CN105400727A - 一株具有抗氧化活性的副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株具有抗氧化活性的副干酪乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

一株具有抗氧化活性的副干酪乳杆菌及其应用，具体涉及一株新的副干酪乳杆菌(Lactobacillus？paracasei)NCU622，保藏编号：CGMCC？11886，还涉及含有所述菌株的组合物。本发明菌株或其组合物具有一定的抗氧化活性。此外，还具有较好的胃肠道环境耐受性及较强的黏附性能，对革兰氏阳性及阴性致病菌均具有较好的抑制作用。本发明菌株可以是食品形式的组合物，并能发酵大宗果蔬产生酸鲜可口、营养丰富、天然果蔬味浓郁并具有良好保健功能的益生菌高效发酵果蔬产品(泡菜、饮料、浆料)，产品中无需添加任何香精香料、色素、酸味剂、稳定剂、防腐剂等食品添加剂，所有风味由益生菌发酵果蔬原料产生。

Description

一株具有抗氧化活性的副干酪乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株具有抗氧化活性的副干酪乳杆菌。
背景技术
益生菌是指一类对宿主产生有益作用的活性微生物，通过定植于宿主肠道、生殖***内，能够对宿主产生确切的健康功效，从而改善宿主体内微生态平衡、发挥有益作用的活性微生物的总称。乳酸菌作为益生菌中最具代表性的菌属，具有帮助消化、促进营养物质的吸收、缓解乳糖不耐症、预防和治疗腹泻、调节肠道菌群和缓解便秘、调节机体免疫功能、降低血液总的胆固醇、改善食物引起的过敏性疾病、延缓衰老及抗肿瘤等生理活性。
氧化是生命必需的过程，氧化过程中产生的活性氧自由基对生理平衡是必需的，但是过量的自由基在体内会产生危害。人体自身的抗氧化能力随年龄的增长而不断下降，所以通过辅助手段来清除体内产生的氧自由基是非常必要的。大量试验研究表明，副干酪乳杆菌具有抗氧化作用。然而，目前中国市场的乳酸菌产品使用的菌株多为国外供应商提供的菌株，如丹麦科汉森公司的动物双歧杆菌BB12、芬兰维利奥公司的鼠李糖乳杆菌LGG等，国内研发的具有自主知识产权的抗氧化的菌株少之又少，能够成功上市的菌株更是凤毛麟角。
目前，国内外研究比较多的有双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌等菌株。然而，由于乳酸菌的益生活性具有菌株特异性，不同菌株之间的益生活性差别较大。因此，需要更有针对性的筛选具有特殊生理活性的菌株，特别是我国有大量的传统发酵食品，其中有大量的乳酸菌亟待研究与开发。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有抗氧化活性的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NCU622，以便解决中国市场上乳酸菌产品使用的菌株的国产化问题。
本发明所述的菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NCU622，该菌株具有抗氧化活性，已于2015年12月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC11886。
本发明同时提供了一种组合物，该组合物包含所述副干酪乳杆菌NCU622。
本发明所述的组合物可以是食品。
本发明所述的副干酪乳杆菌NCU622为活菌或灭活菌或该菌株的衍生物。
所述的食品可以是发酵果蔬、发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或其他含有该菌株或该菌株衍生物的食品的任何一种。
本发明所提供的菌株及其组合物具有抗氧化活性。具体包括：
具有一定的DPPH自由基的清除能力、羟自由基的清除能力、总还原能力及抗脂质过氧化能力。
在发明所提供的体外试验证实，副干酪乳杆菌NCU622具有较好的胃肠道环境耐受性及较强的黏附性能，对革兰氏阳性及阴性致病菌均具有较好的抑制作用，具有一定的抗氧化活性。
