JP3670272B2 - ラクトフェリン類の断片に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造法 - Google Patents
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Description
経口摂取したラクトフェリンは胃液中に分泌された消化酵素、例えばペプシンによって消化され、更に抗菌活性が強い抗菌性ペプチドが生じるものと考えられている。このように酵素により加水分解され、タンパク質から新たに生成した生理活性ペプチドを検出及び定量するためには、加水分解前のタンパク質を抗原として得られた抗体では不十分である。その理由は、加水分解前のタンパク質を抗原としてモノクローナル抗体の作成を行った場合、生理活性ペプチドのみならず、抗菌性活性のないペプチド、抗菌性活性のないタンパク質とも結合する抗体が得られる可能性が高いからである。
ア)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する希釈試料を固相に固定化し、前記モノクローナル抗体を添加し、このモノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した2次抗体を前記固相に添加し、この標識物質を検出すること、
イ)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する希釈試料を固相に固定化し、前記モノクローナル抗体を標識物質で標識化した標識化モノクローナル抗体を添加し、この標識物質を検出すること、のいずれかを含む、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出又は定量する方法が提供される。
a)脱脂乳から分離したラクトフェリン、鉄を一部又は完全に飽和したラクトフェリン、鉄を除去したラクトフェリン、鉄以外の金属(例えば、銅、亜鉛等)を一部又は完全に飽和させたラクトフェリンのいずれかを抗原としたポリクローナル抗体を予め固定化したプレート、
b)前記モノクローナル抗体、
c)前記モノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を酵素で標識化した2次抗体、
d)前記酵素の反応により発色する基質色素、及び
e)標準濃度の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの溶液、を含む、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出又は定量するための試薬キットが提供される。
a)脱脂乳から分離したラクトフェリン、鉄を一部又は完全に飽和したラクトフェリン、鉄を除去したラクトフェリン、鉄以外の金属(例えば、銅、亜鉛等)を一部又は完全に飽和させたラクトフェリンのいずれかを抗原としたポリクローナル抗体を予め固定化したプレート、
b)前記モノクローナル抗体、
c)前記モノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体をビオチン標識した2次抗体、
d)ビオチニル化アルカリフォスファターゼ、
e)ストレプトアビジン溶液、
f)アルカリフォスファターゼの反応により発色する基質色素、及び
g)標準濃度の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの溶液、を含む、配列
番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出又は定量するための試薬キットが提供される。
また、本明細書において、百分率の表示は、特に断りのない限り、重量による値である。
1)ヒト若しくはウシ由来のラクトフェリン類の断片に対して特異性の高い抗体及びこれを産生する細胞ラインが得られる。
2)複雑な装置等を使用することなく、ヒト若しくはウシ由来のラクトフェリン類の断片、例えば胃液、腸内容物、便、血液、尿等に含有されるラクトフェリン類由来の抗菌性ペプチドを、特異的、かつ高感度に検出又は定量することができる。
説明する。
<1>本発明のハイブリドーマの製造方法
本発明は、ウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片、例えばウシラクトフェリン類由来の抗菌性ペプチド及びヒトラクトフェリン類由来の抗菌性ペプチドの少なくともいずれかと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造方法に関する。
特に望ましい抗菌性ペプチドとしては、配列番号1〜配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを例示することができる。このようなペプチドは、ラクトフェリン類の酵素分解物から公知の方法(例えば、特開平5−238948号公報)によって精製できるが、液相又は固相合成法等の化学合成、組み換えDNA法によっても調製することができる。
