28天)将其剂量减半；T-mAb表示曲妥珠单抗；P-mAb表示帕妥珠单抗。
表30.本发明的抗体组合在曲妥珠单抗耐受性胃模型-胃癌异种移植模型中的抗肿瘤功效
注意：a.平均值±SEM；b.T/C％＝T/C×100％，其中T和C分别是治疗组和对照组在第35天的平均肿瘤体积；c.通过T检验与媒介物对照的肿瘤体积比较(*P<0.05和**P<0.01)，T-mAb表示曲妥珠单抗；P-mAb表示帕妥珠单抗。
表31.氨基酸序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
序列表
<110> 博奥信生物技术(南京)有限公司(Biosion, Inc.)
陈明久(Chen, Mingjiu)
<120> ERBB2抗体及其用途
<130> HBI-100WO
<150> 62/443,078
<151> 2017-01-06
<160> 166
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 9
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221>
<222> (1)..(1)
<223> X是S
<220>
<221>
<222> (2)..(2)
<223> X是Y
<220>
<221>
<222> (3)..(3)
<223> X是T或Y
<220>
<221>
<222> (4)..(4)
<223> X是M或I
<220>
<221>
<222> (5)..(5)
<223> X是H
<400> 11
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221>
<222> (1)..(1)
<223> X是Y
<220>
<221>
<222> (2)..(2)
<223> X是I
<220>
<221>
<222> (3)..(3)
<223> X是N
<220>
<221>
<222> (4)..(4)
<223> X是P
<220>
<221>
<222> (5)..(5)
<223> X是S
<220>
<221>
<222> (6)..(6)
<223> X是S
<220>
<221>
<222> (7)..(7)
<223> X是S或D
<220>
<221>
<222> (8)..(8)
<223> X是Y
<220>
<221>
<222> (9)..(9)
<223> X是T
<220>
<221>
<222> (10)..(10)
<223> X是A或N
<220>
<221>
<222> (11)..(11)
<223> X是Y
<220>
<221>
<222> (12)..(12)
<223> X是N
<220>
<221>
<222> (13)..(13)
<223> X是Q
<220>
<221>
<222> (14)..(14)
<223> X是K或N
<220>
<221>
<222> (15)..(15)
<223> X是F
<220>
<221>
<222> (16)..(16)
<223> X是K或R
<220>
<221>
<222> (17)..(17)
<223> X是D
<400> 12
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221>
<222> (1)..(1)
<223> X是A
<220>
<221>
<222> (2)..(2)
<223> X是S
<220>
<221>
<222> (3)..(3)
<223> X是A或S
<220>
<221>
<222> (4)..(4)
<223> X是F
<220>
<221>
<222> (5)..(5)
<223> X是S
<220>
<221>
<222> (6)..(6)
<223> X是L
<220>
<221>
<222> (7)..(7)
<223> X是D
<220>
<221>
<222> (8)..(8)
<223> X是F
<220>
<221>
<222> (9)..(9)
<223> X是W
<400> 13
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221>
<222> (1)..(1)
<223> X是K
<220>
<221>
<222> (2)..(2)
<223> X是A
<220>
<221>
<222> (3)..(3)
<223> X是S
<220>
<221>
<222> (4)..(4)
<223> X是H或Q
<220>
<221>
<222> (5)..(5)
<223> X是D
<220>
<221>
<222> (6)..(6)
<223> X是I
<220>
<221>
<222> (7)..(7)
<223> X是N
<220>
<221>
<222> (8)..(8)
<223> X是K
<220>
<221>
<222> (9)..(9)
<223> X是Y
<220>
<221>
<222> (10)..(10)
<223> X是I
<220>
<221>
<222> (11)..(11)
<223> X是A
<400> 14
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221>
<222> (1)..(1)
<223> X是Y或S
<220>
<221>
<222> (2)..(2)
<223> X是T
<220>
<221>
<222> (3)..(3)
<223> X是S
<220>
<221>
<222> (4)..(4)
<223> X是T
<220>
<221>
<222> (5)..(5)
<223> X是L
<220>
<221>
<222> (6)..(6)
<223> X是Q或Y
<220>
<221>
<222> (7)..(7)
<223> X是P
<400> 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221>
<222> (1)..(1)
<223> X是L
<220>
<221>
<222> (2)..(2)
<223> X是Q或N
<220>
<221>
<222> (3)..(3)
<223> X是Y
<220>
<221>
<222> (4)..(4)
<223> X是D
<220>
<221>
<222> (5)..(5)
<223> X是N
<220>
<221>
<222> (6)..(6)
<223> X是L
<220>
<221>
<222> (7)..(7)
<223> X是L
<220>
<221>
<222> (8)..(8)
<223> X是W
<220>
<221>
<222> (9)..(9)
<223> X是T
<400> 16
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 19
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asn Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Asn
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Arg Ile Thr Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Gly Ile Arg
100 105
<210> 23
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Asn
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ser Phe Arg Ile Thr Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Ile Arg
100 105
<210> 25
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Gln Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 27
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Gln Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Gln Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Gln Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Gln Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Gln Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221>
<222> (24)..(24)
<223> X是A或T
<220>
<221>
<222> (30)..(30)
<223> X是S或T
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Xaa Ser Gly Gly Thr Phe Xaa
20 25 30
<210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221>