本发明所属领域技术人员根据上述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，以下说明仅作为示例说明，并非以任何方式限制其余的揭露内容。若本文所述及的明确完整事物已在与本发明有关的相关技术中出现已知的同等物时，这些已知的同等物将视为独立事项并入本文中。
本发明提供了一株具有抗氧化活性的副干酪乳杆菌NCU622，该菌株或其组合物具有一定的抗氧化活性。此外，副干酪乳杆菌NCU622还具有较好的胃肠道环境耐受性及较强的黏附性能，对革兰氏阳性及阴性致病菌均具有较好的抑制作用。本发明菌株可以是食品形式的组合物，并能发酵大宗果蔬产生酸鲜可口、营养丰富、天然果蔬味浓郁并具有良好保健功能的益生菌高效发酵果蔬产品(泡菜、饮料、浆料)，产品中无需添加任何香精香料、色素、酸味剂、稳定剂、防腐剂等食品添加剂，所有风味由益生菌发酵果蔬原料产生。
附图说明
图1为本发明分离菌株副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中发酵的过程中，发酵液的pH值、酸度的变化情况。
图2为本发明分离菌株副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中发酵的过程中，发酵液中葡萄糖、乳酸及乙酸含量的变化情况。
图3为本发明分离菌株副干酪乳杆菌NCU622对Caco-2细胞的黏附情况，(a)为空白图，(b)为黏附图。
图4为本发明分离菌株副干酪乳杆菌NCU622对DPPH自由基清除率的测定情况。
图5为本发明分离菌株副干酪乳杆菌NCU622对羟自由基清除率的测定情况。
图6为本发明分离菌株副干酪乳杆菌NCU622总还原力的测定情况。
图7为本发明分离菌株副干酪乳杆菌NCU622抗脂质过氧化能力的测定情况。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明进行进一步详细的说明。
实施例1：菌株的筛选和鉴定。
本发明分离菌株副干酪乳杆菌NCU622是自中国自然发酵酸牛奶中分离筛选获得，具体分离鉴定步骤如下：
(1)菌株的分离与培养。
取来源不同的中国自然发酵酸牛奶，采用10倍梯度稀释法，选择适宜稀释度，涂布在初筛平板培养基(添加有溴甲酚紫的MRS固体培养基)上，37℃静置培养24～48h，比较培养皿中菌落形态，选择生长快、菌落大、黄色菌圈大的菌株。将初筛挑选得到的菌株转接到复筛平板培养基上，37℃厌氧培养。挑选在平板上钙圈较大、较明显和变黄色较快的菌株，分别转接到牛胆盐含量为1.0％、pH值为2.0的复筛液体培养基中，37℃培养20h。分别取上述复筛液体培养基，采用平板梯度稀释法，涂布在复筛平板培养基上重复筛选，37℃厌氧培养约48h，选择培养基上黄色、菌圈较大的单菌落，经过划线、分离后得到纯化的乳酸菌株NCU622。
(2)菌株的初步鉴定。
形态学鉴定：将菌种活化后涂布于MRS固体平板上培养，取单菌落和革兰氏染色后的菌落样品镜检。
表1平板培养基上的菌落形态和镜检结果
生理生化特性鉴定：用乳酸菌微量发酵管对菌株进行生化鉴定，根据菌株NCU622的形态特征和生理生化特征，并参照伯杰氏细菌鉴定手册中有关乳酸菌的鉴定标准对其进行分析，这株菌初步鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)。
表2菌株NCU622微量发酵管鉴定结果
鉴定项目 结果 鉴定项目 结果
纤维二糖 + 核糖 +
果糖 + 乳糖 +
半乳糖 + 葡萄糖产气 －
葡萄糖产酸 + 蜜二糖 －
麦芽糖 + 甘露糖 +
海藻糖 + 木糖 －
棉籽糖 － 山梨醇 +
松三糖 + 甘露醇 +
H2O2酶 － 柳醇 +
***糖 －
(3)菌株的分子生物学鉴定。
取NCU622菌株培养物，离心得到菌体用于基因组的提取。利用细菌16srDNA通用引物27f:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492r:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR扩增，扩增产物测序得到的结果与GeneBank中相关序列比对，结果确定NCU622为副干酪乳杆菌。
实施例2：副干酪乳杆菌NCU622生长代谢分析。