り実施することができる。細胞融合の3日前に抗原を免疫動物に静脈注射することにより、抗体産生活性を有するハイブリドーマを得る確率を高くすることが可能である。
ウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片、例えばウシ抗菌性ペプチド、ヒト抗菌性ペプチドのいずれかと特異的に結合するモノクローナル抗体は、上記のようにして得られたハイブリドーマの培養上清から、公知のイオン交換クロマトグラフィー又はプロテインAカラム等によって分離精製することができるが、同系のマウス腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を生成させることにより、1000〜10000倍程度に濃縮されたモノクローナル抗体を得ることもできる。この方法は、腹水から硫酸アンモニウムにより沈殿させるのみで、高純度のモノクローナル抗体を得ることができるので、極めて効率がよい。
ウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片を含有する希釈試料を固相に固定化し、本発明のモノクローナル抗体を添加し、固定化されたラクトフェリン類の断片に対して結合したモノクローナル抗体を検出することによって、前記ラクトフェリン類の断片を免疫学的に検出又は定量することができる。
ンに対する抗体を標識物質で標識化した2次抗体を前記固相に添加し、この標識物質を検出することによっても、固定化されたラクトフェリン類の断片に結合したモノクローナル抗体を間接的に検出することができる。
酸等を、ペルオキシダーゼを用いた場合には、発色基質としてオルトフェニレンジアミン又はABTS等を例示することができる。
トラジオグラフィー又はメンブレン若しくはフィルタ上の特定のバンドの放射活性を、バンドを含むメンブレン若しくはフィルタを切り出して液体シンチレーター等で測定することもできる。
前記キットを構成する各試薬類は、個別に包装され、一つのセットとなっている。また、上記の他に、洗浄用緩衝液、希釈液、基質色素を発色させるための他の基質等を同梱してもよい。
次に、試験例を示して本発明を詳述する。
この試験は、得られたモノクローナル抗体の特異性を調べるために行った。
1)試料の調製
後記参考例2と同一の方法により抗菌性ペプチドを調製した。また、後記実施例1と同一の方法によりモノクローナル抗体を調製した。
PBS溶液1mlに0.1mgの割合でラクトフェリン(森永乳業社製、純度90%)、抗菌性ペプチド又はウシ血清アルブミン(シグマ社製。以下「BSA」と記載する)を溶解し、各100μlを96穴マイクロプレートに添加し、37℃で1時間結合させた。各ウェルに抗原を結合したプレートを、PBS−Tween溶液で洗浄し、1%ゼラチンを含むPBS溶液150μlを各ウェルに添加し、37℃で1時間ブロッキングした。プレートを前記と同様に洗浄し、モノクローナル抗体及び対照のウサギ抗ウシラクトフェリン抗体(パーセル社製)を適当に希釈し、各ウェルに100μlずつ添加し、37℃で1時間抗体を結合させた。プレートを前記と同様に洗浄し、2次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体(ザイメッド社製)、又はアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン抗体(ザイメッド社製)を適当に希釈して各ウェルに100μlずつ添加し、37℃で1時間反応させた。
この試験の結果は、表1に示すとおりである。表1から明らかなとおり、本発明のモノクローナル抗体は、天然のラクトフェリンとは結合せず、抗菌性ペプチドとのみ特異的に結合することが認められた。尚、モノクローナル抗体及び抗菌性ペプチドの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
この試験は、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)及び2−メルカプトエタノールにより変成させたタンパク質又は抗菌性ペプチドと抗体との交叉性を調べるために行った。
1)試料の調製
参考例1及び参考例2と同一の方法によりウシラクトフェリン及び抗菌性ペプチドを調製した。また、実施例1と同一の方法によりモノクローナル抗体を調製した。
ラクトフェリン及び抗菌性ペプチドを50mMトリス−塩酸緩衝液(pH6.8)、1%SDS(ナカライテスク社製)、0.05%ブロモフェノールブルー(和光純薬工業社製)、5%グリセロール(ナカライテスク社製)、1%2−メルカプトエタノール(バイオラッド社製)に溶解し、100℃で2分間加熱して変成させ、前記レムリらの方法により不連続緩衝液を用いたSDS−ポリアクリルアミドゲル(15%)に供給し、電気泳動により分離した。
この試験の結果は、図1に示すとおりである。図1は、ニトロセルロース紙にブロット
