CN104046585A - 一种动物双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株。本发明提供的双歧杆菌细菌素，是发酵动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790，得到的细菌素。本发明提供了动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC No.7790代谢产细菌素的最佳培养条件。本发明还提供了动物双歧杆菌细菌素的提取纯化方法，即通过pH值吸附解吸法粗提，阳离子交换树脂层析及凝胶过滤层析纯化得到细菌素纯品。本发明所提供的双歧杆菌细菌素分子量为1198.6832Da，是一种新型双歧杆菌细菌素，具有非常良好的食品加工特性，抑菌谱广，安全性高，可用于天然食品生物防腐剂的开发。

Description

一种动物双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株

技术领域

本发明涉及一种动物双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株，属于食品生物技术领域。

背景技术

乳酸菌及其活性代谢产物与人类健康密切相关，常常自然存在于食品或被有意识地引进食品产品中，从而使食品拥有人们渴望的风味、营养及安全性。乳酸菌活性代谢产物主要涉及乳酸、细菌素、胞外多糖、共轭亚油酸等。乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中通过核糖体机制合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，它在人体内可被降解，具有高效、无抗药性、无毒、无残留等优点，已成为天然食品生物防腐剂研究与开发的热点。

几乎每个乳酸菌属菌株都可以产生细菌素，目前已报道的乳酸菌细菌素已有40余种。双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)是寄生在人和动物肠道内的典型有益乳酸菌，它可以对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、延缓衰老、抗肿瘤等生理作用。业已发现，极少数双歧杆菌属菌株也可产生细菌素，如两歧双歧杆菌(B.bifidum)NCFB1454、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)RBL67、婴儿双歧杆菌(B.infants)BCRC14602等。

双歧杆菌是人体肠道健康的重要指标，在食品工业中也占有重要地位，其所产细菌素也越来越受到人们的重视，必将成为天然生物防腐剂的开发热点。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有广谱抑菌效果的产细菌素双歧杆菌。

本发明所提供的双歧杆菌，是动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04，已于2013年06月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC №.7790。

本发明的第二个目的是提供一种双歧杆菌细菌素及其生产方法。

本发明所提供的生产双歧杆菌细菌素的方法，是发酵动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimals)BB04 CGMCC №.7790得到的细菌素。

所述方法中，用于培养动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790的培养时间优选为40.4h，培养基起始pH值优选为6.94，培养温度优选为34.5℃。

所述方法中，得到的细菌素可按照以下步骤进行提取纯化：采用pH吸附解吸法从发酵液中提取细菌素，吸附pH值为2.0-3.0，解吸pH值为5.0-7.0，得到细菌素粗品；进一步通过阳离子交换树脂层析及凝胶过滤层析纯化，并经冷冻干燥得到细菌素纯品。

其中，上述pH吸附解吸法的最佳吸附pH值为3.0，最佳解吸pH值为6.0。

上述阳离子交换树脂层析以SP Sepharose Fast Flow为填料，用pH5.5，含0-1M NaCl的0.02M醋酸缓冲液在130min内进行线性梯度洗脱，流速1.0mL/min，收集保留时间为40-48min的蛋白峰为细菌素活性峰。

上述凝胶过滤层析以Sephadex G-10为填料，用pH6.0，0.02mol/L磷酸缓冲液进行洗脱，流速0.5mL/min，收集保留时间为34-48min的蛋白峰为细菌素活性峰。

上述提取纯化所得细菌素分子量为1198.6832Da。

上述方法得到的双歧杆菌细菌素也属于本发明的保护范围。

本发明的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790是一种产细菌素的动物双歧杆菌，该细菌素是一种新型双歧杆菌细菌素，其具有非常良好的食品加工特性，抑菌谱广，安全性高，可用于天然食品生物防腐剂或微生态制剂的开发。

附图说明

图1为不同pH值条件下细菌素对产生菌细胞的吸附率图。

图2为细菌素的阳离子交换树脂层析洗脱曲线图。

图3为细菌素的凝胶过滤层析洗脱曲线图。

图4为细菌素的MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)分析图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不仅限于本发明。