将副干酪乳杆菌NCU622接种于MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56小时处取样，测定pH、酸度、葡萄糖、乳酸及乙酸浓度。
采用高效液相色谱法测定葡萄糖、乳酸及乙酸的浓度。采用H2SO4(6mmol/L)为流动相，其流速为0.5mL/min，每次进样20μL，柱温保持在45℃，用示差检测器对葡萄糖进行检测，用紫外检测器(205nm)对乳酸及乙酸进行检测。根据保留时间及峰面积分别进行定性及定量。
副干酪乳杆菌在发酵过程中会代谢葡萄糖产生乳酸，进而使发酵液的pH值降低，酸度升高。副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中发酵的过程中，发酵液的pH值、酸度及发酵液中葡萄糖、乳酸及乙酸含量的变化情况如附图1和2所示。在0-2h内，菌体细胞处于延滞期，此阶段细胞代谢葡萄糖的数量较少，产生的乳酸量较少，酸度增加不明显，pH稍有下降。进入指数期(2-14h)后，菌体细胞快速***增殖，代谢旺盛。此阶段葡萄糖含量快速下降，乳酸浓度迅速升高，导致pH值迅速下降，酸度迅速上升。稳定期(14-32h)阶段，菌体处于正生长与负生长相等的动态平衡之中，活菌数基本恒定，此阶段对葡萄糖的消耗速率小于对数期，乳酸含量及酸度继续增加，pH值降低。32h以后，发酵液中的活菌数呈下降趋势，对葡萄糖的消耗速率逐渐放缓，乳酸含量及酸度缓慢增加，pH值缓慢降低。48h处葡萄糖已基本被消耗完，此后，乳酸浓度、酸度及pH值处于稳定状态。此外，副干酪乳杆菌NCU622在发酵过程中乙酸浓度基本处于恒定状态。这是由于副干酪乳杆菌是经EMP途径的同型乳酸发酵，代谢过程中不产生乙酸。
实施例3：胃肠道耐受力试验。
通过模拟人体消化道环境，探讨副干酪乳杆菌NCU622在胃肠道中的存活能力，从而为这株乳酸菌能否在人体消化道环境中发挥健康促进作用提供参考。
(1)人工胃液及人工肠液耐受性。
副干酪乳杆菌NCU622活化后，离心(4500r/min，10min)，除去上清液，将菌体分别转入人工胃液及人工肠液中，37℃恒温培养。分别在0、1、2、3h处对人工胃液中样品进行取样，在0、1、2、3、4h处对人工肠液中样品进行取样，采用菌落平板计数法测定样液中的菌体浓度。
(2)耐胆盐实验。
配制含有牛胆盐(0.03、0.3、0.5g/100mL)的MRS液体培养基，灭菌(121℃，20min)后备用。以不含牛胆盐的MRS液体培养基作为对照。副干酪乳杆菌NCU622活化后转接至以上培养基中，接种量为1％(v/v)，37℃恒温培养。分别在0、1、2、3、4h处取样，采用菌落平板计数法测定样液中的菌体浓度。副干酪乳杆菌NCU622存活率的计算公式如下：
(3)耐高盐实验。
配制含有NaCl(1、2、3、4、5g/100mL)的MRS液体培养基，灭菌(121℃，20min)后备用。以不含有NaCl的MRS液体培养基作为对照。副干酪乳杆菌NCU622活化后转接至以上培养基中，接种量为1％(v/v)，37℃恒温培养。在24h处取样，采用菌落平板计数法测定样液中的菌体浓度。
结果和结论：副干酪乳杆菌NCU622在人工胃液及人工肠液中分别作用3h及4h的过程中，其活菌数较0h处变化不显著，具有较好的耐受性。在胆盐质量浓度为0.3、0.5g/100mL的MRS液体培养基中作用4h，存活率分别为95.14％和85.07％，保持了较高的活性。在NaCl质量浓度为5g/100mL的MRS液体培养基中培养24h后，其活菌数较不含NaCl的对照组相比变化不显著。可见副干酪乳杆菌NCU622对人体胃肠道逆环境具有较好的耐受性。
实施例4：黏附性能试验。
(1)菌悬液的制备。
将活化后的副干酪乳杆菌NCU622离心(4500r/min，10min)，收集菌体，用无菌PBS缓冲液洗涤3次后重悬，制得菌悬液备用。
(2)Caco-2细胞培养。
取冻藏的Caco-2细胞复苏，转入培养瓶中，加入DMEM完全培养液，置于二氧化碳培养箱中37℃培养。每两天换液一次，当细胞的融合度达到70％～80％时，用0.25％胰酶-EDTA消化液对细胞进行消化，然后传代培养。
(3)黏附试验。
