CN101633920A - 抗树鼩IgG单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
抗树鼩IgG单克隆抗体的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗树鼩IgG单克隆抗体的制备方法，具体地，涉及单克隆抗体领域，涉及树鼩IgG蛋白的分离与纯化，属生物技术领域。包括树鼩IgG的分离与纯化、免疫BALB/C小鼠、融合杂交瘤细胞、筛选杂交瘤细胞、杂交瘤细胞克隆化、制备单抗腹水、检测单抗腹水效价、单抗的制备步骤。
Description
技术领域：
本发明涉及抗树鼩IgG单克隆抗体的制备方法，具体地，涉及单克隆抗体领域，涉及树鼩IgG蛋白的分离与纯化，属生物技术领域。
背景技术：
树鼩(Tupaia belangeri，tree shrew)是一种形似松鼠的小型哺乳动物，其体型小，生长繁殖快，易于捕捉、驯养和繁殖，成本低，其新陈代谢和大体解剖比啮齿类动物更接近人类，随着国内外非人灵长类资源的逐渐减少和实验动物小型化的发展趋势，树鼩作为研究人类相关疾病的可能动物模型，受到广泛关注，现已应用于病毒、神经、心理、糖尿病、脑缺血、血管、肿瘤、寄生虫等方面的研究。目前已证实树鼩可被多种与人类疾病相关的病毒感染，包括单纯疱疹病毒、轮状病毒、甲肝病毒、乙肝病毒等。
已有很多研究者在验证树鼩作为丙型肝炎动物模型方面做了很多工作，树鼩原代肝细胞体外可被HCV感染且支持病毒复制，活体树鼩也可感染HCV。丙型肝炎病毒受体研究方面，序列分析表明树鼩的B族I型清道夫受体(SR-BI)和人类的有高度的同源性。因此树鼩有可能代替黑猩猩成为丙型肝炎研究的廉价、易得的小动物模型，从而加快HCV治疗药物的开发和疫苗的研究。但由于目前国内外二抗和树鼩抗体检测方法的缺乏，严重限制了以树鼩作为对象的相关病毒学、免疫学的研究。
发明内容：
本发明的目的在于提供了树鼩IgG分离与纯化的方法，为制备抗树鼩IgG单克隆抗体准备抗原，包括树鼩IgG的分离与纯化，对传统的单克隆抗体技术的改进，制备和筛选抗树鼩IgG单克隆杂交瘤细胞，抗树鼩IgG单克隆抗体的制备等，克服现有技术中二抗即抗树鼩IgG单克隆抗体的缺乏。还提供了抗树鼩IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，以解决现有技术中缺乏抗树鼩IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株的技术缺陷。
本发明的上述目的是通过以下的技术方案得以实现的：
抗树鼩IgG单克隆抗体的制备方法，包括树鼩IgG的分离与纯化、免疫BALB/C小鼠、融合杂交瘤细胞、筛选杂交瘤细胞、杂交瘤细胞克隆化、制备单抗腹水、检测单抗腹水效价、单抗的制备步骤。
树鼩IgG的分离与纯化步骤是取树鼩血清，用辛酸-硫酸铵沉淀法分离，用Sephacry-S200凝胶过滤层析法和DEAE-Sephadex A-50离子交换层析法纯化，用SDS-PAGE电泳检测分离纯化结果。
免疫BALB/C小鼠步骤是将树鼩IgG与等量弗氏完全佐剂混合，漩涡震荡乳化半小时，乳化完全后颈背和腹股沟皮下注射6-8周龄BALB/C小鼠，两周后用树鼩IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化后同法进行二免，二免两周后用树鼩IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射进行三免，再两周后进行与三免步骤一样的四免，四免两周后进行回忆刺激，3-4周后取脾细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0融合。
筛选杂交瘤细胞步骤是用HAT培养基选择性培养，用间接ELISA法检测阳性杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞克隆化步骤是采用有限稀释法进行克隆化，再按筛选杂交瘤细胞步骤进行检测，阳性克隆细胞进行再克隆并在液氮中冻存部分，重复进行4次克隆化，直到100％为阳性。
制备单抗腹水步骤是经液体石蜡处理的BALB/C小鼠，腹腔内注射纯化好的阳性杂交瘤细胞1×106个，经过约一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清备用。
单抗的制备步骤是用盐析法对单抗腹水进行初步纯化，用层析法对单抗做进一步纯化；SDS-PAGE检测纯度，抗体的含量用常用的紫外分光光度法测定，用间接ELISA检测抗体效价。
本发明具体的技术方案：