实施例1、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790的分离和鉴定

1、菌株的筛选

无菌称取母乳婴儿粪便25g，迅速放入225mL生理盐水中，再将其10倍梯度稀释至活菌数10^-6-10^-10cfu/mL，然后吸取0.2mL进行亨盖特厌氧滚管，放于37℃恒温箱培养48-72h，然后挑选菌落特征为光滑、凸圆、边缘整齐、乳白色或微带黄色、质地柔软的中小菌落接种于改良MRS液体培养基，厌氧培养24-48h，进行革兰氏染色。挑选革兰氏染色观察有双歧杆菌形态特征的、周围有透明圈、边缘光滑整齐、白色或微黄色的菌落接种于改良MRS培养基，分别在有氧和厌氧环境下于37℃培养24h，同时进行KOH、过氧化氢酶、吲哚、代谢葡萄糖等试验。选取厌氧条件生长、有氧条件不生长、KOH试验阴性、过氧化氢酶试验阴性、吲哚试验阴性、能代谢葡萄糖但不产气的菌初步确定为筛选出的双歧杆菌。采用牛津杯琼脂平板扩散法，以肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)13076和单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)54002(1/2a)为指示菌进行抑菌实验，筛选得到具有较强抑菌活性的菌株为产细菌素的可疑菌株5株。

由于双歧杆菌在发酵过程中会产生细菌素、乳酸、H₂O₂等多种具有抑菌活性的物质，某些双歧杆菌菌体细胞对其他细菌也可能有拮抗作用，因此需要排除这些干扰后对产细菌素的可疑菌株进行进一步鉴定。主要包括：(1)排除有机酸的干扰：在可疑菌株发酵上清液中加入1mol/LNaOH，调其pH值为6.5～7左右，进行抑菌实验，比较排酸前后的抑菌圈直径。(2)排除H₂O₂的干扰：用过氧化氢酶于37℃处理发酵液2h，以未处理发酵液作对照进行抑菌实验，比较抑菌圈直径差异。(3)排除菌体细胞的干扰：将发酵液于4℃，8000rpm离心10min，取上清液过微孔滤膜(尺寸Φ25，孔径0.22μm)的细菌过滤器过滤除去菌体细胞对抑菌实验的影响。(4)用硫酸铵沉淀法粗提细菌素后透析除盐，加入蛋白酶K反应，以确定细菌素为蛋白类物质。将5株可疑菌株的发酵液排除有机酸、H₂O₂及菌体细胞干扰因素影响并经硫酸铵沉淀、透析处理后检测抑菌活性，发现仅有菌株BB04仍具有较高抑菌活性。向透析液中加入蛋白酶K(20U/mL)，37℃作用1h后发现抑菌活性消失，具体结果见表1。综合以上，选择菌株BB04作为目标菌株。

表1 不同处理对菌株BB04发酵液抑菌活性的影响

2、菌株的鉴定

采用形态学观察、API20A生理生化反应和16S rDNA序列分析对目标菌株BB04进行分类学鉴定。菌株BB04在改良固体MRS厌氧管中生长良好，菌落呈白色，圆形，边缘较光滑整齐，在有氧条件下无明显菌落；将挑取菌落稀释后革兰氏染色，显微镜下观察发现：BB04菌体细胞形态为G⁺，呈现杆状，部分呈Y或V字形等分叉结构，无芽孢，不运动，不规则排列。根据API细菌鉴定标准，运用API20A厌氧鉴定***对菌株BB04进行20种糖醇发酵试验。查表分析试剂条反应结果，初步确定BB04属于双歧杆菌属(Bifodobacterium spp.)。提取菌株BB04的DNA基因组，经PCR扩增得到1437bp的DNA序列片段(见序列表)，并将其回收纯化，交由北京六合华大基因科技有限公司测序。将测序结果在NCBI上的Genbank中进行同源性比对，使用Mega3.1软件构建***发育树。由***发育树可知，菌株BB04与Bifidobacterium animalis处于同一个小分支，亲缘关系最近，相似度高达99.1％；结合形态学观察和API20A生化鉴定结果，确定菌株BB04为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)。