取长至单层的Caco-2细胞，经消化液消化后混合均匀，转入6孔组织培养板中(每孔细胞液体积相等)，置于二氧化碳培养箱中37℃培养。每隔两天换液一次，待细胞长至单层后进行黏附试验。取其中一孔对细胞进行消化，然后用血球计数板测定该孔所包含的Caco-2细胞。将其他孔中的培养液吸出，用无菌PBS缓冲液洗涤2次，加入菌悬液及不含双抗的DMEM培养液，混匀后置于二氧化碳培养箱中37℃培养。待细菌黏附完毕后，除去组织培养板各孔中培养液，用无菌PBS缓冲液洗涤5次以除去未黏附的菌体细胞。之后加入消化液进行消化，在进行适当的梯度稀释后用菌落平板计数法测定黏附的菌体数并进行计算。
(4)菌体浓度对黏附性能的影响。
副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中培养14h后，制备浓度分别为1×105、1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL的菌悬液，将其与Caco-2细胞共培养2h，计算黏附数。
当菌体浓度在1×105～1×108CFU/mL之间时，随其值的增加，黏附菌数也显著增加(P<0.05)；当菌体浓度由1×108CFU/mL增加至1×109CFU/mL时，所对应的黏附菌数增加不显著(P>0.05)。由以上结果可知，副干酪乳杆菌NCU622对Caco-2细胞的黏附作用在一定菌体浓度范围内对其存在依赖性。而当菌体浓度超过一定值之后，黏附作用处在吸附与脱附的动态平衡之中，黏附菌数基本恒定。
(5)作用时间对黏附性能的影响。
副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中培养14h后，制备浓度为1×108的菌悬液，将其与Caco-2细胞共培养0.5、1、1.5、2、2.5、3h，计算黏附数。
当作用时间小于2h时，副干酪乳杆菌NCU622对Caco-2细胞的黏附数随作用时间的延长而显著增加(P<0.05)；当作用时间超过2h后，黏附菌数随作用时间的延长变化不显著(P>0.05)。这说明，在2h以内，该菌株对Caco-2细胞的黏附作用与作用时间存在依赖关系；2h以后，黏附作用达到平衡。
(6)生长阶段对黏附性能的影响。
副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中分别培养至2h、8h、14h、32h、40h，制备浓度为1×108的菌悬液，将其与Caco-2细胞共培养2h，计算黏附数。
当发酵时间为2h，即当副干酪乳杆菌NCU622处于延滞期时，该菌株对Caco-2细胞的黏附菌数较少。随着菌龄的增加，黏附菌数也显著增加(P<0.05)，当发酵时间增加至14h(稳定前期)时，黏附菌数达到最大值。当发酵时间增加至32h(稳定末期)，黏附菌数较14h处稍有下降，下降效果不显著(P>0.05)。而40h(衰亡期)处所对应的黏附菌数显著少于(P<0.05)14h及32h处。以上结果说明，副干酪乳杆菌NCU622在稳定期时对Caco-2细胞的黏附作用最强。可能是由于稳定期时，黏附素等物质的积累以及稳定的细胞结构都利于黏附作用的发生。
(7)副干酪乳杆菌NCU622对Caco-2细胞的黏附性能
副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中培养14h后，制备浓度为1×108的菌悬液，将其与Caco-2细胞共培养2h，计算黏附数并进行黏附观察。取黏附完毕的培养板，除去各孔中培养液，用无菌PBS缓冲液洗涤5遍后晾干，进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体对Caco-2细胞的黏附情况。
副干酪乳杆菌NCU622对Caco-2细胞的黏附菌数为(21.19±0.94)CFU/Caco-2细胞，黏附情况如附图3所示。
实施例5：抑菌性能试验。
(1)抑菌活性测定。
选用牛津杯法对副干酪乳杆菌NCU622的发酵液、无菌发酵滤液及菌体进行抑菌活性测定，根据抑菌圈直径大小来评价抑菌效果。试验所选用的指示菌如下：单增李斯特54001，阪崎肠杆菌CMCC45401，金黄色葡萄球菌26003，沙门氏菌CMCC50041，宋内志贺氏菌ATCC29930，蜡样芽胞杆菌D1，大肠埃希氏菌CMCC44496，铜绿假单胞杆菌CMCC10104。