<222> (2)..(2)
<223> X是A或V
<220>
<221>
<222> (8)..(8)
<223> X是K或Q
<220>
<221>
<222> (11)..(11)
<223> X是S或N
<400> 53
Arg Xaa Thr Ile Thr Ala Asp Xaa Ser Thr Xaa Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221>
<222> (4)..(4)
<223> X是Q或H
<220>
<221>
<222> (15)..(15)
<223> X是T或H
<400> 54
Trp Tyr Gln Xaa Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile Xaa
1 5 10 15
<210> 55
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<220>
<221>
<222> (2)..(2)
<223> X是I或V
<220>
<221>
<222> (13)..(13)
<223> X是K、T或R
<220>
<221>
<222> (15)..(15)
<223> X是Y或F
<220>
<221>
<222> (17)..(17)
<223> X是L或F
<400> 55
Gly Xaa Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Xaa Asp Xaa Thr
1 5 10 15
Xaa Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 56
Ser Tyr Thr Met His
1 5
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 57
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 58
Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 59
Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 60
Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 61
Leu Lys Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 62
Ser Tyr Thr Ile His
1 5
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 63
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 64
Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 65
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 66
Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 67
Leu Lys Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 68
Ser Tyr Thr Met His
1 5
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 69
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 70
Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 71
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 72
Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 73
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 74
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 74
Ser Tyr Thr Met His
1 5
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 75
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 76
Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 77
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 78
Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 79
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 80
Ser Tyr Thr Ile His
1 5
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 81
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Asp
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 82
Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe
1 5
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 83
Lys Ala Ser His Asp Ile Asp Arg Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 84
Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 85
Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 86
Ser Tyr Thr Met His
1 5
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 87
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 88
Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 89
Ser Tyr Thr Met His
1 5
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 90
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 91
Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 92
Ser Tyr Thr Met His
1 5
<210> 93
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 93
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 94
Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 95
Ser Tyr Thr Met His
1 5
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 96
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 97
Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5
<210> 98
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 98
Ser Tyr Thr Met His
1 5
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 99
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 100
Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 101
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 102
Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro
1 5
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 103
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 104
