CN102174614B - 一种能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖，属于医药及保健食品技术领域。本发明通过对菌种保藏号为CGMCC NO.3433的南极适冷细菌(Pseudoaltermonassp.)S-5培养、发酵、分离、纯化后，制得适冷微生物胞外多糖。其分子量为39,7046Da，由甘露糖、葡萄糖和半乳糖按照摩尔比4.8∶50.9∶44.3构成。本发明制得的能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖，能促进体外脾淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的活性，提高机体免疫力。
Description
技术领域
本发明涉及一种能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖，属于医药及保健食品技术领域。
背景技术
南极海洋终年覆盖冰雪，地理环境和气候特征都十分特殊，在这种极端环境中生存的微生物具有高度的多样性，这种多样性为开发具有特殊应用价值的活性物质提供了丰富的资源。南极微生物产生的胞外多糖能够缓解低温和高盐对菌体的伤害，是一种很好的抗冻保护剂，在微生物适应南极低温高盐的恶劣环境中发挥了重要的低温保护作用。南极微生物胞外多糖的结构新颖，功能独特，是开发新型多糖类免疫调节剂的重要资源。如南极微生物Pseudoaltermonas sp.S-15-13所产生的胞外多糖，是一种分子量为62kDa的甘露聚糖，这种胞外多糖具有一定的免疫活性。(Production and characterization of anextracellular polysaccharide of antarctic marine bacteria Pseudoalteromonas sp.S-15-13；LI Jiang，CHEN Kaoshan，LIN Xuezheng，HE Peiqing，LI Guangyou；国际标准干号：0253-505X；2006.6)。
南极适冷细菌Pseudoal termonas sp.S-5，属于假交替单胞菌属。菌体呈杆状，生理生化鉴定结果表明，该菌革兰氏染色阴性，兼性厌氧，氧化酶、接触酶、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应呈阳性；硝酸盐还原反应、吲哚试验、明胶液化试验、H2R试验、MR试验、VP试验、ONPG试验、鸟氨酸脱梭酶反应均呈阴性。
南极适冷细菌Pseudoal termonas sp.S-5的发酵液，可应用于植物及农作物抗冷方面，如公开号为CN101775361A(申请号200910256034.6)的中国专利，其中的抗冻活性物质即为南极适冷细菌Pseudoaltermonas sp.S-5所产生的胞外多糖，该多糖的分子量约为39,7046Da，而这种胞外多糖在提高机体免疫力方面的功效还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖及其在提高机体免疫力方面的应用。
一种能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将菌种保藏号为CGMCC NO.3433的南极适冷细菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5活化后，接种于Zobell 2216E液体培养基中，6-10℃培养22-25小时，按1-2wt％量接种于Zobell 2216E液体培养基扩大培养，得扩繁菌种；
(2)将步骤(1)制得的扩繁菌种按8-12wt％的接种量，接种于液体发酵罐中的发酵培养基，7-9℃有氧搅拌培养50-60h，搅拌速度150-180r/min，得液体发酵液；
(3)将步骤(2)制得的液体发酵液在12000r/min下离心15min，收集上清液；
(4)将步骤(3)制得的上清液浓缩至原体积的1/4，得浓缩液，然后向浓缩液中加入三倍体积的95％乙醇，过夜沉淀，离心，收集沉淀；
(5)将步骤(4)收集的沉淀用水溶解，得溶解液，然后加入seveage试剂脱去蛋白质，制得粗糖溶液；
(6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过大孔树脂D-301R脱色后，经过DEAE-Fast Flow阴离子交换柱和Sephadex G-75层析柱分离，制得纯化的胞外多糖溶液；
(7)将步骤(6)制得的胞外多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖。
所述步骤(1)中的Zobell 2216E液体培养基组分如下，均为重量百分数：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，葡萄糖2％，人工海水余量，pH7.0。
所述步骤(2)中的发酵培养基组分如下，均为重量百分数：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，葡萄糖2％，氯化钠2％，人工海水余量，pH7.0。
所述步骤(2)的搅拌培养前还包括向发酵培养基中加入发酵培养基重量0.3％的灭菌豆油。灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。