副干酪乳杆菌NCU622的发酵菌液及无菌发酵滤液对所有指示菌包括革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有较好的抑菌作用，而菌体对所有指示菌均无抑菌作用。MRS液体培养基没有抑菌作用(结果未显示)。发酵菌液比无菌发酵滤液对所有指示菌有更强的抑菌效果。
(2)无菌发酵滤液的抑菌作用。
以大肠埃希氏菌CMCC44496，金黄色葡萄球菌26003，单增李斯特54001，宋内志贺氏菌ATCC29930为指示菌，用无菌发酵滤液进行培养。为了测定发酵过程中产生的乳酸及MRS培养基pH的改变对致病菌活性的影响，用无菌发酵滤液(pH6.2)、MRS液体培养基(补充与无菌发酵滤液中相同量的乳酸)、MRS液体培养基来培养上述指示菌。利用高效液相色谱来测定无菌发酵滤液中乳酸的含量。指示菌过夜培养后以体积分数为1％的接种量接种到上述四种培养基中，37℃恒温培养，分别于0、1、2、3、4h取样，采用胰蛋白胨大豆琼脂培养基进行平板计数。
副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中培养24h后，MRS液体培养基的pH值由6.2降低至3.62，乳酸的浓度达到157.34mM。为了考察发酵过程中产生的乳酸及MRS液体培养基pH的变化对致病菌的活性是否有影响，用无菌发酵滤液(pH6.2)及MRS液体培养基(补充有157.34mM的乳酸)分别培养致病菌。在无菌发酵滤液中作用1h后，大肠埃希氏菌CMCC44496，单增李斯特菌54001和宋内志贺氏菌ATCC29930的活菌数降低了1.7-1.9lgCFU/mL，金黄色葡萄球菌26003丧失活性。当无菌发酵滤液的pH值调整至6.2时，相同时间点致病菌的活菌数与MRS液体培养基中相比无显著性差异(P>0.05)，说明无菌发酵滤液的抑菌活性与其pH值有关。补充有157.34mM乳酸的MRS液体培养基中致病菌的活菌数较MRS液体培养基中显著降低，说明副干酪乳杆菌NCU622发酵过程中产生的乳酸是产生抑菌活性的因素之一。补充有157.34mM乳酸的MRS液体培养基比无菌发酵滤液对四株致病菌有更强的抑制作用，可能是因为MRS液体培养基中非解离乳酸的量比无菌发酵滤液中多(有机酸如乳酸的抑菌作用主要取决于它们的非解离形式)。
(3)热处理对无菌发酵滤液抑菌活性的影响。
样品分别在60、80和100℃水浴中处理20min，121℃高压蒸汽处理20min，设置空白对照。以大肠埃希氏菌CMCC44496，宋内志贺氏菌ATCC29930，金黄色葡萄球菌26003，单增李斯特54001为指示菌，副干酪乳杆菌NCU622为供试菌，采用牛津杯法进行抑菌活性测定。
无菌发酵滤液经过4种温度条件处理后，其对致病菌的抑菌活性与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，说明副干酪乳杆菌NCU622产生的抑菌物质对热不敏感。
(4)蛋白酶及过氧化氢酶预处理对无菌发酵滤液抑菌活性的影响。
分别用浓度为1mg/mL的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、过氧化氢酶在其最适pH条件下水浴(37℃)处理无菌发酵滤液1h，处理后将样品pH调整至初始值。设不加酶的空白对照，相同方法处理。以大肠埃希氏菌CMCC44496，宋内志贺氏菌ATCC29930，金黄色葡萄球菌26003，单增李斯特54001，为指示菌，副干酪乳杆菌NCU622为供试菌，采用牛津杯法进行抑菌活性测定。
无菌发酵滤液经胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K及木瓜蛋白酶分别处理后，抑菌效果与对空白照组相比无显著变化(P>0.05)，说明该研究中抑菌物质对蛋白酶不敏感。经过氧化氢酶处理后，无菌发酵滤液的抑菌活性与空白对照组相比无显著变化(P>0.05)，说明副干酪乳杆菌NCU622产生的抑菌物质中可能无过氧化氢，或者其所含的过氧化氢浓度不足以产生抑菌效果，排除了过氧化氢的干扰。