したタンパク質のアミドブラック染色図(図1のA)及び本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫染色図(図1のB)であり、レーン1〜3は、それぞれ分子量マーカー、ウシラクトフェリン及び抗菌性ペプチドを示す。
イオン交換体(CM−セファロースFF(ファルマシア社製))を3Lのカラムに充填し、4Lの100mM塩酸を通液し、水洗し、イオン交換体を平衡化した。4℃に冷却したpH6.9のヒト脱脂乳22Lをカラムに500ml/分の流速で通液し、透過液を回収し、再び同様にカラムに通液した。次に、500ml/分の流速で蒸留水を通液し、10%食塩水4Lを2L/分の流速で通液し、イオン交換体に吸着した塩基性タンパク質溶液3.5Lを得た。
脱脂乳から分離したウシラクトフェリン(森永乳業社製。純度約90%)10gを5%(w/v)の濃度で蒸留水に溶解し、1規定塩酸を添加してpHを3.0に調整し、ペプシン(和光純薬工業社製)を基質の3%の割合で添加し、37℃で4時間加水分解し、のち80℃に15分間加熱してペプシンを失活させ、1規定水酸化ナトリウムを添加してpHを7.0に調整し、1500×gで30分間遠心して不溶物を除去し、凍結乾燥し、抗菌性ペプチドを含有する粉末状のペプチド混合物約7.9gを得た。
溶液10mlを得た。得られた抗菌性ペプチド溶液を水で平衡化した脱塩用のPD10カラム(ファルマシア社製)に5回に分けて注入し、脱塩した抗菌性ペプチド溶液を取得し、この溶液を凍結乾燥し、粉末状の抗菌性ペプチド約18mgを得た。
ペプチドシンセサイザー(ファルマシアLKB バイオテクノロジー社製。LKB Biolynx 4170)を使用し、シェパード等の方法[ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキンI(Journal of Chemical Society Perkin I) 、第538頁、1981年]による固相ペプチド合成法に基づいて、次のようにして配列番号2に示す配列を有するペプチドを合成した。
着剤HP20(三菱化学社製)カラムに供給して吸着させ、水で十分洗浄し、60%CH3CN/1N AcOH(関東化学社製)でペプチドを溶出させ、遠心濃縮後水を添加して凍結乾燥し、粗製ペプチド61.1mgを得た。
使用するアミノ酸の順序が異なることを除き、参考例3と同様の操作を行ない、配列番号3に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は約581mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は約83.3mgであり、精製した抗菌性ペプチド約59.9mgを得た。参考例3と同一の試験方法により配列番号3に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。
参考例1と同様に精製したヒトラクトフェリン10g(純度97%)を用い参考例2と同様の操作を行なった。脱塩後の抗菌性ペプチドの収量は約25mgであった。
使用するアミノ酸の順序が異なることを除き、参考例3と同様の操作を行ない、配列番号6に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は約830mg、脱保護、脱樹脂後のCys(Acm)粗製ペプチドの収量は約201.0mg、酸化した粗製ペプチド169.2mg、精製した抗菌性ペプチド約62.1mgを得た。参考例3と同一の試験方法により配列番号6に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。
使用するアミノ酸の順序が異なることを除き、参考例3と同様の操作を行ない、配列番号7に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は約570mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は約59.5mgであり、精製した抗菌性ペプチド約38.2mgを得た。参考例3と同一の試験方法により配列番号7に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。
使用するアミノ酸の順序が異なることを除き、参考例3と同様の操作を行ない、配列番
号8に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は約750mg、脱保護、脱樹脂後のCys(Acm)粗製ペプチドの収量は約186.8mgであり、酸化した粗製ペプチド131.2mg、精製した抗菌性ペプチド約51.4mgを得た。参考例3と同一の試験方法により配列番号8に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。
この例は、ヒトのラクトフェリン類由来ペプチドを定量するための本発明のキットに含まれるポリクローナル抗体の作成を示すものである。
この例は、合成ペプチドを抗原とした抗ウシ抗菌性ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製を示すものである。