所述步骤(3)中的离心条件为：12000r/min，15min。
所述步骤(4)中的浓缩条件为：60℃，旋转蒸发；浓缩液约为上清液体积的1/4。
所述步骤(5)的seveage试剂由氯仿和正丁醇按照体积比4∶1构成；seveage试剂的添加量为溶解液体积的1/3。
所述人工海水为Instant Ocean Reef Crystals海水盐配制。
由上述制备方法制得的能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖，其分子量为39,7046Da，由甘露糖、葡萄糖和半乳糖按照摩尔比4.8∶50.9∶44.3构成。
上述适冷微生物胞外多糖在制备促进体外脾淋巴细胞的增殖、增强巨噬细胞的活性及提高机体免疫力药物及保健品方面的应用。
有益效果
由本发明所述制备方法制得的能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖，能促进体外脾淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的活性，提高机体免疫力。
附图说明
图1是适冷微生物胞外多糖的红外光谱检测图谱；
图2是适冷微生物胞外多糖的高效渗透色谱检测图谱；
图3是适冷微生物胞外多糖的气相色谱检测图谱；
图中：a、甘露糖，b、葡萄糖，c、半乳糖，d、肌醇六乙酰酯。
具体实施方式
实施例中所述适冷细菌S-5(Pseudoaltermonas sp.S-5)，已于2009年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC NO.3433。
实施例中所述Instant Ocean Reef Crystals海水盐购自上海宇杰水族用品有限公司。
实施例1
一种能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)将菌种保藏号为CGMCC NO.3433的南极适冷细菌(Pseudoaltermonnas sp.)S-5活化后，接种于Zobell 2216E液体培养基中，9℃培养24小时，按1wt％量接种于Zobell 2216E液体培养基扩大培养，得扩繁菌种；
(2)将步骤(1)制得的扩繁菌种按10wt％的接种量，接种于液体发酵罐中的发酵培养基，向发酵培养基中加入发酵培养基重量0.3％的灭菌豆油后，7-9℃有氧搅拌培养50-60h，搅拌速度160-170r/min，得液体发酵液；
(3)将步骤(2)制得的液体发酵液在12000r/min下离心15min，收集上清液；
(4)将步骤(3)制得的上清液在60℃条件下，旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，得浓缩液，然后向浓缩液中加入三倍体积的95％乙醇，过夜沉淀，离心，收集沉淀；
(5)将步骤(4)收集的沉淀用水溶解，加入1/3体积的seveage试剂(氯仿∶正丁醇的体积比为4∶1)脱去蛋白质，制得粗糖溶液；
(6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过大孔树脂D-301R脱色后，再经过DEAE-Fast Flow阴离子交换柱和Sephadex G-75层析柱分离，制得纯化的胞外多糖溶液；
(7)将步骤(6)制得的胞外多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖。
所述步骤(1)中的Zobell 2216E液体培养基组分如下，均为重量百分数：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，葡萄糖2％，人工海水余量，pH7.0。
所述步骤(2)中的发酵培养基组分如下，均为重量百分数：葡萄糖2％，氯化钠2％，人工海水余量，pH7.0。
所述人工海水为Instant Ocean Reef Crystals海水盐配制。
产物性状：
经上述方法制得的能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖为固态干粉，呈絮状，经碘-碘化钾反应、双缩脲反应、Molish反应、紫外检测表明样品中没有蛋白质、核酸等杂质存在，经红外光谱检测，发现其有多糖的特征峰吸收，证明其为多糖(如图1所示)；通过高效渗透色谱法测定其分子量为39,7046Da(如图2所示)；利用气相色谱法测得其单糖组成为甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝4.8∶50.9∶44.3(如图3所示)，表明这种胞外多糖是一种杂多糖。
实施例2适冷微生物胞外多糖体外给药对小鼠脾淋巴细胞活性增殖的影响
