CN101864375B - 一株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌及其应用。该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C88，其保藏编号为CCTCC NO：M 209254。本发明菌株具有较强的耐酸性、耐胆盐性、耐抗生素性和黏附性，证明该菌株具有良好的益生特性，还具有很强的降低胆固醇的性能，可用于开发降低胆固醇益生菌产品，且本发明菌株具有产生胞外多糖的特性，可以达到改善应用本菌株产品的质地和口感的效果。因此，本发明菌株在黏液多糖和荚膜多糖的制备、及具有降低胆固醇的功能的产品的制备过程中，将有广阔的应用前景。

Description

一株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌及其应用。

背景技术

***粮农组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)对益生菌的定义是指通过摄取适当的量，对食用者的身体健康能发挥有效作用的活菌。具体地说，所谓益生菌就是能活着到达小肠，并能抑制有害菌在肠内的繁殖，促进肠道运动，从而增强和保持肠道的自然平衡，提高肠道机能。同时，益生菌对身体健康也有促进作用，具有防治腹泻，缓解乳糖不耐症，增强机体免疫力，预防癌症和抑制肿瘤生长及降低血清胆固醇等功能。目前，最为人所熟知和应用最为广泛的益生菌为乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)。

血清胆固醇水平偏高是引发心血管疾病的主要危险因素。而益生菌的一个重要的益生特性是能够降低血清胆固醇水平。20世纪70年代，科学家先后通过对大量饮用酸乳等发酵乳制品的非洲Masai人血清胆固醇的研究、对常饮酸乳的美国人的调查，以及直接对酸乳的研究均发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用。这些结果引起了国内外研究者的普遍关注，从而掀起了乳酸菌降胆固醇作用的研究热潮。迄今，有大量实验证实不同种类的乳酸菌具有降低胆固醇的效果。1982年，K.K.Grunewald于J.Food Sci.，47：2078-2079中报导，当大鼠被喂食含有经嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)发酵的乳4周后，大鼠血清胆固醇浓度显著下降。Danieloson等人于J.Anim.Sci.(1989)，67：966-974中报导由猪分离出的嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)LA16显示有降低血清胆固醇能力。Usman及Hosono于J.Dairy Sci.(1999)，82：243-248中报导，一株加氏乳杆菌(L.gasseri)具有耐酸、耐胆盐及降胆固醇能力。D.I.A.Pereira和G.R.Gibson于Appl.Environm.Microbiol.(2002)，68，4689-4693报导了分离自人肠道的一些乳杆菌和双歧杆菌具有良好的体外降胆固醇作用。M.T.Liong和N.P.Shah于J.Dairy Sci.(2005)，88：55-66报道了具有耐酸、耐胆盐及降胆固醇作用的嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌。

经口进入机体的益生菌，必须能耐受上消化道的强酸和高胆盐环境，并具有良好的粘附性能及定植抗性才能发挥益生作用。因此将能够耐受低pH和高胆盐及对肠上皮细胞的黏附、定植与否作为益生菌菌种筛选和应用的基础和前提。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株具有降低胆固醇功能的菌株。

本发明所提供的菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C88，其保藏编号为CCTCC NO：M 209254。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C88已于2009年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO：M 209254。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C88CCTCC NO：M 209254在降低胆固醇中的应用也属于本发明的保护范围，所述应用不包括疾病治疗方法。

植物乳杆菌(L.plantarum)C88CCTCC NO：M 209254在制备具有降低胆固醇功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述具有降低胆固醇功能的产品可为具有降低胆固醇功能的药物组合物、具有降低胆固醇功能的化妆品、具有降低胆固醇功能的食品、具有降低胆固醇功能的动物饲料或具有降低胆固醇功能的宠物食品。

上述应用中，所述具有降低胆固醇功能的产品为具有降低胆固醇功能的益生菌产品。

所述具有降低胆固醇功能的益生菌产品为具有降低胆固醇功能的药物组合物、具有降低胆固醇功能的化妆品、具有降低胆固醇功能的食品、具有降低胆固醇功能的保健品、具有降低胆固醇功能的发酵剂、具有降低胆固醇功能的发酵乳、具有降低胆固醇功能的动物饲料或具有降低胆固醇功能的宠物食品。