树鼩IgG的分离与纯化是先采用辛酸-硫酸铵沉淀法对树鼩血清进行初步分离，然后用Sephacry-S200凝胶过滤层析法和DEAE-Sephadex A-50离子交换层析法进行纯化，用SDS-PAGE电泳检测树鼩IgG的分离与纯化结果。将纯化的树鼩IgG与等量弗氏完全佐剂混合，漩涡震荡乳化半小时，乳化完全后颈背和腹股沟皮下注射6-8周龄BALB/C小鼠，两周后用树鼩IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化后同法进行二免，二免两周后用树鼩IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射进行三免，再两周后进行四免(同三免)，四免两周后进行回忆刺激，3-4周后取脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用50％的PEG1500进行融合。用HAT培养基选择性培养，用间接ELISA法检测阳性杂交瘤细胞。用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞。将纯化好的细胞接种入BALB/C小鼠腹腔产生腹水收集腹水，间接ELISA检测腹水效价。用盐析法对单抗腹水进行初步纯化，用层析法对单抗做进一步纯化。SDS-PAGE检测纯度，用常用的紫外分光光度法测定抗体的含量，用间接ELISA检测抗体效价。
本发明的积极效果在于：制备了高纯度的树鼩IgG为抗原，制备了产生抗树鼩IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备了抗树鼩IgG单克隆抗体，为树鼩免疫学检测提供了抗体，为树鼩作为对象的相关病毒学、免疫学等方面的研究奠定了基础。
附图说明：
图1为树鼩血清辛酸-硫酸铵提取物Sephacryl-S200柱层析图；
图2为DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析图；
图3为各步骤纯化产物SDS-PAGE图；
1：Marker(14.4kD～94kD)2：辛酸-硫酸铵沉淀透析后3：过S200柱后第二峰4：S200第二峰过A50离子柱后第一峰5：树鼩全血清；
图4为蛋白质标准相对迁移率及对数分子量标准曲线；
图5为阳性杂交瘤细胞TM1图；
图6为单抗亚类鉴定间接ELISA反应结果图。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
树鼩IgG的分离与纯化：
树鼩IgG的分离与纯化，树鼩血清先采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行初步分离，用Sephacry-S200凝胶过滤层析法和DEAE-Sephadex A-50离子交换层析法进行纯化，用SDS-PAGE电泳检测分离纯化结果。
(一)树鼩血清的制备：
采用断颈取血法，血液在室温或37℃下放置1小时，而后在4℃冰箱中过夜。收集上清，12000rpm，离心10min。得到的血清立即冻存于低温冰箱中，备用。
(二)树鼩IgG的分离与纯化：
1.辛酸-硫酸铵沉淀法：
取1份血清加4份0.06mol/l pH 4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(25μl/ml)，室温下边加边搅拌，持续30min；10000rpm离心20min，取上清，加等体积的PBS，以1M NaOH调pH至7.4；再加入硫酸铵(0.277g固体硫酸铵/ml)使其终浓度约为45％，4℃下搅拌30min，静置1～2h，出现沉淀；将液体离心10000rpm，30min。弃上清，沉淀物溶于PBS，4℃透析过夜，期间换液3～4次。将上述蛋白质粗提物，真空冷冻干燥，-70℃冻存备用。
2.Sephacryl-S200凝胶过滤层析：
树鼩血清经辛酸-硫酸铵沉淀后的提取物以柱床体积的1％上样，经Sephacryl-S200柱层析后，出现2个蛋白洗脱峰F1，F2见图1。电泳检测表明第一峰F1为杂蛋白峰，第二峰F2为目的蛋白峰(IgG)。收集第二峰蛋白进行SDS-PAGE分析，结果表明，相对分子质量大于IgG的杂蛋白都已经除去，但仍有一些小分子量或与目的蛋白分子量相当的杂蛋白没有除去。
3.DEAE-Sephadex A-50离子交换层析：
将Sephacryl-S200柱的第二蛋白峰F2过A-50离子柱。用Tris-HCl(0.05M，pH8.0)平衡柱子，先过2个柱体积，使蛋白与离子交换剂充分吸附，然后再用缓冲液Tris-HCl(0.05mol/1，pH8.0)和含1MNaCl的相同缓冲液线性洗脱3个柱体积，分别收集洗脱前和洗脱后的液体，检测其在280nm下的吸光度。结果表明，线性洗脱前的收集液中不含蛋白，图2为洗脱后的层析图，第一峰F1为目的蛋白。
4.样品的保存：
将经过两次层析得到的蛋白，装入透析袋4℃下外加聚乙二醇(分子量6000)，浓缩后测定蛋白含量，将浓缩样品分成小包装0.02-0.05ml，-20℃保存。
(三)蛋白纯度测定：
在分离过程中，将分离的中间产物及终产物-IgG分别留样，用15％的不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测，以判断其成份和纯度。