小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制备脾淋巴细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液制成1×106/ml细胞悬液。将小鼠1×106/ml脾细胞悬液加入96孔细胞培养板内，每孔100μl，实验设对照组、胞外多糖(终浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10μg/ml)刺激组、ConA(终浓度为5μg/ml)刺激组，每组每浓度设六复孔，空白对照组以等体积的RPMI 1640代替。于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养72小时。于培养结束前4小时每孔加入MTT溶液10μl，继续培养至实验结束。取出，吸去上清100μl，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μl溶解甲瓒，在酶标仪570nm波长处读取每孔的OD值。
实施例1制得的适冷微生物胞外多糖在体外对小鼠脾淋巴细胞增殖活性有促进作用，实验结果见表1。适冷微生物胞外多糖能明显促进脾淋巴细胞的增殖。在浓度为0.1-10μg/ml范围内均能显著的促进淋巴细胞增殖(P＜0.01)，其最适作用浓度为0.5μg/ml，吸光值较对照组提高了39.7％。
表1适冷微生物胞外多糖对小鼠脾淋巴细胞体外增殖活性的影响(n＝6)
*表示t检验后，与对照组相比呈显著性差异(P＜0.05)
**表示t检验后，与对照组相比呈极显著性差异(P＜0.01)
实施例3：适冷微生物胞外多糖体外给药对小鼠巨噬细胞酸性磷酸酶活性的影响
小鼠腹腔注射4％淀粉溶液1ml，3天后颈椎脱臼处死，无菌取小鼠腹腔巨噬细胞，制备细胞悬液；取腹腔细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5％CO2条件下置于CO2培养箱中培养4小时。去上清，贴壁细胞即为巨噬细胞。实验设对照组、胞外多糖(终浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10μg/ml)刺激组、LPS(终浓度为1μg/ml)刺激组，每孔100μl，每组每浓度设六复孔。于37℃、5％CO2条件下置于CO2培养箱中培养24小时。取出，去上清，每孔加pNPP溶液100μl，混匀，于37℃放置30min，取出，立即加入1.0mol/LNaOH溶液10μl终止反应。在酶标仪405nm波长处读取每孔OD值。检测适冷微生物胞外多糖体外给药对小鼠巨噬细胞酸性磷酸酶活性的影响。
实施例1制得的适冷微生物胞外多糖在体外对小鼠腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶活性有刺激作用，实验结果见表2。适冷微生物胞外多糖在浓度为0.1-10μg/ml范围内均能显著增强巨噬细胞酸性磷酸酶的活性，并且随着浓度的增加，作用逐步增强，呈剂量依赖性。且在浓度为10μg/ml时，巨噬细胞酸性磷酸酶的活性比对照组提高了302.7％。
表2适冷微生物胞外多糖对小鼠巨噬细胞酸性磷酸酶活性的影响(n＝6)
*表示t检验后，与对照组相比呈显著性差异(P＜0.05)
**表示t检验后，与对照组相比呈极显著性差异(P＜0.01)
实施例4：适冷微生物胞外多糖体内给药对正常小鼠的免疫调控作用
将50只老鼠(体重为18-22g)随机分为5组，每组10只，分别为对照组和给药组，其中给药组剂量分别为实施例1制得的适冷微生物胞外多糖1.25、2.5、5、10mg/kg/day，连续灌胃10天，检测对正常小鼠脾脏指数、胸腺指数、巨噬细胞吞噬活性的影响。
巨噬细胞吞噬活性的测定实验第7天腹腔注射4％的淀粉溶液1ml致敏小鼠。实验第10天每只老鼠注射1ml 1％鸡血红细胞生理盐水溶液，30min后摘眼球取血，处死后腹腔解剖，吸取腹腔渗出液，取腹腔液置于玻片上，涂片，固定，瑞氏染液染色，冲洗，晾干，显微镜下观察，计算吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬百分率：每100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。
吞噬指数：每100个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞的总数除以100，即每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。
实验结果见如表3所示。适冷微生物胞外多糖体内给药能显著影响小鼠巨噬细胞吞噬鸡血红细胞的吞噬率和吞噬指数，与对照组比较有极显著性差异(P＜0.01)，吞噬效果随着胞外多糖浓度的增加而增加，当浓度为10mg/kg/day，吞噬率较对照组提高了62.08％，吞噬指数较对照组提高了103.09％，这说明适冷微生物胞外多糖可以显著增强小鼠巨噬细胞的活性，从而提高小鼠的非特异性免疫能力。
表3活冷微生物胞外多糖对正常小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响(n＝10)
*表示t检验后，与对照组相比呈显著性差异(P＜0.05)
**表示t检验后，与对照组相比呈极显著性差异(P＜0.01)
脏器系数的测定实验第10天称重后处死老鼠，解剖后取脾脏和胸腺，分别计算脾脏指数和胸腺指数。
脾脏指数(％)＝(脾脏重量/体重)×100％
胸腺指数(％)＝(胸腺重量/体重)×100％
实验结果见如表4所示。适冷微生物胞外多糖浓度为1.25、2.5、5、10mg/kg/day均能显著影响小鼠胸腺指数，当适冷微生物胞外多糖浓度为10mg/kg/day时，脾脏指数较对照组提高28.57％，胸腺指数较对照组提高了166.67％，与对照组比较有极显著性差异(P＜0.01)，这说明适冷微生物胞外多糖可以促进小鼠免疫器官的生长。