结论：副干酪乳杆菌NCU622的发酵液及无菌发酵滤液的抑菌谱广泛，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有较好的抑菌活性。发酵过程中乳酸的产生及发酵液pH的降低是主要的抑菌因素。抑菌物质具有热稳定性，没有蛋白质性质，且排除过氧化氢的作用。
实施例6：抗氧化活性。
(1)样品处理。
活菌体：将副干酪乳杆菌NCU622接种于MRS液体培养基中，37℃培养14h，离心(4500r/min，10min)，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤3遍后重悬。
无细胞提取液：收集离心所得菌体，用去离子水洗涤3遍后重悬，经65℃处理40min后，超声波破碎(400W，破碎5s，间隔5s，粉碎8min)，细胞碎片经离心后除去，所得上清液即为无细胞提取液。
无菌发酵滤液：菌体离心后，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液即为供试菌的无菌发酵滤液。
(2)DPPH自由基清除率的测定。
样品组：取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mL样品分别加入到2mLDPPH乙醇溶液(0.1mmol/L)中，样品体积不足2mL者用pH7.4的PBS溶液补足；对照组：在2mL乙醇溶液中加入2mLDPPH乙醇溶液。空白组：2mL乙醇溶液加不同浓度样品液。将以上反应体系置于黑暗中，室温下静置反应30min。加入等体积的三氯乙酸进行抽提，离心(4500r/min，10min)后收集上清，于517nm处测定吸光值。DPPH自由基清除率的计算方法如下式：
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A样品-A空白)/A对照]×100
DPPH自由基是含有单个的稳定自由基，其乙醇溶液在517nm处有较强吸收，对该自由基有清除能力的物质可降低其吸光度值，根据这一原理来测定物质对DPPH自由基的清除能力。本试验结果见附图4。副干酪乳杆菌NCU622的活菌体、无细胞提取液及无菌发酵滤液对DPPH自由基菌具有较好的清除能力，随着样品添加量的增加，其对DPPH自由基的清除率呈增长趋势。当添加量为2.0mL时，无菌发酵滤液的清除率达到95.86％，无细胞提取液的清除率为77.18％，活菌体的最低，为43.84％。无菌发酵滤液对DPPH自由基的清除率高于MRS液体培养基，说明副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中发酵的过程中产生可清除DPPH自由基的物质。
(3)羟自由基清除率的测定。
取1mLPBS溶液(pH7.4，0.02mol/L)，依次加入1mL邻二氮菲溶液(2.5mmol/L)、1mLFeSO4溶液(2.5mmol/L)和1mLH2O2水溶液(20mmol/L)，充分混匀后再加入0、0.25、0.50、0.75、1.0mL样品(用PBS溶液(0.02mol/L，pH7.4)补足至1.0mL)，37℃恒温水浴1h，于536nm处测定吸光值。羟自由基清除率的计算方法如下式：
羟自由基清除率(％)＝(A样-A损)/(A未损-A损)×100
式中，A样、A损及A未损分别为含样品和H2O2、不含样品含H2O2、不含样品和H2O2的吸光度值。
邻二氮菲-Fe2+在536nm处有最大吸收，羟自由基可将该配位离子中的Fe2+氧化为Fe3+，进而使其吸收值降低，对羟自由基有清除能力的物质可阻止以上过程的发生，根据此原理来测定物质对羟自由基的清除能力。由附图5可以看出，副干酪乳杆菌NCU622的活菌体、无细胞提取液及无菌发酵滤液对羟自由基均有一定的清除能力，无菌发酵滤液的清除能力最强，无细胞提取液次之，活菌体最弱。随着样品添加量的增加，对羟自由基的清除率逐渐增加，当样品添加量为1mL时，无菌发酵滤液对羟自由基的清除率达到89.4％，无细胞提取液的清除率为50.79％，活菌体的清除率为33.18％。无菌发酵滤液对羟自由基的清除能力高于MRS液体培养基，说明副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中发酵的过程中产生可有效清除羟自由基的物质。
(4)总还原力的测定。