所述具有降低胆固醇功能的食品为液体乳、乳粉、奶酪或饮料；所述具有降低胆固醇功能的保健品为胶囊。所述液体乳为酸奶；所述乳粉为奶粉。

所谓发酵剂，是指为制作酸奶而调制的特定的微生物培养物。

发酵乳的定义：乳或乳制品在特征菌的作用下发酵而成的酸性凝乳状产品.在保质期内，该类产品中的特征菌必须大量存在，并能继续存活和具有活性。

植物乳杆菌(L.plantarum)C88CCTCC NO：M 209254在制备黏液多糖(slimepolysaccharides，SPS)和/或荚膜多糖(capsular polysaccharides，CPS)中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明，本发明的菌株具有产黏液多糖和荚膜多糖的特性；植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254在37℃下生长良好，16h达到对数期末期，菌数达到9.79(logcfu/ml)，培养液pH值下降到4.07，16h后开始进入到稳定期，32h达到稳定期。发酵56h菌数仍然能达到8.68(log cfu/ml)。植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254的SPS和CPS产生都是从8h开始快速增长，在32h达到最高，产量分别达到22.01mg/L(SPS)和15.86mg/L(CPS)。从32h之后，菌株生长大致处于衰亡期时SPS和CPS的量减少。实验还证明，植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254的胆固醇降低率平均为70.82％，在培养12h的时候，菌株降低胆固醇能力很强，在21h达到最高，24h仍然保持很高的水平；表明本发明的菌株具有很强且稳定的降低胆固醇的功能，用其制备得到的酸奶等乳制品也具有降低胆固醇的功能。本发明菌株还具有较强的耐酸性、耐胆盐性、耐抗生素性和黏附性，证明该菌株具有良好的益生特性，能被用来开发降低胆固醇益生菌产品，且本发明菌株具有产生胞外多糖的特性，可以达到改善应用本菌株产品的质地和口感的效果。因此，本发明菌株在黏液多糖和荚膜多糖的制备、具有降低胆固醇的功能的产品及益生菌产品的制备过程中，将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为负染法观察植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254产荚膜多糖的光学显微镜照片；

图2为植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254在SDM(semi-defined medium)液体培养基中37℃培养48h的菌株生长、粘液多糖和荚膜多糖产生情况；

图3为植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254的胆盐耐受作用。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明菌株于2006年12月10日分离得到。

实施例1、菌株的分离与鉴定

一、菌株的分离

本发明从中国内蒙古地区传统发酵奶豆腐的微生物群落中分离筛选菌株。

分离培养基(BCP培养基)：酵母膏2.5g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖5g/L、溴甲酚紫0.04g/L、琼脂15g/L、pH 7.0，121℃灭菌15min。

纯化培养基(MRS培养基)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、KH₂PO₄2g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸钠5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、MnSO₄·4H₂O0.05g/L、吐温801mL、琼脂15g/L、葡萄糖20g/L，pH 6.6，121℃灭菌15min。

经BCP分离平板反复划线培养，挑取产黄圈的单菌落接种于MRS固体培养基上继续培养，经MRS平板反复划线培养纯化，得到多株纯培养菌种。

纯培养菌种经革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性、吲哚反应阴性、产硫化氢试验阴性、明胶液化试验阴性、水解淀粉试验阴性和硝酸盐还原试验阴性筛选出多株乳酸杆菌。纯化后的菌株接种到MRS液体培养基培养后，加入20％甘油，-80℃冰箱保存备用。

用苯酚硫酸法测定多株纯培养菌种胞外多糖的产量，筛选出一株胞外多糖产量较高的菌株，将其命名为C88。

二、菌株的鉴定

(一)生理生化试验

菌株C88为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不运动的杆菌，在15℃和45℃能够生长，耐受6.5％NaCl，不水解淀粉，不液化明胶，不产生硫化氢，发酵葡萄糖产酸不产气，联苯胺试验阴性、吲哚试验阴性、乙酰甲基甲醇试验阳性。