动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BB04已于2013年06月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC №.7790。

实施例2、利用动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790生产细菌素

1、细菌素活性检测方法

(1)选择标准曲线范围：将500mg nisin(乳酸链球菌素)标准品(10⁶AU/g)溶于50mL无菌的0.02mol/L的盐酸稀释溶液中，配成10⁴AU/mL的标准液备用。用0.02mol/L HCl依次将10⁴AU/mL的nisin标准液稀释成5000，2500，1000，750，500，250，100，75，50，25，10AU/mL的标准溶液。分别取100μL依次加于已制备好平板的牛津杯中，每个浓度重复3个平板，做抑菌试验，以抑菌圈直径的校正值为横坐标，nisin效价的对数为纵坐标，绘制标准曲线。确定抑菌圈直径与效价对数值有较好的线性关系时的nisin效价范围。其中，以肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)13076为指示菌，nisin标准品购于Sigma公司。

(2)制作效价值标准曲线：根据上一步确定的nisin效价范围，以肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)13076为指示菌，做抑菌试验，制作nisin效价标准曲线。用0.02mol/L HCl依次将10⁴AU/mL的nisin标准液稀释成1000，750，500，250，100，75和50AU/mL，依次取100μL分别加入平板(已制备好)中相互间隔的3个牛津杯中，同时将100μL中心浓度的nisin溶液加入另外间隔的3个中，每个梯度重复3个平板，将对应的效价值对数为纵坐标，对应抑菌圈直径的差数为横坐标，进行标准曲线的绘制。

(3)确定样品的效价值：将不同样品稀释适当倍数后，取100μL分别加入相互间隔的3个牛津杯中，将对照(nisin效价曲线的中间浓度)加入另外间隔的3个牛津杯中，重复3次试验。将抑菌圈直径与对照抑菌圈直径的差值代入标准曲线中计算，可得到样品的效价值

结果显示，当nisin效价在50～1000AU/mL时，效价对数值与抑菌圈直径差值呈较好的线性关系，拟合曲线的线性程度较高，说明该标准曲线对于效价测定有较高的精确度和灵敏度，因此确定其作为测定样品效价的标准曲线，得到其回归方程为y＝0.2165x+2.7633(R²＝0.9939)，其中y表示相对抑菌效价的对数值；x表示抑菌圈直径/mm，将待测细菌素样品的抑菌圈直径代入即可得到该细菌素的抑菌效价。

2、细菌素生产条件的优化

选择适合于双歧杆菌生长的改良MRS培养基(配方为蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、磷酸氢二钾0.2％、柠檬酸二胺0.2％、乙酸钠0.5％、葡萄糖2％、吐温800.1％、七水合硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、玉米浆0.35％、L-半胱氨酸盐酸0.035％、蒸馏水1000mL，pH6.5，所述百分数均为质量百分比)，采用10⁴cfu/mL接种量，培养基起始pH值6.5，在37℃下厌氧培养100h，分别于0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、60、100h取样测定动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790生长量及细菌素产量。结果显示该动物双歧杆菌在培养7h后进入对数期，20h进入稳定期，在24h开始产生细菌素，40-48h细菌素产量最高，并维持相对稳定，之后有所下降。因此选取最适培养时间为40h，细菌素效价为255.43AU/mL。之后分别对比不同接种量(10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷cfu/mL)、培养基起始pH值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0)、培养温度(25℃、30℃、37℃、40℃、45℃)对细菌素产量的影响，选取对细菌素产生影响显著的培养因素进行响应面优化，以确定细菌素的最优生产条件，结果见表2-4。