分别取样品0、0.25、0.5、0.75、1.0mL，用0.2mol/L的PBS缓冲液补足至2mL，加入1mL1g/mL的铁***溶液，混匀后在50℃下保温20min，然后将样品迅速冷却后加入三氯乙酸进行抽提，离心(4500r/min，10min)，取2mL上清液，向其中加入0.35mL0.1g/mL的三氯化铁溶液，混匀后反应10min，于700nm处测定吸光度值[89]。配制L-半胱氨酸标准溶液，将其代替样品进行以上试验，绘制标准曲线，将样品所对应的吸光度值换算为半胱氨酸当量值。
样品将铁***K3Fe(CN)6还原成黄血盐K4Fe(CN)6，黄血盐再与Fe3+作用生成普鲁十蓝，在700nm波长测定吸光度值，以检测普鲁士蓝的生成量作为试样的还原能力。由附图6可以看出，副干酪乳杆菌NCU622的活菌体、无细胞提取液及无菌发酵滤液均具有一定的还原能力，其中无菌发酵滤液的还原能力最强，活菌体次之，无细胞提取液最弱。当样品的添加量为1mL时，无菌发酵滤液的半胱氨酸当量达到1.6mM，活菌体及无细胞提取液的半胱氨酸当量分别为0.21mM和0.19mM。无菌发酵滤液的半胱氨酸当量高于MRS液体培养基，说明副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中发酵过程中产生还原性物质。
(5)抗脂质过氧化能力的测定。
取1mL亚油酸乳液(包含0.5％亚油酸、1％吐温20、98.5％去离子水)，分别加入0.2mL过氧化氢溶液(0.02％)及硫酸亚铁溶液(0.01％)，然后加入0、0.25、0.50、0.75、1.00mL的样品(用0.02mol/L的PBS补足1mL)。将以上反应体系充分混匀后37℃反应12h，然后加入0.2mL三氯乙酸(4％)、2mL硫代巴比妥酸(0.8％)和0.2mL2,6-二叔丁基对甲苯酚(0.4％)，混匀后在100℃下反应30min，冷却后离心，取上清液，于532nm处测定吸光度值。根据下式计算样品的抗脂质过氧化率。
本试验采用硫代巴比妥酸法来测定副干酪乳杆菌NCU622的活菌体、无细胞提取液及无菌发酵滤液对脂质过氧化的抑制作用，试验结果见附图7。副干酪乳杆菌NCU622的活菌体、无细胞提取液及无菌发酵滤液均具有较好的抗脂质过氧化能力，当样品的添加量为1mL时，无菌发酵滤液的抗脂质过氧化率最高，为87.27％，活菌体及无细胞提取液的分别为62.09％及60.77％。无菌发酵滤液的抗脂质过氧化能力高于MRS液体培养基，说明副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中发酵的过程中产生抗脂质过氧化的物质。
结论：通过DPPH自由基的清除能力、羟自由基的清除能力、总还原能力及抗脂质过氧化能力四个指标来评价副干酪乳杆菌NCU622的抗氧化活性。研究发现，副干酪乳杆菌NCU622的活菌体、无细胞提取液及无菌发酵滤液均具有一定的DPPH自由基的清除能力、羟自由基的清除能力、总还原能力及抗脂质过氧化能力，且无菌发酵滤液的能力高于MRS液体培养基，说明副干酪乳杆菌NCU622的活菌体、无细胞提取液及代谢产物均有一定的抗氧化活性。

Claims (5)

1.一株具有抗氧化活性的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NCU622，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC11886。
2.一种组合物，其特征是包含权利要求1所述副干酪乳杆菌NCU622。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征是所述的组合物为食品。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征是所述的副干酪乳杆菌NCU622为活菌或灭活菌或该菌株的衍生物。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征是所述的食品为发酵果蔬、发酵乳、乳酪、含乳饮料或乳粉。
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