(二)API 50CH(法国梅里埃公司)

API 50CH鉴定结果表明该菌株为植物乳杆菌(L.plantarum)，为极好的鉴定(表1)。

表1、植物乳杆菌C88的生理生化及微生物学特性

(三)16S rDNA鉴定

16S rDNA序列如序列表中序列1所示，其与已报道的植物乳杆菌JDM1(GenBankacc.No.CP001617)和EW-p(GenBank acc.No.EU096230)序列同源性达100％。

综合上述结果，乳杆菌C88被鉴定为植物乳杆菌(L.plan tarum)。

植物乳杆菌(L.plantarum)C88已于2009年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO：M 209254。

实施例2、植物乳杆菌CCTCC NO.M 209254的性能及功能

一、植物乳杆菌CCTCC NO.M 209254的生长特性及胞外多糖产生

植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254为同时产黏液多糖(SPS)和荚膜多糖(CPS)的乳酸菌株。采用负染法显微镜观察植物乳杆菌C88所产荚膜如图1所示。通常将菌株生长代谢过程中分泌到培养基中的多糖称为黏液多糖，而将附着于菌体细胞壁表面的多糖称为荚膜多糖，2种多糖是根据存在方式不同而区分的。

植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254在SDM(semi-defined medium)液体培养基中37℃培养48h，测定培养过程中菌株生长及胞外多糖产量变化，结果如图2所示。结果表明，植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254在37℃下生长良好，16h达到对数期末期，菌数达到9.79(log cfu/ml)，培养液pH值下降到4.07，16h后开始进入到稳定期，32h达到稳定期。发酵56h菌数(log cfu/ml)仍然能达到8.68。植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254的SPS和CPS产生都是从8h开始快速增长，在32h达到最高，产量分别达到22.01mg/L(EPS)和15.86mg/L(CPS)。从32h之后，菌株生长大致处于衰亡期时EPS和CPS的量减少。

SDM液体培养基按照如下方法配制的：胰蛋白胨10g(进口LP4002，TRYR Tone)，无水乙酸钠5g，柠檬酸钠5g，K₂HPO₄2g，MgSO₄0.2g，MnSO₄0.05g，加蒸馏水至1000ml，加入吐温801ml，葡萄糖20g，用1mol/L醋酸调至pH＝6.5。在115℃下灭菌15min，与经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的无氨基酸氮源(Yeast Nitrogen Base，BD公司)5g及氨基酸(L-His 10mg，L-Met 20mg和L-Try 20mg)混合。

二、植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254的耐受性测定

1、耐酸试验

为了确定乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254对低pH值的耐受能力，以中性(pH 6.6)为对照，检测菌株在不同pH(2.0，2.5和3.0)中的存活率。将植物乳杆菌C88CCTCCNO：M 209254菌种过夜培养活化，然后按3％(v/v)的量接种于新鲜的MRS液体培养基中，用盐酸将培养基的pH调节为2.0、2.5、3.0和6.6，置于37℃培养箱静置培养，分别于1h、2h和3h无菌取出培养菌液50μL，涂布MRS琼脂平板，培养48h，菌落计数，计算存活率。

结果如表2所示，表明植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254不耐受pH 2.0，对pH 2.5有很好的耐受作用。pH 2.5处理1h～3h存活率分别为68.57％、26.83％和23.26％。对pH 3.0均具有较强的耐受能力，培养3h后菌株存活率仍超过80％。

表2、植物乳杆菌C88CCTCC M209254的酸耐受作用

2.耐胆盐试验

为了检验植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254在胆盐存在环境下的生长存活状态，将菌株在MRS液体培养基中活化两次至活力恢复，试验设5g/L、10g/L、20g/L和30g/L 4个胆盐浓度(即向培养基中加入不同质量的牛胆粉，得到不同胆盐浓度的培养基)，以不加胆盐的培养基为对照。活化后的菌株在MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，按3％接种量分别接种于含不同浓度牛胆粉的MRS液体培养基中。37℃厌氧培养4h，取50μl稀释、涂布MRS琼脂平板。培养48h后菌落计数。