经盐析的蛋白粗提物过Sephacryl-S200柱所得的蛋白峰F2的电泳条带主要有6条，第1条与第2条在45～66.2kD之间，在45～35kD之间有三条，第6条在24kD附近，蛋白浓度较高的是第2条带和第6条带，是我们要的目的蛋白。电泳图(图3)表明蛋白确实得到了纯化。在此基础上我们又将蛋白再次浓缩过DEAE-SephadexA-50柱，从图中可以看出目的蛋白的纯度较高，图中仅见免疫球蛋白重链、轻链处两条带。
(四)分子量的测定：
根据血清免疫球蛋白经Sephacryl-S200和DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析纯化后SDS-PAGE电泳图谱，测量各个蛋白质条带迁移的距离。以溴酚蓝的迁移距离为标准1，计算相对迁移距离Rf。计算蛋白质标准的分子量的对数，并做出标准曲线方程(见表1和表2)。
由于树鼩血清IgG在SDS和2-巯基乙醇作用下，分子中共价二硫键被还原，解离成亚基形式，单体的IgG被拆解为H、L链亚单位。电泳图(图3)中仅见分子量约为53kD和28kD的两条蛋白带，分别代表IgG的重链(H链)和轻链(L链)，表明通过纯化获得的树鼩血清IgG纯度较高。由于IgG分子都是由一个四链单位组成，分别为两条相同的重链和轻链，由此可推断树鼩血清IgG的分子量约为160kD。
表1蛋白质标准迁移距离及相对迁移率及对数分子量
表2待测蛋白质迁移距离及相对迁移率
标准曲线方程为：
y＝-0.9936x+5.1972 R2＝0.9841
y为分子量的对数(logMW)；x为相对迁移率(Rf)
重链x1＝0.471代入方程计算得y1＝4.729
轻链x2＝0.747代入方程计算得y2＝4.545
分子量MW＝10y
重链：53.5kd 轻链：28.4kD
IgGMW＝(53.5+28.4)×2≈160kD
实施例2：
抗树鼩IgG杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备：
(一)免疫动物：
用分离纯化的树鼩IgG四次免疫BALB/C小鼠，第一次免疫将树鼩IgG与等量弗氏完全佐剂混合，漩涡震荡乳化半小时，乳化完全后颈背和腹股沟皮下注射6～8周龄BALB/C小鼠，两周后用树鼩IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化后同法进行二免，二免两周后用树鼩IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射进行三免，再两周后进行四免(同三免)，一至四免的注射量均为100μg/只，注射0.3～0.4ml。四免两周后进行回忆刺激，尾静脉注射树鼩IgG50μg/只。间接ELISA方法检测免疫后的血清效价。
(二)杂交瘤细胞株的制备和筛选：
取回忆刺激3～4天的小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％的PEG1500进行融合。用含1×HAT和10％FBS的RPMI-1640培养。融合三天后开始出现融合细胞，480个孔中158个为融合孔，融合率为32.9％。用间接ELISA法检测抗树鼩IgG单克隆抗体，检测110个孔，其中阳性孔为2个，阳性率为1.8％。经过四次有限稀释克隆，最后获得一株稳定分泌抗树鼩IgG单克隆抗体的细胞株，标记为TM1。
(三)腹水的制备及其效价和抗体亚类的鉴定：
将阳性杂交瘤细胞株以1×106个/只腹腔注射预先致敏的10周龄左右的雌性BALB/C小鼠，7～10天后，采集小鼠腹水，用间接ELISA法检测腹水效价，以骨髓瘤细胞系SP2/0腹水做对照，包被树鼩IgG抗原的浓度为10μg/ml。
结果：SP2/0腹水与抗原无反应，单克隆抗体效价为1.28×106。按照单抗亚类鉴定试剂盒说明进行间接ELISA反应，结果(图6)显示分泌的抗体属于IgG1亚类。
实施例3：
单克隆抗体的纯化：
1.盐析法进行抗体的初步纯化：
1份腹水和同体积生理盐水充分混匀放于冰水混合物上，再放于磁力搅拌器上再滴加2份100％饱和硫酸铵，边加边震荡混匀，即为终浓度50％饱和硫酸铵进行沉淀，4℃过夜。高速离心10000rpm，4℃，15min。弃上清及漂浮物，并将沉淀溶于腹水原体积量2倍的生理盐水。同时再加入一倍体积的饱和硫酸铵即终浓度33％，操作步骤同50％饱和硫酸铵沉淀，沉淀然后4℃过夜，高速离心10000rpm，4℃，15min。弃上清及漂浮物，并将沉淀溶于腹水原体积量的生理盐水。装入预先处理好的透析袋，置于透析缓冲液0.01M、pH7.4 PBS，约1000ml中，4℃，搅拌，透析除去硫酸铵。每天换液3-4次，一般为3天，用纳氏试剂监测NH4 +析出情况，直至无铵离子析出时停止透析。
2.层析法进一步纯化：