由单因素试验结果可知，在培养时间40h、接种量10⁵cfu/mL、培养起始pH值7及培养温度37℃条件下，细菌素活性较高；选取其中对细菌素产生影响显著的培养时间、培养起始pH值和培养温度三个因素为自变量，以相对抑菌效价为响应值，进行中心组合试验设计，建立回归模型并验证，回归模型方差分析表如下表5。

表2 不同接种量对菌株BB04代谢产细菌素的影响

表3 不同培养基起始pH值对菌株BB04代谢产细菌素的影响

表4 不同培养温度对菌株BB04代谢产细菌素的影响

表5 回归模型方差分析表

对回归模型方差分析表中数据进行多元回归拟合，得到产细菌素抑菌效价(Y)对培养时间(A)、培养起始pH值(B)、培养温度(C)的多项回归方程为：Y＝4620.509-177.263A-850.27B-132.626C+546.3965AB-229.421AC+76.5085BC-1455.55A²-1950.68B²-1014.88C²。式中：Y为效价的预测值；A，B，C分别为培养时间、培养起始pH和培养温度对应的编码值。

由表5可知，此模型p＝0.0004＜0.05，回归方程拟合程度良好；失拟项(p＝0.0668＞0.05)不显著，表明模型精度高，适用性好。通过方程表达式，得知其二次项的系数都为负值，作图显示的抛物面开口向下，所以方程具有极大值点。经计算分析可得细菌素最优产生条件为：培养时间40.4h、培养起始pH6.94、培养温度34.5℃，优化后的细菌素抑菌效价达到886.34AU/mL，比优化前的抑菌效价255.43AU/mL提高了2.47倍，与预测值拟合率达98.9％，表明预测值和实际值有良好的拟合性，优化模型可靠。

实施例3、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790所产细菌素的提取纯化

1、pH值吸附解吸法提取

最佳吸附解吸pH值的确定：(1)离心收集细胞，用灭菌的PBS(5mM pH6.0)冲洗几次并重悬于1.0M NaCl中用5％的磷酸调pH至3.0，在4℃混匀1h离心收集并重悬于20倍初始体积的无菌水中，以确保细胞表面没有吸附的细菌素。(2)确定pH对细菌素吸附的影响，各取0.1mL细胞，0.1mL细菌素样品(效价为886.34AU/mL)，分别加到1.8mL PBS(pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)中，混匀30min，离心检测上清液中细菌素的抑菌活性。对照1：用0.1mL的水代替0.1mL的细菌素；对照2：用0.1mL的水代替加入的细胞：细菌素的吸附率＝100％×(上清液中的效价-对照1)/对照2。抑菌活性检测采用琼脂平板扩散法，以肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)13076为指示菌进行。具体结果见图1。

结果显示，当pH值调至5-7时吸附到产生菌细胞上的细菌素较少，吸附率低于30％，即未吸附上的细菌素含量较高；而pH值调至2-3时细菌素吸附到产生菌细胞上的吸附率较高(80％以上)。故选取pH值3为细菌素最佳吸附pH值，pH值6分别为细菌素最佳解吸pH值。

选用上述确定的最佳吸附和解吸pH值，对发酵液中的细菌素进行粗提。具体为：将菌株BB04以10⁵cfu/mL接种量接种于100mL改良MRS培养基中，于34.5℃下厌氧发酵40h，发酵过程中控制pH稳定在7左右。发酵结束后调温度至70℃，灭酶25min。冷却至室温后将发酵液调至最佳吸附pH值3，4℃搅拌2h，离心收集细胞，用与吸附pH值相同的磷酸缓冲液洗细胞1-2次，重悬于灭菌蒸馏水中，调至最佳解吸pH值6，4℃磁力搅拌12h以上，8000rpm，离心15min，取上清液即为细菌素粗提物进行下面的纯化步骤。此步骤可由100mL发酵液(比活力66.79AU/mg)经pH吸附解吸法得到30mL，比活力为76.74AU/mg的细菌素粗品，纯化倍数提高了1.15倍。