结果如图3所示，植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254对5g/L～30g/L浓度胆盐耐受的存活率分别为87.91％、66.42％、55.31％和37.57％，实验结果表明，随着胆盐浓度上升存活率下降，在胆盐浓度30g/L条件下存活率还能达到37.57％，这表明该菌株对胆盐表现出较强的耐受性。

3.抗生素耐受性测定

益生菌植物乳杆菌C88 CCTCC NO：M 209254的抗生素敏感性采用最小抑制浓度值(MIC)确定。本试验选用10种抗生素，采用MRS培养基添加不同浓度抗生素的方法，根据生长状况观察和培养后菌数对照得到该菌株对每种抗生素的MIC值。根据测定的MIC值和MIC临界点值EUC(EU Commission)的统计参考值，确定菌株对各种抗生素的敏感性结果。结果如表3所示，显示除了对利福平敏感外，本菌株对其他种类的抗生素显示出抗性。

表3植物乳杆菌C88抗生素抗性MIC值及敏感性

S代表敏感，R代表抗性

三、细胞粘附性测定

当Caco-2细胞在24孔细胞培养板(Greiner Bio-One，Cat.-No.662160)中长至单层贴壁时，经血球计数板计数，细胞数目为3.5×10⁵个。每孔加入0.5ml浓度为3.4×10⁹CFU/ml菌悬液和0.5ml新鲜的DMEM(GIBCO，Cat.-No.12100-046)培养液，置37℃、5％CO₂、90％湿度的二氧化碳培养箱中孵育2h，用灭菌的PBS漂洗细胞5次，以除去未黏附的细菌。漂洗完后，用0.4％多聚甲醛固定30min，革兰氏染色，镜检。之后每孔中加入0.2ml胰酶作用10min，待细胞完全脱落，加入0.125ml含有20％血清的培养液终止反应。之后加入0.175ml 0.1％Triton X-100，静置10min，以裂解细胞。混合菌液经系列稀释后，平板菌落计数。以不加菌液细胞培养为对照。每个处理做3个平行，计算每个细胞黏附的平均细菌数。结果表明，植物乳杆菌C88对Caco-2细胞有很好的粘附性，黏附细胞数为(16.1±0.7)CFU/细胞。

四、降低胆固醇能力测定

胆固醇购自BIO BASIC INC.，产品目录号为LS0306B069L CAS#57-88-5；牛胆盐购自SIGMA.ALDRICH.Co.，产品目录号为8008-63-7；

挑取植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254菌落，转接到MRS液体培养基中，37℃培养24h进行菌株活化，重复活化2次。

培养液MRSO-CHOL的组成：由MRS液体培养基、巯基乙酸钠、胆固醇和牛胆盐组成；巯基乙酸钠在培养液MRSO-CHOL中的浓度为2g/L，胆固醇在培养液MRSO-CHOL中的浓度为200mg/L，牛胆盐在培养液MRSO-CHOL中的浓度为0.3％(质量百分含量)。115℃灭菌20min。

植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254降低胆固醇功能检测方法如下所述：15mL无菌具塞离心管中加入10mL培养液MRSO-CHOL(胆固醇含量200mg/L)，按照3％(v/v)的接种量接入活化后菌液(菌液中菌的浓度为3×10⁹cfu/ml)，37℃培养24h，培养液12000×g离心10min，按照邻苯二甲醛法测定培养样上清液胆固醇的含量，以未接菌的培养液MRSO-CHOL作空白对照，计算出植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254的胆固醇降低率。

邻苯二甲醛法：将样品准备好后，取1mL置于干净试管(18cm×18cm)中，再加入3mL 95％的乙醇，旋涡震荡均匀后再加入2mL 50％KOH溶液，震荡均匀后置于60℃的水浴中加热10min。取出后冷却至室温，加入3mL水，震荡均匀后加入5ml正己烷，旋涡震荡1min进行萃取，室温下静置10min。取正己烷层2.5mL于干净试管内(15cm×15cm)，置于60℃水浴中用N₂吹干(或者真空干燥)，干燥后加入4mL邻苯二甲醛显色剂，震荡均匀后，加入2mL浓硫酸，震荡1min后静置10min。使用分光光度计在550nm处测其吸光度。