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 105
Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 106
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 107
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 108
Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 109
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 110
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 111
Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 112
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 113
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 113
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 114
Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 115
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 116
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 117
Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 118
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 119
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 119
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 120
Ser Thr Ser Thr Leu Tyr Pro
1 5
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 121
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
1 5
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 122
Ser Tyr Thr Ile His
1 5
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 123
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Asp
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 124
Ala Ser Ala Phe Ser Leu Asp Phe
1 5
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
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1 5
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<211> 17
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1 5 10 15
Asp
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Leu Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Trp Thr
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 161
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 162
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 163
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
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Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
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<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 164
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1 5 10 15
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20
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 165
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<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 166
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30

Claims (52)

1.一种结合蛋白，其包含能特异性结合受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-2（ErbB2）的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，轻链可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中该CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如
a） SYTIH（SEQ ID NO: 80）、YINPSSDYTAYNQKFRD（SEQ ID NO: 81）、ASAFSLDF（SEQ IDNO: 82）、KASHDIDRYIA（SEQ ID NO: 83）、YTSTLQP（SEQ ID NO: 84）、和LNYDNLLWT（SEQ IDNO: 85）；或
b） SYTMH（SEQ ID NO: 74）、YINPSSSYTNYNQNFKD（SEQ ID NO: 75）、ASSYSLDY（SEQ IDNO: 76）、KASQDINKYIA（SEQ ID NO: 77）、STSTLYP（SEQ ID NO: 78）、和LQYDNLLWT（SEQ IDNO: 79）所示。
2.如权利要求1所述的结合蛋白，其中重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO:25和26；SEQ ID NO:39和45；SEQ ID NO:39和46；SEQ ID NO:39和47；SEQ ID NO:39和48；SEQ ID NO:39和49；SEQ ID NO:39和50；SEQ ID NO:39和51；SEQ ID NO:40和45；SEQ IDNO:40和46；SEQID NO:40和47；SEQ ID NO:40和48；SEQ ID NO:40和49；SEQ ID NO:40和50；SEQ ID NO:40和51；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:41和46；SEQ ID NO:41和47；SEQ IDNO:41和48；SEQID NO:41和49；SEQ ID NO:41和50；SEQ ID NO:41和51；SEQ ID NO:42和45；SEQ ID NO:42和46；SEQ ID NO:42和47；SEQ ID NO:42和48；SEQ ID NO:42和49；SEQ IDNO:42和50；SEQID NO:42和51；SEQ ID NO:43和45；SEQ ID NO:43和46；SEQ ID NO:43和47；SEQ ID NO:43和48；SEQ ID NO:43和49；SEQ ID NO:43和50；SEQ ID NO:43和51；SEQ IDNO:44和45；SEQID NO:44和46；SEQ ID NO:44和47；SEQ ID NO:44和48；SEQ ID NO:44和49；SEQ ID NO:44和50；或SEQ ID NO:44和51；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:27和32；SEQ IDNO:27和33；SEQ ID NO:27和34；SEQ ID NO:27和35；SEQ ID NO:27和36；SEQ ID NO:27和37；SEQ ID NO:27和38；SEQ ID NO:28和32；SEQID NO:28和33；SEQ ID NO:28和34；SEQ IDNO:28和35；SEQ ID NO:28和36；SEQ ID NO:28和37；SEQ ID NO:28和38；SEQ ID NO:29和32；SEQ ID NO:29和33；SEQ ID NO:29和34；SEQID NO:29和35；SEQ ID NO:29和36；SEQ IDNO:29和37；SEQ ID NO:29和38；SEQ ID NO:30和32；SEQ ID NO:30和33；SEQ ID NO:30和34；SEQ ID NO:30和35；SEQ ID NO:30和36；SEQID NO:30和37；SEQ ID NO:30和38；SEQ IDNO:31和32；SEQ ID NO:31和33；SEQ ID NO:31和34；SEQ ID NO:31和35；SEQ ID NO:31和36；SEQ ID NO:31和37；或SEQ ID NO:31和38所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的结合蛋白，其还包含人受体框架序列。