经初步纯化的单抗再用Q sepharose Fast Flow交换层析技术进一步纯化。平衡缓冲液为20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液，层析柱XK16/20、Pharmacia AKTA FPLC层析***。按照说明书装柱，平衡缓冲液平衡层析柱、流速5mL/min。上样后用3倍体积的平衡缓冲液进行洗脱，用NaCl递增的线性梯度洗脱结合的抗体蛋白，线性梯度为0-1.0MNaCl，10倍柱体积。A280检测收集洗脱的蛋白。SDS-PAGE检测纯度，用常用的紫外分光光度法测定抗体的含量，用间接ELISA检测抗体效价。
Claims (8)
1、抗树鼩IgG单克隆抗体的制备方法，包括树鼩IgG的分离与纯化、免疫BALB/C小鼠、融合杂交瘤细胞、筛选杂交瘤细胞、杂交瘤细胞克隆化、制备单抗腹水、检测单抗腹水效价、单抗的制备步骤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：树鼩IgG的分离与纯化步骤是取树鼩血清，用辛酸-硫酸铵沉淀法分离，用Sephacry-S200凝胶过滤层析法和DEAE-Sephadex A-50离子交换层析法纯化，用SDS-PAGE电泳检测分离纯化结果。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：免疫BALB/C小鼠步骤是将树鼩IgG与等量弗氏完全佐剂混合，漩涡震荡乳化半小时，乳化完全后颈背和腹股沟皮下注射6-8周龄BALB/C小鼠，两周后用树鼩IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化后同法进行二免，二免两周后用树鼩IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射进行三免，再两周后进行与三免步骤一样的四免，四免两周后进行回忆刺激，3-4周后取脾细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0融合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：筛选杂交瘤细胞步骤是用HAT培养基选择性培养，用间接ELISA法检测阳性杂交瘤细胞。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：杂交瘤细胞克隆化步骤是采用有限稀释法进行克隆化，再按筛选杂交瘤细胞步骤进行检测，阳性克隆细胞进行再克隆并在液氮中冻存部分，重复进行4次克隆化，直到100％为阳性。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：制备单抗腹水步骤是经液体石蜡处理的BALB/C小鼠，腹腔内注射纯化好的阳性杂交瘤细胞1×106个，经过约一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清备用。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：单抗的制备步骤是用盐析法对单抗腹水进行初步纯化，用层析法对单抗做进一步纯化；SDS-PAGE检测纯度，抗体的含量用常用的紫外分光光度法测定，用间接ELISA检测抗体效价。
8、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于树鼩IgG的分离与纯化步骤是取树鼩血清，用辛酸-硫酸铵沉淀法分离，用Sephacry-S200凝胶过滤层析法和DEAE-Sephadex A-50离子交换层析法纯化，用SDS-PAGE电泳检测分离纯化结果；免疫BALB/C小鼠步骤是将树鼩IgG与等量弗氏完全佐剂混合，漩涡震荡乳化半小时，乳化完全后颈背和腹股沟皮下注射6-8周龄BALB/C小鼠，两周后用树鼩IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化后同法进行二免，二免两周后用树鼩IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射进行三免，再两周后进行与三免步骤一样的四免，四免两周后进行回忆刺激，3-4周后取脾细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0融合；筛选杂交瘤细胞步骤是用HAT培养基选择性培养，用间接ELISA法检测阳性杂交瘤细胞；杂交瘤细胞克隆化步骤是采用有限稀释法进行克隆化，再按筛选杂交瘤细胞步骤进行检测，阳性克隆细胞进行再克隆并在液氮中冻存部分，重复进行4次克隆化，直到100％为阳性；制备单抗腹水步骤是经液体石蜡处理的BALB/C小鼠，腹腔内注射纯化好的阳性杂交瘤细胞1×106个，经过约一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清备用；单抗的制备步骤是用盐析法对单抗腹水进行初步纯化，用层析法对单抗做进一步纯化；SDS-PAGE检测纯度，抗体的含量用常用的紫外分光光度法测定，用间接ELISA检测抗体效价。
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