胆固醇降低率(D)计算公式为：

$D=\frac{C-A}{C}\×100\%$

其中A为试验菌株发酵上清液OD550nm值

C为空白对照OD550nm值

D为胆固醇降低率

实验设3次重复，结果取平均数。结果如表5所示。植物乳杆菌C88CCTCC NO：M 209254培养12h胆固醇降低率为68.23％，在培养21h达到最高为73.11％，培养24h仍保持很高的水平。这表明该菌株具有很强的降胆固醇能力。

表5植物乳杆菌C88胆固醇降低率

序列表

<110>吉林省农业科学院

<120>一株具有降胆固醇功能的植物乳杆菌及其应用

<160>1

<210>1

<211>1474

<212>DNA

<213>植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400>1

gcggcgtgcc  taatacatgc  aagtcgaacg  aactctggta ttgattggtg  cttgcatcat    60

gatttacatt  tgagtgagtg  gcgaactggt  gagtaacacg tgggaaacct  gcccagaagc    120

gggggataac  acctggaaac  agatgctaat  accgcataac aacttggacc  gcatggtccg    180

agcttgaaag  atggcttcgg  ctatcacttt  tggatggtcc cgcggcgtat  tagctagatg    240

gtggggtaac  ggctcaccat  ggcaatgata  cgtagccgac ctgagagggt  aatcggccac    300

attgggactg  agacacggcc  caaactccta  cgggaggcag cagtagggaa  tcttccacaa    360

tggacgaaag  tctgatggag  caacgccgcg  tgagtgaaga agggtttcgg  ctcgtaaaac    420

tctgttgtta  aagaagaaca  tatctgagag  taactgttca ggtattgacg  gtatttaacc    480

agaaagccac  ggctaactac  gtgccagcag  ccgcggtaat acgtaggtgg  caagcgttgt    540

ccggatttat  tgggcgtaaa  gcgagcgcag  gcggtttttt aagtctgatg  tgaaagcctt    600

cggctcaacc  gaagaagtgc  atcggaaact  ggaaaacttg agtgcagaag  aggacagtgg    660

aactccatgt  gtagcggtga  aatgcgtaga  tatatggaag aacaccagtg  gcgaaggcgg    720

ctgtctggtc  tgtaactgac  gctgaggctc  gaaagtatgg gtagcaaaca  ggattagata    780

ccctggtagt  ccataccgta  aacgatgaat  gctaagtgtt ggagggtttc  cgcccttcag    840

tgctgcagct  aacgcattaa  gcattccgcc  tggggagtac ggccgcaagg  ctgaaactca    900

aaggaattga  cgggggcccg  cacaagcggt  ggagcatgtg gtttaattcg  aagctacgcg    960

aagaacctta  ccaggtcttg  acatactatg  caaatctaag agattagacg  ttcccttcgg    1020

ggacatggat  acaggtggtg  catggttgtc  gtcagctcgt gtcgtgagat  gttgggttaa    1080

gtcccgcaac  gagcgcaacc  cttattatca  gttgccagca ttaagttggg  cactctggtg    1140

agactgccgg  tgacaaaccg  gaggaaggtg  gggatgacgt caaatcatca  tgccccttat    1200

gacctgggct  acacacgtgc  tacaatggat  ggtacaacga gttgcgaact  cgcgagagta    1260

agctaatctc  ttaaagccat  tctcagttcg  gattgtaggc tgcaactcgc  ctacatgaag    1320

tcggaatcgc  tagtaatcgc  ggatcagcat  gccgcggtga atacgttccc  gggccttgta    1380

cacaccgccc  gtcacaccat  gagagtttgt  aacacccaaa gtcggtgggg  taacctttta    1440

ggaaccagcc  gcctaaggtg  ggacagatga  ttag                                 1474

Claims (2)

1.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)C88，其保藏编号为CCTCC NO：M209254。

2.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)C88 CCTCC NO：M 209254在制备黏液多糖和/或荚膜多糖中的应用。 

Images