4.如权利要求3所述的结合蛋白，其中所述人受体框架序列包含选自SEQ ID NO:3-10的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的结合蛋白，其中所述人受体框架序列包含选自SEQ ID NO:3-10和161-166的氨基酸序列。
6.如权利要求3所述的结合蛋白，其中所述人受体框架序列在关键残基处包含至少一个框架区氨基酸取代，其中所述关键残基选自：与CDR相邻的残基、糖基化位点残基、稀有残基、能够与人ErbB2相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、典型残基、重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、游标区内的残基，以及Chothia限定的可变重链CDR1和Kabat限定的第一重链框架之间的重叠区域内的残基。
7.如权利要求6所述的结合蛋白，其还包含共有人可变结构域序列。
8.如权利要求3所述的结合蛋白，其中所述人受体框架包含至少一个框架区氨基酸取代，其中所述人受体框架由与人种系受体框架的序列至少65％相同的氨基酸序列组成，并且其中所述人受体框架包含与人种系受体框架相同的至少70个氨基酸残基。
9.如权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白为抗体。
10.如权利要求9所述的结合蛋白，其中所述抗体为人源化的抗体。
11.如权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够调节ErbB2介导的生物活性。
12.如权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够在与ErbB2阳性细胞接触后被内化至该细胞内。
13.如权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够抑制ErbB2阳性细胞的生长。
14.如权利要求13所述的结合蛋白，其中所述ErbB2阳性细胞为BT474细胞。
15.如权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够与曲妥珠单抗协同抑制肿瘤的生长，其中所述肿瘤为ErbB2阳性的和曲妥珠单抗抗性的。
16.一种结合蛋白缀合物，其包含权利要求1-15中任一项所述的结合蛋白、接头多肽、以及试剂，其中所述试剂选自显像剂、和治疗剂。
17.如权利要求16所述的结合蛋白缀合物，其中所述治疗剂选自细胞毒素剂和免疫黏附分子。
18.如权利要求16所述的结合蛋白缀合物，其中所述显像剂选自放射性同位素标记、酶、发光标记、磁性标记和生物素。
19.如权利要求18所述的结合蛋白缀合物，其中发光标记为生物发光标记。
20.如权利要求16所述的结合蛋白缀合物，其中所述试剂选自抗代谢物、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、毒素和凋亡剂。
21.如权利要求20所述的结合蛋白缀合物，其中毒素为烷化剂。
22.如权利要求20所述的结合蛋白缀合物，其中凋亡剂为抗有丝***剂。
23.如权利要求22所述的结合蛋白缀合物，其中抗有丝***剂为蒽环类药物。
24.如权利要求16所述的结合蛋白缀合物，其中所述结合蛋白缀合物能够在与ErbB2阳性细胞接触后被内化至细胞内。
25.一种多核苷酸，其编码权利要求1-15中任一项所述的结合蛋白。
26.一种载体，其包含权利要求25所述的多核苷酸。
27.如权利要求26所述的载体，其中所述载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、NV和pBJ。
28.一种药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项所述的结合蛋白、和药学上可接受的载体。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其还包含至少一种其他试剂，其中至少一种其他试剂选自显像剂；血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻滞剂；黏附分子阻滞剂；甲氨蝶呤；DNA烷化剂；顺铂；卡铂；抗微管蛋白剂；紫杉醇；多西他赛；阿霉素；吉西他滨；蒽环类药物；5-氟尿嘧啶（5-FU）；亚叶酸；伊立替康；细胞凋亡抑制剂；Bcl2/Bclx抑制剂；厄洛替尼；吉非替尼；COX-2抑制剂；抗风湿剂；肌肉松弛剂；镇痛剂；麻醉剂；镇静剂；神经肌肉阻滞剂；抗微生物剂；抗银屑病剂；合成代谢类固醇；免疫抑制剂；生长激素；抗精神病药；***；哮喘药物；肾上腺素；细胞因子；以及细胞因子拮抗剂。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其中细胞因子为***。
31.如权利要求29所述的药物组合物，其中细胞因子拮抗剂为TNF拮抗剂。
32.如权利要求29所述的药物组合物，其中所述免疫抑制剂选自环孢菌素和FK506。
33.如权利要求29所述的药物组合物，其中麻醉剂为局部麻醉剂。
34.如权利要求28所述的药物组合物，还包含免疫球蛋白，其中免疫球蛋白为抗VEGF抗体；抗EGFR抗体；抗cMet抗体；抗ErbB3抗体；抗ErbB2抗体；抗CD20抗体；抗B7.2抗体；CTLA4-Ig；抗E选择素抗体；抗L选择素抗体；或抗细胞因子抗体。
35.权利要求1-15中任一项所述的结合蛋白在制备一种用于治疗与ErbB2过表达相关的癌症的药物中的用途。
36.如权利要求35所述的用途，其中与ErbB2过表达相关的癌症选自乳腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、泌尿道癌、内分泌腺癌、皮肤癌、血管瘤、黑色素瘤、肉瘤、脑肿瘤、神经癌、眼部肿瘤、子宫肌瘤、或T细胞急性成淋巴细胞性白血病（T-ALL）。
37.如权利要求35所述的用途，其中所述癌症为原发性癌症、或转移性癌症。
38.如权利要求36所述的用途，其中所述癌症为乳腺癌。
39.如权利要求36所述的用途，其中所述癌症为胃癌。
40.如权利要求36所述的用途，其中所述癌症为肺癌。
41.如权利要求35所述的用途，其中所述药物通过肠胃外施用。
42.如权利要求35所述的用途，其中所述药物通过口腔、或腹内施用。
43.如权利要求35所述的用途，其中所述药物通过皮下、肌内、静脉内、动脉内、关节内、支气管内、软骨内、小脑内、脑室内、大肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、***内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、子宫内、膀胱内、***、直肠、舌下的、或鼻内施用。
44.如权利要求35所述的用途，其中所述药物还包含一种或多种其他试剂，其中所述一种或多种其他试剂中的每种为能够结合ErbB2的抗体或其抗原结合片段，并且其中所述一种或多种其他试剂中的每种不同于所述结合蛋白。
45.如权利要求44所述的用途，其中所述ErbB2为人ErbB2。
46.如权利要求44或45所述的用途，其中所述一种或多种其他试剂包含曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合。
47.如权利要求44所述的用途，其中所述结合蛋白与所述一种或多种其他试剂协同调节ErbB2活性。
48.权利要求1-15中任一项所述的结合蛋白在制备一种用于抑制ErbB2阳性细胞的生长的药物中的用途。
49.如权利要求48所述的用途，所述药物还包括一种或多种其他试剂，所述结合蛋白与所述一种或多种其他试剂协同性抑制所述ErbB2阳性细胞的生长，其中所述一种或多种其他试剂中的每种为能够结合ErbB2的抗体或其抗原结合片段，并且其中所述一种或多种其他试剂中的每种不同于所述结合蛋白。
50.如权利要求49所述的用途，其中所述一种或多种其他试剂包含曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合。
51.如权利要求48所述的用途，其中所述ErbB2阳性细胞在受试者中。
52.如权利要求51所述的用途，其中所述受试者是人。
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