16mgのKLH(ピアス社製)を1mlの10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)に溶解し、2.8mgのm−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロサクシニミド・エステル(m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester:以下「MBS」と記載する。和光純薬工業社製)を添加し、30分間撹袢した。溶液を0.45μmのフィルターで瀘過し、セファデックスG−25(Sephadex G-25:ファルマシア社製)カラムクロマトグラフィーにかけ、KLH−MBS溶液約5mlを分取した。
前記の溶液50μlを生理食塩水1mlと混合し、1.5mlのフロイント完全アジュバントと共に5匹の6週齢BALB/cマウスの皮下に1匹当たり400μlを注射した。以後2週間の間隔で同様に3回免疫を行った。免疫の過程で抗原に対する血清の抗体価
の上昇を、マウスから採血してELISA法により観察した。最も抗体価の高かったマウスに、150μlのPBSに溶解した15μgの配列番号2に示す化学合成抗菌性ペプチドを尾静脈から注射し、ブーストとした。
最終免疫3日後に脾細胞を無菌的に摘出し、ステンレスメッシュで単細胞にほぐし、RPMI1640(25mM HEPES及び2mM L−グルタミン)で3回洗浄し、脾細胞の約1/4量のX−63−Ag86.5.3ミエローマ細胞(ギブコ社製)と混合して遠心した。細胞のペレットに50%ポリエチレングリコール(PEG)1500を添加し、細胞融合を行い、遠心した細胞ペレットに、30%ウシ胎児血清(ギブコ社製。以下FCSと記載する)入りヒポキサンチン・チミジン(hypoxantine thymidine)培地を加え、96穴マイクロプレート19枚に播種し、翌日、各ウェルにHAT培地を添加した。
融合後1300ウェルからコロニーが生育し、これらの培養上清について、ウシラクトフェリン由来の抗菌性ペプチドを抗原とするELISA法を行い、抗原と強く反応するハイブリドーマを得た。限界希釈によるクローニングを4回反復し、安定した抗体産生を示すクローン8個を得た。
この例は、ウシラクトフェリンから調製したウシ抗菌性ペプチドを抗原とした抗ウシ抗菌性ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製を示すものである。
この例は、合成ペプチドを抗原とした抗ヒト抗菌性ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製を示すものである。
参考例6と同一の方法により製造した配列番号6に示す抗菌性ペプチドを用いたことを除き、実施例2と同一の方法により、抗体を産生するクローン6個を得た。
参考例4と同一の方法により製造した配列番号3に示す抗菌性ペプチドを用いたことを除き、実施例1と同一の方法により、抗体を産生するクローン8個を得た。
参考例5と同一の方法により製造した配列番号4及び配列番号5に示す抗菌性ペプチドダイマーを用いたことを除き、実施例2と同一の方法により、抗体を産生するクローン10個を得た。
参考例7と同一の方法により製造した配列番号7に示す抗菌性ペプチドを用いたことを除き、実施例1と同一の方法により、抗体を産生するクローン8個を得た。
参考例8と同一の方法により製造した配列番号8に示す抗菌性ペプチドを用いたことを
除き、実施例2と同一の方法により、抗体を産生するクローン6個を得た。
この例は、ウシラクトフェリン由来の抗菌性ペプチドの定量法を示すものである。
1ml当たり1mgのウシラクトフェリンを含有する溶液100mlを経口摂取したヒトの胃液を5分後に回収し、回収した胃液に0.01%の割合でペプスタチンA(シグマ社製)を添加し、体外でのプロテアーゼ活性によるタンパク質の分解を防止した。
この例は、抗菌性ペプチドを検出又は定量するための試薬キットを示すものである。
本発明にかかるモノクローナル抗体を用い、胃液、腸内容物、便、血液、尿中のヒト抗菌性ペプチドをELISA法により検出又は定量するキットを次のとおり作製した。
Claims (1)
- マウスの皮下に配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとフロイント完全アジュバントを投与して免疫し、最終免疫3日目に脾臓を摘出し、摘出した脾臓から採取した脾細胞とミエローマ細胞をポリエチレングリコールを添加して細胞融合し、融合した細胞から配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、限界希釈法を行ってモノクローナル化されたハイブリドーマを得ることを特徴とする配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造方法。
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