2、细菌素的纯化

细菌素的纯化采用阳离子交换树脂层析和凝胶过滤层析，纯化过程中以肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)13076为指示菌，并采用琼脂平板扩散法对每步纯化样品抑菌活性进行分析。具体方法如下：将上述细菌素粗提液通过SP Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂层析进一步纯化，上样1.0mL，以含0-1M NaCl，pH5.5的0.02mol/L醋酸缓冲液线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的时间是130min，所述线性梯度洗脱中NaCl的浓度在130min内由0M线性升至1M，流速为1.0mL/min，每2min接收1管，同时检测洗脱液在280nm处的紫外吸收值，并根据A₂₈₀值图形波峰波谷的情况，分别检测每管洗脱液的抑菌活性，结果如图2所示。收集保留时间为40-48min(即第60-64管)的蛋白峰为细菌素活性峰，经冷冻干燥浓缩复溶于pH7.0磷酸缓冲液中，作为细菌素半纯品。共获得10mL，效价为3674.67AU/mL的细菌素半纯样品。接着，通过Sephadex G-10凝胶过滤层析进行纯化，上样1mL细菌素半纯品，采用pH6.0，0.02mol/L磷酸缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min，每2min接收1管，同时监测各管洗脱液的A₂₈₀值。根据A₂₈₀值图形波峰波谷的情况，将所有峰的洗脱液分别进行合并后进行抑菌活性检测，结果见图3。收集保留时间为34-48min(即第17-24管)的蛋白峰为细菌素活性峰，经冷冻干燥浓缩复溶于pH7.0磷酸缓冲液中，作为细菌素纯品，4℃冰箱贮存备用。最终获得2mL，效价为5542.12AU/mL细菌素纯品(表6)。

表6 不同阶段细菌素纯化效果分析表

由表6可以看出，通过以上提取纯化程序(pH值吸附解吸、阳离子交换树脂层析及凝胶过滤柱层析)，每100mL动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790发酵液可最终获得2mL，比活力高达2067.91AU/mg的细菌素纯品。

总蛋白：采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自碧云天生物技术研究所，产品货号：P0012)对各样品中总蛋白质含量进行测定；

总活力的定义为：细菌素样品所具有的总抑菌活力单位数；

比活力的定义为：每毫克细菌素蛋白所具有的抑菌活力单位数；

总活力(AU)＝细菌素样品效价值(AU/mL)×样品总体积(mL)；

比活力(AU/mg)＝细菌素样品总活力(AU)/样品总蛋白含量(mg)；

纯化倍数＝纯化后细菌素样品比活力(AU/mg)/纯化前细菌素样品比活力(AU/mg)；

回收率(％)＝纯化后细菌素样品总活力(AU)/纯化前细菌素样品总活力(AU)×100％。

3、纯化细菌素的分子量确定

为了确定细菌素的纯度及精确地分子量，用MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)对纯化所得细菌素样品进行分析，确定纯化所得样品为单一成分物质，得到该细菌素的分子量为1198.6832Da，如图4所示。

实施例4、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790所产细菌素的应用特性

1、细菌素的理化特性

(1)热稳定性：准备7管纯化后细菌素样品(效价5542.12AU/mL)，1mL/管，分别水浴加热处理50℃、30min；60℃、30min；70℃、30min；80℃、30min；90℃、30min；121℃、20min。以未经热处理的样品为对照，进行抑菌试验，检测细菌素活性变化。结果表明：菌株BB04所产细菌素经50～80℃，处理30min，能保持85％以上的活性残留；90℃处理其抑菌活性仅损失约一半；121℃，20min的高温处理后仍有10％左右的抑菌活性，说明该细菌素具有较强的热稳定性。