表4适冷微生物胞外多糖对正常小鼠脏器系数的影响(n＝10)
*表示t检验后，与对照组相比呈显著性差异(P＜0.05)
**表示t检验后，与对照组相比呈极显著性差异(P＜0.01)
Claims (2)
1.一种能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将菌种保藏号为CGMCC NO.3433的假交替单胞菌（Pseudoaltermonas sp.）S-5活化后，接种于Zobell 2216E液体培养基中，9℃培养24小时，按1wt%量接种于Zobell 2216E液体培养基扩大培养，得扩繁菌种；
（2）将步骤（1）制得的扩繁菌种按10wt%的接种量，接种于液体发酵罐中的发酵培养基，向发酵培养基中加入发酵培养基重量0.3%的灭菌豆油后，7-9 ℃有氧搅拌培养50-60h,搅拌速度160-170r/min，得液体发酵液；
（3）将步骤（2）制得的液体发酵液在12000 r/min下离心15min，收集上清液；
（4）将步骤（3）制得的上清液在60℃条件下，旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，得浓缩液，然后向浓缩液中加入三倍体积的95%乙醇，过夜沉淀，离心，收集沉淀；
（5）将步骤（4）收集的沉淀用水溶解，加入1/3体积的seveage 试剂脱去蛋白质，制得粗糖溶液；
（6）将步骤（5）制得的粗糖溶液通过大孔树脂D-301R脱色后，再经过DEAE-Fast Flow 阴离子交换柱和Sephadex G-75层析柱分离，制得纯化的胞外多糖溶液；
（7）将步骤（6）制得的胞外多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得适冷微生物胞外多糖纯品；
所述步骤（1）中的Zobell 2216E液体培养基组分如下，均为重量百分数：蛋白胨 0.5%，酵母粉0.1%，葡萄糖2%，人工海水余量，pH7.0；
所述步骤（2）中的发酵培养基组分如下，均为重量百分数：蛋白胨 0.5%，酵母粉0.1%，葡萄糖2%，氯化钠2%，人工海水余量，pH7.0；
所述人工海水为Instant Ocean Reef Crystals海水盐配制。
2.权利要求1所述制备方法制得的能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖，其分子量为39,7046 Da，由甘露糖、葡萄糖和半乳糖按照摩尔比4.8：50.9：44.3构成。
3、权利要求2所述能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖在制备促进体外脾淋巴细胞的增殖、增强巨噬细胞的活性及提高机体免疫力药物及保健品方面的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Owner name: BODE BIOTECHNOLOGY (BEIJING) CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SHANDONG UNIVERSITY Effective date: 20140507 |
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| COR | Change of bibliographic data |
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Effective date of registration: 20140507 Address after: 102488 Beijing City, Fangshan District Yan Village Yan Fu Road No. 1 -E22 Patentee after: Bode biological technology (Beijing) Co., Ltd. Address before: 250100 Ji'nan Province, Lixia District, Shandong City, South Hill Road, No. 27 Patentee before: Shandong University |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190613 Address after: 253077 No. 3230 Chongde Eighth Avenue, Yuanqiao Town, Dezhou Economic and Technological Development Zone, Shandong Province Patentee after: Bode biological technology (Dezhou) Co., Ltd. Address before: 102488 No. 1-E22 Yanfu Road, Yancun Town, Fangshan District, Beijing Patentee before: Bode biological technology (Beijing) Co., Ltd. |