(2)酸碱耐受性：选取pH范围2～11处理进行细菌素酸碱耐受性试验。分别取0.5mL的细菌素样品(pH7.0，效价5542.12AU/mL)于10个试管中，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH分别调其至所要求pH，37℃温育4h后，将所有试管调pH至中性(7.0左右)，以未调节pH的样品加蒸馏水同比稀释的细菌素样品(pH＝7.0)为对照，进行抑菌试验，检测细菌素活性变化。结果表明：菌株BB04所产细菌素的抑菌活性在pH3-9范围内基本保持不变，残留效价比均在93％以上；而pH为2和10时，抑菌活性有所降低，但仍保持50％的活力。pH大于10时，抑菌活性迅速降低，残留效价比最高只有19％。这些结果显示该细菌素具有较宽泛的pH值活性范围，可在酸性和中性食品中使用。

(3)蛋白酶敏感性：将不同蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶)配成5mg/mL的溶液，分别取0.1mL置于离心管中，分别加入纯化后的细菌素样品(效价5542.12AU/mL)0.4mL，使酶的终浓度为1mg/mL，并调节pH值为各酶的最适pH范围内，同时以0.1mL无菌水加入0.4mL细菌素作为对照，37℃温育4h，检测细菌素活性。由表7可以看出，菌株BB04所产细菌素对胃蛋白酶、胰蛋白酶和酸性蛋白酶十分敏感，处理后抑菌圈消失，完全失活；中性蛋白酶和木瓜蛋白酶使其部分失活，溶菌酶对其无作用。结果表明该细菌素可被人体内的部分蛋白酶分解消化，在人体内可被消化而无残留，作为食品防腐剂使用具有很高的安全性。

表7 菌株BB04所产细菌素的蛋白敏感性

注：+表示完全失活，(+)表示部分失活，-表示完全不失活。

2、细菌素的抑菌谱

采用牛津杯双层平板琼脂扩散法制作不同指示菌平板，指示菌细菌终浓度为10⁷cfu/mL，真菌、酵母细胞或孢子浓度为10⁴个/mL，牛津杯中加样品后于指示菌最适条件培养，测定抑菌圈直径。如表8所示：菌株BB04所产细菌素有较宽的抑菌范围，不仅对李斯特菌、葡萄球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有明显抑制作用，对大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌等阴性菌也表现出非常强烈的抑菌活性，同时对两株受试真菌(白假丝酵母菌和啤酒酵母菌)也表现出抑菌活性，可广泛用于食品防腐杀菌处理。

表8 菌株BB04所产细菌素的抑菌谱

注：NICPBP为***药品生物制品检定，ATCC为美国标准菌种保藏所，CVCC为中国兽医微生物菌种保藏中心，CGMCC为普通微生物菌种保藏管理中心；-表示没有抑制，+表示抑菌圈直径＜13mm，++表示抑菌圈直径为13～20mm，+++表示抑菌圈直径＞20～25mm，++++表示抑菌圈直径＞25mm。

Claims (9)

1.动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790。

2.一种生产双歧杆菌细菌素的方法，是发酵权利要求1所述的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC №.7790，得到的细菌素。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述培养时间优选为40.4h，培养基起始pH值优选为6.94，培养温度优选为34.5℃。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述方法得到的细菌素按照以下步骤进行纯化：采用pH吸附解吸法从发酵液中提取细菌素，吸附pH值为2.0-3.0，解吸pH值为5.0-7.0，得到细菌素粗品；进一步通过阳离子交换树脂层析及凝胶过滤层析纯化，并经冷冻干燥得到细菌素纯品。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述pH吸附解吸法的最佳吸附pH值为3.0，最佳解吸pH值为6.0。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述阳离子交换树脂层析以SP Sepharose FastFlow为填料，用pH5.5，含0-1M NaCl的0.02M醋酸缓冲液在130min内进行线性梯度洗脱，流速1.0mL/min，收集保留时间为40-48min的蛋白峰为细菌素活性峰。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述凝胶过滤层析以Sephadex G-10为填料，用pH6.0，0.02mol/L磷酸缓冲液进行洗脱，流速0.5mL/min，收集保留时间为34-48min的蛋白峰为细菌素活性峰。

8.根据权利要求4所述方法，其特征在于：提取纯化得到的细菌素分子量为1198.6832Da。

9.由权利要求2或3或4中所述方法得到的双歧杆菌细菌素。